คาร์บอนมอนอกไซด์ (CO) บรรเทาโรคไตจากเบาหวาน (DN) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

ตอนที่Ⅰ: คาร์บอนมอนอกไซด์บรรเทาความชราในโรคไตจากเบาหวานโดยการปรับปรุง autophagy

กุ้ยบิน เมล; ชุนเจี๋ยเจียง; เซี่ยเอ๋อเฉิง; & ที่ al.V

การแนะนำ

โรคไตจากเบาหวาน (DN) เป็นภาวะแทรกซ้อนทางหลอดเลือดจากเบาหวานที่พบได้บ่อยและร้ายแรงที่สุดชนิดหนึ่ง ตามสถิติแล้ว 20 เปอร์เซ็นต์ -40 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่มี DN (โรคไตจากเบาหวาน) จะพัฒนาเป็นโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้าย (ESRD) ในอัตราเร็วกว่าโรคไตอื่น ๆ ถึง 14 เท่า นอกจากนี้ ความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือดที่เพิ่มขึ้นของDN (โรคไตจากเบาหวาน)ผู้ป่วยมีส่วนอย่างมากต่อการตายสูง2การเกิดโรคที่ซับซ้อนของDN (โรคไตจากเบาหวาน)ยังไม่มีความชัดเจนในแนวทางการรักษาที่มีอยู่อย่างจำกัด ดังนั้นจึงเป็นเรื่องเร่งด่วนที่จะระบุสาเหตุของโรคและการรักษาเพื่อป้องกันการสูญเสียการทำงานของไตอย่างต่อเนื่องของ DN (โรคไตจากเบาหวาน).

เซลล์ชราภาพซึ่งมีลักษณะเฉพาะจากการหยุดวงจรของเซลล์อย่างถาวร ได้รับความสนใจอย่างกว้างขวางว่าเป็น 'เซลล์ซอมบี้' เนื่องจากความต้านทานต่อการตายของเซลล์และการผลิตฟีโนไทป์ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SASP) อย่างต่อเนื่อง เซลล์ชราภาพจึงเป็นที่รู้จักมากขึ้นว่าเป็นสาเหตุสำคัญของโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ ความผิดปกติของไตที่เชื่อมโยงกับวัยชรามักพบในDN (โรคไตจากเบาหวาน)ผู้ป่วยและแบบจำลองการทดลอง เช่น หนูที่เหนี่ยวนำให้เกิด STZ (เบาหวานชนิดที่ 1 (T1D)) และหนู db/db(เบาหวานชนิดที่ 2 (T2D)) อย่างสำคัญ การกำจัด p16-เซลล์บวกของหนูสูงวัยทำให้โรคหลอดเลือดตีบดีขึ้น นอกจากนี้ การเคาะ p21 หรือ p27 ในหนูทดลอง T1D ช่วยบรรเทาโปรตีนในปัสสาวะและการขยายตัวของไต ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการชราภาพมีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของDN (โรคไตจากเบาหวาน). อย่างไรก็ตาม กฎเกณฑ์ความชราภาพในDN (โรคไตจากเบาหวาน)ยังคงคลุมเครือ

หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นว่า autophagy ซึ่งเป็นกลไกของการเสื่อมสภาพของเนื้อหาภายในเซลล์เป็นตัวควบคุมความชราภาพที่ถูกต้อง" แม้ว่าจะมีรายงานว่า autophagy ส่งเสริมการได้มาซึ่งฟีโนไทป์การชราภาพ แต่ผลการต่อต้านการชราภาพของ autophagy ก็เป็นที่ยอมรับกันอย่างแพร่หลาย มีรายงานว่า autophagy เพื่อยืดอายุขัยของหนูสูงอายุและแมลงวันผู้สูงอายุ10 จากการศึกษาเพิ่มเติมพบว่าการขจัด Atg7 ทำให้สเต็มเซลล์ชราภาพแย่ลง 11 ที่สำคัญกว่านั้น การลบ Atg5 ทำให้เกิดโปรตีนในปัสสาวะและพังผืดที่กำเริบขึ้นซึ่งเป็นผลการทำงานหลักของไตaging.12.13 ดังนั้น ยาที่กำหนดเป้าหมาย autophagy เพื่อบรรเทาความชราภาพอาจเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มมากที่สุดสำหรับ DN (โรคไตจากเบาหวาน)การป้องกันและรักษา

