โรคไต: นิกเกิลกระตุ้นให้เกิด Autophagy ในไตได้อย่างไร?

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:Ali.ma@wecistanche.com

ส่วนที่Ⅰ:นิกเกิลกระตุ้นการ autophagy ผ่านเส้นทาง PI3K/AKT/mTOR และ AMPK ในไตของเมาส์

Heng Yin, Zhicai Zuo และคณะ

1. บทนำ

นิกเกิล(Ni) ซึ่งเป็นองค์ประกอบทางธรรมชาติ มีการแพร่กระจายอย่างกว้างขวางในสิ่งแวดล้อมต่างๆ รวมทั้งดิน น้ำ และอากาศ (Schrenk et al,2020) นิ (นิกเกิล)สารประกอบและโลหะ Ni (นิกเกิล)มีการใช้งานทางอุตสาหกรรมและเชิงพาณิชย์มากมาย เช่น การผลิตโลหะผสม การชุบด้วยไฟฟ้า แบตเตอรี่นิกเกิล-แคดเมียม และตัวเร่งปฏิกิริยาในอุตสาหกรรมเคมีและอาหาร (Genchi et al., 2020) อย่างไรก็ตาม การใช้ Ni . ในอุตสาหกรรมอย่างมากมาย (นิกเกิล)นำไปสู่มลภาวะต่อสิ่งแวดล้อมในวงกว้าง ซึ่งเพิ่มความเสี่ยงของการสัมผัสกับ Ni ผ่านอาหารและน้ำดื่มของมนุษย์ (Das et al,2018) แม้ว่านิ (นิกเกิล) เป็นสารอาหารรองที่จำเป็นสำหรับมนุษย์และสัตว์ การได้รับ Ni มากเกินไปเป็นอันตรายต่อสุขภาพของมนุษย์อย่างมาก (Das et al.,2018)

ด้วยอุบัติการณ์ที่เพิ่มขึ้นของ Ni (นิกเกิล)การปนเปื้อนในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา พิษวิทยาของ Ni รวมถึงความเป็นพิษต่อภูมิคุ้มกัน ความเป็นพิษต่อตับ พิษต่อไต และความเป็นพิษต่อปอด ได้ดึงดูดความสนใจเพิ่มขึ้น (Gathwan et al.,2013; Deng et al.,2016; Hasanein and Felegari, 2017; Guo et al., 2020a . 2020ข). ดิไตเป็นอวัยวะเป้าหมายที่สำคัญใน Ni (นิกเกิล)พิษวิทยาด้วยการสะสมของNi (นิกเกิล)และ Ni (นิกเกิล)สารประกอบในนั้นผ่านการสัมผัสเรื้อรังสามารถทำให้เกิดความเสียหายต่อไตอย่างมีนัยสำคัญ (Elangovan et al, 2018) การวิจัยที่มีอยู่ของทีมวิจัยของเราได้แสดงให้เห็นการเหนี่ยวนำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การตายของเซลล์ การตายของเซลล์ การอักเสบ และการหยุดวงจรของเซลล์ในไตของไก่เนื้อโดย NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2) ในอาหารเกิน 300 มก./กก. (Guo et al, 2014, 2016a,2016b). การศึกษาหลายชิ้นได้เสนอแนะว่ากลไกของพิษวิทยาของไต Ni รวมถึงความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การแตกของสาย DNA และการตายของเซลล์ (Lee et al,2001; Chen et al.,2010)

มีส่วนสำคัญในสภาวะสมดุลของเซลล์autophagyพบว่ามีความเกี่ยวข้องกับอุบัติการณ์และการเกิดโรคของโรคต่างๆ (Martin et al,2019) การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าการตายของเซลล์อาจเกิดขึ้นได้โดยการอยู่นอกเหนือการควบคุมหรือการกระตุ้นมากเกินไปของautophagy(เดนตันและคูมาร์ 2019). เนื่องจากเป็นกระบวนการภายในเซลล์ที่ซับซ้อนและมีคำสั่งสูงautophagyเริ่มต้นจากการสร้างถุงน้ำเมมเบรนสองชั้นที่เรียกว่าออโตฟาโกโซมที่กลืนกินส่วนของไซโตซอลและออร์แกเนลล์ (Martin et al,2019) ต่อจากนั้น autophagosomes จะมีส่วนร่วมในการสลายโปรตีนของสารที่ถูกกลืนกินหลังจากย้ายไปที่ไลโซโซม

