Laccase-Mediator System โดยใช้ Natural Mediator เป็นสารไวท์เทนนิ่งสำหรับการลดสีของเมลานิน ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม: ในการศึกษานี้ ระบบ laccase-mediator (LMS) โดยใช้ตัวกลางธรรมชาติได้รับการพัฒนาเป็นสารทำให้ผิวขาวสำหรับการลดสีของเมลานิน สารไกล่เกลี่ยตามธรรมชาติ 7 ชนิดถูกนำมาใช้เพื่อทดแทนสารสื่อกลางสังเคราะห์ และประสบความสำเร็จในการเอาชนะศักยภาพรีดอกซ์ต่ำของแลคเคสและการเข้าถึงเมลานินที่จำกัดไปยังตำแหน่งที่ใช้งานของแลคเคส กิจกรรมการลดสีของเมลานินของแลคเคสจาก Trametes versicolor (lacT) และ Myceliophthora thermophila (lacM) ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยใช้ตัวกลางจากธรรมชาติ ได้แก่ acetosyringone, syringaldehyde และ acetovanillone ซึ่งมีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำ กลุ่ม methoxy และ ketone ของผู้ไกล่เกลี่ยตามธรรมชาติมีบทบาทสำคัญในการลดสีของเมลานิน ค่าคงที่ความจำเพาะของ laT และ lacM สำหรับการลดสีของเมลานินเพิ่มขึ้น 247 และ 334 ตามลำดับ เมื่อใช้ acetosyringone เป็นตัวกลาง LMS ที่ใช้ลูกไม้และอะซีโตไซริงโทนยังสามารถลดสีของเมลานินที่มีอยู่ในฟิล์มเซลลูโลสไฮโดรเจล ซึ่งเลียนแบบสภาพผิว นอกจากนี้ LMS ยังสามารถลดสีของสารอะนาล็อกยูเมลานินสังเคราะห์ที่เตรียมโดยปฏิกิริยาออกซิเดชันของไทโรซีน แต่ยังลดสีเมลานินตามธรรมชาติที่ผลิตโดยเซลล์มะเร็งผิวหนังด้วย

จากการศึกษาที่เกี่ยวข้องพบว่ากระท่อมเป็นสมุนไพรที่ขึ้นชื่อว่า "สมุนไพรมหัศจรรย์อายุยืน" มีองค์ประกอบหลักคือซิสทาโนไซด์ซึ่งมีเอฟเฟกต์ต่างๆ เช่นสารต้านอนุมูลอิสระ, ต้านการอักเสบ, และการส่งเสริมการทำงานของภูมิคุ้มกัน. กลไกระหว่าง cistanche และผิวขาวอยู่ในผลต้านอนุมูลอิสระของ cistancheไกลโคไซด์. เมลานินในผิวหนังของมนุษย์ผลิตโดยปฏิกิริยาออกซิเดชันของไทโรซีนที่เร่งปฏิกิริยาโดยไทโรซิเนสและปฏิกิริยาออกซิเดชั่นต้องการการมีส่วนร่วมของออกซิเจน ดังนั้นอนุมูลอิสระของออกซิเจนในร่างกายจึงกลายเป็นปัจจัยสำคัญที่ส่งผลต่อการผลิตเมลานิน Cistanche ประกอบด้วยซิสทาโนไซด์ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระและสามารถลดการสร้างสารอนุมูลอิสระในร่างกายได้ ดังนั้นยับยั้งการสร้างเมลานิน

คลิกที่ Rou Cong Rong ประโยชน์ของการฟอกสีฟัน

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:

david.deng@wecistanche.com วอทแอพ:86 13632399501

1. บทนำ

แลคเคส (EC 1.10.3.2, benzenediol: dioxygen oxidoreductases) เป็นโปรตีนหลายทองแดงที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบฟีนอลและไม่ใช่ฟีนอลต่างๆ ผ่านกลไกปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาที่รุนแรงโดยการลดลงของโมเลกุลออกซิเจน [1,2] แลคเคสถูกใช้เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพสำหรับกระบวนการย่อยสลายทางชีวภาพ เช่น การบำบัดทางชีวภาพของสีย้อม [3,4] เภสัชภัณฑ์ [5,6] สารกำจัดวัชพืช [7] และการแยกส่วน [8-10] แลคเคสยังถูกใช้เพื่อเร่งปฏิกิริยาพอลิเมอไรเซชันของสารตั้งต้นของสีย้อมและสารประกอบอินทรีย์ [11] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง คุณสมบัติที่น่าสนใจ เช่น ความจำเพาะของสารตั้งต้นต่ำ การใช้ออกซิเจนเป็นตัวรับอิเล็กตรอนขั้นสุดท้าย การสร้างน้ำเป็นผลพลอยได้ และไม่ต้องการ (หรือไม่มีการผลิต) ของเปอร์ออกไซด์ ทำให้พวกมันน่าสนใจในด้านเทคโนโลยีชีวภาพและ สาขาสิ่งแวดล้อม [1,11,12].

