ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

คลิกที่นี่เพื่อดูข้อมูลเกี่ยวกับส่วนที่ II (บทนำ วัสดุ และวิธีการ ) ของบทความนี้

โปรไฟล์โปรตีโอมิกส์ใกล้เซลล์เดียวของท่อใกล้เคียงและโกลเมอรูลัสของไตมนุษย์ปกติ

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², สุเดชนา รอย¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², อดัม ซี. สเวนเซ่น², รุย จ้าว³, หญิง จู³, Priyanka Rashmi¹, แอนดรูว์ ชโรเดอร์¹, อิซาเบลล่า ดัมม์¹, สวัสดิกะ Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* และ มินนี่ เอ็ม. ซาร์วาล¹* สำหรับโครงการ Kidney Precision Medicine Project (KPMP) Consortium

¹Division of MultiOrgan Transplantation, Department of Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, สหรัฐอเมริกา

²Pacific Northwest National Laboratory, Biological Sciences Division, Richland, WA, United States

³ห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์โมเลกุลสิ่งแวดล้อม Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, United States

⁴Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, MI, สหรัฐอเมริกา

คำสำคัญ:โกลเมอรูลัส, แมสสเปกโตรเมทรี, การวิเคราะห์เซลล์เดียว, โปรตีโอมิกส์,ไต

การประเมินระดับโมเลกุลที่ระดับเซลล์เดียวสามารถเร่งการวิจัยทางชีววิทยาโดยให้การประเมินโดยละเอียดของการจัดระเบียบของเซลล์และความแตกต่างของเนื้อเยื่อทั้งในโรคและสุขภาพ มนุษย์ไตมีสถานะหลายเซลล์ที่ซับซ้อนพร้อมฟังก์ชันการทำงานที่แตกต่างกัน ซึ่งตอนนี้ส่วนใหญ่สามารถควบคุมได้อย่างสมบูรณ์ด้วยความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีล่าสุดในโปรตีโอมิกส์ของเนื้อเยื่อในระดับเซลล์ใกล้เดียว เราหารือเกี่ยวกับขั้นตอนพื้นฐานในการใช้งานครั้งแรกของวิธีการโปรตีโอมิกส์ที่ใช้แมสสเปกโตรเมตรี (MS) สำหรับการวิเคราะห์ส่วนย่อยของมนุษย์ปกติไตเป็นส่วนหนึ่งของโครงการ Kidney Precision Medicine Project (KPMP) ด้วยการใช้เลเซอร์ประมาณ 30-40 เซลล์ไตที่ผ่าด้วยเลเซอร์ขนาดเล็ก เราได้ระบุโปรตีนของมนุษย์มากกว่า 2,500 ชนิด โดยมีความจำเพาะต่อหลอดใกล้เคียง(PT; โปรตีน n=25 รายการ) และบริเวณไต (Glom; n=67 โปรตีน) ของไตและหน้าที่เมตาบอลิซึมที่เป็นเอกลักษณ์ การศึกษานำร่องนี้จัดทำแผนงานสำหรับการประยุกต์ใช้เวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกส์เซลล์ใกล้เซลล์เดียวของเราสำหรับการวิเคราะห์ช่องไมโครไตอื่นๆ ในขนาดที่ใหญ่ขึ้น เพื่อแก้ปัญหาการรบกวนการทำงานของเซลล์ย่อยของไตในไตปกติตลอดจนสาเหตุต่างๆ เฉียบพลันและเรื้อรังโรคไต.

cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไตได้

บทนำ

ความก้าวหน้าล่าสุดในการจัดทำโปรไฟล์ระดับโมเลกุล โดยเฉพาะการวิเคราะห์การถอดรหัสที่ระดับเซลล์เดียว สามารถเปิดเผยจำนวนเซลล์ที่หายากภายในเนื้อเยื่อทางคลินิกที่ต่างกัน ซึ่งเอื้อต่อความเข้าใจของเราเกี่ยวกับชีววิทยาของไตและกระบวนการระดับโมเลกุล (1–7) มีความจำเป็นที่ยังไม่บรรลุผลในการพัฒนาวิธีการที่สามารถให้ข้อมูลทางชีววิทยาที่ครอบคลุมในระดับ RNA และ DNA และยังช่วยให้สามารถวิเคราะห์เนื้อเยื่อโปรตีโอมิกเซลล์เดียวได้