คาร์บอนมอนอกไซด์ (CO) ที่เกิดจากกระบวนการ catabolism ของ haem โดยเอนไซม์ haem oxygenase เป็นโมเลกุลของก๊าซภายในร่างกาย สิ่งพิมพ์จำนวนหนึ่งเปิดเผยคุณสมบัติต้านการอักเสบ ต่อต้าน apoptotic และป้องกันอื่น ๆ ของ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์) เมื่อทาในปริมาณที่น้อย14 แม้ว่าCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ได้รับการศึกษาอย่างดีเพื่อมอบการป้องกัน renoprotection ให้กับ ischemia-reperfusion หรือไตหนูปลูกถ่าย 15 ผลกระทบและกลไกของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บน DN (โรคไตจากเบาหวาน)ไม่ชัดเจน เมื่อเร็ว ๆ นี้ วรรณกรรมแสดงให้เห็นว่าCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ให้บทบาทการป้องกันเซลล์ในฐานะตัวกระตุ้น autophagy ในเกาะเล็กเกาะน้อยที่ถูกท้าทายโดยภาวะขาดออกซิเจน หนูเมาส์ติดเชื้อ 16 ตัว7และหนูที่อายุมากที่มีภาวะหัวใจหยุดเต้น18 นอกจากนี้ การบริหารให้ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาความชราของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่เกิดจากความเป็นพิษของยา1การค้นพบนี้เห็นได้ชัดว่าช่วยส่งเสริมการไกล่เกลี่ยที่เป็นไปได้ของ autophagy ที่กำหนดเป้าหมายโดย CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)เพื่อบรรเทาความชราภาพ

ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าการสะสมของเซลล์ชราภาพในไตของ DN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูสามารถย้อนกลับได้โดยCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ผ่านการกระตุ้น autophagy ภายหลังการปรับปรุงความผิดปกติของไต เพื่อทดสอบสมมติฐานของเราและสำรวจกลไกที่อยู่เบื้องหลัง เราใช้การบำบัดโมเลกุลการปลดปล่อยคาร์บอนมอนอกไซด์-2 (CORM-2) ในร่างกาย (DN ทดลอง (โรคไตจากเบาหวาน)หนูเมาส์) และในหลอดทดลอง (เซลล์ mesangial ของหนู, เซลล์เยื่อบุผิวท่อของมนุษย์, และพอดไซต์ของมนุษย์)

การทำงานของไต: ผลกระทบของคาร์บอนมอนอกไซด์ (CO) มีผลอย่างไรโรคไตจากเบาหวาน (DN)

Click to Cistanches และผลิตภัณฑ์ Cistanche สำหรับโรคไต

วัสดุและวิธีการ

2.1|การออกแบบการทดลองสัตว์

หนู C57BL/6J เพศผู้อายุแปดสัปดาห์ (แม่น้ำชาร์ลส์) ถูกเก็บไว้ในวงจรแสง/ความมืดมาตรฐาน (12:12 ชั่วโมง) ด้วยอาหารปกติ (ND) หรืออาหารที่มีไขมันสูง (HFD) (พลังงาน 60 เปอร์เซ็นต์จากไขมัน ) เป็นเวลา 16 สัปดาห์ 20 ในสัปดาห์ที่ 17 ของการศึกษา หนูที่เลี้ยงด้วย HFD ได้รับการฉีดในช่องท้องของ STZ (50 มก./กก.) เป็นเวลา 7 วัน ในขณะที่หนูที่มี ND ถูกฉีดด้วยกระสายยา (citrate buffer, pH=4 .5). หนึ่งสัปดาห์หลังการฉีด ระดับน้ำตาลในเลือดของทิ่มแทงถูกวัดสองครั้งในช่วงเวลา 24 ชั่วโมง ต่อไป DN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูที่มีระดับกลูโคส 16.9 มิลลิโมล/ลิตร หรือมากกว่า ถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่มโดยสุ่ม โดยมีสัตว์ 15 ตัวในแต่ละกลุ่ม (DN (โรคไตจากเบาหวาน), DN (โรคไตจากเบาหวาน)บวก CO และ DN (โรคไตจากเบาหวาน)บวก iCO): กลุ่มที่เรียกว่ากลุ่มควบคุม DN และกลุ่มอื่นๆ ที่รักษาด้วยการฉีดเข้าช่องท้อง (สองครั้งต่อสัปดาห์เป็นเวลา 16 สัปดาห์) ของ CORM-2 (3 มก./กก.)หรือ CORM ที่ไม่ถูกต้อง-2 ซึ่งเป็น ผลิตโดยการปล่อยCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)จาก CORM-2 ที่อุณหภูมิห้อง เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการทดลอง หนูทดลองได้รับการดมยาสลบ เก็บตัวอย่างเลือดโดยการสร้างนิวเคลียสของลูกตา และไตถูกเก็บเกี่ยวเพื่อการวิเคราะห์ สัตว์ทั้งหมดได้รับการรักษาตามหลักเกณฑ์ในการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองที่เผยแพร่โดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา และขั้นตอนสำหรับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากสภาคณะกรรมการการดูแลสัตว์ของ Tongji Medical College

2.2|การวิเคราะห์ทางชีวเคมีและเนื้อเยื่อพลาสมา

เลือดครบส่วนและซีรัมที่เก็บรวบรวมถูกเก็บไว้ที่-80 องศาสำหรับการวิเคราะห์ ยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ถูกวัดด้วยชุดทดสอบที่มีจำหน่ายทั่วไป (Jiancheng Bioengineering Institute, China) หลังจากนำไตออกและล้างพื้นผิวด้วยน้ำเกลือ เนื้อเยื่อไตถูกย้อมด้วย hematoxylin-eosin และคราบไตรโครมของ Masson และในที่สุดก็สังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์