ไอออนทองแดง 4 ไอออนที่ไซต์แอคทีฟเกี่ยวข้องกับกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของแลคเคส ทองแดง "สีน้ำเงิน" (ไซต์ T1) ออกซิไดซ์สารตั้งต้น และกลุ่มทองแดงสามอะตอม (T2/T3) รับอิเล็กตรอนจากไซต์ T1 เพื่อลดโมเลกุลออกซิเจน [1,12,13] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ศักยภาพรีดอกซ์ของ T1 ไซต์ Cu ถือเป็นปัจจัยสำคัญในการกำหนดความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาของแลคเคส [14] แลคเคสมีศักยภาพรีดอกซ์ค่อนข้างต่ำ (0.4–0.8 V) เมื่อเทียบกับลิกนิโนไลติกเปอร์ออกซิเดส (มากกว่า 1 V) เช่น แมงกานีสเปอร์ออกซิเดสและลิกนินเปอร์ออกซิเดส แลคเคสไม่สามารถออกซิไดซ์สารตั้งต้นที่ไม่ใช่ฟีนอลโดยตรงด้วยศักย์รีดอกซ์ที่สูงกว่า 1.3 V [13,14] ดังนั้น เพื่อเอาชนะข้อจำกัดของแลคเคส ระบบตัวกลางแลคเคส (LMS) โดยใช้สารประกอบโมเลกุลขนาดเล็ก เช่น 2,20 -azinobis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS), { {24}}แนะนำให้ใช้ไฮดรอกซีเบนโซไตรอะโซล (HOBt), กรดไวโอลูริก (VLA), เอ็น-ไฮดรอกซีพทาลิไมด์ (HPI), เอ็น-ไฮดรอกซีอะซีตานิไลด์ (NHA) และ TEMPO ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวกลางรีดอกซ์ [15–17]

ตัวกลางเหล่านี้อนุญาตให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบขนาดใหญ่ผ่านเส้นทางออกซิเดชันที่แตกต่างกัน ระบบ laccase-ABTS ออกซิไดซ์ซับสเตรตโดยสร้างอนุมูลอิสระ ABTS ที่เป็นประจุบวกผ่านกลไกการถ่ายโอนอิเล็กตรอน (ET) LMS ที่มี HOBt, VLA, HPI หรือ NHA จะสร้างอนุมูลไนตรอกซิลผ่านกลไกการถ่ายโอนอะตอมของไฮโดรเจน (HAT) [1,12,17] นอกจากนี้ ตัวกลางเช่น TEMPO และแอนะล็อกจะทำปฏิกิริยาผ่านวิถีไอออนิกเพื่อสร้างออกโซแอมโมเนียมไอออน [1,12,18] การใช้ตัวกลางเหล่านี้สามารถออกซิไดซ์สารประกอบได้หลากหลายในการใช้งานต่างๆ เช่น การย่อยสลายสีย้อม [3,4] การย่อยสลายยา [5,6] และการย่อยสลายลิกนิน [8–10] อย่างไรก็ตาม การประยุกต์ใช้ตัวกลางสังเคราะห์ในด้านอุตสาหกรรมมีข้อจำกัดเนื่องจากความเป็นพิษที่อาจเกิดขึ้น ค่าใช้จ่ายสูง และผลกระทบจากการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการศึกษาโมเลกุลฟีนอลิกที่ได้จากลิกนินในฐานะสื่อกลางธรรมชาติ (เช่น ไซริงกัลดีไฮด์, อะซีโตไซริงโทน, วานิลลิน, อะซีโตวานิลโลน, เมทิลวานิลลาเลต, กรดเฟรูลิก, กรดซินาพิก, กรด p-coumaric เป็นต้น) เพื่อแทนที่สารไกล่เกลี่ยสังเคราะห์ [1,12] . ข้อดีของสารสื่อกลางธรรมชาติคือต้นทุนต่ำและความเป็นพิษต่ำเนื่องจากได้มาจากแหล่งธรรมชาติและพลังงานหมุนเวียน [19]

