การขาด Klotho เพิ่มความเข้มข้นของการแสดงออกของ IFN- / ผ่านการควบคุม RIG-I ในไต
Mar 25, 2022
เชิงนามธรรม ภาวะขาดออกซิเจนเป็นทางเดินร่วมไปสู่ความก้าวหน้าของระยะสุดท้ายโรคไต.ยีน I(RIG-I) ที่เหนี่ยวนำกรดเรติโนอิก I(RIG-I) เข้ารหัสเฮลิเคส RNA ที่ตรวจจับไวรัสรวมถึง SARS-CoV2 ซึ่งมีหน้าที่ในการผลิตอินเตอร์เฟอรอน (IFN)-a/ เพื่อป้องกันการแพร่กระจายของการติดเชื้อไวรัส เมื่อเร็ว ๆ นี้ การกระตุ้น RIG-l ถูกพบภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน และการขาด klotho แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น RIG-I เข้มข้นขึ้นในสมองของหนูเมาส์ อย่างไรก็ตาม บทบาทของการทำงานเหล่านี้ในการอักเสบของไตยังคงเข้าใจยาก ในที่นี้สำหรับการศึกษาในหลอดทดลอง การแสดงออกของ RIG-I และ IFN-a/ ถูกตรวจสอบในหนูแรทปกติไต(NRK)-52เซลล์ E ที่ฟักตัวภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน (1 เปอร์เซ็นต์ O2) ต่อมา siRNA ที่กำหนดเป้าหมาย RIG-I หรือ siRNA ที่ถูกรบกวนถูกทรานส์เฟกไปในเซลล์ NRK52E เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ RIG-I และ IFN-a/ß ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน นอกจากนี้เรายังตรวจสอบระดับการแสดงออกของ RIG-I และ IFN-a/ ใน 33humanไตตัวอย่างชิ้นเนื้อที่วินิจฉัยว่าเป็นโรคไต lgA สำหรับในการศึกษาของ Vivo เราทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนในไตโดยยึดหลอดเลือดแดงไตเป็นเวลา 10 นาทีในหนูประเภท wild-type (หนู WT) และหนู Klotho-knockout (KIT/หนู) การฟักตัวภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มการแสดงออกของ RIG-lI และ IFN-a/ ในเซลล์ NRK52E การปรับเพิ่มของพวกมันถูกยับยั้งในเซลล์ NRK52E ที่ทรานส์เฟกด้วย siRNA ที่มุ่งเป้า RIG-I ในผู้ป่วยที่เป็นโรคไต IgA การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีของตัวอย่างชิ้นเนื้อไตเปิดเผยว่าการแสดงออกของ RIG-I มีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ IFN-a/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively).="" the="" expression="" levels="" of="" rig-i="" and="" ifn-a/β="" were="" upregulated="" in="">ไตของหนูเมาส์ WT ที่ขาดออกซิเจนและการปรับเพิ่มเพิ่มเติมถูกสังเกตพบในหนูเมาส์ที่ขาดออกซิเจน การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการขาดออกซิเจนทำให้เกิดการแสดงออกของ IFN-a/ ผ่านการควบคุม RIG-I ที่เพิ่มขึ้น และการขาด klotho นั้นทำให้การแสดงออกที่เกิดจากการขาดออกซิเจนรุนแรงขึ้นในไต
คำสำคัญ:โรคไต; เซลล์ไต การเปลี่ยนไต; ความเสียหายของไต; ไต
CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต
บทนำเรื้อรังโรคไต(CKD) ส่งผลกระทบต่อผู้คน 697.5 ล้านคนทั่วโลกในปี 2560 [1] ดังนั้นจึงเป็นที่ยอมรับกันดีว่าเป็นปัญหาด้านสุขภาพที่สำคัญ เพื่อชะลอการลุกลามของ CKD จะใช้สารยับยั้งของวิถีทางระบบ renin-angiotensin-aldosterone (RAAS) ในสภาวะทางคลินิก [2,3] อย่างไรก็ตาม ผลประโยชน์ของพวกเขามีจำกัด และผู้ป่วยจำนวนมากต้องการการบำบัดทดแทนไตในที่สุด[4] ในทางพยาธิวิทยา การอักเสบเรื้อรังและพังผืดคั่นระหว่างหน้าเป็นลักษณะทั่วไปของ CKD โดยไม่คำนึงถึงโรคหลัก [5] แม้ว่าการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต (TGF)- 1 จะมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาของพังผืดคั่นระหว่างหน้า [6-8] การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการแทรกซึมของเซลล์อักเสบมีหน้าที่ในการผลิต TGF{{12} } [9]. การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการอักเสบเป็นเหตุการณ์ต้นน้ำของการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้า และการอักเสบนั้นเป็นเป้าหมายในการรักษาสำหรับ CKD