ออโตฟาจีมีความไวต่อความเครียดของเซลล์ประเภทต่างๆ เช่น การกีดกันการเจริญเติบโตหรือปัจจัยของสารอาหาร การขาดออกซิเจน ความเสียหายของดีเอ็นเอ ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) การรวมตัวของโปรตีน เชื้อโรคภายในเซลล์ หรือความเสียหายต่อออร์แกเนลล์(Dodson et al,2013) เป็นกระบวนการที่ซับซ้อนมากในการควบคุมautophagyที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณจำนวนมาก รวมถึงไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นอะดีโนซีน โมโนฟอสเฟต (AMPK), ฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 3-ไคเนส-I(PI3K) และเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของราพามัยซิน (mTOR)วิถี (Cao et al2021) และเส้นทาง mTOR มีผลสำคัญในautophagyการเริ่มต้น กิจกรรม mTOR เป็นจุดตรวจหลักของautophagyซึ่งมีผลยับยั้งทำให้เกิดการดีฟอสโฟรีเลชั่นของ ULK1 บรรเทาautophagyการยับยั้ง (Parzvch และ Klionsky, 2014). นอกจากนี้ PI3K/Akt และ AMPK ยังเป็นหน่วยงานกำกับดูแลต้นน้ำที่สำคัญของ mTOR(Gong et al,2020; Xu et al,2020) การวิจัยก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าโลหะหนัก (เช่น Cd, Hg, Cu และ Pb) สามารถทำให้เกิดautophagy(Su et al,2017). แม้ว่า Huang et al.(2016) และ Son et al. (2017) พบว่า Ni (นิกเกิล)การสัมผัสสามารถกระตุ้นได้อย่างมีประสิทธิภาพautophagyในเซลล์เยื่อบุผิวหลอดลม กลไกที่แม่นยำยังไม่ชัดเจน

ผลของ Ni (นิกเกิล)บนautophagyไม่ค่อยได้รับรายงาน และมีการศึกษาเพียงไม่กี่เรื่องเกี่ยวกับผลกระทบของ Ni ต่อไตautophagyของหนูในร่างกาย ดังนั้นงานปัจจุบันจึงมีวัตถุประสงค์เพื่อยืนยันว่า NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)การรักษาสามารถทำให้เกิดautophagyและเพื่อประเมินกลไกศักยภาพของ NiCl (นิกเกิลคลอไรด์)- เหนี่ยวนำautophagyรวมถึงเส้นทาง AMPK และ PI3K/AKT/mTOR

นิกเกิลมีผลต่อไตและทำให้เกิดโรคไต

Click to Cistanche สำหรับโรคไต

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สารเคมีและแอนติบอดี

นิกเกิลคลอไรด์(NiCl) ให้บริการโดย Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (เฉิงตู ประเทศจีน) ในการวิเคราะห์อิมมูโนบลอต แอนติบอดีทั้งหมดถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology (CST,USA) ซึ่งรวมถึงโปรตีนที่สัมพันธ์กับไมโครทูบูลที่ต้านกระต่าย1 สายเบา 3B(LC3B)(Cat no.43566T),anti-rabbit p62(SQSTM1)(Cat no.5114D), แอนตี้กระต่าย Beclin1 (Cat no.3495T), แอนตี้กระต่ายautophagyโปรตีนที่เกี่ยวข้อง12 (Atg12)(Cat no.4180T), anti-rabbit Atg5(Cat no.12994T),anti-rabbit Atg16L1(Cat no.8089T), anti-rabbit Atg7 (Cat no.8558T),anti-rabbit Atg3 ( แมว no.3415T),สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมต้านกระต่ายเป้าหมายของราพามัยซิน (mTOR)(แมว no.2983T),ต้านกระต่าย p-mTOR(แมว no.5536T),แอนตี้กระต่าย unc-51 เช่นไคเนส 1 (ULK1 )(Cat no.8054D), anti-rabbit p-UIK1(Cat no.5869T), anti-rabbit PI3K(Cat no.4292S),anti-rabbit p PI3K(Cat no.4228T,anti-rabbit Akt(Cat no. .9272S), แอนตี้-กระต่าย p-Akt (Cat no.4060T), แอนตี้-rabbit mTOR(Cat no.2972S), แอนตี้-rabbit p-mTOR (Cat no. 5536S), แอนตี้-rabbit AMPK (Cat no.5831S) ),แอนตี้-แรบบิท p-AMPK (Cat no.2535S) และ -actin(Cat no.4970T)