เมลานินเป็นกลุ่มของเม็ดสีธรรมชาติที่ผลิตโดยเมลาโนเจเนซิสผ่านปฏิกิริยาออกซิเดชันพอลิเมอไรเซชันของไทโรซีนโดยเมลาโนไซต์ เมลานินตามธรรมชาติสามารถจำแนกได้เป็นห้าประเภท ได้แก่ ยูเมลานิน ฟีโอเมลานิน เมลานินทั้งหมด ฟีโอเมลานิน และนิวโรเมลานิน [20] เมื่อเร็ว ๆ นี้มีการศึกษาการใช้งานทางการแพทย์และเคมีไฟฟ้าโดยใช้เมลานินหรือสารตั้งต้นของเมลานิน [20,21] สีผิวของมนุษย์ส่วนใหญ่ถูกกำหนดโดยการปรากฏตัวของเมลานิน ในอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง ได้มีการเสนอการลดเม็ดสีเมลานินโดยตรงโดยใช้เอนไซม์เพื่อพัฒนาสารที่ทำให้ผิวขาวขึ้น มีการศึกษาเปอร์ออกซิเดสหลายชนิดเพื่อลดสีของเมลานิน Woo และคณะ แสดงให้เห็นว่าเมลานินสังเคราะห์สามารถเปลี่ยนสีได้โดยตรงโดยลิกนินเปอร์ออกซิเดสจาก P. chrysosporium [22] กลุ่ม Keneko และ Mohorˇciˇc ยังรายงานการลดสีของเมลานินด้วยเอนไซม์โดยแมงกานีสเปอร์ออกซิเดสที่แยกได้จากเชื้อรา (Sporotrichum pruinose และ Phlebia radiata) [23,24] คิมและคณะ รายงานว่าส่วนผสมของเอ็นไซม์หยาบที่มีแมงกานีสเปอร์ออกซิเดส ลิกนินเปอร์ออกซิเดส และแลคเคส มีฤทธิ์ลดเม็ดสีเมลานิน [25] เมื่อเปอร์ออกซิเดสไปทำลายเม็ดสีเมลานิน พวกเขาต้องการไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) เป็นปัจจัยร่วมที่สามารถทำให้ผิวระคายเคืองได้ ดังนั้น เพื่อลดการใช้ H2O2 จึงมีการนำกลูโคสออกซิเดสหรือแลคเคสเข้าสู่ระบบผสมของเอนไซม์ [26,27] Laccas สามารถลดสีของเมลานินโดยไม่ต้องใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ คำเมืองและสารธิมารายงานว่าแลคเคสจาก Lentinus polycarpous Lév แสดงฤทธิ์ลดเม็ดสีเมลานินโดยใช้ ABTS วานิลลิน และกรดวานิลลิกเป็นตัวกลาง [28]

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. วัสดุ

2.2. การลดเม็ดสีเมลานินด้วย LMS

สารละลายเมลานินอิ่มตัว (1.4 มก./มล.) เตรียมได้โดยการละลายเมลานินสังเคราะห์ 3 มก. ใน 1.3 มล. ของ NaOH 10 มิลลิโมลาร์ สารละลายถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อกำจัดเมลานินที่ไม่ละลายออก และส่วนลอยถูกเจือจางด้วย 0.1 โมลาร์ซิตริกแอซิดฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 หรือ 7) และใช้เป็นสารละลายตั้งต้นสำหรับ LMS ความเข้มข้นของเมลานินในสารละลายตั้งต้นคือ 63 µg/mL และได้รับการยืนยันทางสเปกโตรโฟโตเมตริกที่ 475 นาโนเมตร สารละลายซับสเตรตเมลานิน 0.8 มล. ผสมกับสารละลายตัวกลาง 0.1 มล. (0–1 มล.) ในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มล. ปฏิกิริยาการลดสีของเมลานินเริ่มต้นโดยการเติมสารละลายแลคเคส 0.1 มล. (15.8 µg (0.6 U) lacT หรือ 19.2 µg (1.8 U) lacM) ลงในส่วนผสมของเมลานินและตัวกลางที่อุณหภูมิ 25 ◦C ในอ่างน้ำแบบเขย่าที่ความเร็ว 120 รอบต่อนาที . หลังปฏิกิริยา ของผสมของปฏิกิริยาถูกปั่นแยก และค่าการดูดกลืนแสงของสารแขวนลอยถูกวัดที่ 475 นาโนเมตร ผลผลิตการลดสี ( เปอร์เซ็นต์ ) ถูกคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:

การลดสี ( เปอร์เซ็นต์ ) {{0}} (A0 - ที่)/A0 × 100, (1)

2.3. การศึกษาจลนศาสตร์ของการลดสีของเมลานินด้วย LMS

2.4. ความเป็นพิษต่อเซลล์ของผู้ไกล่เกลี่ยตามธรรมชาติ

สายเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16F10 (ธนาคารสายเซลล์แห่งเกาหลี กรุงโซล ประเทศเกาหลี) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของผู้ไกล่เกลี่ยตามธรรมชาติสำหรับ LMS ทำการทดสอบสีแดงที่เป็นกลาง (NR) เพื่อวัดความเป็นพิษต่อเซลล์ของผู้ไกล่เกลี่ย [29] NR วัดความมีชีวิตของเซลล์ไลโซโซมที่มีชีวิต เซลล์เมลาโนมาที่มีความเข้มข้น 3 × 104 เซลล์ถูกจ่ายลงในแต่ละหลุมของจานหลุม 96- หลังจากการเพาะเลี้ยง 24 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยตัวกลางตามธรรมชาติ (1, 2, 5, 10, 22 และ 46 มิลลิโมลาร์) หลังจากการเพาะเลี้ยงเพิ่มเติมเป็นเวลา 2 วัน เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยสารละลาย NR 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรที่ละลายใน DMEM และบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง หลังจากกำจัดส่วนลอยเหนือตะกอนผ่านการดูดแล้ว สารละลาย NR ดูดซับ (กรดกลาเซียลอะซิติก 1 เปอร์เซ็นต์ เอทานอล 49 เปอร์เซ็นต์ และน้ำกลั่น 50 เปอร์เซ็นต์) ถูกนำมาใช้สำหรับการสกัดสี หลังจากกระบวนการสกัด การเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 540 นาโนเมตร

2.5. การเตรียมและการลดสีของฟิล์มไฮโดรเจลเมลานิน/เซลลูโลส

ในการวัดกิจกรรมการลดสีของ LMS สำหรับฟิล์มเมลานิน/เซลลูโลส ฟิล์มไฮโดรเจลที่เตรียมไว้ถูกตัดเป็นแผ่นขนาด 1 × 2 ซม. ฟิล์มไฮโดรเจลถูกแช่ใน 4 มล. ของ 0.1 โมลาร์บัฟเฟอร์กรดซิตริกฟอสเฟต (pH 5.5); ต่อมา 0.5 มล. ของ 1 มิลลิโมลาร์ อะซีโตไซริงโทนและ 0.5 มล. ของสารละลายลูกไม้ (2.5 U) ถูกเติมลงในบัฟเฟอร์ ปฏิกิริยาการลดสีถูกดำเนินการในอ่างน้ำด้วยการเขย่าที่เวลา 120 น. และ 25 ◦ซ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง หลังจากเกิดปฏิกิริยา ฟิล์มจะถูกล้างด้วยน้ำกลั่นและติดกับด้านในของคิวเวตต์เพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงของสเปกตรัมในช่วง 400–800 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV/Vis ปฏิกิริยาควบคุมที่ไม่มี lacM หรือตัวกลางยังดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ไม่พบการปลดปล่อยเมลานินจากฟิล์มหรือการเปลี่ยนสีของฟิล์มเมลานิน/เซลลูโลสภายใต้สภาวะปฏิกิริยา นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงของพารามิเตอร์สี (ค่า L*, a* และ b*) ของฟิล์มเมลานิน/เซลลูโลสหลังจากปฏิกิริยาการลดสีโดย LMS ยังถูกบันทึกโดยใช้เครื่องวัดสี (KONICA MI NOLTA, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ได้รับค่า ∆L (ความแตกต่างของเมตริกความสว่าง), ∆E (ความแตกต่างของสีทั้งหมด), YI (ดัชนีความเหลือง) และ WI (ดัชนีความขาว) โดยใช้สมการต่อไปนี้ [30–32]:

2.6. การเตรียมเมลานินธรรมชาติ

เมลานินธรรมชาติได้มาจากเซลล์เมลาโนมา B16F10 เซลล์ได้รับการรักษาด้วยฮอร์โมนกระตุ้นอัลฟาเมลาโนไซต์เพื่อผลิตเมลานิน หลังจากการบ่มเป็นเวลา 4 วัน เซลล์ถูกจับโดยใช้ทริปซิน-EDTA และกระตุ้นด้วยคลื่นเสียงเป็นเวลา 10 นาที สารส่วนเกินได้มาจากการปั่นแยกที่ 8000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงปรับเป็น pH 1.5 โดยใช้ 6 M HCl สารละลายถูกต้มที่อุณหภูมิ 100 ◦C เป็นเวลา 4 ชั่วโมงเพื่อไฮโดรไลซ์เศษโปรตีนที่เหลือ สารละลายที่มีเมลานินตามธรรมชาติถูกล้างด้วยอะซิโตน ตามด้วยคลอโรฟอร์มและเอทานอล จากนั้นล้างด้วยน้ำปราศจากไอออนเพื่อกำจัดสิ่งตกค้าง เช่น เซลล์ ส่วนประกอบของสื่อ และเศษส่วนโปรตีน [33,34] กระบวนการซักทั้งหมดดำเนินการมากกว่าสองครั้ง ในที่สุด เมลานินตามธรรมชาติได้มาจากการทำแห้งแบบเยือกแข็งและใช้เป็นสารตั้งต้นสำหรับ LMS

