thภาษา
หน้าหลัก / ความรู้ / เนื้อหา

ความรู้

Kuwanon T และ Sanggenon A ที่แยกได้จาก Morus Alba Exert ผลต้านการอักเสบโดยการควบคุม NF-κB และ HO-1/Nrf2 เส้นทางการส่งสัญญาณในเซลล์ BV2 และ RAW264.7

Mar 30, 2022

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: ก่อนหน้านี้เราได้ศึกษาสารสกัดเมทานอลของเปลือก Morus alba และจำแนกสารประกอบ 11 ชนิดจากสารสกัด: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) และ norartocarpanone (11) ในที่นี้เราตรวจสอบต้านการอักเสบผลกระทบของสารประกอบเหล่านี้ต่อเซลล์ไมโครเกลีย (BV2) และมาโครฟาจ (RAW264.7) ในหมู่พวกเขา 3 และ 4 ยับยั้งการผลิตไนตริกออกไซด์ที่เกิดจากไลโปโพลีแซคคาไรด์ (LPS) อย่างเห็นได้ชัดในเซลล์เหล่านี้ ซึ่งบ่งบอกถึงคุณสมบัติต้านการอักเสบของสารประกอบทั้งสองนี้ สารประกอบเหล่านี้ยับยั้งการผลิต prostaglandin E2, interleukin-6 และ tumor necrosis factor-c และการแสดงออกของไนตริกออกไซด์ที่เหนี่ยวนำให้เกิดและไซโคลออกซีเจเนส-2 หลังการกระตุ้น LPS การปรับสภาพด้วย 3 และ 4 ยับยั้งการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณของปัจจัยนิวเคลียร์แคปปาบีในเซลล์ทั้งสองประเภท สารประกอบดังกล่าวยังกระตุ้นการแสดงออกของ heme oxygenase(H2O)-1 ผ่านการกระตุ้นของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับนิวคลีโอไทด์ erythroid 2-ที่ 2 การปราบปรามกิจกรรมของ H2O-1 กลับผลต้านการอักเสบที่เกิดขึ้น โดยการปรับสภาพด้วย 3 และ 4 ซึ่งบ่งชี้ว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบถูกควบคุมโดย HO-1 เมื่อนำมารวมกัน 3 และ 4 เป็นผู้ที่มีศักยภาพในการพัฒนายารักษาโรคและป้องกันสำหรับโรคอักเสบ.

คีย์เวิร์ด: โมรุส อัลบ้า; คุวานนท์ ที; ซังเกนอนเอ; BV2; RAW264.7 เซลล์; ฤทธิ์ต้านการอักเสบ

flavonoids anti-inflammatory

คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้ผลิตภัณฑ์เพิ่มเติม

1. บทนำ

Morus alba ซึ่งเป็นพืชสมุนไพรในวงศ์ Moraceae ถูกนำมาใช้รักษาอาการอักเสบของปอดในยาแผนโบราณ [1] เปลือกรากประกอบด้วยสารออกฤทธิ์หลายชนิด เช่น อัมเบลลิเฟอโรน สโคโปเลติน เมือก แทนนินฟลาโวนอยด์(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E และ kuwanon H)[2], 2-arylbenzofurans (moracenin D, moracin P, moracin O และ mulberrofuran O), และ prenylated flavonoids (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin และ Kuwana U)[3,4] สารสกัด M. alba และสารออกฤทธิ์สามารถบรรเทาโรคปอด ตามที่เปิดเผยโดยการศึกษาล่าสุด [5-7] นอกจากผลทางเภสัชวิทยาของ M.alba ต่อปอดแล้ว สารฟลาโวนอยด์ที่มีไอโซพรีนิเลต (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G และ mulberrofuran C) ยังส่งผลในการป้องกันตับในเซลล์ HepG2 ที่เกิดจาก t-BHP [8] Prenyl-flavonoids (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T และ morusin) และ triterpenoids (betulin acid, avail และ -sitosterol) ยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ 3T3-L1 adipocytes [9] โมรินไฮเดรต ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักของฟลาโวนอยด์ของ M. alba บรรเทาความบกพร่องของหน่วยความจำที่เกิดจากความเครียดเรื้อรังที่คาดเดาไม่ได้ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารนี้สามารถเพิ่มระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระและยับยั้งเส้นทางการอักเสบของระบบประสาท [10] การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าองค์ประกอบที่มีอยู่ใน M.alba เป็นตัวเลือกที่มีศักยภาพในการรักษาโรคต่างๆ