2.3|กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

เปลือกนอกของไตชิ้นเล็ก ๆ ได้รับการแก้ไขในกลูตาราลดีไฮด์ (2.5 เปอร์เซ็นต์) และฝังอยู่ใน Araldite เนื้อเยื่อถูกตัดเป็นโพลีเมอร์เป็นส่วนบางเฉียบ (80-100 นาโนเมตร) โดยใช้ ultramicrotome (Leica EM UC7) ชิ้นบาง ๆ บนกริดตาข่ายทองแดงถูกย้อมและสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Tecnai G220 TWIN)

2.4|อีลาสโตกราฟีคลื่นเฉือน

เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาทดลอง หนูทดลองถูกวางยาสลบแล้วส่งไปยังห้องปฏิบัติการอัลตราโซนิก (โรงพยาบาลยูเนียน วิทยาลัยการแพทย์ถงจี้ มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีหัวจง เมืองหวู่ฮั่น ประเทศจีน) สำหรับการทำอีลาสโตกราฟีคลื่นเฉือนโดยใช้ขอบเขตเร็ว ๆ นี้ (จินตนาการเหนือเสียง) โมดูลัสเฉลี่ยของ Young (Eman) ถูกใช้เพื่อวัดความแข็งของเนื้อเยื่อของไต

2.5|SA- -การย้อมด้วยสีกัลวาไนซ์

แช่แข็งไตส่วนและเซลล์ที่เพาะในแผ่นหลุม 6-หลุมถูกใช้เพื่อตรวจหากิจกรรมของ SA- -gal โดยชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ (Beyotime Biotechnology) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต คราบสีน้ำเงินถือเป็นพื้นที่สะสมของเซลล์ในวัยชรา

2.6|PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์สำหรับการแสดงออกของ mRNA

ตามคำแนะนำ (TaKaRa BIO INC) เนื้อเยื่อไต RNA ถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ TRlzol การแสดงออกของ mRNA ถูกหาปริมาณด้วยชุด gRT-PCR ที่เป็นสีเขียวของ TB และไพรเมอร์จำเพาะ (ตารางที่ 1) การแสดงออกของยีนแต่ละตัวได้รับการประเมินด้วยเส้นโค้งมาตรฐานของตัวเอง และระดับ mRNA ของ Gapdh ถูกหาปริมาณเป็นการควบคุมภายในร่างกาย

2.7|Western blotting และ immunoprecipitation

เนื้อเยื่อหรือเซลล์ของไตถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและสลาย จากนั้นจึงหาปริมาณโดยชุดทดสอบโปรตีน BCA (Beyotime Biotechnology) โปรตีนถูกแยกออกและต่อมาถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF (Millipore) หลังจากถูกปิดกั้น เยื่อหุ้มถูกบ่มข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (ตารางที่ 2) หลังจากล้าง เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่สอดคล้องกัน ความหนาแน่นของแถบเป้าหมายแต่ละแถบวัดปริมาณโดยซอฟต์แวร์ Image Pro-Plus 60 และปรับให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH เป็นความหนาแน่นของแสง ขนาดตัวอย่างทั้งหมดของสัตว์หรือเซลล์มีค่ามากกว่าหรือเท่ากับ 3

ไลเซตของเนื้อเยื่อไตถูกปั่นเหวี่ยง (14 000 ก. ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที) และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกล้างล่วงหน้าด้วยเม็ดอะกาโรส A/G โปรตีน 20 ไมโครลิตร เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและบ่มข้ามคืนด้วย Bcl{{6} } หรือแอนติบอดี lgG ของหนูเมาส์ อิมมูโนพรีซิพิเทตถูกล้าง แขวนใหม่ ต้ม และวิเคราะห์โดย Western blot โดยใช้ anti-Beclin-1 (Cell Signaling Technology) และ anti-Bcl-2 (Proteintech) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ .21

ตารางที่ 1 ลำดับไพรเมอร์ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์

2.8|อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

เนื้อเยื่อไตที่ฝังอยู่ในสื่อ OCT ถูกตัดเป็นส่วนแช่แข็งหนา 6-8 ไมโครเมตร หลังจากการปิดกั้นด้วยเซรั่มแพะปกติ 10 เปอร์เซ็นต์ ส่วนต่างๆ ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ วันรุ่งขึ้น เนื้อเยื่อถูกติดฉลากด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว สไลด์จะถูกฟักด้วย DAPI และถ่ายภาพในภายหลังด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Olympus)

2.9|การเพาะเลี้ยงเซลล์

HBZY-1 ถูกคงรักษาไว้ใน DMEM(Gibco) และ HK-2 ถูกคงรักษาไว้ใน DMEM/F12 (Gibco) ที่เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ fetal bovine serum, 100 U mL-1 penicillin/streptomycin (Gibco) ) ที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมีอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์และ CO . 5 เปอร์เซ็นต์ (คาร์บอนมอนอกไซด์). HPC ที่จัดเตรียมโดยศาสตราจารย์ Chun Zhang จากมหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี Huazhong ได้รับการบำรุงรักษาใน RPMI 1640 (Gibco) HPC ถูกเพิ่มจำนวนขึ้นครั้งแรกที่ 33 องศา จากนั้นจึงถ่ายโอนไปที่ 37 องศาเพื่อสร้างความแตกต่างก่อนที่จะนำไปใช้ในการทดลองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้22