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

3.1. ผลกระทบของผู้ไกล่เกลี่ยต่อการลดเม็ดสีเมลานินด้วย LMS

ผลของตัวกลางต่างๆ ต่อปฏิกิริยาการลดสีของเมลานินโดย LMS ได้รับการตรวจสอบโดยใช้แลคเคสสองตัวจาก T. versicolor (lacT) และ M. thermophila (lacM) (รูปที่ 1)เมื่อใช้แลคทีโดยไม่มีตัวกลางในการลดสีของเมลานิน ผลผลิตของการลดสีจะเหลือเพียง 1 เปอร์เซ็นต์หลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมงของปฏิกิริยา เมื่อใช้ HOBt เป็นตัวกลางสำหรับแลคที อัตราการลดสีจะเพิ่มขึ้นเล็กน้อยเป็น 2 เปอร์เซ็นต์หลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมงของปฏิกิริยา การใช้ตัวกลางสังเคราะห์ต่างๆ เช่น HOBt, ABTS, VLA และ TEMPO ในการออกซิเดชันที่เร่งด้วยแลคเคสของสารประกอบฟีนอลหรือที่ไม่ใช่ฟีนอลิกช่วยเพิ่มอัตราการเกิดปฏิกิริยาอย่างมีนัยสำคัญ [10,15] เมื่อการเข้าถึงสารประกอบเป้าหมายไปยังตำแหน่งแอคทีฟของแลคเคสถูกจำกัดโดยสิ่งกีดขวาง steric ของพวกมัน อนุมูลที่เป็นสื่อกลางที่ก่อตัวขึ้นจากแลคเคสสามารถออกซิไดซ์สารประกอบเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยกลไกการถ่ายโอนอิเล็กตรอนหรือการถ่ายโอนอะตอมของไฮโดรเจน [12] HOBt เป็นหนึ่งในตัวกลางสังเคราะห์ที่ใช้บ่อยที่สุดใน LMS เนื่องจากมีศักยภาพรีดอกซ์สูง (1.1 V) [6] อย่างไรก็ตาม HOBt ไม่ใช่ส่วนผสมเครื่องสำอางที่ดี เนื่องจากมีความเป็นพิษต่อเซลล์และความสามารถในการยับยั้งแลคเคส ดังนั้นเราจึงเลือกตัวกลางธรรมชาติเจ็ดตัว ได้แก่ อะซีโตไซริงโทน ไซริงกัลดีไฮด์ กรด p-coumaric วานิลลิน กรดวานิลลิก วานิลิลแอลกอฮอล์ และอะซีโตวานิลโลน สำหรับปฏิกิริยาการลดสีของเมลานินโดย LMS ที่น่าสนใจคือตัวกลางธรรมชาติทั้งหมดทำหน้าที่เป็นตัวกลางที่มีประสิทธิภาพมากกว่า HOBt สำหรับการลดสีของเมลานินโดยขาด เมื่อใช้ acetosyringone, syringaldehyde และ p-coumaric acid ผลลัพธ์ของการลดสีคือ 28 เปอร์เซ็นต์ 22 เปอร์เซ็นต์ และ 18 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ หลังจาก 5 ชั่วโมงของปฏิกิริยา ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของตัวกลางธรรมชาติสำหรับปฏิกิริยาการลดสีของเมลานินโดย LMS ตัวกลางใน LMS จะถูกออกซิไดซ์เป็นอนุมูลตัวกลางโดยแลคเคส และอนุมูลตัวกลางจะกระตุ้นการเกิดออกซิเดชันและการลดสีของเมลานิน เมื่อใช้การขาดโดยไม่มีตัวกลางสำหรับการลดสีของเมลานินในช่วงเวลาปฏิกิริยาที่เพียงพอ ซึ่งอาจถึงสภาวะสมดุล ผลผลิตของการลดสีคือ 7 เปอร์เซ็นต์หลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยา ตัวกลางตามธรรมชาติ ยกเว้นกรดวานิลลิก ทำหน้าที่เป็นตัวกลางที่มีประสิทธิภาพมากกว่า HOBt สำหรับการลดสีของเมลานินด้วยแลคทีหลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยา ผลผลิตของการลดสีหลังจากปฏิกิริยา 24 ชั่วโมงโดยใช้กรดวานิลลิกเป็นตัวกลางมีค่าต่ำกว่าหลังจากปฏิกิริยา 5 ชั่วโมง ซึ่งอาจเกิดจากความเสถียรต่ำของกรดวานิลลิกในรูปแบบอนุมูลออกซิไดซ์ เมื่อใช้ acetosyringone, syringaldehyde และ acetovanillone ผลการลดสีคือ 34 เปอร์เซ็นต์ 30 เปอร์เซ็นต์ และ 31 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ หลังปฏิกิริยา 24 ชั่วโมง กรด p-Coumaric มีประสิทธิภาพในการเพิ่มอัตราการเกิดปฏิกิริยาเริ่มต้นมากกว่า acetovanillone ในขณะที่ acetovanillone เหนี่ยวนำให้เกิดการลดสีที่สภาวะสมดุลสูงกว่ากรด p-coumaric

ผลของผู้ไกล่เกลี่ยต่อปฏิกิริยาการลดสีโดย LMS โดยใช้ lacM ก็คล้ายกันมากกับผลที่ได้รับจาก LMS โดยใช้ laT เมื่อใช้ลูกไม้โดยไม่มีตัวกลางในการลดสีของเมลานิน ผลลัพธ์ของการลดสีจะอยู่ที่ 2 เปอร์เซ็นต์เท่านั้นหลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมงของปฏิกิริยา HOBt เป็นตัวกลางสำหรับ lacM ไม่ได้เพิ่มผลผลิตการลดสีในระหว่างปฏิกิริยา 5 ชั่วโมง ตัวกลางธรรมชาติทั้งหมด ยกเว้นกรด p-coumaric และวานิลลิน ทำหน้าที่เป็นตัวกลางที่มีประสิทธิภาพในการลดสีของเมลานินโดย lacM เมื่อใช้ acetosyringone และ syringaldehyde ผลการลดสีคือ 25 เปอร์เซ็นต์ และ 22 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ หลังจาก 5 ชั่วโมงของปฏิกิริยา กรด p-Coumaric และวานิลลินถูกใช้เป็นสื่อกลางที่มีประสิทธิภาพสำหรับแต่ละรายการ แต่ไม่สามารถเพิ่มอัตราการลดสีใน LMS โดยใช้ลูกไม้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ซึ่งอาจเกิดจากความจำเพาะของสารตั้งต้นที่ต่ำกว่าของ lacM สำหรับกรด p-coumaric และวานิลลิน ผลการลดสีหลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยาของ lacM กับกรด p-coumaric และวานิลลินมีความคล้ายคลึงกับที่ได้จาก laT สิ่งนี้บ่งชี้ว่ารูปแบบออกซิไดซ์ของกรด p-coumaric และวานิลลินสามารถลดสีของเมลานินได้อย่างมีประสิทธิภาพ แม้ว่าอัตราการออกซิเดชันของพวกมันโดย lacM จะต่ำกว่าโดย laT มาก เมื่อใช้ lacM โดยไม่ใช้ตัวกลางในการลดสีของเมลานินในช่วงเวลาปฏิกิริยาที่เพียงพอ ผลผลิตของการลดสีคือ 5 เปอร์เซ็นต์หลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยา ตัวกลางตามธรรมชาติ ยกเว้นกรดวานิลลิก ยังทำหน้าที่เป็นตัวกลางที่มีประสิทธิภาพมากกว่า HOBt สำหรับการลดสีของเมลานินด้วย lacM หลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยา เมื่อใช้ acetosyringone, syringaldehyde และ acetovanillone เป็นตัวกลางสำหรับ lacM ผลการลดสีคือ 34 เปอร์เซ็นต์ 28 เปอร์เซ็นต์ และ 31 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ หลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยา เมื่อใช้กรดวานิลลิกเป็นตัวกลางสำหรับทั้ง lactT และ lacM จะแสดงค่าการลดสีที่ต่ำที่สุด ซึ่งอาจเกิดจากความเสถียรต่ำของกรดวานิลลิกในรูปแบบอนุมูลออกซิไดซ์ คำเมืองและสารธิมารายงานว่าวานิลลินและกรดวานิลลิกสามารถใช้เป็นตัวกลางในการลดเม็ดสีเมลานินโดยใช้แลคเคสจาก Lentinus polycarpous [28] อย่างไรก็ตาม พวกมันแสดงกิจกรรมการลดสีของเมลานินที่ต่ำกว่า acetosyringone เมื่อใช้เป็นตัวกลางสำหรับแลคทีและลูกไม้

ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าตัวกลางตามธรรมชาติมีประสิทธิภาพสำหรับการลดสีของเมลานินด้วย LMS มากกว่า HOBt HOBt ได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวกลางสังเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพสำหรับแลคเคสเนื่องจากมีศักยภาพรีดอกซ์สูงและมีบทบาทในการเร่งปฏิกิริยาของกลุ่ม N OH ของ HOBt [5] ประสิทธิภาพของสารไกล่เกลี่ยในการออกซิไดซ์ซับสเตรตเป้าหมายนั้นขึ้นอยู่กับความสามารถในการสร้างอนุมูลที่เสถียรรวมถึงอุปสรรคสเตอริกที่เกิดจากสารตั้งต้นอัลคิลขนาดใหญ่มากกว่าศักยภาพรีดอกซ์ของสารไกล่เกลี่ย [19,35] ความเสถียรต่ำของตัวกลางออกซิไดซ์ของ HOBt ถูกกำหนดโดยไซคลิกโวลแทมเมทรี [6] ดังนั้น ผลผลิตการลดสีต่ำโดย LMS โดยใช้ HOBt อาจเกิดจากความเสถียรต่ำของ HOBt ภายใต้สภาวะการเกิดปฏิกิริยาของแลคเคส แม้ว่าศักยภาพรีดอกซ์ของ syringaldehyde จะต่ำกว่าของ HOBt แต่ syringaldehyde นั้นมีความเสถียรค่อนข้างสูงกว่า HOBt [6]