ภาวะขาดออกซิเจนเป็นภาวะที่ออกซิเจนไม่เพียงพอทำให้เป็นเนื้อเยื่อ เนื่องจากเซลล์ตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจน ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน (HIF) มีบทบาทสำคัญในการป้องกันความเสียหายของเนื้อเยื่อ [10-12] อย่างไรก็ตาม ภาวะขาดออกซิเจนอย่างรุนแรงทำให้เกิดโรคหลอดเลือดเฉียบพลัน เช่น โรคหลอดเลือดสมอง [13] โรคหลอดเลือดหัวใจตีบ[14] และโรคหลอดเลือดแดงส่วนปลาย [15] เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีรายงานว่าภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรัง เช่น ภาวะหยุดหายใจขณะนอนหลับ มีส่วนทำให้เกิดโรคต่างๆ [16] ว่าด้วยเรื่องไตมีรายงานว่าภาวะขาดออกซิเจนรุนแรงขึ้นตามความก้าวหน้าของระยะ CKD และปัจจุบันถือว่าเป็นพยาธิสรีรวิทยาทั่วไปที่นำไปสู่ระยะสุดท้ายโรคไต[17]. ดังที่ได้กล่าวมาแล้วการอักเสบถือเป็นเหตุการณ์ต้นน้ำ,ดังนั้นกลไกที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนทำให้เกิดการอักเสบควรได้รับการชี้แจงในระดับโมเลกุล การอักเสบมีลักษณะเฉพาะด้วยความเจ็บปวด ความร้อน รอยแดง บวม และสูญเสียการทำงาน[18] อย่างไรก็ตาม โดยพื้นฐานแล้วจะทำหน้าที่กำจัดสาเหตุเบื้องต้นของการบาดเจ็บของเซลล์ และเพื่อขจัดเซลล์ที่เป็นเนื้อตายและเนื้อเยื่อที่เสียหาย ไม่ว่าในกรณีใด การอักเสบไม่ใช่การตอบสนองที่เฉพาะเจาะจง และภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติถือว่ามีส่วนร่วมในกระบวนการเริ่มต้นของการอักเสบเป็นหลักผ่านการผลิตอินเตอร์เฟอรอน (IFN)- / [19] ในบรรดาปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด ยีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดกรดเรติโนอิก I (RIG-I) มีหน้าที่ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อไวรัส[20. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มการควบคุมการแสดงออกของ RIG-I ในสมองและตับ ส่งผลให้มีการผลิต IFN- / [21,22] อย่างไรก็ตาม บทบาทของการขาดออกซิเจนในการแสดงออกของ RIG-I-mediated ของ IFN- /B ในไตยังคงเข้าใจยาก
Klotho ได้รับรายงานเป็นครั้งแรกว่าเป็นโปรตีนต่อต้านวัย [23] แท้จริงแล้วหนูที่ขาดโคลโทจะมีอายุขัยสั้นลงพร้อมกับฟีโนไทป์ที่คล้ายกับอายุของมนุษย์ ในทางตรงกันข้าม หนูดัดแปรพันธุกรรม klotho แสดงอายุขัยที่ยาวนานขึ้น [24] ในแง่ของผลกระทบต่อ renoprotective พบว่าการขาด klotho ทำให้ความเสียหายของไตรุนแรงขึ้นในแบบจำลองการทดลองของโรคไตในขณะที่ klotho overexpression หรือการบริหารของโปรตีน klotho ทำให้มันดีขึ้น [25] โปรตีน Klotho มีอยู่สามรูปแบบ: เมมเบรน สารคัดหลั่ง และโคโตภายในเซลล์ ในกลุ่มเหล่านี้ มีรายงานว่าโคลโทภายในเซลล์ยับยั้งการแสดงออกของ RIG-I พร้อมกับการอักเสบ [26] ซึ่งเพิ่มความเป็นไปได้ที่การขาดโคลโทจะทำให้การควบคุม RIG-I และ IFN- / ในไตการค้นพบนี้ทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าการแสดงออกของ RIG-I และ IFN- / เพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนในสายเซลล์ของเซลล์ท่อไตและการควบคุมที่เหนี่ยวนำให้เกิดการขาดออกซิเจนนั้นรุนแรงขึ้นในหนูเมาส์ที่มีโครโธน็อกเอาต์ (KI-7 หนู) ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าการขาดออกซิเจนควบคุม RIG-I และ IFN-a/ ในหนูปกติไตเซลล์ (NRK-52E) และไตของหนูเมาส์ เรายังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่า RIG-I มีหน้าที่ในการควบคุม IFN-c/ B ที่เกิดจากภาวะออกซิเจนมากเกินไป ในมนุษย์จริงไตตัวอย่างจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไต IgA พบว่าการแสดงออกของ RIG-I มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ IFN- / สุดท้ายนี้ การปรับเพิ่มจากภาวะขาดออกซิเจนของ RIG-I และ IFN- / ถูกทำให้รุนแรงขึ้นในหนู KI-/- การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการขาด klotho ทำให้การแสดงออกของ IFN- ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนรุนแรงขึ้น / ผ่านการควบคุม RIG-I ในไต
CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต
วัสดุและวิธีการ สัตว์หนู C57BL/6J wild-type(WT) เพศผู้ (อายุ 8 สัปดาห์และน้ำหนัก20-25 ก.) ได้มาจาก Charles River Laboratories Japan (โยโกฮาม่า ประเทศญี่ปุ่น) หนูตัวผู้ (อายุ 6 สัปดาห์และน้ำหนักประมาณ 15 กรัม) ถูกซื้อมาจาก CLEA Japan, Inc. หนูเหล่านี้ถูกจัดเก็บไว้ในสถาบันสัตวศาสตร์ในห้องปฏิบัติการของมหาวิทยาลัยฮิโรชิม่า (ฮิโรชิมา ประเทศญี่ปุ่น) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดย คณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัยฮิโรชิมา (หมายเลขใบอนุญาต: A19-158 และ 2019-156) และดำเนินการตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH) เกี่ยวกับการใช้สัตว์ทดลอง หนู WT และ KI-'mice ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุมหรือกลุ่มที่ขาดออกซิเจน (n=5 ในแต่ละกลุ่ม) ภาวะขาดออกซิเจนเกิดขึ้นจากการยึดหลอดเลือดแดงไตซ้ายเป็นเวลา 10 นาทีภายใต้การดมยาสลบ (เมเดโทมิดีน 0.3 มก./กก., มิดาโซแลม 4 มก./กก. และบิวโทฟานอล 5 มก./กก.)[28] หนูในกลุ่มควบคุมได้รับการผ่าตัดหลอกซึ่งเป็นขั้นตอนเดียวกับในกลุ่มที่ขาดออกซิเจน ยกเว้นในกรณีที่ไม่มี ligation ของหลอดเลือดแดง หลังจากขาดออกซิเจน 10 นาที หนูจะถูกการุณยฆาตโดยการเจาะหัวใจและไตถูกเก็บเกี่ยว ภาวะขาดออกซิเจนของไตได้รับการยืนยันโดย western blotting สำหรับการแสดงออกของ erythropoietin (รูปที่ S1)
การเพาะเลี้ยงเซลล์หนูปกติไต(NRK)-52E เซลล์ถูกซื้อมาจาก American Type Culture Col. lection (Manassas, VA, USA)NRK-52E เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน RPMI-1640สื่อที่มีทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มวัว (FBS) (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) และ penicillin/streptomy-cin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) เซลล์เหล่านี้ถูกเพาะลงในจานเพาะเลี้ยงขนาด 10 ซม. หลังจากเติบโตไปสู่การรวมตัวกันย่อย เซลล์ถูกบ่มใน 1 เปอร์เซ็นต์ O2Modular Incubator Chamber (MIC 101; Billups-Rothenberg, San Diego, CA, USA) เป็นเวลา 30,60,90 และ 120 นาที lysates ทั้งเซลล์ถูกเตรียมและอยู่ภายใต้ สู่การวิเคราะห์ Western blot ภาวะขาดออกซิเจนของ NRK-52E เซลล์ได้รับการยืนยันโดย western blotting สำหรับการแสดงออกของ HIF-1 (S2 รูปที่)