2.10|ELIS Assay

หลังจาก HPC ถูกบำบัดอย่างแตกต่างและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 5 วัน ครึ่งหนึ่งของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกนำออกไปเพื่อตรวจหา (VEGF ที่ปลดปล่อย) เซลล์ถูกทำลายโดยใช้เครื่องคั้นเซลล์อัลตราโซนิก (SONICS) ทำให้โปรตีนถูกปล่อยออกมาอย่างสมบูรณ์ในส่วนลอยเหนือตะกอนที่เหลืออยู่ (VEGF ทั้งหมด) จากนั้น วัดความเข้มข้นของ VEGF โดยใช้ชุดเครื่องมือ ELISA เชิงพาณิชย์ (MEIMIAN) อัตราส่วนของ VEGF ที่ปล่อยออกมาต่อ VEGF ทั้งหมดคืออัตราการรั่วของ VEGF

2.11|ยีนเงียบ

การล้มลงของ Atg7 ในเซลล์ HK-2 ทำได้สำเร็จโดยการใช้ขั้นตอนการทรานส์เฟกชัน siRNA แบบย้อนกลับที่ทำในเพลตหกหลุม เมื่อเติบโตขึ้นถึง 70 เปอร์เซ็นต์ที่บรรจบกัน เซลล์จะถูกถ่ายด้วย siRNA หรือ siRNA ที่มีสัญญาณรบกวน (RiboBio) ที่มีสัญญาณรบกวนโดยใช้ Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต หลังจาก 48 ชั่วโมงของการทรานส์เฟกชัน ประสิทธิภาพการถ่ายถูกตรวจสอบโดย Western blot เพื่อตรวจสอบลำดับ (ACTCGAGTCTTTCAAGACT)

ตารางที่ 2 รายการแอนติบอดีทั้งหมด

2.12|ตรวจสอบฟลักซ์ autophagic

พลาสมิดที่มี Lentiviral vector RFP-GFP-LC3(Genecopoeia) ถูกสร้างและบรรจุในเซลล์ HEK293T ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (GeneCopoeia) ส่วนลอยเหนือตะกอนของไวรัสถูกรวบรวมเพื่อแพร่เชื้อในเซลล์ HK-2 และ HBZY-1 เพื่อติดตามการไหลของ autophagy โพรบนี้สามารถแยกแยะออโตฟาโกโซม (GFP*/RFPt, puncta เหลือง) และ autolysosomes (GFP-/RFPt, รอยแดงสีแดง)

2.13|การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ Graph Pad Prism8 และแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ความแตกต่างระหว่างกลุ่มถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ความสำคัญถูกกำหนดเป็น P<>

ผลลัพธ์

3.1|CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)การทำงานของไตบกพร่องของDN (โรคไตจากเบาหวาน)หนู

เพื่อสำรวจ renoprotection ของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์), DN (โรคไตจากเบาหวาน)แบบจำลองถูกเหนี่ยวนำโดย HFD และSTZ(รูปที่ 1A) หลังจากให้อาหารทดลอง 34 สัปดาห์ ระดับน้ำตาลในเลือด น้ำหนักไต- วัดสัดส่วนร่างกาย ครีเอตินีน และ BUN ในDN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่ม,ไต- อัตราส่วนร่างกาย ครีเอตินีน และ BUN เพิ่มขึ้น ในขณะที่การรักษา CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)กลับความผิดปกติ (ตารางที่ 3) อย่างต่อเนื่อง สัณฐานวิทยาของไตของ DN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูเมาส์มีความผิดปกติอย่างมากกับการทำให้เซลล์เยื่อบุผิวเสื่อมสภาพ, การเสื่อมสภาพของหลอดเลือด, การขยายพื้นที่ของโกลเมอร์รูลาร์โบว์แมน และการขยายตัวของเส้นประสาท (รูปที่ 1B) นอกจากนี้ โครงสร้างพิเศษของโกลเมอรูลัสยังแสดงความหนาของเมมเบรนของชั้นใต้ดินและการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้าของโพโดไซต์ (รูปที่ 1B) ในทางตรงกันข้าม CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)การรักษาทำให้เป็นมาตรฐานเหนือการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาเชิงลบ (รูปที่ 1B) นอกจากนี้ คอลลาเจนไฟบริลที่สะสมอยู่ในเยื่อหุ้มสมองของไต (รูปที่ 1C) และความกระด้างของไตที่วัดโดยอีลาสโตกราฟีด้วยคลื่นเฉือน ทั้งคู่เพิ่มขึ้นใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)หนู (รูปที่ 1D) ตามที่คาดไว้ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ความผิดปกติของไตดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของDN (โรคไตจากเบาหวาน)รวมทั้งพังผืด

รูปที่ 1 CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)การทำงานของไตบกพร่องของDN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูที่เกิดจาก HFD และ STZ