ดังแสดงในรูปที่ 2 สารไกล่เกลี่ยตามธรรมชาติที่ใช้ในงานวิจัยนี้มีหมู่แทนที่หลายตัว (เช่น ไฮดรอกซิล เมทอกซี คาร์บอกซิล คีโตน หรืออัลดีไฮด์) ที่ตำแหน่งต่างๆ บนวงแหวนเบนซีน [12,19] ผู้ไกล่เกลี่ยที่มีเมทอกซีสองกลุ่ม (อะซีโตไซริงวันและไซริงกัลดีไฮด์) แสดงอัตราการกำจัดสีที่สูงกว่ากลุ่มที่มีเมทอกซีหนึ่งกลุ่ม อัตราการลดสีที่ได้จากกรด p-coumaric ที่ไม่มีหมู่เมทอกซีขึ้นอยู่กับชนิดของแลคเคส กรด p-coumaric ที่มี lactT แสดงอัตราการขจัดสีที่สูงกว่ากรดที่มีหมู่ methoxy หนึ่งหมู่ ในขณะที่กรด p-coumaric ที่มี lacM แสดงอัตราการขจัดสีที่ต่ำที่สุดในปฏิกิริยา 5 ชั่วโมง เติมและคณะ ยังแสดงผลลัพธ์ที่คล้ายกันสำหรับการลดสีของหมึกเฟล็กโซกราฟีโดยแลคเคสจากเชื้อราด้วยตัวกลางธรรมชาติ [36] ตัวกลางธรรมชาติฟีนอล (อะซีโตไซริงโทน เมทิลไซริงค์ และไซริงอัลดีไฮด์) ที่มีองค์ประกอบแทนที่เมทอกซีสององค์ประกอบในวงแหวนถูกออกซิไดซ์โดยแลคเคสเร็วกว่ากรด p-coumaric ที่ไม่มีหมู่เมทอกซี สิ่งนี้บ่งชี้ว่าหมู่เมทอกซีมีบทบาทสำคัญในฐานะผู้ให้อิเล็กตรอนมากกว่าพันธะคู่ของกรด p-coumaric ที่สายโซ่ด้านข้าง เมื่อเปรียบเทียบสารไกล่เกลี่ยที่มีเมทอกซีกลุ่มเดียว ผลผลิตการเปลี่ยนสีเพิ่มขึ้นตามลำดับต่อไปนี้: อะซีโตวานิลโลน > วานิลลิน > วานิลลิลแอลกอฮอล์ > กรดวานิลลิก Acetovanillone ซึ่งมีหมู่คีโตนแสดงอัตราการขจัดสีและผลผลิตที่สูงกว่าตัวกลางที่มีหมู่อัลดีไฮด์ ไฮดรอกซิล และคาร์บอกซิล อะซีโตไซริงโทนที่มีหมู่คีโตนยังแสดงอัตราการกำจัดสีและผลผลิตที่สูงกว่าไซริงอัลดีไฮด์ที่มีหมู่อัลดีไฮด์อีกด้วย

ในการทดลองต่อไปนี้ ได้เลือก acetosyringone, syringaldehyde และ acetovanillone ซึ่งมีความสามารถในการลดสีของเมลานินสูง เป็นตัวกลางสำหรับ LMS ในการลดสีของเมลานิน ผลกระทบของผู้ไกล่เกลี่ยต่อปฏิกิริยาการลดสีโดย LMS ได้รับการตรวจสอบเมื่อเวลาผ่านไป (รูปที่ S1) ปฏิกิริยาการลดสีโดยใช้แลคทีร่วมกับ acetosyringone, syringaldehyde และ acetovanillone ทำให้ได้ผลลัพธ์ของการลดสี 21 เปอร์เซ็นต์ 18 เปอร์เซ็นต์ และ 1 เปอร์เซ็นต์หลังจากทำปฏิกิริยา 1 ชั่วโมงตามลำดับ ปฏิกิริยาการลดสีโดยใช้ lacM กับ acetosyringone และ syringaldehyde ทำให้ได้ผลผลิตการลดสี 19 เปอร์เซ็นต์และ 18 เปอร์เซ็นต์หลังจากทำปฏิกิริยา 1 ชั่วโมงตามลำดับ แลคเคสทั้งสองแสดงโปรไฟล์ปฏิกิริยาที่คล้ายคลึงกันเมื่อใช้ตัวกลางตัวเดียวกัน Acetosyringone และ syringaldehyde เพิ่มอัตราการลดสีอย่างมีนัยสำคัญระหว่างปฏิกิริยาเริ่มต้น ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า acetosyringone และ syringaldehyde ที่มีหมู่ไดเมทอกซีมีประสิทธิภาพในการเพิ่มอัตราเริ่มต้นของการลดสีโดย LMS มากกว่า acetovanillone ที่มีหมู่ methoxy หนึ่งหมู่ เติมและคณะ รายงานด้วยว่ากลุ่มเมทอกซีในโครงสร้างวงแหวนของผู้ไกล่เกลี่ยทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของพื้นผิว [36] ในทางกลับกัน ผลการลดสีหลังจาก 24 ชั่วโมงของปฏิกิริยาโดย acetovanillone นั้นคล้ายกับของ syringaldehyde แม้ว่า acetovanillone จะเพิ่มอัตราการเกิดปฏิกิริยาในระดับปานกลาง

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501