การเปลี่ยนถ่าย RIG-I siRNAเซลล์ NRK52E ถูกถ่ายด้วย 20 nM siRNA ที่กำหนดเป้าหมาย RIG-I (RSS311418: Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) หรือ siRNA ควบคุมเชิงลบ (4390843; Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) โดยใช้ Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจาก 43-45 ชั่วโมง เซลล์เหล่านี้บางเซลล์ถูกบ่มภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน (1 เปอร์เซ็นต์ O) เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อประเมิน RIG-I เซลล์อื่นถูกเปลี่ยนเป็นอาหารสด หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์เหล่านี้ถูกบ่มภายใต้การแบ่งแยกออกซิเจน (1 เปอร์เซ็นต์ O2) เป็นเวลา 60 และ 120 นาทีเพื่อยืนยันการปราบปรามของ IFN-a/ .Whole-cell lysates ถูกเตรียมและอยู่ภายใต้การวิเคราะห์ western blot
การวิเคราะห์ Western blotการเก็บตัวอย่างและการทำ Western blotting ได้ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[29] แอนติบอดีโมโนโคลนัล anti-RIG-I ของกระต่าย(#3743S; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), แอนติบอดีโพลีโคลนอลต้าน IFN- 11 กระต่าย (bs-7023R; Bioss Anti-bodies, Woburn, แมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา), กระต่ายโพลีโคลนัลแอนติ-IFN- แอนติบอดี (GTX37658; GeneTex, เออร์ไวน์, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา), แอนติบอดีโมโนโคลนัลต้าน RIG-I ของกระต่าย (=700366; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), โพลีโคลนัลกระต่าย แอนติบอดีต้าน IFN- 2 (ab193055; Abcam, Cambridge, UK), แอนติบอดีโพลีโคลนัล anti-IFN- ของกระต่าย (PA5-20390; Invitrogen), โมโนโคลนัลแอนติบอดีต่อมนุษย์ klotho แอนติบอดีของหนู (KO603; TransGenic, ฟุกุโอกะ , ญี่ปุ่น), โมโนโคลนัลแอนติ- -แอคตินแอนติบอดีของหนูเมาส์ (A5316; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) และโมโนโคลนัลต้าน- -ทูบูลินแอนติบอดีของหนูเมาส์ (T9026; Sigma-Aldrich) ถูกใช้ เป็นแอนติบอดีหลัก ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกตแพะต้านกระต่ายอิมมูโนโกลบูลิน G(ดาโก, กลอสตรัพ, เดนมาร์ก) และอิมมูโนโกลบูลินต้านเมาส์ของแพะ (ดาโก) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ SuperSignal West Dura และระบบ Pico (Thermo Fisher Scientific) ถูกใช้เพื่อตรวจจับสัญญาณ ความเข้มของแต่ละแถบวัดโดยซอฟต์แวร์ ImageJ (เวอร์ชัน 1.47y; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) และปรับให้เป็นมาตรฐานจนถึงระดับของ -actin หรือ -tubulin
CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต
การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของเนื้อเยื่อไตของหนูเมาส์การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีได้ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] ในฐานะที่เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิ ผลิตภัณฑ์ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: แอนติบอดีโมโนโคลนัลแอนติ-RIG-I ของกระต่าย(#700366; Invitrogen), แอนติบอดีโพลีโคลนัลแอนติ-IFN- 2 ของกระต่าย (ab193055; Abcam), โพลีโคลนัลแอนติ-IFN- แอนติบอดีสำหรับกระต่าย ( PA5-20390; Invitrogen) และโมโนโคลนัลแอนติ-ฮิวแมนโคลโทแอนติบอดีของหนูแรท(KO603; TransGenic).RIG-I-,IFN-a/ -, และบริเวณที่เป็นบวกของโคลโทถูกหาปริมาณเป็นค่าเฉลี่ยของ 20 ฟิลด์ที่เลือกแบบสุ่มด้วย ซอฟต์แวร์ ImageJ
การเก็บตัวอย่างทางคลินิกและคำชี้แจงจริยธรรมตัวอย่างไตได้รับจากการตรวจชิ้นเนื้อไตที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยฮิโรชิมาระหว่างเดือนสิงหาคม 2014 ถึงพฤศจิกายน 2559 จากผู้ป่วย 33 รายที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไต IgA การศึกษานี้ยึดตามหลักการที่รวมอยู่ในปฏิญญาเฮลซิงกิและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยฮิโรชิมา (E-1718) ได้รับความยินยอมตามข้อมูลในรูปแบบของการเลือกไม่ใช้บนเว็บไซต์ (httns:/inzounaika Hiroshima-uaciplresearchl opt out.html)
การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของเนื้อเยื่อไตของมนุษย์การสร้างภูมิคุ้มกันได้ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] แอนติบอดีหลักต่อไปนี้ถูกใช้: แอนติบอดีโมโนดอนอลต้าน RIG-I ของกระต่าย(#700366; Invitrogen), โมโนโคลนัลแอนติ-IFN- แอนติบอดีของหนูเมาส์ (sc-373757; Santa Cruz Biotechnology, Dallas,TX, USA) และกระต่าย polyclonal anti-IFN- แอนติบอดี(PA5-20390; Invitrogen), RIG-I- และ IFN-a/ -positive area ถูกหาปริมาณเป็นค่าเฉลี่ยของห้าฟิลด์ที่ถูกสุ่มเลือกแบบสุ่มด้วยซอฟต์แวร์ Image]
การวิเคราะห์ทางสถิติผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) คำนวณความสัมพันธ์โดยใช้การวิเคราะห์การถดถอยแบบไม่มีตัวแปร สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ เราใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบ t ของนักเรียนด้วยการแก้ไข Bonferroni วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างทั้งสองกลุ่มโดย Student's t-test.P<0.05 was="" considered="" as="" statistically="">
ผลลัพธ์:ภาวะขาดออกซิเจนจะควบคุม RIG-I และ IFN-a/ ในเซลล์หนูของเซลล์เยื่อบุผิวของไตเพื่อระบุผลของการขาดออกซิเจนต่อการแสดงออกของ RIG-I และ IFN-a/ ในหลอดทดลอง เราทำการวิเคราะห์ western blot สำหรับโปรตีนเหล่านี้ในเซลล์ NRK-52E ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน ระดับโปรตีนของ RIG-I สูงสุดที่ 30 นาที แล้วค่อยๆ ลดลงในเซลล์ NRK-52E ภายใต้การกระตุ้นด้วยออกซิเจน (รูปที่ 1A) ระดับ IFN- /ß เพิ่มขึ้นและสูงสุดที่ 120 และ 60 นาทีตามลำดับใน NRK -52E เซลล์ที่มีการกระตุ้นด้วยออกซิเจน (Eig 1Band1C) การล้มลงของ RIG-I ช่วยลดการแสดงออกของ IFN-a/ ในเซลล์ NRK52E ที่มีภาวะขาดออกซิเจน เพื่อประเมินว่า RIG-I มีส่วนร่วมในการแสดงออกของ IFN- / ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน เราตรวจสอบการแสดงออกของพวกมันในเซลล์ NRK-52E ที่ถ่ายด้วย RIG-I siRNA หรือเชิงลบ
ควบคุม siRNA อันดับแรก เรายืนยันผลของการล้มลงของ RIG-siRNA ในเซลล์ NRK-52E Western blotting สำหรับ RIG-I เปิดเผยว่า RIG-I siRNA ลดการแสดงออกของ RIG-I ในเซลล์ NRK-52E ไม่ว่าจะมีหรือไม่มีการกระตุ้นด้วยออกซิเจน (Eig 2A) ต่อไปเราจะตรวจสอบบทบาทของการเพิ่มการควบคุม RIG ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน -I ในการแสดงออกของIFN- /B ในเซลล์ NRK-52E โดยใช้ RIG-I siRNA หรือกลุ่มควบคุมเชิงลบ RIG-siRNA ยับยั้งการแสดงออกของ IFN- / ใน NRK-52Ecells (Eig2Band2C)
RIG-I มีความสัมพันธ์กับระดับการแสดงออกของ IFN- / ในตัวอย่างไตของมนุษย์ของ IgA nephropathyเราตรวจสอบว่าระดับการแสดงออกของ RIG-Iis เกี่ยวข้องกับ IFN-a/ ในตัวอย่างชิ้นเนื้อไตที่ได้รับจากผู้ป่วยโรคไต IgA (n=33) หรือไม่ ลักษณะทางคลินิกโดยละเอียดของผู้ป่วยเหล่านี้แสดงไว้ในตาราง S1 การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับ RIG-I และ IFN- / แสดงการแสดงออกของพวกมันในโกลเมอรูไลและท่อไต (รูปที่ 3A) และแสดงให้เห็นว่า RIG-I มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ IFN-o/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively)(eig="">
ภาวะขาดออกซิเจนไม่เปลี่ยนระดับการแสดงออกของ klotho ใน WT และ K1-/ miceเพื่อตรวจสอบผลของการกระตุ้นด้วยออกซิเจนต่อการแสดงออกของโคลโทในร่างกาย เราได้ตรวจสอบการแสดงออกของมันใน WT และ K-/หนู โดยมีหรือไม่มีการกระตุ้นด้วยออกซิเจนน้อยกว่า 10 นาที Western blotting และ immunohistochemical staining เปิดเผยว่าการแสดงออกของ klotho ไม่ได้แตกต่างกันระหว่างหนู WT ที่มีและไม่มีออกซิเจน และการแสดงออกของ klotho นั้นไม่พบใน KIT/หนู โดยไม่คำนึงถึงการมีหรือไม่มีการกระตุ้น hypoxic (Eig 4Aand4B) ในหนู WT klotho โปรตีนถูกย้อมในไซโทพลาสซึมของเซลล์หลอด (รูปที่ 4B)การแสดงออกของ RIG-I เข้มข้นขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนใน K~miceมีรายงานว่าโคลโทภายในเซลล์สามารถยับยั้งการอักเสบที่เกิดจาก RIG-I ดังนั้นเราจึงตรวจสอบระดับการแสดงออกและการแปล RIG-I ในภาวะขาดออกซิเจนไตของ WT และ Kl−/− หนู Western blotting เปิดเผยว่าการแสดงออกของ RIG-I เพิ่มขึ้นในหนูเมาส์ WT ที่มีการกระตุ้นด้วยออกซิเจนต่ำ และมันรุนแรงขึ้นในหนู Kl−/− (รูปที่ 5A) อิมมูโนฮิสโตเคมีแสดงให้เห็นว่าพื้นที่ที่เป็นบวกของ RIG-I เพิ่มขึ้นในหนูเมาส์ Kl−/− ซึ่งคล้ายกับผลลัพธ์ที่ได้จากการซับแบบตะวันตก (รูปที่ 5B)
IFN- ได้รับการควบคุมภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนใน KI--miceเพื่อระบุผลกระทบของการขาดออกซิเจนต่อการแสดงออกของ -a ใน wvo เราตรวจสอบระดับการแสดงออกและการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นใน hypoxic WT และ KI-mice Western blotting เปิดเผยว่าการแสดงออกของ IFN- เพิ่มขึ้นในหนูเมาส์ WT ที่มีการกระตุ้น hypoxic และได้รับการควบคุมเพิ่มเติมในหนูเมาส์ (รูปที่ 6A) การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีคอลยังเผยให้เห็นว่าบริเวณที่เป็นบวกของ IFN- -ส่วนใหญ่สังเกตพบในเซลล์รูปท่อ และระดับการแสดงออกของ IFN- แสดงแนวโน้มเดียวกันกับในการซับแบบตะวันตก (รูปที่ 6B)
IFN- เพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนใน K1T-/miceนอกจาก IFN-c แล้ว เราตรวจสอบระดับการแสดงออกและการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ IFN-Bin hypoxic WT และหนูเมาส์ จากผลลัพธ์ของ Western blotting การแสดงออกของ IFN- เพิ่มขึ้นในหนูเมาส์ WT ที่มีการกระตุ้นด้วยออกซิเจนต่ำ ในขณะที่การเพิ่มขึ้นอีกถูกสังเกตพบใน KIT/หนู (รูปที่ 7A) เมื่อหาปริมาณพื้นที่บวกของ IFN- - ระดับการแสดงออกของ IFN- เพิ่มขึ้นใน KI-/-หนูเมาส์เมื่อเปรียบเทียบกับสิ่งนั้นในหนูเมาส์ WT'(รูปที่ 7B)
สังเกตพบในหนูทดลอง Kl−/− โดยไม่คำนึงถึงการกระตุ้นด้วยออกซิเจน เราแสดงให้เห็นว่าการขาดออกซิเจนในไตเพิ่มการแสดงออกของ RIG-I และ IFN- / และการแสดงออกของพวกมันนั้นรุนแรงขึ้นอีกในหนูเมาส์ Kl−/− การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการขาด klotho ทำให้การแสดงออกของ RIG-I ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนรุนแรงขึ้น ส่งผลให้มีการควบคุม IFN- / มากขึ้น เราพบว่าการแสดงออกของ RIG-I และ IFN- / ที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน ในการศึกษาทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย เพื่อปรับให้เข้ากับสภาวะขาดออกซิเจน HIF จะเสถียรและทำหน้าที่เป็นปัจจัยการถอดรหัส [30] ในการศึกษาก่อนหน้านี้ มีรายงานว่า RIG-I เกี่ยวข้องกับโมเลกุลที่เหนี่ยวนำด้วย HIF อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถระบุได้ว่า RIG-I เป็นเอฟเฟกต์ดาวน์สตรีมของ HIF นอกจากการติดเชื้อไวรัสแล้ว การแสดงออกของ RIG-I จะเพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน [31] แม้ว่าการศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าภาวะขาดออกซิเจนส่งผลต่อเซลล์เยื่อบุผิวท่อ เซลล์บุผนังหลอดเลือด เพอริไซต์ ไฟโบรบลาสต์ เซลล์อักเสบ และเซลล์ต้นกำเนิดในไต [32,33] เราแสดงให้เห็นว่าการควบคุม RIG-I ส่วนใหญ่พบในเซลล์เยื่อบุผิวท่อในหนูทดลอง ด้วยการกระตุ้น hypoxic เช่นเดียวกับในผู้ป่วยที่เป็นโรคไต IgA เนื่องจากท่อไตถือเป็นจุดเข้าของเชื้อโรคที่เกี่ยวกับท่อปัสสาวะ [34] RIG-I อาจมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน การตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาตินั้นไม่เพียงกระตุ้นการทำงานของจุลินทรีย์เท่านั้น แต่ยังกระตุ้นสัญญาณเตือนจากเซลล์ที่เสียหาย บาดเจ็บ หรือเครียดอีกด้วย [35] ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ RIG-I ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนมีส่วนร่วมในการผลิต IFN- / ในเซลล์ของหนูของท่อไต ข้อมูลที่นำเสนอแนะนำว่าการแสดงออกของ RIG-I ทำหน้าที่เป็นระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของ cytosol เพื่อตอบสนองต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจนและการติดเชื้อไวรัส การศึกษาก่อนหน้านี้อธิบายว่าภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มขึ้นในระหว่างการพัฒนาของ CKD โดยไม่คำนึงถึงโรคปฐมภูมิและการขาดออกซิเจนนั้นมีส่วนทำให้เกิดความเสียหายต่อไต [17] ในการศึกษาทางคลินิกโดยใช้การถ่ายภาพด้วยคลื่นสนามแม่เหล็กที่ขึ้นกับระดับออกซิเจนในเลือด ภาวะขาดออกซิเจนของไตไม่เพียงแต่ทวีความรุนแรงขึ้นในระหว่างที่ CKD ลุกลามเท่านั้น แต่ยังคาดการณ์ถึงความก้าวหน้าดังกล่าวอีกด้วย [36] ดังนั้น ภาวะขาดออกซิเจนในปัจจุบันจึงถือเป็นเส้นทางสู่ความก้าวหน้าของระยะสุดท้ายโรคไตดังนั้นการอักเสบที่เกิดจากการขาดออกซิเจนจึงควรเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคเพื่อยับยั้งการลุกลามของ CKD
เราแสดงให้เห็นว่าการขาดออกซิเจนทำให้เกิดการผลิต IFN- / ซึ่งจัดอยู่ในประเภทที่ 1 อินเตอร์เฟอรอน โดยทั่วไปแล้ว interferons ชนิดที่ 1 ทำหน้าที่ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัส [37] และเพื่อต้านทานการกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจากการขาดออกซิเจน [21,22] อย่างไรก็ตาม การศึกษาที่ดำเนินการจนถึงปัจจุบันได้รายงานว่าอินเตอร์เฟอรอนชนิดที่ 1 นำไปสู่การกระตุ้นเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ ซึ่งมีบทบาทสำคัญในไม่เพียงแต่การกำจัดเซลล์ที่ติดไวรัสเท่านั้น แต่ยังรวมถึงความเสียหายของเนื้อเยื่ออีกด้วย [38] อันที่จริง จากการศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า RIG-I มีส่วนทำให้เกิดการอักเสบในอวัยวะต่างๆ เช่น ปอด [39],ไต[40] และระบบประสาท [21]. ในการศึกษานี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าการควบคุมที่เพิ่มขึ้นของ RIG-I ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนมีหน้าที่ในการผลิต IFN- / ดังนั้น interferons ชนิดที่ 1 อาจทำงานเพื่อป้องกันการติดเชื้อในภาวะขาดออกซิเจน แต่จะเป็นอันตรายภายใต้สภาวะที่ไม่ติดเชื้อ นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า นอกเหนือจาก interferons ชนิดที่ 1 แล้ว RIG-I ยังเกี่ยวข้องกับการผลิตไซโตไคน์ต่างๆ เช่น IL-1 , IL- 6 และ TNF- [41] เนื่องจากไซโตไคน์เหล่านี้ทำให้เกิดความเสียหายต่อเนื้อเยื่อ การปรับเพิ่มของ RIG-I ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนอาจมีส่วนร่วมในการลุกลามของ CKD เราแสดงให้เห็นว่าการขาด klotho ช่วยเพิ่มการแสดงออกของ RIG-I ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน ซึ่งมาพร้อมกับการควบคุม IFN- / มีรายงานว่าการแสดงออกของ Klotho ลดลงตามอายุและความก้าวหน้าของ CKD [42,43] ดังนั้นการแสดงออกของ RIG-I อาจถูกควบคุมมากขึ้นในผู้สูงอายุและผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน ซึ่งนำไปสู่การผลิต IFN- / ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น โคลโทมีอยู่สามรูปแบบ—เมมเบรน สารคัดหลั่ง และโคลโทภายในเซลล์—โดยแบบหลังมีหน้าที่ในการยับยั้งการผลิตไซโตไคน์อักเสบที่อาศัย RIG-I [26] ในแง่ของการแปล เราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ klotho ส่วนใหญ่เกิดขึ้นที่เซลล์ท่อไต โดยมีหลักฐานว่าการแสดงออกของ RIG-I นั้นรุนแรงขึ้นส่วนใหญ่ที่เซลล์ท่อไตภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ klotho ที่ลดลงมีส่วนช่วยในการผลิต interferons ชนิดที่ 1 โดยใช้ RIG-I เพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน
CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต
โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่า RIG-I และ IFN- / ในไตของหนูเมาส์และเซลล์ท่อไตของหนูทดลอง และ RIG-I นั้นเกี่ยวข้องกับการเพิ่มการควบคุมของ IFN- / ในหลอดทดลองที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน ในตัวอย่างชิ้นเนื้อไตของผู้ป่วยที่เป็นโรคไต IgA การแสดงออกของ RIG-I มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของ IFN- / สุดท้ายนี้ การแสดงออกของ RIG-I ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนถูกทำให้รุนแรงขึ้นในหนูทดลองที่มีโครโธ-น็อคเอาท์ ควบคู่ไปกับการปรับขึ้นของ IFN- / การแสดงออกที่อาศัย RIG-I ของอินเตอร์เฟอรอนชนิดที่ 1 เพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน และการปรับเพิ่มเพิ่มเติมถูกสังเกตพบในสภาวะของโคลโทดาวน์เรกูเลชัน จากการศึกษาทางคลินิก ภาวะขาดออกซิเจนจะรุนแรงขึ้นด้วยระยะ CKD ขั้นสูง [36] และเป็นการทำนายความก้าวหน้าในระยะยาวของ CKD [36] นอกจากนี้ การแสดงออกของ klotho จะลดลงเมื่อการทำงานของไตลดลง และการลดการแสดงออกของ klotho นั้นสัมพันธ์กับความเสียหายของไต [44] ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าการขาด klotho เพิ่มความเข้มข้นของการแสดงออกของ IFN- ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน / ผ่านการควบคุม RIG-I ในไต และการแสดงออกของ RIG-I นั้นสัมพันธ์กับ IFN- / ในผู้ป่วย IgA nephropathy จริง เมื่อนำการค้นพบนี้ร่วมกัน ทั้งภาวะขาดออกซิเจนและการลด klotho ได้รับการส่งเสริมในระหว่างการพัฒนาของ CKD ดังนั้นการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดจึงเพิ่มขึ้นในผู้ป่วย CKD