การอักเสบซึ่งเป็นการตอบสนองการป้องกันตัวเองที่ซับซ้อนต่อสิ่งเร้าที่ทำร้าย มีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันผ่านการกระตุ้นเซลล์ภูมิคุ้มกันหลายชนิด รวมทั้งมาโครฟาจ โมโนไซต์ เม็ดเลือดขาว แมสต์เซลล์ และเซลล์ประเภทอื่นๆ [11] มาโครฟาจเป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันที่มีมากและมีการกระจายอย่างกว้างขวางที่สุดในร่างกาย และไมโครเกลียเป็นมาโครฟาจประจำถิ่นในระบบประสาทส่วนกลาง (CNS)[12] เซลล์มาโครฟาจและไมโครเกลียลเป็นตัวสำคัญในการตอบสนองต่อการอักเสบ พวกมันสามารถกระตุ้นเพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้า เช่น ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS), ไซโตไคน์ และคีโมไคน์ และทำให้เกิดสภาวะอักเสบ [13] ภายใต้สภาวะการอักเสบ มาโครฟาจที่กระตุ้นมากเกินไปและเซลล์ microglial ทำให้เกิดการควบคุมที่ผิดปกติของผู้ไกล่เกลี่ยการอักเสบ (ไนตริกออกไซด์ (NO), พรอสตาแกลนดิน E2 (PGE,), การสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ที่เหนี่ยวนำ (iNOS) และไซโคลออกซีเจเนส (COX)-2 ) และไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (อินเตอร์ลิวคิน (IL)-6 และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก (TNF)-a) ผ่านการกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณของปัจจัยนิวเคลียร์คัปปา บี (NF-B)[14,15] ระดับที่เพิ่มขึ้นของตัวกลางไกล่เกลี่ยการอักเสบทำให้การลุกลามของโรคอักเสบรุนแรงขึ้น ซึ่งเพิ่มการกระตุ้นของปัจจัยการอักเสบ ส่งผลให้เกิดวงจรอุบาทว์[16] ดังนั้นการควบคุมสารไกล่เกลี่ยการอักเสบจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการรักษาและป้องกันโรคที่เกิดจากการอักเสบ

Heme oxygenase (H2O)-1 เป็นเอนไซม์จำกัดอัตราเร่งการเสื่อมสลายของ heme ไปเป็นบิลิเวอร์ดิน เฟอร์รัสไอออน (Fe2 บวก ) และคาร์บอนมอนอกไซด์(CO)[17] การเหนี่ยวนำ HO-1 ถูกควบคุมโดยการกระตุ้นของปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2(Nrf2) HO-1 สามารถเหนี่ยวนำให้ตอบสนองต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบได้ เพื่อปกป้องเนื้อเยื่อและรักษาสภาวะสมดุลในร่างกาย[18] ดังนั้น การเหนี่ยวนำโดยกำหนดเป้าหมาย HO-1 จึงเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ที่เป็นไปได้สำหรับการรักษาโรคเกี่ยวกับการอักเสบ

ในความพยายามอย่างต่อเนื่องของเราในการสำรวจผู้สมัครจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเพื่อรักษาโรคอักเสบ เราขอนำเสนอฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารประกอบ 11l ที่แยกได้จาก M.alba ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่เหนี่ยวนำโดย LPS

4flavonoids anti-inflammatory

2. ผลลัพธ์

2.1.ผลกระทบของ 11 สารประกอบที่แยกได้จาก M.alba ต่อความมีชีวิตของเซลล์ BV2 และ RAW264.7

ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เปลือกรากของ M.alba ถูกสกัดในเมทานอลที่เป็นน้ำ และสารสกัดที่ได้รับจะถูกแบ่งออกเป็น EtOAc, n-BuOH และ H2O2 ตามลำดับ โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ SiO2, ODS และ Sephadex LH-20 ที่ทำซ้ำของเศษส่วน EtOAc มีสารประกอบ 11 ชนิด เช่น kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), ซังเกนอล A(6), มัลเบอโรฟูแรน บี(7), มัลเบอโรฟูแรน จี(8), โมราซิน เอ็ม(9), โมราซิน โอ(10) และนอร์อาร์โทคาร์ปาโนน (11)[6,19,20] โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบ 11 ชนิดที่แยกได้จาก M.alba ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 1 เพื่อตรวจสอบผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบเหล่านี้ a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{ 26}}.5-การทดสอบไดฟีนิลเตตตราโซเลียมโบรไมด์(MTT) ถูกดำเนินการ เซลล์ BV2 และ RAW264.7 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ระบุของสารประกอบเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ความเข้มข้นสูงถึง 80 ไมโครโมลาร์ (ภาพที่2). สารประกอบ 2, 3 และ 4 มีผลเป็นพิษที่ 80 ไมโครโมลาร์, สารประกอบ 5 มีปฏิกิริยาที่เป็นพิษที่ 40 ไมโครโมลาร์ ตามผลของการประเมินความเป็นพิษ ช่วงความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษถูกเลือกสำหรับการศึกษาต่อมาเกี่ยวกับผลต้านการอักเสบ (สารประกอบ 2, 3,4 ที่ 40 uM, สารประกอบ 5 ที่ 200 ไมโครโมลาร์ และสารประกอบอื่นๆ ที่ 80 ไมโครโมลาร์) .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2.ผลของl1 สารประกอบที่แยกได้จาก M. alba ต่อการแสดงออกของปัจจัยการอักเสบและโปรตีน iNOS ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7

NO เป็นอนุมูลอิสระในระบบหัวใจและหลอดเลือด ประสาท และระบบภูมิคุ้มกัน. มันรักษาสภาวะสมดุลภายในเซลล์ ขนส่งสารสื่อประสาท และควบคุมฤทธิ์ต้านการอักเสบและความเป็นพิษต่อเซลล์ อย่างไรก็ตาม เมื่อมีการผลิต NO จำนวนมาก ก็จะส่งผลเสียต่อร่างกาย รวมทั้งการขยายหลอดเลือด ความเป็นพิษต่อเซลล์ และความเสียหายของเนื้อเยื่อ [21,22] จากนั้น เราตรวจสอบผลกระทบของสารประกอบเหล่านี้ต่อการผลิตไนไตรต์ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่เกิดจาก LPS เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารประกอบเป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนการกระตุ้นด้วย LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในบรรดาสารประกอบ มีเพียงสารประกอบ 3 (kuwanonT) และ 4 (ซังเกนอน A) เท่านั้นที่ยับยั้งการผลิตไนไตรต์อย่างมีนัยสำคัญในทั้งสายพันธุ์ของเซลล์ BV2 และ RAW264.7 (รูปที่ 3) นอกจากนี้ เราทำการทดลองเพิ่มเติมเพื่อเปรียบเทียบผลการยับยั้งการผลิตไนไตรต์ระหว่างกลุ่มที่บำบัดด้วย LPS หลังการปรับสภาพด้วยสารประกอบและกลุ่มที่บำบัดด้วยสารประกอบหลังการปรับสภาพด้วย LPS เป็นผลให้ไม่มีความแตกต่างในผลการยับยั้งการผลิตไนไตรต์ระหว่างสองกลุ่มทดลอง (รูปที่ S1) ดังนั้นในการศึกษานี้ การทดลองต่อไปนี้จึงถูกดำเนินการโดยใช้การบำบัดล่วงหน้าด้วยสารประกอบภายใน 2~3 ชั่วโมงก่อนทำการบำบัด LPS

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

การผลิต NO เพิ่มขึ้นโดยโปรตีนโปรอักเสบที่เหนี่ยวนำให้เกิดไนตริกออกไซด์ synthase (iNOS) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่มากเกินไปของ iNOS บั่นทอนพยาธิสรีรวิทยาของโรคอย่างจริงจัง [23] สารประกอบ 3 และ 4 ยับยั้งการแสดงออกของ iNOS ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น (รูปที่ 4) เราตรวจสอบผลของสารประกอบ 3 และ 4 ต่อการแสดงออกของปัจจัยการอักเสบที่เกิดจาก LPS ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกันของสารประกอบ 3 และ 4 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนการกระตุ้นด้วย LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สารประกอบทั้งสองยับยั้งการแสดงออกของ PGE2, TNF และ IL-6 ที่เหนี่ยวนำโดย LPS อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 (รูปที่ 5) ผลลัพธ์ปรากฏว่าการบำบัดก่อนด้วยสารประกอบ 3 และ 4 ยับยั้งการอักเสบที่เกิดจาก LPS ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3.ผลของสารประกอบ 3 และ 4 ต่อการเคลื่อนย้าย NF-xB ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7