เทคโนโลยีโปรตีโอมิกซึ่งแตกต่างจากจีโนมสามารถให้ข้อมูลการทำงานเกี่ยวกับสถานะเซลลูลาร์และเครือข่ายการกำกับดูแล (2) ความท้าทายทางเทคโนโลยีสำหรับโปรตีโอมิกส์ที่ใช้แมสสเปกโตรสโคปีคือข้อจำกัดของวัสดุตั้งต้น โปรตีโอมิกส์ไม่อนุญาตให้มีการขยายระดับโมเลกุลต่างจากทรานสคริปโทมิกส์ factoid นี้ส่งผลให้มีความพยายามอย่างมากในการเพิ่มความไวในการวิเคราะห์ของโปรตีโอมิกส์ที่ใช้ MS รวมถึงการย่อขนาดเทคโนโลยีและประสิทธิภาพที่สูงขึ้นที่แหล่งกำเนิดอิออไนเซชันด้วยไฟฟ้า (8, 9) ซึ่งขณะนี้ความไวในการวิเคราะห์เพียงพอที่จะตรวจจับโปรตีนในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเดี่ยว เซลล์. แม้จะมีความไวในการวิเคราะห์สูง แต่การประยุกต์ใช้โปรตีนกับตัวอย่างที่มีปริมาณน้อยทำให้เกิดความท้าทายเพิ่มเติม เช่น การดูดซับโปรตีนและเปปไทด์แบบไม่จำเพาะต่อพื้นผิวของหลอดปฏิกิริยา จลนพลศาสตร์ของการย่อยอาหารที่ไม่มีประสิทธิภาพ ความจำเป็นในการทำความสะอาด และความท้าทายในการนำส่ง เมื่อเร็วๆ นี้ กลุ่มของเราได้รายงานเกี่ยวกับวิธีการโปรตีโอมิกเซลล์ใกล้เซลล์เดียว (nscProteomics) ในเซลล์ HeLa ซึ่งให้เทคโนโลยีที่เป็นนวัตกรรมและมีความละเอียดอ่อนสูงสำหรับการวัดโปรตีโอมของตัวอย่างด้วยปริมาณโปรตีนในระดับนาโนนาโนกรัมจากเซลล์จำนวนน้อย (10) วิธีนี้ต้องใช้อุปกรณ์การประมวลผลตัวอย่างที่ปรับแต่งได้สูง และยากต่อการถ่ายโอนไปยังห้องปฏิบัติการวิจัยอื่นในสถานะการพัฒนาในปัจจุบัน มนุษย์แปรรูปไตเนื้อเยื่อผ่านไปป์ไลน์นี้จำเป็นต้องให้ความสนใจอย่างใกล้ชิดกับการพัฒนาโปรโตคอลเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรักษาเนื้อเยื่อและการดักจับเซลล์

ในการศึกษานี้ เราได้มุ่งเน้นไปที่การจัดทำแผนงานสำหรับการวัดผลการสอบปากคำโปรตีโอมิกของช่องย่อยต่างๆ ของไตที่ระดับเซลล์ใกล้เซลล์เดียว โดยมีผลลัพธ์ดังต่อไปนี้: (i) การประเมินการรวบรวมและจัดเก็บเนื้อเยื่อไตที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ nscProteomics; (ii) การระบุมาตรฐานอ้างอิงที่เหมาะสมสำหรับ nscProteomics; (iii) การเพิ่มประสิทธิภาพของความหนาของเนื้อเยื่อไตสำหรับ microdissection การจับด้วยเลเซอร์ (LCM); (iv) การเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์ LCM; (v) คำอธิบายของวิธี nscProteomics โดยใช้วิธีการ micro POTS แบบอัตโนมัติโดยใช้ LC-MS (μPOTS; การประมวลผลในหม้อเดียวสำหรับตัวอย่าง Trace) (11); (vi) การวิเคราะห์ข้อมูลสำหรับ nscProteomics

เพื่อให้บรรลุภารกิจดังกล่าว เราได้ดำเนินการ 11 คนที่ไม่ซ้ำกันไตการตรวจชิ้นเนื้อและโปรโตคอลและวิธีการที่พัฒนาขึ้นเพื่อรวบรวม ประมวลผล และซักถามการแสดงออกของโปรตีนของมนุษย์ไตตัวอย่างโดย μPOTS เมื่อใช้ร่วมกับ LC-MS ที่มีความไวสูง เราจะแสดงวิธี μPOTS แบบอัตโนมัติเต็มรูปแบบ ซึ่งช่วยให้สามารถทำซ้ำได้ และให้การวัดเชิงปริมาณโปรตีโอมิกของโปรตีน ~3000 จาก 10 ถึง 100 เซลล์ไตที่ผ่าด้วยเลเซอร์ขนาดเล็ก (LCM) ระดับความครอบคลุมที่ทำได้ก่อนหน้านี้สำหรับเซลล์หลายพันเซลล์ (12–17) การศึกษานี้จะช่วยในการจำแนกลักษณะโมเลกุลของความแตกต่างของเซลล์เนื้อเยื่อและพยาธิสภาพในการตัดชิ้นเนื้อไตจากผู้ป่วยที่มีสาเหตุต่างๆ ของโรคไตเฉียบพลันและเรื้อรัง เทคโนโลยีที่เป็นเอกลักษณ์นี้มีศักยภาพในการคลี่คลายความแตกต่างของโปรตีนและเครื่องหมายโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะที่แตกต่างกันไตชนิดย่อยของโรคและโครงสร้างย่อยที่จะสัมพันธ์กับการเกิดโรค การพยากรณ์โรค และการแบ่งชั้นความเสี่ยง การศึกษาสรุปไว้ในรูปที่ 1

รูปที่ 1 เวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกเซลล์เดียว (nscProteomics) ที่ใกล้เคียงได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการประมวลผลของมนุษย์ไตเนื้อเยื่อ เวิร์กโฟลว์รวมถึงการระบุตัวที่เหมาะสมที่สุดไตการเก็บและจัดเก็บเนื้อเยื่อ การควบคุมคุณภาพสำหรับการสร้าง microdissection การจับด้วยเลเซอร์ของวิธี nscProteomics สำหรับเซลล์ไต

ขั้นตอนการทดลอง

เรียนออกแบบ

การแสดงแผนผังของการศึกษาโปรตีโอมิกที่ดำเนินการกับภาวะปกติของมนุษย์ที่ไม่ซ้ำกัน 11 แบบไตแสดงในรูปที่ 2A ดำเนินการรันแมสสเปกโตรเมตรี (MS) ทั้งหมด 28 ครั้งสำหรับ nscProteomics ที่ผ่าด้วยเลเซอร์จำนวนมากและการดักจับด้วยเลเซอร์บนส่วนที่เป็นคู่ของไต (Glom) และส่วนท่อที่ซับซ้อนใกล้เคียง (PT) เนื้อเยื่อจากสองตัวแรกไตถูกเก็บรักษาไว้เป็น FFPE และในตัวกลางของสารประกอบที่มีอุณหภูมิตัดที่เหมาะสม (OCT) ปัญหาเนื้อเยื่อไตจากไตอีก 9 ตัวได้รับการประมวลผลในเดือนตุลาคมเท่านั้น (รูปที่ 2A)

รูปที่ 2 (A) สรุปตัวอย่างการศึกษาและการสอบวิเคราะห์ (B) พล็อต QC สำหรับการทำซ้ำของกระบวนการโดยใช้เนื้อเยื่อ OCT ความแตกต่างของการนับสเปกตรัมระหว่างโปรตีนสำหรับการวิ่ง 2 ครั้งแยกกันโดยใช้เนื้อเยื่อ OCT ถูกวางแผนเทียบกับจำนวนสเปกตรัมโปรตีนเฉลี่ยสำหรับโปรตีน 1,257 โปรตีน ในโครงเรื่อง เส้นสีน้ำเงินแสดงถึงความแตกต่างเฉลี่ย เส้นสีแดงและสีเขียวแสดงถึงขีดจำกัด 2 SD และ 3 SD ตามลำดับ 97.96 เปอร์เซ็นต์ของโปรตีนอยู่ภายในขีดจำกัดความสามารถในการทำซ้ำที่คำนวณได้ที่ 13.52 ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถในการทำซ้ำในระดับสูง นอกจากนี้ยังพบว่าความแปรปรวนระหว่างการวิ่งของกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับเนื้อเยื่อ OCT นั้นต่ำกว่ากระบวนการที่เกี่ยวข้องกับเนื้อเยื่อ FFPE (ขีดจำกัดความสามารถในการทำซ้ำที่คำนวณได้: 24.43) (C) การเปรียบเทียบการกระจายตัวนับสเปกตรัมของโปรตีนทั่วไป 374 ชนิดใน OCT และ FFPE โปรตีนจำนวนมากจากเนื้อเยื่อ OCT แสดงจำนวนสเปกตรัมสูง ในขณะที่โปรตีนจากเนื้อเยื่อ FFPE มีความเหนือกว่าของการนับสเปกตรัมต่ำ (D) การเปรียบเทียบการกระจายตัวนับสเปกตรัมของโปรตีน 76 ชนิดใน FFPE และโปรตีนที่ไม่ซ้ำกัน 244 ชนิดในเดือนตุลาคม ความเหนือกว่าของโปรตีนที่มีจำนวนสเปกตรัมต่ำจะเห็นได้ในเนื้อเยื่อ OCT นี่อาจบ่งชี้ว่าเทคนิคเนื้อเยื่อ OCT ดีกว่าสำหรับการตรวจหาโปรตีนที่มีปริมาณมากน้อยในสถานการณ์ปัจจุบัน ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนที่ระบุจากเนื้อเยื่อแช่แข็ง 2 OCT คือ 0.96 (P <>

การได้มาซึ่งตัวอย่างเนื้อเยื่อไต

มนุษย์เนื้อเยื่อไตรวบรวมจากไตเทียมบางส่วนที่ไม่ระบุตัวตนทั้งหมด 11 ชิ้น ซึ่งได้จาก University of California San Francisco (UCSF) และ University of Michigan (UM) โดยได้รับอนุมัติจาก IRB ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาความเป็นไปได้ด้านเทคโนโลยีนำร่องใน NIH Kidney Precision Medicine โครงการ (เคพีเอ็มพี). เฉพาะพื้นที่เพื่อสุขภาพของไตตามที่กำหนดโดยนักพยาธิวิทยาที่ผ่านการฝึกอบรมมาใช้เพื่อจุดประสงค์นี้ ตัวอย่างไม่ระบุชื่อโดยมีข้อแม้เพียงข้อเดียวคือเก็บเนื้อเยื่อจากผู้ใหญ่ เพื่อประเมินโปรโตคอลการเก็บตัวอย่างที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเทคโนโลยี เริ่มแรก ~100 มก. ของเนื้อเยื่อจาก 2 ไตถูกแบ่งเท่าๆ กัน และเตรียมเป็นส่วนเนื้อเยื่อที่ฝังพาราฟินแบบตรึงฟอร์มาลิน (FFPE) หรือถูกแช่แข็งใน สารประกอบ OCT ของเนื้อเยื่อ-Plus™ (Fisher Scientific) ตัดส่วนต่อเนื่องกันหนา 5 ไมโครเมตรและหนา 10 ไมโครเมตรหนึ่งชิ้นจากบล็อก OCT แต่ละบล็อกด้วยไครโอ-ไมโครโตม และติดตั้งบนสไลด์เมมเบรน 1.0 พอลิเอทิลีนเทเรพทาเลต (Zeiss) สำหรับไตและหลอดใกล้เคียงการผ่า ส่วนที่มีความหนา 5 ไมครอนถูกย้อมด้วย H&E เพื่อให้เห็นภาพโครงสร้างทางเนื้อเยื่อที่สำคัญ ส่วนที่มีความหนา 10 μm ที่เหลือไม่มีสีย้อม สไลด์ทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ −80 องศาจนกระทั่งผ่า

Cistanche สำหรับการปรับปรุงความผิดปกติของไต

การประเมินผลกระทบของการขนส่งเนื้อเยื่อและการแปรรูปต่อผลผลิตที่เป็นโปรตีน

เพื่อประเมินผลกระทบของความล่าช้าในการวิเคราะห์โปรตีนของเนื้อเยื่อแช่แข็ง OCTไตtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 ชั่วโมงเดินทางออกไปและประมวลผลที่ศูนย์ที่สองและในทางกลับกัน โปรตีโอมิกส์จำนวนมากได้ดำเนินการบน 2 ตัวที่ไม่ซ้ำกันไต(ไต #3, #4) จัดหาที่มหาวิทยาลัยมิชิแกน และส่งไปยัง 2 สถานที่ที่แตกต่างกัน (มหาวิทยาลัยแห่งรัฐโอไฮโอและ UCSF) สำหรับการวิเคราะห์ MS โดยใช้โปรโตคอลและพารามิเตอร์ MS เดียวกันที่ไซต์ทั้งสอง จากนั้นเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการดำเนินการ MS ระหว่าง 2 ไซต์

การสกัดโปรตีนและการตกตะกอน

สิ่งนี้ถูกดำเนินการทั้งบน OCT และวิธีเตรียมเนื้อเยื่อ FFPE สำหรับการเลือกวิธีการที่เหมาะสมที่สุดสำหรับโปรตีโอมิกส์ของเนื้อเยื่อ เนื้อเยื่อ OCT ถูกแบ่งเป็นส่วนที่มีความหนา 10 ไมโครเมตรโดยใช้ไครโอมิโครโตม ในการเลือกเนื้อเยื่อจำนวนน้อยที่สุดที่จำเป็นสำหรับการสกัดโปรตีนสำหรับ MS สามลอน (ส่วนที่ใส่ในหลอดเอพเพนดอร์ฟแทนที่จะกระจายบนสไลด์) และเนื้อเยื่อแช่แข็ง 5 ลอนถูกตัด ละลาย และโอนไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ มีเม็ดบีดสแตนเลส 5 มม. (Qiagen) สัมผัสกับ Mammalian Cell Lysis Buffer (รวมถึง Benzonase® Nuclease และ Protease Inhibitor Solution; Qiagen) และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน TissueLyser LT (Qiagen) ที่ 50 r/s เป็นเวลา 3 นาที ความเข้มข้นของโปรตีนถูกหาปริมาณ (การทดสอบ Bradford; Thermo Scientific) และเก็บไว้ที่ -20 องศาจนกว่าจะใช้ เนื้อเยื่อที่เก็บไว้สำหรับ<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

การย่อยทริปซิน

ประมาณ 150 ไมโครกรัมของโปรตีนทั้งหมด (~15 เปอร์เซ็นต์ของอินพุตที่มีอยู่) สัมผัสกับสารรีดิวซ์ (200 mM DTT และ 100 mM Tris-HCl) และสารทำปฏิกิริยาที่เป็นด่าง (200 มิลลิโมลาร์ ไอโอโดอะซีตาไมด์ และ 100 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl) จากนั้นเจือจางด้วยน้ำปราศจาก RNAse/DNAse เพื่อลดความเข้มข้นของยูเรียเป็น 0.6 โมลาร์ เติมทริปซิน (ซิกม่า) สุกร 4 ไมโครกรัม และตัวอย่างย่อยที่ 37 องศา ความเข้มข้นของโปรตีนถูกหาปริมาณ (การทดสอบ Bradford; ThermoScientific) และใช้โปรตีน 10 ไมโครกรัมสำหรับ MS

MS สำหรับ Bulk Proteomics เพื่อประเมินวิธีการประมวลผลเนื้อเยื่อไตที่เหมาะสมที่สุด

ของผสมทริปติกเปปไทด์ถูกทำให้เป็นกรดด้วยกรดฟอร์มิก ทำความสะอาดด้วยคอลัมน์ C18 Monospin และวิเคราะห์บน Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) MS/MS ถูกดำเนินการโดยใช้ Higher-Energy C-Trap Dissociation (HCD) วิเคราะห์มวลสเปกตรัมโดยใช้ Byonic v2.14.27 (ตัวชี้วัดโปรตีน) ยอมให้มีพิกัดความเผื่อมวล 12 ppm การดัดแปลงหลังการแปลที่เปลี่ยนแปลงได้ได้รับอนุญาตสำหรับ ซึ่งรวมถึงออกซิเดชัน, เมทิเลชัน, คาร์บาไมเลชันและฟอสโฟรีเลชัน โปรตีนจำกัดเฉพาะผู้ที่ให้คะแนนได้ดีกว่าอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) 1 เปอร์เซ็นต์ เปรียบเทียบปริมาณโปรตีนและข้อมูล MS เพื่อเลือกวิธีการที่เหมาะสมที่สุดสำหรับไตการเก็บเนื้อเยื่อระหว่าง FFPE และ OCT

เลเซอร์ดักจับไมโครดิสเซกชั่น

ชิ้นงานที่มีความหนา 5, 10 และ 20 μM แบบไม่ย้อมสีที่ติดตั้งบนสไลด์ PET ถูกวางบนแท่นตัดเฉือนไมโครบีมเลเซอร์ Zeiss PALM (Zeiss) เพื่อทดสอบความหนาในการตัดที่เหมาะสมที่สุด ไตและหลอดใกล้เคียงพื้นที่ถูกเลือกโดยใช้เครื่องมือด้วยมือเปล่า และทำการผ่าที่วัตถุประสงค์ 10X จับส่วนที่มีพื้นที่ ~4,580 μm2 และความหนา 10 uM ซึ่งคิดเป็น ~40 เซลล์ไตตามสูตรที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้สำหรับการประมาณค่าเซลล์ไตในผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดีไต(18). สำหรับหลอดใกล้เคียงเซลล์ เราได้จับ ~2,900 μm2 ของหลอดใกล้เคียงเซลล์ ซึ่งคิดเป็น ~36 เซลล์ ส่วนที่ตัดถูกยิงเข้าไปในฝากาวทึบแสง 200 ไมโครลิตร (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) และเก็บไว้ที่ −80 องศา

โปรตีโอมิกส์ใกล้เซลล์เดียว (nscProteomics)

ในการละลายโปรตีนที่เก็บรวบรวมในแคปจับด้วย LCM หยด 10 ไมโครลิตรของ 0.1 เปอร์เซ็นต์ DDM 50 มิลลิโมลาร์ Tris pH 8 ถูกเติมโดยตรงไปยังแคป ตัวอย่างถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 องศาในเทอร์โมมิกซ์เซอร์ Eppendorf ThermoTop เพื่อลดการระเหย ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 2,000 × g เป็นเวลา 1 นาทีเพื่อถ่ายโอนไลเซทไปยังขวด โปรตีนถูกทำให้ลดลงด้วยไดไทโอไทรอิทอล 5 มิลลิโมลาร์และบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที ดำเนินการอัลคิเลชันที่ 10 มิลลิโมลาร์ไอโอโดอะซีตาไมด์ด้วยการฟักตัว 45 นาทีในความมืดที่ 25 องศา ต่อมา เพิ่มส่วนลิคอต 10 ng ของ Ls-C ตามด้วยการฟักตัว 3 ชั่วโมงที่ 25 องศา จากนั้นจึงเติมทริปซินส่วนย่อย 10 ng ตามด้วยการย่อยข้ามคืนที่ 25 องศา เปปไทด์ที่ถูกย่อยถูกผสมกับส่วนลิคอต 15 ไมโครลิตรของน้ำ 18 MΩ

แพลตฟอร์ม LC-MS สำหรับตัวอย่างขนาดเล็กพิเศษ

ตัวอย่างเปปไทด์ (25 ไมโครลิตร) ถูกแยกโดยใช้คอลัมน์ 60 ซม. ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 50 ไมโครเมตรและตัวปล่อยแบบรวม (วัตถุประสงค์ใหม่) คอลัมน์ถูกบรรจุภายในด้วยสื่อ Waters BEH เส้นผ่านศูนย์กลาง 1.7 μm การไล่ระดับสี 100-นาทีถูกสร้างขึ้นโดยใช้ปั๊มนาโน Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific) ระบบนี้เชื่อมต่อกับแมสสเปกโตรมิเตอร์ QExactive Plus (Thermo Scientific) สเปกตรัมมวลถูกรวบรวมจาก 300 ถึง 1,800 m/z โดยใช้วิธีการรับที่ขึ้นกับข้อมูล 12 อันดับแรก สเปกตรัม MS1 ถูกรวบรวมด้วยความละเอียดมวล 35K และ MS2 ที่มี 17.5K มีการใช้ IT สูงสุด 100 ms เพื่อเพิ่มการระบุจากไอออนที่มีความอุดมสมบูรณ์ต่ำ

การสกัดข้อมูลโปรตีโอมิก

ไฟล์ดิบทั้งหมดได้รับการประมวลผลโดยใช้ MaxQuant (เวอร์ชัน 1.5.3.30) สำหรับการตรวจจับคุณลักษณะ การค้นหาฐานข้อมูล และการหาปริมาณโปรตีน/เปปไทด์ (19) ตามการตั้งค่าที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (10) สเปกตรัมมวลควบคู่ถูกค้นหาในฐานข้อมูลมนุษย์ UniProtKB/Swiss-Prot (ดาวน์โหลดเมื่อวันที่ 29 ธันวาคม 2018 และมีรายการตรวจสอบ 20,417 รายการ) ข้อมูล MS proteomics สำหรับ nscProteomics ถูกฝากไปยัง ProteomeXchange Consortium ผ่านที่เก็บของพาร์ทเนอร์ PRIDE (20) ด้วยตัวระบุชุดข้อมูล PXD015058 และ 10.6019/PXD015058

การวิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูล MS ได้มาจากการดำเนินการที่ PNNL (nscProteomics) และ Stanford University (bulk proteomics) สำหรับโปรตีโอมิกส์จำนวนมาก ใช้วิธีการทางสถิติต่อไปนี้ในการเลือกค่าที่เหมาะสมที่สุดไตวิธีการเก็บเนื้อเยื่อ ไม่ว่าจะแช่แข็งใน OCT หรือถูกแปรรูปเป็น FFPE ตามที่ประเมินโดยโปรตีโอมิกส์ปริมาณมากของเนื้อเยื่อ (i) ผลผลิตโปรตีน/มิลลิกรัมของเนื้อเยื่อป้อนเข้าที่เท่ากันถูกคำนวณ; (ii) ความสามารถในการทำซ้ำของ MS ถูกทดสอบบนเอาต์พุต MS จากส่วน FFPE และ OCT จากไตแต่ละ 2 ข้าง ซึ่งเตรียมโดยบุคคลเดียวกันโดยใช้โปรโตคอลเดียวกัน วิเคราะห์ด้วยเครื่องมือ MS เดียวกันโดยใช้โปรโตคอลที่กำหนดไว้ ห่างกันสองสามวัน (21) ขีดจำกัดความสามารถในการทำซ้ำ (22) ถูกใช้เพื่อให้ขอบเขตโดยประมาณของความแตกต่างในการวัดระหว่างการรันต่อเนื่องของกระบวนการเดียวตลอดจนค่าประมาณของความแม่นยำสำหรับการเปรียบเทียบระหว่างกระบวนการ คำนวณค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ซึ่งกำหนดระดับของข้อตกลงระหว่างการวิ่งต่อเนื่องกัน (โดยใช้เนื้อเยื่อเดียวกัน) (iii) ความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนและการกระจายขนาดชิ้นส่วนเปปไทด์ถูกคำนวณเพื่อประเมินความผันแปรที่เกิดจากการเสื่อมสลายของโปรตีน การเชื่อมขวางเนื่องจากฟอร์มาลิน ฯลฯ แง่มุมอื่น ๆ ของ QC รวมถึง (iv) การประเมินกระบวนการลอยเหนือการทำซ้ำและเวลาโดยใช้แหล่งรวมทั่วไปไตการอ้างอิงและ (v) การคำนวณอคติ การวิเคราะห์เชิงปริมาณที่เข้มงวดและการระบุโปรตีนเฉพาะที่ใช้ข้อมูลเฉพาะกับโปรตีนที่มีจำนวนสเปกตรัมมากกว่าหรือเท่ากับ 5 (23) การทดสอบที่แม่นยำของฟิชเชอร์ใช้เพื่อประเมินการเพิ่มคุณค่าของโปรตีนทั่วไปและโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะซึ่งจับคู่ระหว่างไตปกติของมนุษย์ 2 ตัว (#1 และ #2) จากการวิเคราะห์ข้างต้น (ดูผลลัพธ์) เนื้อเยื่อแช่แข็ง OCT ถูกเลือกเป็นวิธีการรวบรวมสำหรับการวิเคราะห์ที่ตามมาทั้งหมด

ขั้นตอนต่อไปของการมุ่งเน้นการวิเคราะห์ข้อมูลคือการระบุ หาปริมาณ และตรวจสอบชุดโปรตีนที่อุดมไปด้วยหรือจำเพาะสำหรับเซลล์ ~10-100 ที่ได้รับจากแต่ละเซลล์ที่เลือกไว้สองตัวไตช่องย่อย—ภูมิภาค Glom และ PT ได้มาจากไต, โดยจำนวนมากและ LCM ของ OCT แช่แข็งเนื้อเยื่อไต(n=9; ไต #3–11) และดำเนินการโดย nscProteomics

มีการใช้วิธีการกรองแบบกึ่งอนุรักษ์นิยมขั้นตอน {{0}} ขั้นตอนเพื่อจัดการกับปัญหาข้อมูลที่ขาดหายไป/ข้อมูลที่ไม่สมบูรณ์ และการทดสอบ G-test (24) ใช้เพื่อระบุว่าข้อมูลสูญหายแบบสุ่ม (MAR) หรือไม่ หรือหายไปไม่สุ่ม (MNAR) การประเมินความน่าเชื่อถือของข้อมูลเพิ่มเติมทำได้โดยการเลือกโปรตีนที่สังเกตพบอย่างเข้มงวดมากกว่าหรือเท่ากับร้อยละ 50 ของกลุ่มตัวอย่างทั้งหมด การทดสอบ T ใช้เพื่อระบุการเสริมสมรรถนะของโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญใน glomming หรือ PT และการแก้ไขการทดสอบหลายรายการ (Benjamini-Hochberg FDR) ที่มีขีดจำกัดนัยสำคัญที่ 0.1 ถูกนำไปใช้ สำหรับวัตถุประสงค์ของการวิเคราะห์ ข้อมูล MS ความเข้มสัมพัทธ์ (บันทึก 2 ที่แปลงแล้ว) ที่ได้จาก Glom, PT และเศษส่วนจำนวนมากจากเศษส่วนเดียวไตถือว่าเข้าคู่กัน เราระบุโปรตีนที่อุดมด้วย Glom (มีระดับ PT ต่ำ/ เป็นกลุ่ม) และมีลักษณะเฉพาะสำหรับ Glom (ไม่มีใน PT) เช่นเดียวกับโปรตีนที่อุดมด้วย PT (ที่มีระดับต่ำใน Glom/ เป็นกลุ่ม) และมีลักษณะเฉพาะสำหรับ PT (ไม่มีใน Glom) . การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าทำได้เฉพาะกับข้อมูลโดยปราศจากค่าในแต่ละกลุ่มเพื่อเพิ่มความมั่นใจ ความสัมพันธ์ระหว่างค่าความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนทั่วไปถูกใช้เพื่อประเมินระดับของข้อตกลงระหว่างโปรตีนในช่องย่อยที่เสริมสมรรถนะระหว่างการทดลองแยกกันในการทดลองเดียวกัน นอกจากนี้เรายังทำการตรวจสอบความถูกต้องไขว้ของโปรตีนที่เสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญในแต่ละช่องโดยแยกการเปรียบเทียบเหล่านี้จากชุดตัวอย่างที่ไม่ซ้ำกันระหว่างการวิ่ง 2 รอบที่แตกต่างกัน การวิ่งที่ 1 และการวิ่งที่ 2 การตรวจสอบความถูกต้องทางชีวภาพสำหรับชุดโปรตีนที่มีช่องย่อยที่เสริมสมรรถนะ (Glom และ PT) ดำเนินการโดย การค้นหาว่าโปรตีนที่เสริมสมรรถนะของช่องย่อยที่รู้จักสามารถแปลกลับไปยังภูมิภาคเฉพาะในข้อมูลสาธารณะจาก Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) ได้หรือไม่ (25)

Cistanche สำหรับอาการไตวาย

การเปรียบเทียบ/การรวมข้อมูลข้าม Omics

เพื่อประเมินความสอดคล้องของการแสดงออกของโปรตีนที่ระดับ RNA ข้อมูลที่สร้างขึ้นจากการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว (scRNA Seq) ดำเนินการใน 10 nephrectomies ดั้งเดิมซึ่ง 9 ในนั้นซ้อนทับกับไตใช้ใน nscProteomics สำหรับสิ่งนี้ แพลตฟอร์ม 10x Genomics Chromium ที่มีเคมี v3 ถูกใช้โดยใช้วิธีการที่ปรับให้เหมาะสมในห้องปฏิบัติการ Sarwal เป็น Tissue Interrogation Site (TIS) ของ KPMP Consortium (ต้นฉบับที่มีรายละเอียดวิธีการและผลลัพธ์อยู่ในระหว่างเตรียมการ) สำหรับการวิเคราะห์แบบไขว้นี้ เราใช้ข้อมูลการถอดรหัสจาก 45,411ไตเซลล์ถูกแยกออกเป็นเก้าประเภทหลัก: Podocytes, mesangial cells, glomerular endothelium, stroma/interstitium, เซลล์ภูมิคุ้มกัน,หลอดใกล้เคียง, แขนขาขึ้นหนาของห่วง Henle, ท่อส่วนปลาย/ส่วนต่อ และท่อรวบรวม การวิเคราะห์ข้อมูลเซลล์เดียวทำได้โดยใช้แพ็คเกจ Seurat R เวอร์ชัน 2.3.4 การวิเคราะห์เชิงลึกเพิ่มเติมของข้อมูลนี้อยู่ในระหว่างการพัฒนา (26)

จาก: 'การทำโปรไฟล์โปรตีโอมิกส์ใกล้เซลล์เดียวของProximal Tubularและโกลเมอรูลัสของมนุษย์ธรรมดาไต' โดย Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Lu Sur4, Yinghuio Yang4, Wei-Jun Qian2* และ Minnie M. Sarwal1* สำหรับไตโครงการยาแม่นยำ (KPMP) Consortium

---บทความวิจัยต้นฉบับด้านหน้า พ., 17 กันยายน 2020 |