สคีมาของการออกแบบทดลอง B, ภาพตัวแทนของไตเนื้อเยื่อที่ย้อมด้วย H&E (แถบมาตราส่วน: 50 μm), PAS (แถบมาตราส่วน: 10 μm) และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างพิเศษในสัณฐานวิทยาของไตที่ประเมินโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (แท่งมาตราส่วน: 1 μm)

และข้อมูลทางสถิติของอัตราส่วน PAS-positive ต่อพื้นที่ glomerular, ความหนา GBM, ความกว้างของ foot process และจำนวน foot process ต่อ mm ของ GBM (n=3)

C, ภาพตัวแทนของเนื้อเยื่อไตที่ย้อมด้วยไตรโครมของ Masson และข้อมูลทางสถิติของพื้นที่บวก (n=3) แถบมาตราส่วน: 25 μm.

D, อีลาสโตกราฟีแบบคลื่นเฉือนที่ตรวจพบด้วยขอบเขตโซโนและการหาปริมาณของโมดูลัสของยังเป็นระดับของการเกิดพังผืดของไต (n=7) *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

ตารางที่ 3 ข้อมูลเมตาบอลิซึมของหนูในทุกกลุ่ม

3.2|CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาความชราภาพในDN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูและเซลล์ไตถูกท้าทายโดยกลูโคสสูง

การชราภาพถือเป็นสาเหตุหลักของการเกิดพังผืดในไตมากขึ้นเรื่อยๆ ซึ่งเป็นเครื่องหมายรับรองความชราภาพ23 เพื่อตรวจสอบผลการต่อต้านการชราภาพของ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์), เราทำการย้อม SA- -gal บนไต เซลล์ SA- -gal* และ p16* ที่เพิ่มขึ้นถูกสะสมทั่วเยื่อหุ้มสมองของไตใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่มในขณะที่ควบคุมและCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)- ไตที่บำบัดแสดงแง่บวกเป็นครั้งคราว (รูปที่ 2A, B) จากตำแหน่งทางกายวิภาคของไต ตรวจพบการแสดงออกในเชิงบวกของ p16 ในเซลล์ mesangial (ลูกศรสีเหลือง) เซลล์เยื่อบุผิวท่อไต (ลูกศรสีแดง) และ podocytes (ลูกศรสีดำ) ชราภาพที่เกิดขึ้นในDN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูเมาส์ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยการเพิ่มการควบคุมที่เห็นได้ชัดของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพแบบคลาสสิก ซึ่งรวมถึง p53,p21 และ p16 (รูปที่ 2C) ในทางกลับกัน การบริหาร CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาประสิทธิภาพการชราภาพข้างต้น

มีรายงานว่าฟีโนไทป์ของการหลั่งที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ ซึ่งเป็นสารคัดหลั่งที่โดดเด่นของเซลล์ในวัยชรา ซึ่งรบกวนสภาพแวดล้อมจุลภาคและอำนวยความสะดวกในการลุกลามของโรค2 ดังนั้น ระดับ mRNA ของ SASP ที่เป็นตัวแทนบางส่วนจึงถูกวัด ซึ่งรวมถึง I-1 , Il-6 , Tgf- , Tnf-a, Vegf, Icam-1 และ Vcam-1 ผลการศึกษาพบว่า CO . ในรอยพับที่ผิดปกติของ SASP นี้ถูก CO . หลีกเลี่ยง (คาร์บอนมอนอกไซด์)การแทรกแซง(รูปที่ 2D).

ด้วยความชราภาพปราบปรามของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ในร่างกาย เราสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลการต่อต้านการชราภาพ ในหลอดทดลอง ของเซลล์ไต 3 ประเภท ได้แก่ เซลล์ mesangial ของหนู (HBZY-1) เซลล์เยื่อบุผิวท่อมนุษย์ (HK-2) และเซลล์พอดไซต์ของมนุษย์ (เอชพี) หลังจากได้รับกลูโคสสูง (HG,35 mmol/L) เซลล์ 3 ชนิดแสดงการเสริมของ SA- -gal ที่มีสัณฐานวิทยาขนาดใหญ่ขึ้นในวันที่ 7 (รูปที่ 2E) วันที่ 5 และวันที่ 14 (รูปที่ 2l) ตามลำดับ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเพิ่มขึ้นของอัตราการรั่วไหลของ LDH ของ HBZY-1 บ่งชี้ว่าเซลล์เสื่อมและความเสียหายที่เกิดจาก HG (รูปที่ 2F) เพื่อตรวจสอบปริมาณ CO . ที่เหมาะสม (คาร์บอนมอนอกไซด์), HBZY-1 ถูกบำบัดด้วย CORM ที่มีความเข้มข้นต่างกัน-2 โดยการวัดอัตราการรั่วไหลของ LDH(รูปที่ 2F), เซลล์ EdU-positive (รูปที่ 2G) และ SA- -gal (รูปที่ 2H) เราพบว่าความเข้มข้น 1 ไมโครโมล/ลิตรมีผลแทรกแซงที่ดีกว่า CO . อย่างต่อเนื่อง (คาร์บอนมอนอกไซด์)(1μmol/L) ยังลดการแสดงออกในเชิงบวกของ SA- -gal ใน HK-2 และ HPC (รูปที่ 2) เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบเหล่านี้ได้คลี่คลายว่า CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)มีบทบาทสำคัญในการต่อต้านการชราภาพทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง

รูปที่ 2 CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาความชราภาพในDN (โรคไตจากเบาหวาน)หนูและเซลล์ไตที่ท้าทายโดย HG

A, ภาพตัวแทนของไตเนื้อเยื่อที่ย้อมด้วย SA- -gal และข้อมูลทางสถิติของพื้นที่บวก (n=3) โกลเมอรูลัสถูกระบุด้วยวงกลมประสีแดง แถบมาตราส่วน: 25 μm.