NF-kB เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ควบคุมการแสดงออกของ iNOS [24] NF-kB ปกติยังคงอยู่ในรูปแบบที่ไม่ใช้งานโดยสร้างสารเชิงซ้อนที่มีโปรตีนควบคุม เช่น IKB อย่างไรก็ตาม เมื่อมันถูกกระตุ้นโดย LPS IkBa จะถูกย่อยสลายโดยฟอสโฟรีเลชั่น และ NF-kB (เช่น p65) จะถูกย้ายไปยังนิวเคลียส [25] ซึ่งส่งเสริมยีนสื่อกลางการอักเสบและกระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยการอักเสบ [26] เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลการยับยั้งของสารประกอบ 3 และ 4 ต่อการผลิตปัจจัยกระตุ้นการอักเสบในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่เปิดใช้งาน LPS เราตรวจสอบการแสดงออกของนิวเคลียส p65 ในเซลล์ที่บำบัดด้วยสารประกอบ 3 และ 4, LPS หรือ ทั้งคู่ใช้แอนติบอดีที่ติดฉลาก anti-p65 FITC DAPI ถูกใช้สำหรับการย้อมสีด้วยนิวเคลียร์ ในกลุ่มควบคุม ตรวจพบการแสดงออก p65 ในไซโทซอล อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย LPS ตรวจพบการสะสม p65 ในนิวเคลียส ดังที่ระบุไว้ในภาพที่ผสานของการย้อมสี DAPI และ p65 นอกจากนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย LPS สารประกอบ 3 และ 4 ลดการเพิ่มขึ้นที่อาศัย LPS อย่างเห็นได้ชัดในกิจกรรมการจับ NF-KB (p65)DNA (รูปที่ 6A, B) และการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ (รูปที่ 6C-F) การค้นพบนี้บ่งชี้ว่าสารประกอบ 3 และ 4 เป็นตัวควบคุมเชิงลบของการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ NF-kB ที่กระตุ้นด้วย LPS

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4.ผลกระทบของสารประกอบ 3 และ 4 ต่อเส้นทาง Nrf2/HO-1 ใน BV2 และ RAW264.7

Cells Heme oxygenase-1(HO-1) เป็นเป้าหมายของนิวเคลียสแฟกเตอร์ E2-related factor 2(Nrf2), Nrf2/H2O-1 วิถีเป็นระบบส่งสัญญาณต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพ เพื่อส่งเสริมธาตุเหล็กอิสระในคาร์บอนมอนอกไซด์ (CO) บิลิเวอร์ดิน และฮีม [27] คาร์บอนมอนอกไซด์ซึ่งเป็นเมแทบอไลต์ของก๊าซของกระบวนการ catabolism ของ heme แสดงผลตามกฎข้อบังคับของการขยายหลอดเลือดและการตอบสนองต่อการอักเสบ [28] นอกจากนี้ HO-1 ยังเป็นที่รู้จักว่ามีบทบาทสำคัญในการปกป้องเซลล์จากการอักเสบและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และเพื่อควบคุมการผลิตไนไตรต์ในมาโครฟาจที่ถูกกระตุ้น [29] เราทำ Western blotting เพื่อตรวจสอบว่าสารประกอบ 3 และ 4 เพิ่มระดับการแสดงออกของ H2O-1 หรือไม่ โดยที่ HO-1 ตัวเหนี่ยวนำโคบอลต์โปรโตพอร์ไฟริน(CoPP) ที่รู้จักกันดีถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกที่เพิ่มขึ้น HO{{ 16}} การแสดงออกของโปรตีน [30]. ผลการศึกษาพบว่าสารประกอบ 3 และ 4 ยังเพิ่มการควบคุมการแสดงออกของ H2O-1 (รูปที่ 7) เราสำรวจเพิ่มเติมว่าสารประกอบ 3 และ 4 ควบคุมการกระตุ้นของ Nrf2 หรือไม่ การเคลื่อนย้ายของ Nrf2 ไปยังนิวเคลียสเพิ่มขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับเวลา ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบ 3 และ 4 ควบคุมวิถี Nrf2/HO-1 ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 8)