2.2.สัตว์และการรักษา

หนู ICR เพศผู้ที่แข็งแรงทั้งหมด 160 ตัวที่มีอายุแปดสัปดาห์ถูกจัดเตรียมโดย Dashuo Biological Technology Company (เฉิงตู ประเทศจีน) สัตว์ทั้งหมดถูกเลี้ยงในสภาวะคงที่ (อุณหภูมิ 25±2C;12-ชม. รอบแสง-มืด) ในสภาพแวดล้อมปลอดเชื้อ และเลี้ยงด้วยอาหารเม็ดมาตรฐานและน้ำเปล่า หนูถูกจำแนกออกเป็นสี่กลุ่มโดยสุ่ม แต่ละกลุ่มมีไมโครโฟนสี่สิบตัวหลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพอากาศเป็นเวลาเจ็ดวัน น้ำกลั่นได้รับการควบคุมในกระเพาะอาหารในขณะที่Ni (นิกเกิล)(NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2).6H2O) ที่มีขนาดยา 7.5,15 และ 30 มก./กก. ถูกจัดให้มีในกระเพาะอาหารสำหรับสัตว์ในกลุ่มทดลอง Ni นำมาใช้ในที่นี้พิจารณาจากค่ามัธยฐานของขนาดยาที่ทำให้ตายได้ (LD50, 306.11 มก./กก.) ที่ได้รับในการวิจัยเกี่ยวกับความเป็นพิษเฉียบพลันในช่องปากของหนูเพศผู้ NiCl (นิกเกิลคลอไรด์),.6HZO ถูกเจือจางโดยใช้น้ำกลั่นก่อนทำการทดลอง กลุ่มทั้งสี่กลุ่มถูกบริหารให้ด้วยขนาดยาทางสายน้ำที่ 1 มล. ต่อ 100 กรัมของน้ำหนักตัววันละครั้งเป็นเวลา 28 วัน หลังการรักษาเป็นเวลา 14 และ 28 วัน สัตว์ทั้งหมดถูกสังเวยอย่างมีมนุษยธรรมเพื่อรวบรวมไตตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ในส่วนด้านล่าง สัตว์ทดลองและขั้นตอนทั้งหมดได้ดำเนินการตามข้อตกลงที่ได้รับการอนุมัติจาก Animal Care และคณะกรรมการจริยธรรมใน Sichuan Agricultural University (หมายเลขการอนุมัติ:2012-024 เฉิงตู ประเทศจีน)

2.3. การกำหนดดัชนีไตและหน้าที่

หนูทุกตัวได้รับการชั่งน้ำหนักทุกสัปดาห์และเสียสละอย่างมีมนุษยธรรมเมื่อเสร็จสิ้นการรักษาและจากนั้นไตถูกตัดและชั่งน้ำหนัก ดิไตดัชนีที่ใช้เป็นอัตราส่วนระหว่างไตน้ำหนักและน้ำหนักตัว.

นักวิจัยตรวจวัดยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) และระดับครีเอตินินในเลือด (CRE) ตามคำแนะนำของชุดเครื่องมือเชิงพาณิชย์ที่ผลิตโดยสถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Naniing Jiancheng แห่งประเทศจีน (หนานจิง ประเทศจีน)

2.4. ความมุ่งมั่นของการสะสมไตของNi (นิกเกิล)

ไตเก็บตัวอย่างในวันที่ 28 ระหว่างการทดลอง จากนั้น HCIO 1 มล. และ HNO 9 มล. (เฉิงตู Kelong Chemical Co.,Ltd. ประเทศจีน)ถูกนำมาใช้ในการย่อยตัวอย่างเปียก 0.5g ของตัวอย่างเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในหลอดที่มีความทนทานต่ออุณหภูมิสูง จากนั้น หลอดเหล่านี้ถูกวางบนจานร้อนเพื่อระเหยของเหลวทั้งหมดออก ตามด้วยสารแขวนลอยของเรซิดิวโดยใช้ HNO 10 มิลลิลิตร 0.1 โมลาร์/ลิตร หลังจากนั้น นักวิจัยวิเคราะห์ตัวอย่างในรูปของ Ni (นิกเกิล)ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ดูดกลืนอะตอมแบบเปลวไฟ (AAS700, PerkinElmer, USA)