B, การแสดงออกในเชิงบวกของ p16 ในไตแสดงโดยอิมมูโนฮิสโตเคมี (n=3) ลูกศรสีเหลืองระบุเซลล์ mesangial สีแดงระบุเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต และลูกศรสีดำระบุ podocytes แถบมาตราส่วน: 25 μm.

C, ระดับโปรตีนของเครื่องหมายความชราซึ่งกำหนดโดยอิมมูโนบล็อกและการวิเคราะห์ความหนาแน่นของ p53, p21 และ p16 (n=3)

D, การเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของ SASP mRNA (Il-1 , Il-6, Tgf- , Tnf- , Vegf, Icam-1 และ Vcam-1) (n มากกว่าหรือเท่ากับ 4)

E, HBZY{{0}} ที่สัมผัสกับ NG (5 มิลลิโมล/ลิตร) หรือ HG (35 มิลลิโมล/ลิตร) ถูกย้อมด้วย SA- -แกลลอนตั้งแต่วันที่ 0 ถึงวันที่ 7 และข้อมูลทางสถิติของ SA - -เซลล์กัล-บวกที่ 5 และ 7 วัน (n=3) แถบมาตราส่วน: 50 μm.

F, อัตราการปลดปล่อย LDH ของ HBZY{{0}} ที่บำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CORM-2 (0.1, 1, 10 และ 100 ไมโครโมล/ลิตร) (n=6)

G, สัดส่วนของ EdU-positive HBZY-1 ที่บำบัดด้วย CORM-2 ที่มีความเข้มข้นต่างกัน (n=3)

H, SA- -gal การย้อมสีใน HBZY-1 ที่บำบัดด้วย CORM-2 ที่มีความเข้มข้นต่างกัน (n=3) แถบมาตราส่วน: 50 μm.

I ภาพตัวแทนของ SA- -gal ของ HPC (วันที่ 5) และ HK-2 (วันที่ 14) ด้วยการบริหารให้ CORM-2 (1μmol/L) และข้อมูลทางสถิติ (n { {6}}) แถบมาตราส่วน: 50 μm. *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

3.3|CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)autophagy ที่เปิดใช้งานและปรับปรุงการไหลของ autophagy ในร่างกายและในหลอดทดลอง

การวิจัยที่เพิ่มขึ้นเผยให้เห็นกฎระเบียบเชิงลบของการ autophagy ต่อการชราภาพและCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวกระตุ้น autophagy เพื่อสำรวจผลกระทบของ COon autophagy ใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)วัดชุดของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy เมื่อเทียบกับหนูที่เป็นเบาหวาน CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)การบำบัดเพิ่มการแสดงออกของ Beclin โปรตีนที่เริ่มต้น autophagy อย่างมีนัยสำคัญ-1(รูปที่ 3A) และลดซับสเตรต autophagy p62(รูปที่ 3B) แต่ลดอัตราส่วนของ LC3Il ต่อLC3l ซึ่งเป็นเครื่องหมายของออโตฟาโกโซม(รูปที่ 3C) หลักฐานก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าความขัดแย้งนี้อาจเกิดจากการปิดกั้นการไหลของ autophagy ซึ่งเกิดจากความผิดปกติของไลโซโซม.25ผลการวิจัยพบว่าโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไลโซโซม Cathepsin B และ LAMP2 เพิ่มขึ้นใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)บวก COgroup เมื่อเปรียบเทียบกับ DN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่ม (ภาพที่ 3D) นอกจากนี้ การวิเคราะห์ co-localization ของ LC3 puncta และ LAMP2 ยังสนับสนุน CO . นั้น (คาร์บอนมอนอกไซด์)ลดการสะสมของออโตฟาโกโซมอย่างเห็นได้ชัดและเพิ่มจำนวนของออโตไลโซโซม (รูปที่ 3E)