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบและต้านการอักเสบของสารประกอบ 3 และ 4 มีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ H2O-1 ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 หรือไม่ เราได้ทำการทดลองชุดหนึ่งกับ tin protoporphyrin-IX(SNPP) ซึ่งเป็นตัวยับยั้งการออกฤทธิ์ของ H2O-1 โดยใช้ SNPP ซึ่งสามารถลดการแสดงออกของ H2O-1 เราพยายามตรวจสอบว่า H2O-1 เป็นสื่อกลางในการยับยั้งผลการยับยั้งของสารประกอบข้างต้นต่อการตอบสนองต่อการอักเสบที่เหนี่ยวนำโดย LPS 【 31】 หรือไม่ หลังจากบำบัดเซลล์ด้วย 20 ไมโครโมลาร์ของสารประกอบ 3 และ 4 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงโดยมีหรือไม่มี 50 ไมโครโมลาร์ SNPP พวกมันถูกบำบัดด้วย LPS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แม้ว่าสารประกอบ 3 และ 4 จะลดการผลิตไนไตรต์ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย LPS แต่ผลการต้านการอักเสบของพวกมันกลับตรงกันข้ามโดยการบำบัดด้วย SNPP (รูปที่ 9) SNPP เพียงอย่างเดียวไม่ส่งผลต่อการผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) หลังการกระตุ้น LPS ซึ่งเสนอแนะว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารประกอบ 3 และ 4 ถูกควบคุมโดยการแสดงออกของ H2O-1

image

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. อภิปราย

การศึกษาปัจจุบันแสดงให้เห็นว่า Kuwana T และ sanggenon A พยายามระงับการอักเสบที่เกิดจาก LPS ในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 สารประกอบเหล่านี้ยับยั้งการผลิต NO, PGE2 และโปรอักเสบไซโตไคน์ที่เกิดจาก LPS ซึ่งรวมถึง IL-6 และ TNF- และการแสดงออกของ iNOS และ COX-2 ทั้งในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า Kuwana T และ sanggenon A มีฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยการปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-kB นอกจากนี้ สารประกอบเหล่านี้กระตุ้นการแสดงออกของ H2O-1 ผ่านการกระตุ้นของ Nrf2 นอกจากนี้ สารประกอบเหล่านี้ยังเหนี่ยวนำการแสดงออกของ H2O-1 ผ่านการกระตุ้น Nrf2 และผลกระทบนี้ยังได้รับการยืนยันว่าเกี่ยวข้องกับ ฤทธิ์ต้านการอักเสบ

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.) และ thromboxane A2(TXA,)[361. ภายใต้สภาวะการอักเสบ ระดับของ iNOS และ COX-2 จะเพิ่มขึ้น ส่งผลให้เกิดการผลิต NO และ PGE2 มากเกินไป ตามลำดับ และนำไปสู่อาการกำเริบของความผิดปกติของการอักเสบ [37] ในการศึกษานี้ ก่อนอื่นเราประเมินสารประกอบ 11 ชนิดที่แยกได้จาก M.alba เพื่อตรวจสอบว่าไม่มีการยับยั้งการผลิตในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า kuwanon T และ sanggenon A ออกฤทธิ์ในการยับยั้งที่รุนแรงที่สุดในทั้งเซลล์ BV2 และ RAW264.7 (รูปที่ 3) ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา moracin M มีฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์มาโครฟาจ แต่ผลลัพธ์ของเรามีความแตกต่างกัน ลวดลาย. อย่างไรก็ตาม เนื่องจากแต่ละเซลล์มีลักษณะที่แตกต่างกัน กิจกรรมที่แตกต่างกันอาจปรากฏขึ้นแม้ในกลไกเดียวกัน J38] ดังนั้น จากผลของบทความนี้ จึงได้รับการยืนยันว่า moracin M ไม่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 จนถึงความเข้มข้นของการรักษา ดังนั้น จึงเลือก kuwanon T และ sanggenon A สำหรับการทดลองต่อไป