2.5. การสังเกตทางจุลพยาธิวิทยาและโครงสร้างพื้นฐาน

หลังจากรวบรวมและตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์แล้วไตตัวอย่างถูกทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ ฝังในพาราฟิน หั่นบาง ๆ ที่ 5 ไมโครเมตร และผ่านกรรมวิธีเพื่อย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน กล้องดิจิตอล (Nikon DS-Ri1, Japan) ถูกใช้เพื่อสังเกตชิ้นและถ่ายภาพสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยา จุลทรรศน์ ๑๐ แห่งไตถูกตรวจสอบ ภาพที่แสดงในกระดาษเป็นตัวแทน

สำหรับการประเมินโครงสร้างพื้นฐาน ใช้กลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์สำหรับการตรึงไตเนื้อเยื่อ (ประมาณ 1 มม. 5) ที่อุณหภูมิห้อง ตามมาด้วยการตรึงเนื้อเยื่อเหล่านี้ใน 1 เปอร์เซ็นต์ osmium tetroxide, dehy-dated ในอะซิโตนและฝังในอีพอกซีเรซิน นำแผ่นบางเฉียบที่เตรียมมาวางบนตะแกรงทองแดงแล้วย้อมด้วยยูแรนิล อะซิเตทและตะกั่วอะซิเตท ภาพโครงสร้างพื้นฐานถูกจับโดยใช้ JEM-1400กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแฟลช (JEOL, Japan)

ฟื้นฟูและปรับปรุงการทำงานของไต: cistanche

2.6. อิมมูโนฮิสโตเคมีคัล

หลังจากล้างด้วยไซลีนแล้ว พาราฟินชิ้นจะถูกนำกลับมาใช้ใหม่โดยใช้ชุดสารละลายเอทานอลที่จัดลำดับ ตามด้วยการล้างด้วยน้ำกลั่นและ PBS และการบล็อก 15 นาทีของกิจกรรมเปอร์ออกซิเดสภายใน (EPA) ผ่านการฟักไข่โดยใช้เมทานอล H,O.in 3 เปอร์เซ็นต์สำหรับการดับ EPA เพื่อความสะดวกในการดึงแอนติเจน เราบำบัดชิ้นโดยการให้ความร้อนด้วยไมโครเวฟเป็นเวลา 15 นาทีใน 00บัฟเฟอร์โซเดียมซิเตรต 1 โมลาร์ที่มีค่า pH 6.0 หลังจากอิ่มตัวด้วยซีรั่มแพะปกติ 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงทำการฟักตัวโดยใช้แอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา 1 เปอร์เซ็นต์ biotinylated goat anti-rabbit/mouse IgG secndary antibody (Boster, Wuhan, China) ถูกใช้เพื่อฟักไข่ที่ล้างด้วย PBS ที่ 37 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และที่ 37 องศา จะเป็น streptavidin-biotin complex (SABC;Boster) หวู่ฮั่น ประเทศจีน) ถูกใช้เป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยจุ่มชิ้นในไดอะมิโนเบนซิดีนไฮโดรคลอไรด์ (DAB; Boster, หวู่ฮั่น, จีน) สำหรับการสร้างปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน สุดท้าย หลังจากการย้อมสีเคาน์เตอร์แบบเบาโดยใช้ฮีมาทอกซิลิน ชิ้นจะถูกทำให้แห้งด้วยเอธานอล ล้างด้วยไซลีนและติดตั้งตามลำดับ

ความหนาแน่นเชิงแสงแบบรวม (IOD) ถูกใช้สำหรับการหาปริมาณของระดับโปรทีนของ LC3B และ p62 วิธีการวิเคราะห์สำหรับค่า IOD ที่อ้างอิงถึง Fanget al.(2018).A Nikon DS-Ril digital microscope camera system (Japan) ถูกนำมาใช้สำหรับการถ่ายภาพ จากนั้นนักวิจัยได้เลือกห้าฟิลด์ (0.064 มม.²) ในแต่ละพื้นที่ของรูปภาพของแต่ละชิ้นสำหรับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA ).

2.7. ซับตะวันตก

การสกัดโปรตีนจากไตตัวอย่างถูกดำเนินการโดยใช้บัฟเฟอร์การสลายของ RIPA และใช้รีเอเจนต์การทดสอบโปรตีน BCA (P0010S, เทคโนโลยี Beyotime ประเทศจีน) สำหรับการวัดความเข้มข้น จากนั้นจึงดำเนินการ SDS-PAGE สำหรับตัวอย่างโปรตีน ซึ่งต่อมาถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส ปิดกั้นโดยใช้นมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน หลังจากใช้แอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบกับเปอร์ออกซิเดสจากพืชชนิดหนึ่งเพื่อฟักตัวเป็นเวลา 1 ชั่วโมง มีการใช้ Chemidoc XRS เพื่อตรวจหาแถบโปรตีนบนเยื่อหุ้มเซลล์โดยใช้ชุดเครื่องมือ ECL (P0018A, Beyotime Technology, China)

2.8.ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR)

ไตนำและบดด้วยไนโตรเจนเหลวในครกโดยใช้สากและเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิต่ำ (-80 องศา ) สกัด RNA รวมของไตโดยใช้ RNAiso Plus(9108/9109, Takara, Otsu, Japan) ตามคำแนะนำจาก ผู้ผลิต ตามมาด้วยการสังเคราะห์ DNA เสริม (cDNA) ด้วยชุดรีเอเจนต์ RR047A Prim-ScriptTM RT ที่ผลิตโดย Takara ในญี่ปุ่นตามคำแนะนำ หลังจากนั้น qRT-PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ LightCycler ⑩ 480 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA) และชุด SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japan) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR แสดงไว้ในตารางที่ 1 -actin ถูกใช้เพื่อทำให้การแสดงออกของยีนเป็นปกติ และการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA ถูกคำนวณโดยวิธี 2-4ac (Livak and Schmittgen, 2001)

2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลถูกแสดงในรูปแบบของค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และวิเคราะห์ผ่าน LSD หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวน T3 ของ Dunnett ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดสำหรับ windows พี<0.05 represents="" a="" significant="">

ตารางที่ 1: ลำดับไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา

3. ผลลัพธ์

3.1.NiClz (นิกเกิลคลอไรด์)ทำให้การทำงานของไตบกพร่อง

ดังแสดงในรูปที่ 1A น้ำหนักตัวลดลงในสามกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2). และยังพบการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในน้ำหนักสัมพัทธ์ของไต(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

เซรั่ม CRE และ BUN ถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพมาตรฐานสำหรับการทำงานของไต ผลลัพธ์ของการทำงานของไตแสดงในรูปที่ 1C และ D และความเข้มข้นของ CRE และ BUN เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05)in the=""> (นิกเกิลคลอไรด์2)- กลุ่มการรักษาในวันที่ 14 และ 28 สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุม

รูปที่ 1E แสดงให้เห็นว่า Ni . ทั้งสาม (นิกเกิล)กลุ่มบำบัดมีความเข้มข้นของ Ni ในไตมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (นิกเกิลคลอไรด์)- ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาของไต

รูปที่ 2 แสดงว่า NiClz (นิกเกิลคลอไรด์)การรักษาทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาของไตด้วยปริมาณและเวลาที่เกี่ยวข้องกับโกลเมอรูลัสที่บวมพร้อมกับช่องว่างของแคปซูลที่แคบลง vacuolar และการเสื่อมสภาพของเม็ดในเยื่อบุผิวของท่อไต

มะเดื่อ 2. NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาในไต

รอยโรคทางจุลพยาธิวิทยารวมถึงโกลเมอรูลัสที่บวมพร้อมกับช่องว่างของแคปซูลที่แคบลง (*) การเสื่อมสภาพของหลอดเลือด (ลูกศรสีดำ) และการเสื่อมสภาพแบบละเอียด (ลูกศรสีขาว) ในเยื่อบุผิวท่อไต HE การย้อมสี แถบมาตราส่วน=50 µm

3.3.NiCl (นิกเกิลคลอไรด์)กระตุ้น autophagy และเพิ่มยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ในไต

LC3 และ p62 เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่สำคัญของautophagy(Gomez-San-chez et al..2016). เมื่อเทียบกับตัวควบคุม NiCl2 . สามตัว (นิกเกิลคลอไรด์2) กลุ่มบำบัดพบการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในระดับโปรตีนของ LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autophagyเป็นการกำหนดโดย TEM ในการศึกษานี้ด้วย ดังแสดงในรูปที่ 3F การสังเกต TEM พบว่าจำนวน autolysosomes เพิ่มขึ้นในเนื้อเยื่อไตตาม NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)การรับสัมผัสเชื้อ.

มะเดื่อ 3. NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)เพิ่ม autophagy ในไตของหนู

(A) ผล Western blot ของ LC3 และ p62 (B, C) การหาปริมาณของ LC3-II/I และ p62 (DE) การแสดงออกของ mRNA ของ LC3 และ p62 (ช)

โครงสร้าง ultrastructural ของเซลล์เยื่อบุผิวของ tubule ที่โค้งงอใกล้เคียง (รูปด้านขวาแสดงการขยายบางส่วนของตัวเลขด้านซ้าย ลูกศรสีดำแสดงโครงสร้าง autolysosome)

ค่าจะแสดงด้วยค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n {{0}}) คอลัมน์ที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P <>

นอกจากนี้ อิมมูโนฮิสโตเคมียังใช้สำหรับวัดระดับโปรตีนของ LC3B และ p62 ในไตเนื้อเยื่อในการศึกษาครั้งนี้ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4 เซลล์ที่เป็นบวกย้อมเป็นสีน้ำตาล และ LC3B และ p62 ส่วนใหญ่แสดงออกในไซโทพลาสซึมของเซลล์เยื่อบุผิวของท่อไต เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ค่า IOD ของ LC3B แสดงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (นิกเกิลคลอไรด์) ในวันที่ 14 และ 28 นอกจากนี้ ค่า IOD ของ p62 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

รูปที่ 4. ผลอิมมูโนฮิสโตเคมีของ LC3B และ p62 ในไตของหนูเมาส์

(A) ภาพอิมมูโนฮิสโตเคมีของ LC3B (แถบมาตราส่วน=50 µm) (B) ภาพอิมมูโนฮิสโตเคมีของ p62 (แถบมาตราส่วน=50 µm)

(C) ความหนาแน่นของแสงแบบบูรณาการ (IOD) ของ LC3B (D) ความหนาแน่นของแสงในตัว (IOD) ของ p62

ค่าจะแสดงด้วยค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n {{0}}) คอลัมน์ที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P <>

ยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับautophagyและมีส่วนร่วมในautophagyวัดฟลักซ์เพื่อตรวจสอบผลกระทบของNiCl .เพิ่มเติม (นิกเกิลคลอไรด์) บนautophagy. ซึ่งรวมถึง Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 และ Atg3 (Li และ Zhang.2019; Nishimura และ Tooze,2020) ดังแสดงในรูปที่ 5A-C เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่มบำบัดของ Ni (นิกเกิล)แสดงระดับโปรตีนที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 และ Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

มะเดื่อ 5. NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)เพิ่มยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ในไตของหนู

(A) ผล Western blot ของ Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 และ Atg3 (B&G) การหาปริมาณของการแสดงออกของโปรตีน Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 และ Atg3

(HM) การแสดงออกของ mRNA ของ Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 และ Atg3 ค่าจะแสดงด้วยค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=8) คอลัมน์ที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P <>

3.4.NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)กระตุ้นเส้นทาง PI3K/Akt/mTOR และ AMPK ในไต

mTOR เป็นผู้ควบคุมที่ไม่จำเป็นของautophagy(Wang et al.,2017) และเส้นทางควบคุมต้นน้ำที่เป็นที่ยอมรับของ mTOR ได้แก่ PI3K/Akt และ AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020) ดังนั้น การศึกษานี้จึงวัดโปรตีนของวิถี AMPK และ PI3K/Akt

เนื่องจาก Fg.6A และ B แสดงให้เห็นว่าระดับโปรตีนของ p-PI3K, p-AKT และ p-mTOR มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (นิกเกิลคลอไรด์2)ในวันที่ 14 และ 28 ของการทดสอบที่สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุม กลุ่มบำบัดมีระดับโปรตีนของ p-AMPK และ p-ULK1 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (นิกเกิลคลอไรด์2)- กลุ่มบำบัดพบว่าการแสดงออกของ mRNA ของ PI3K, AKT และ mTOR ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าautophagyเกิดจาก NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)ในไตหนูเมาส์เกี่ยวข้องกับเส้นทาง AMPK และ PI3K/Akt/mTOR

มะเดื่อ 6. NiCl2 (นิกเกิลคลอไรด์2)กระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/Akt/mTOR และ AMPK ในไตของหนูเมาส์

(A) ผล Western blot ของ p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 และ ULK1

(BF) การหาปริมาณของการแสดงออกของโปรตีน p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR และ p-ULK1/ULK1 (จี เค)

นิพจน์ mRNA ของ PI3K, AKT, AMPK, mTOR และ ULK1 ค่าจะแสดงด้วยค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=8) คอลัมน์ที่มีตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P <>

คลิกที่นี่เพื่อเข้าร่วมⅡ