อย่างต่อเนื่อง พบความผิดปกติของ autophagy และ lysosome ในหลอดทดลอง ดังที่แสดงโดยระดับโปรตีนและโพรบ lysosomal (รูปที่ 3F, G) นอกจากนี้ HK-2 และ HBZY-1 ถูกทรานส์เฟกด้วยเลนติไวรัส RFP-GFP-LC3 เพื่อเฝ้าติดตามการไหลของออโตฟาจี ภายใต้เงื่อนไขของ HG puncta ของ autophagosomes เพิ่มขึ้นและ autolysosomes ลดลงใน HBZY-1 และ HK-2 ซึ่งไม่เปลี่ยนแปลงเพิ่มเติมด้วยการบำบัดด้วยคลอโรควิน (CQ) CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)เพิ่มจำนวนของ autolysosomes และ autophagosomes ที่ลดลงซึ่งถูกยับยั้งโดยการเพิ่ม CQ (รูปที่ 3H, I) โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)autophagy ที่เปิดใช้งานและปรับปรุงการไหลของ autophagy ในร่างกายและในหลอดทดลอง

3.4|CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาความชราด้วยการปรับปรุง autophagy ในหลอดทดลอง

เพื่อสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทของ autophagy ในกลไกการต่อต้านการชราภาพของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์), การรวมกันของ CORM-2 และสารยับยั้ง autophagy ถูกใช้ในเซลล์ไตที่สัมผัสกับ HG สารยับยั้งสองประเภท ได้แก่ wortmannin (WORT) เพื่อป้องกันการเริ่มต้น autophagy และ CQ เพื่อควบคุมการไหลของ autophagy อีกครั้ง ย้อนกลับการลดลงของ SA- -gal โดย CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ในเซลล์ไต 3 ชนิด (ภาพที่ 4A) CO . อย่างต่อเนื่อง (คาร์บอนมอนอกไซด์)เพิ่มสัดส่วนของเซลล์ EdU อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งถูกยับยั้งโดยตัวยับยั้งสองตัวใน HBZY-1(รูปที่ 4B)และ HK-2(รูปที่ 4C)ใน HBZY-1 ผลที่บรรเทาความชรา ของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)แสดงโดยการแสดงออกที่ลดลงของ p53,p21 และ p16 หายไปหลังจากการเติมสารยับยั้ง autophagy (รูปที่ 4D) ในทำนองเดียวกัน การวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์พบว่าสารยับยั้ง autophagy ปิดกั้นการลดลงของ p53- และ p16- เซลล์บวกโดย CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ในฮ่องกง-2 （รูปที่ 4印） และ HPC (รูปที่ 4F) นอกจากนี้ ความเงียบของ Atg7 (รูปที่ 4G) ยังบล็อกผลการป้องกันของCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)แสดงโดยเซลล์ SA- -galt ที่เพิ่มขึ้นและลด EdU*cells ใน HK-2(รูปที่ 4H) จากผลดังกล่าวชี้ให้เห็นว่าCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ระงับความชราภาพโดยการปรับปรุง autophagy

3.5|autophagy ที่เปิดใช้งานอาจทำให้ SASP ลดลงใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)หนู

เราได้สำรวจความสัมพันธ์เฉพาะระหว่าง autophagy และความชราภาพ การวิจัยพบว่า autophagy บรรเทาความชราโดยการคัดเลือก GATA4 ที่ย่อยสลายซึ่งควบคุม NF-KB ในเชิงบวกเพื่อปล่อย SASP26 ในทำนองเดียวกัน SASP จำนวนมากได้รับการพัฒนาใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่ม (รูปที่ 2D) และการแสดงออกและการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ p65 เพิ่มขึ้น (รูปที่ 5A) อย่างไรก็ตาม ระดับโปรตีนของ GATA4 ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง โดยบอกว่า GATA4 อาจไม่เป็นสื่อกลางในการสร้าง SASP ในสถานะกลูโคสสูง (รูปที่ 5B) นอกจากนี้ จากการศึกษาพบว่า TOR-autophagy spatial coupling compartment (TASCC) เกิดขึ้นจากการรวมกันของ mTOR, autophagosome ตอนปลาย และ lysosome เร่งการชราภาพโดยการเพิ่มการหลั่งของ SASP.27อย่างไรก็ตาม ผล immunofluorescence พบว่าไม่มี mTOR, LC3 และ LAMP2 ซึ่งบ่งชี้ถึงการก่อตัวที่ล้มเหลวของ TASCC ในไต (รูปที่ 5C)