ไซโตไคน์มีอิทธิพลด้านกฎระเบียบที่ซับซ้อนต่อการตอบสนองการอักเสบและภูมิคุ้มกัน [39] การกระตุ้นของมาโครฟาจและเซลล์ไมโครเกลียลช่วยเพิ่มการหลั่งไซโตไคน์โปรอักเสบ J40 และการหลั่งที่เพิ่มขึ้นนี้นำไปสู่การปลดปล่อยไซโตไคน์เพิ่มเติม [41] IL-6 เป็นหนึ่งในไซโตไคน์ที่สำคัญและเป็นตัวกลางที่ละลายน้ำได้ซึ่งมีหน้าที่ในการอักเสบ การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน และการสร้างเม็ดเลือด [42] การส่งสัญญาณ IL-6 ถูกควบคุมผ่านกลไกที่แตกต่างกันสองกลไก ซึ่งรวมถึงการจับกับรีเซพเตอร์ IL-6 ที่จับกับเมมเบรน (mblL6R) และการรับรู้ของรีเซพเตอร์ IL-6 ที่ละลายได้ (sIL6R) [43] กลไกทั้งสองเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นไกลโคโปรตีน (GP)130 ซึ่งส่งผลให้เกิดการกระตุ้นโมเลกุลการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม รวมถึง Janus kinase (IAK)/ตัวแปลงสัญญาณและตัวกระตุ้นการถอดรหัส (STAT)ไคเนส, ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส (PI3K) ) และไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK)[44] IL-6 ใช้เพื่อทำนายและประเมินระดับการอักเสบในผู้ป่วยโรคมะเร็ง การติดเชื้อ โรคภูมิต้านตนเอง โรคตับอ่อน และโรคหลอดเลือดหัวใจ

TNF- ซึ่งเป็นไซโตไคน์ที่สำคัญอีกชนิดหนึ่งก็มีบทบาทสำคัญในกระบวนการภูมิคุ้มกันและการอักเสบหลายอย่าง เช่น การเพิ่มจำนวนเซลล์ภูมิคุ้มกัน การตายของเซลล์ การตายแบบอะพอพโทซิส ผลกระทบทางชีวภาพของ TNF- ถูกควบคุมโดยการจับกับตัวรับสองตัวที่แตกต่างกัน ได้แก่ ตัวรับปัจจัยการตายของเนื้องอก (TNFR) 1 และ TNFR2 TNFR1 เป็นตัวกลางหลักของกิจกรรม TNF ในเซลล์ส่วนใหญ่ เนื่องจาก TNFR2 มีความสัมพันธ์ในการจับกับ TNF- น้อยกว่า ส่งผลให้ TNF- แยกออกจาก TNFR2 ได้ง่ายกว่าจาก TNFR1 ความผิดปกติในการส่งสัญญาณ TNF และการผลิต TNF ที่มากเกินไป- นำไปสู่การพัฒนาของโรคต่างๆ รวมถึงโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ โรคสะเก็ดเงิน โรคโครห์น หลอดเลือด ภาวะติดเชื้อ เบาหวาน และโรคอ้วน [45,46. ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะยับยั้งการผลิตไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบเพื่อยับยั้งและป้องกันปฏิกิริยาการอักเสบและการพัฒนาของโรคที่เกิดจากการอักเสบ ในการศึกษานี้ kuwanon T และ sanggenon A ยับยั้งการผลิต IL-6 และ TNF- ที่เกิดจาก LPS ทั้งในเซลล์ BV2 และ RAW264.7

NF-KB เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่แพร่หลายที่สุด [47] และการส่งสัญญาณ NF-kB มีบทบาทสำคัญในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการอักเสบ รวมถึงการเข้ารหัส iNOS, COX-2 และไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ 48]. ในสถานะปิดใช้งาน หน่วยย่อย NF-kB มีอยู่ในไซโตพลาสซึมที่จับกับโปรตีนตัวยับยั้ง ตัวยับยั้ง kappa B (kB)- สารกระตุ้นหลายอย่าง รวมทั้ง LPS และ cytokines ทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชันและการเสื่อมสภาพของ IkB- ซึ่งช่วยให้เกิดการปลดปล่อยและเคลื่อนย้ายของหน่วยย่อย NF-kB เข้าสู่นิวเคลียส หน่วยย่อยที่ถูกเคลื่อนย้ายไปจับกับตำแหน่ง kB ของยีนเป้าหมายใน DNA ส่งผลให้เกิดการเหนี่ยวนำการถอดรหัสของยีนที่เข้ารหัสตัวกลางที่ทำให้เกิดการอักเสบได้ [49] ดังนั้น การหยุดทำงานของวิถี NF-kB อาจเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคสำหรับโรคที่มีการอักเสบ ในการศึกษานี้ การปรับสภาพด้วย kuwanon T และ sanggenon A ยับยั้งการกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดย LPS ของการส่งสัญญาณ NF-kB โดยการยับยั้งการออกฤทธิ์ในการจับดีเอ็นเอและการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของหน่วยย่อย NF-kB (รูปที่ 6) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลการต้านการอักเสบของ kuwanon T และ sanggenon A กระทำโดยการควบคุมของวิถีการส่งสัญญาณ NF-kB

ภายใต้สภาวะปกติ Nrf2 จะจับกับโปรตีน 1 ที่เกี่ยวข้องกับ ECH คล้ายเคลช์ (Keap1) ในไซโตพลาสซึม อย่างไรก็ตาม มันแยกตัวออกจาก Keapl ย้ายไปยังนิวเคลียส และจับกับไซต์การตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) บน DNA ซึ่งนำไปสู่การแสดงออกของยีนต้านอนุมูลอิสระต่างๆ รวมถึงการเข้ารหัส HO-1, NAD(P)H : quinone oxidoreductase 1(NQO1), peroxiredoxin (Prx) และ thioredoxin (Trx)[50] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HO-1 เป็นที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับฤทธิ์ต้านการอักเสบ และกิจกรรมของมันถูกแสดงโดยระดับของ CO ซึ่งเป็นหนึ่งในสามผลพลอยได้ที่เกิดจากกิจกรรมของเอนไซม์ของ H2O{{12 }} [51]. ในการศึกษานี้ เราพบว่าการแสดงออกของ kuwanon T และ sanggenon A ที่เหนี่ยวนำโดย HO-1 โดยการเปิดใช้งาน Nrf2 (รูปที่ 7 และ 8) นอกจากนี้ เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างผลต้านการอักเสบของการแสดงออกของ kuwanon T และ sanggenon A และ HO-1 โดยใช้ SNPP ซึ่งเป็นตัวยับยั้งการคัดเลือกของกิจกรรม HO-1 ผลการยับยั้งของ kuwanon T และ sanggenon A ต่อการผลิต NOและ TNF และการกระตุ้น NF-kB ถูกย้อนกลับบางส่วนโดยการรักษาร่วมกับ SNPP (รูปที่ 9) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลต้านการอักเสบของ kuwanon T และ sanggenon A ถูกควบคุมโดยการแสดงออกของ HO-1

effects of cistanche improve immunity (11)

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. วัสดุ

ซื้อจากสถาบัน Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) และเซรั่มจากวัวในครรภ์จาก Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA) สารเคมีทั้งหมดได้มาจาก Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) แอนติบอดีหลักที่ต่อต้าน iNOS, สารต้าน- -แอกติน, แอนติ-p65 และแอนติ-HO-1 ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ (ซานตาครูซ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา); และแอนติบอดีทุติยภูมิต้านกระต่ายและแอนตี้เมาส์จากเมอร์ค

(บิลเลริกา, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา). ชุดทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) สำหรับ PGE, IL-6 และ TNF- ถูกซื้อจาก R&DSystems Inc. (มินนิอาโปลิส มินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) การแยกเดี่ยวและการกำหนดโครงสร้างของสารประกอบ 11 ชนิดจาก Morus alba ได้รับการอธิบายไว้ที่อื่น [19-21]

4.2. การทดสอบการเพาะเลี้ยงเซลล์และความมีชีวิต

เซลล์ BV2 และ RAW264.7 ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 5× 105 เซลล์/มล. ใน RPMI 1640 ที่เสริมด้วยยาปฏิชีวนะ 1 เปอร์เซ็นต์ (เพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน) และ FBS ที่ไม่ใช้ความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาในคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ที่มีความชื้น โดยมีบรรยากาศในอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์ ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [52]

4.3. การวัด NO Production

การผลิตไนไตรต์ ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายที่เสถียรของ NO ออกซิเดชัน วัดเป็นตัวบ่งชี้การผลิต NO ในเซลล์ โดยสังเขป ความเข้มข้นของไนไตรต์ในตัวกลางที่ปรับสภาพถูกกำหนดโดยใช้วิธีการที่อิงตามปฏิกิริยา Griess [53] รายละเอียดของการทดสอบได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [54]

4.4. PGE2 Ass4y/

ความเข้มข้นของ PGEz ในแต่ละตัวอย่างถูกวัดโดยใช้ชุดเครื่องมือ ELISA ที่มีจำหน่ายทั่วไป ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [55]

4.5.การวัด IL-6 และ TNF-a Levels

อาหารเลี้ยงเชื้อถูกรวบรวมเพื่อกำหนดระดับของ IL-6 และ TNF- โดยใช้ชุดเครื่องมือที่มีขายทั่วไป (BioLegend, San Diego, CA, USA) การทดสอบดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยย่อ เซลล์ BV2 และ RAW264.7 ถูกเพาะในจานเพาะเลี้ยง 24-หลุมที่ความหนาแน่น 20× 10 เซลล์/หลุม หลังจากการฟักไข่ ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมและใช้ในการวัดความเข้มข้นของ IL-6 และ TNF- ด้วยชุดเครื่องมือ ELISA

4.6. การวิเคราะห์ Western Blot

เซลล์ BV2 และ RAW264.7 แบบอัดเม็ดถูกล้างด้วย PBS และสลายในบัฟเฟอร์ RIPA ปริมาณโปรตีนที่เท่ากันถูกหาปริมาณโดยใช้ความเข้มข้นของสารย้อมสีสำหรับการทดสอบโปรตีนที่ได้จากห้องปฏิบัติการ Bio-Rad (#5000006; Hercules, CA, USA) ผสมในบัฟเฟอร์การโหลดตัวอย่าง และแยกโดยใช้ SDS-PAGE จากนั้นโปรตีนที่แยกจากกันถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนของไนโตรเซลลูโลส การจับที่ไม่จำเพาะกับเมมเบรนถูกปิดกั้นโดยการฟักไข่ในสารละลายนมพร่องมันเนย เยื่อหุ้มเซลล์ถูกฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (ซึ่งทั้งหมดถูกใช้ที่ 1:1000) ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน และจากนั้นทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (ซึ่งทั้งหมดถูกใช้ที่ 1:5000) (มิลลิพอร์) [ 31].

4.7.NF-xB การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นและการวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

เพื่อศึกษาการแปลตำแหน่งของเซลล์ NF-kB, BV2 และ RAW264.7 ถูกเพาะเลี้ยงบนสไลด์แชมเบอร์ Lab-Tek II และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารประกอบเป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนการกระตุ้น LPS(0.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชม. จากนั้นเซลล์ถูกตรึงในฟอร์มาลินและซึมผ่านด้วยอะซีโตนเย็นและสอบสวนด้วยแอนติบอดีต้าน p65 (1:200) ที่ตามด้วยการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลากฟลูออเรสซินไอโซไทโอไซยาเนต (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen) เพื่อแสดงภาพนิวเคลียส เซลล์ถูกบำบัดด้วย 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ 4'6-ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลลินโดล (DAPI เป็นเวลา 30 นาที ล้างด้วย PBS เป็นเวลา 5 นาที และบำบัดด้วย VectaShield 50 ไมโครลิตร (ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์ เบอร์ลินเกม แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) เซลล์สีถูกมองเห็นและได้ภาพมาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) [31].

4.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองอิสระสามการทดลอง การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณของทูคีย์ ใช้เพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างทั้งสามกลุ่ม การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 5.01, GraphPad Software Inc., ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

5. สรุปผลการวิจัย

Kuwanon T และ sanggenon A มีฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์ BV2 และ RAW264.7 ที่เกิดจาก LPS โดยยับยั้งการผลิต NO, PGE2, IL-6 และ TNF- และการแสดงออกของ iNOS และ COX{{8} }. ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าผลการยับยั้งเหล่านี้ถูกสื่อกลางผ่านการยับยั้งวิถี NF-KB โดยการบำบัดด้วย kuwanon T และ sanggenon A นอกจากนี้ สารประกอบเหล่านี้ยังเหนี่ยวนำการแสดงออกของ H2O-1 โดยกระตุ้นการเคลื่อนย้ายของ Nrf2 เข้าไปในนิวเคลียส . การค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ HO-1 ที่เหนี่ยวนำโดย kuwanon T และ sanggenon A สัมพันธ์กับผลในการปราบปรามการอักเสบที่เกิดจาก LPS เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราให้หลักฐานว่า Kuwana T และ sanggenon A ที่แยกได้จาก M. Albu อาจเป็นผู้ที่เสนอชื่อในการพัฒนายารักษาโรคและป้องกันโรคเกี่ยวกับระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์และโรคพาร์กินสัน


คุณอาจชอบ