ดังที่เราทราบ autophagy ทำหน้าที่ในการย่อยสลายองค์ประกอบ cytosolic ซึ่งส่วนใหญ่ดำเนินการโดย autolysosome ซึ่งเกิดจากการหลอมรวมของ autophagosome และ lysosome มีการรายงาน Autophagy เพื่อลดการหลั่งของ IL-1 โดยการย่อยสลาย pro-IL-1 ในมาโครฟาจที่กระตุ้นด้วย LPS28 ที่น่าสนใจคือ เราพบว่า IL-1 (สีเขียว) อยู่ร่วมกัน ด้วย LC3 puncta (สีแดง) และ LAMP2 (สีชมพู) ใน CON และ DN (โรคไตจากเบาหวาน)บวก CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)กลุ่ม (รูปที่ 5D ลูกศรสีแดง) แสดงจุดตัดระหว่าง SASP กับการเสื่อมสภาพของ autophagy ในทำนองเดียวกันเมื่อเปรียบเทียบกับ DN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่ม, ไซโตไคน์อื่นๆ ของ SASP ซึ่งรวมถึง IL-6, TGF- และ VEGF ยังมีการโลคัลไลเซชันร่วมกันที่พอประมาณแต่เห็นได้ชัดด้วย LC3 puncta และ LAMP2 ใน CON และ DN บวก CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)กลุ่ม(รูปที่ 5E-G, ลูกศรสีแดง) ซึ่ง VEGF มีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นร่วมกับออโตไลโซโซมอย่างชัดเจนที่สุด(รูปที่ 5G) อย่างไรก็ตาม การย้อมสีเหลืองที่ทับซ้อนกันใน DN (โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่มแสดงให้เห็นว่า SASP ถูกวางร่วมกับ LC3 puncta เท่านั้น (รูปที่ 5D-G, ลูกศรสีขาว) นอกจากนี้ ระดับโปรตีนของ VEGF ถูกวัดใน HPC หลังจากการเติมออโตฟาจีอะโกนิสต์ (ABT737 และราพามัยซิน) หรือ CORM-2 แม้ว่าระดับโปรตีนทั้งหมดของ VEGF ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5H) การมีอยู่ของทั้งตัวเร่งปฏิกิริยา autophagy และ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ลดการปลดปล่อย VEGF ใน HPC ที่เหนี่ยวนำโดย HG ลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 5I, J) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า SASP บางส่วนถูกย่อยสลายผ่าน autophagy

รูปที่ 4 CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)บรรเทาความชราภาพโดยการปรับปรุง autophagy ในหลอดทดลอง HBZY-1, HPC และ HK-2 ถูกบำบัดด้วย HG, CORM-2 และตัวยับยั้ง autophagy (WORT: 200nM และ CQ: 5 ไมโครโมล/ลิตร)

A, การย้อมสีและเซลล์บวกของ SA- -gal ในเซลล์ไต 3 ชนิด (n=3) แถบมาตราส่วน: 25 μm.

B, C, การเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ประเมินโดยการย้อมสี EdU ใน HBZY-1 และ HK-2 และการหาปริมาณของสัดส่วนของเซลล์บวก (n=3) แถบมาตราส่วน: 50 μm.

D, การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (p53, p16 และ p21) ใน HBZY-1 (n=5)

E, F, ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของ p53 และ p16 และการหาปริมาณสัดส่วนของเซลล์บวกใน HK-2 และ HPC (n=3) แถบมาตราส่วน: 50 μm.

G, ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ Atg7 ใน HK-2 ถูกทำให้เงียบด้วย siRNA (สามลำดับ)

H ภาพตัวแทนของ SA- -gal (แถบมาตราส่วน: 50 μm) และการย้อมสี EdU (แถบมาตราส่วน: 25 μm) และการหาปริมาณของสัดส่วนของเซลล์บวกใน HK-2 (n {{4 }}) *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

3.6|CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)เปิดใช้งาน autophagy บางส่วนโดยแยก Beclin-1-Bcl-2 complex

มีรายงานการแยกตัวของคอมเพล็กซ์ Beclin-1-Bcl-2 เพื่อปรับปรุง autophagy และป้องกันริ้วรอยก่อนวัยรวมถึงการเปลี่ยนแปลงของไตที่เกี่ยวข้องกับอายุ21 นอกจากนี้ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์)เปิดใช้งาน autophagy ผ่าน Beclin-1 ใน sepsis mice.1/ด้วยเหตุนี้ เราจึงสำรวจว่าการแยกการเปิดใช้งาน autophagy โดย CO ที่เป็นสื่อกลางที่ซับซ้อนหรือไม่ (คาร์บอนมอนอกไซด์). ผลการตกตะกอนร่วมพบว่าCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)ลดการผูกมัดของ Beclin-1-Bcl-2 ใน DN (โรคไตจากเบาหวาน) หนูเมาส์ (รูปที่ 6A) นอกจากนี้ เมื่อเทียบกับการรักษา HG และ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์), การใช้ HG, CO . ร่วมกัน (คาร์บอนมอนอกไซด์)และ Beclin-1-Bcl-2 สารแยกตัวที่ซับซ้อน ABT737 กระตุ้น autophagy เพิ่มเติมของ HBZY-1 ตามที่เห็นได้จาก LAMP2 ที่ไม่เปลี่ยนแปลง ลดลง p62 และเพิ่มอัตราส่วน LC3ll/LC3l (รูปที่ 6B) นอกจากนี้ ผลการวิจัยพบว่าการใช้ CO . ร่วมกัน (คาร์บอนมอนอกไซด์)และ ABT737 ลดการแสดงออกของ p53,p21 และ p16 ใน HBZY-1 (รูปที่ 6C) และลด SA- -galt cell ใน HBZY-1, HK{{9} } และ HPC (รูปที่ 6D) ซึ่งบ่งชี้ว่า ABT737 เพิ่มประสิทธิภาพการต่อต้านการชราภาพของ CO (คาร์บอนมอนอกไซด์). ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าCO (คาร์บอนมอนอกไซด์)สามารถกระตุ้น autophagy โดยแยก Beclin-1-Bcl-2 คอมเพล็กซ์เพื่อบรรเทาความชราภาพ

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅱