Ishophloglucin A ที่แยกได้จาก Ishige Okamurae ยับยั้งการสร้าง Melanogenesis ที่เกิดจาก -MSH: ในหลอดทดลองและใน Vivo ตอนที่ 2

3. การอภิปราย

สดุด

สารประกอบ DPHC ที่แยกได้จาก IOE ได้รายงานการยับยั้งไทโรซิเนสแล้วกิจกรรมและผลการป้องกันต่อการทำลายเซลล์ที่เกิดจากรังสี UV-Bในหลอดทดลอง[8]; อย่างไรก็ตาม,ฤทธิ์ต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสของส่วนประกอบที่ได้จาก IOE ใน silico โดยอันตรกิริยากับไทโรซิเนส,ในร่างกายในการศึกษาฟีโนไทป์ในแบบจำลองสัตว์ และกลไกระดับโมเลกุลพื้นฐานยังไม่ได้ตรวจสอบ ในการศึกษาปัจจุบัน เราได้พิจารณาการต่อต้านเมลาโนเจเนซิสและไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้งของ IPA, phlorotannin ที่แยกได้จาก IO และ IOE ในแบบจำลองสัตว์มีกระดูกสันหลังของ zebrafishในร่างกายและในเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16F10 ในหลอดทดลอง หลังจากการเหนี่ยวนำด้วย -MSH.

การรักษาด้วย -MSH เป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นการสังเคราะห์เมลานินและการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนส [20]. นอกจากนี้ ไทโรซิเนสได้รับการพิสูจน์แล้วว่าจำเป็นต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิส [29]. การศึกษาก่อนหน้าได้แสดงให้เห็นว่าการเชื่อมต่อระดับโมเลกุลสามารถใช้ในการประเมินกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนส [30,31]. ดังนั้น การคำนวณการเทียบท่าระดับโมเลกุลจึงถูกดำเนินการเพื่อทำความเข้าใจแบบจำลองการจับของ IPAและ DPHC ซึ่งเป็นโพลีฟีนอลที่รู้จักซึ่งแยกได้จาก IO ซึ่งได้เปิดเผยพลังงานการจับตัวที่สูงขึ้นในฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีเมลาโนเจเนซิสมากกว่าอาร์บูตินซึ่งเป็นตัวควบคุมเชิงบวก ตามผลลัพธ์ (รูปที่1), IPA เปิดเผยคะแนนการเทียบท่าที่ต่ำที่สุด ซึ่งระบุว่าการทำงานร่วมกันของ IPA กับเป้าหมายโปรตีนไทโรซิเนสนั้นแข็งแกร่งกว่าสารประกอบอีกสองตัวคือ DPHC และอาร์บูติน อย่างไรก็ตาม,มีข้อ จำกัด ในการเชื่อมโยงการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสของเห็ดกับกิจกรรมของเซลล์ไทโรซิเนสหรือการผลิตเมลานินในเมลาโนไซต์ที่เพาะเลี้ยง [32]. จึงมีผลยับยั้งของ IPA เมื่อวันที่ตรวจสอบกิจกรรมของไทโรซิเนสและเมลาโนเจเนซิสในปลาเซเบราฟิชในร่างกายโมเดลและหนู B16F10เซลล์มะเร็งผิวหนัง

เม็ดสีเมลานินจะสะสมอยู่บนผิวของปลาเซเบราฟิช ทำให้สามารถสังเกตได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์กระบวนการสร้างเม็ดสีโดยไม่มีขั้นตอนการทดลองที่ซับซ้อนทำให้ได้แบบจำลองที่เหมาะสมเพื่อคัดกรองสารยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิส [33,34]. เราได้ประเมินผลการยับยั้งเมลานินของไอพีเอและ IOE ในแบบจำลองตัวอ่อนของม้าลายที่ถูกกระตุ้นโดย -MSH ผ่านการวัดปริมาณเมลานินตัวอย่างที่ทดสอบทั้งหมดมีผลยับยั้งอย่างลึกซึ้งบนผิวคล้ำ zebrafish ที่ไม่มีนัยสำคัญความเป็นพิษ (รูปที่ S2) มีผลในการยับยั้งของเม็ดสีถูกสังเกตโดยการวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาของตัวอ่อน zebrafish ที่เกี่ยวข้องที่แตกต่างกันการรักษา (รูปที่2). นอกจากนี้การใช้ลูกปลาระยะแรกแทนที่จะเป็นตัวเต็มวัยให้ประโยชน์อีกประการหนึ่งในการทดสอบผลกระทบผ่านผิวหนังของยาหรือสารประกอบเครื่องสำอาง [33,35]. ในกรณีนี้เราเลือก -MSH เป็นตัวเหนี่ยวนำทั้งใน zebrafish ในร่างกายและในเซลล์เมลาโนมา B16F10ในหลอดทดลอง. จากผลลัพธ์ทั้งสองในตัวอ่อนม้าลายและ B16F10เซลล์มะเร็งผิวหนังมีปริมาณเมลานินเพิ่มขึ้น - การกระตุ้น MSH

ปริมาณเมลานินสัมพันธ์โดยตรงกับกิจกรรมและระดับโปรตีนของไทโรซิเนส [36]. ดังนั้น,เราได้กำหนดผลการยับยั้งของ IPA และ IOE ต่อกิจกรรมไทโรซิเนสที่เกิดจาก -MSH บนเซลล์ B16F10 เราพบว่ากลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย IPA มีกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนสและเมลานินลดลงเนื้อหากระตุ้นโดย -MSH โดยลดการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสประมาณ 35 เปอร์เซ็นต์ และ 40 เปอร์เซ็นต์ปริมาณเมลานิน (รูปที่4ก, ค). IOE ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและลดการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ B16F10 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่4ข, ง). เมื่อเทียบกับอาร์บูติน, IPA และIOE มีผลยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญต่อการสร้างเมลานินและกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนสผลการศึกษาการเชื่อมต่อระดับโมเลกุลก่อนหน้านี้

เพื่อศึกษากลไกการออกฤทธิ์ยับยั้งบน - การสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก MSH ในเซลล์ ทำการ blotting แบบตะวันตก ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเมลานิน ได้แก่ERK, JNK และ p38 หลังการรักษาด้วย IPA หรือ IOE ได้รับการประเมิน เปิดใช้งานฟอสโฟรีเลชั่นของ ERK สามารถส่งเสริมการย่อยสลายของ MITF ผ่านทาง ubiquitin–proteasome-dependent pathway [28]. สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าสารยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่อาจเกิดขึ้นอาจยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินโดยการส่งเสริมการย่อยสลายโปรตีนของ MITF ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ ERKทางเดิน [37]. ERK, JNK และ p38 MAPK เป็นของตระกูล MAPK [38–40]. นอกจากนี้,การเปิดใช้งานเส้นทาง p38 MAPK ทำให้เกิดการแสดงออกของ MITF [41]. ในการศึกษานี้ Western blotการวิเคราะห์พบว่า IPA ส่งเสริม p-JNK และ p-p38 (รูปที่5ข, ค). ในทางตรงกันข้าม ระดับของ p-ERKไม่เปลี่ยนแปลงกับการรักษา IPA และ IOE (รูปที่5ก). ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งบอกว่ามีผลยับยั้งของ IPA และ IOE ต่อการทำงานของไทโรซิเนสและเมลาโนเจเนซิสอาจเกี่ยวข้องกับ JNK และ p38เส้นทางการส่งสัญญาณ

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),L-DOPA, ฮอร์โมนกระตุ้นอัลฟาเมลาโนไซต์ ( -MSH) และฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS)ถูกซื้อจาก Sigma–Aldrich Chemical Co. (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่, สหรัฐอเมริกา) Dulbecco ถูกดัดแปลงอาหารเลี้ยงเชื้อของนกอินทรี (DMEM) และซีรั่มวัวในครรภ์ (FBS) ได้รับจาก Invitrogen – Gibco(เกาะแกรนด์ นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK1/2), ERK1 ที่เติมด้วยฟอสโฟรี/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-เทอร์มินอลไคเนส (JNK), JNK ที่มีฟอสโฟรีเลต (p-JNK), p38, ฟอสโฟรีเลตp38 (p-p38), โปรตีนจับองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์ (CREB), CREB ฟอสโฟรีเลต (p-CREB),ปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับ microphthalmia (MITF), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (Trp-2),โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (Trp-1), ไทโรซิเนส (TYR), แอนติบอดีต่อต้านหนูและต่อต้านกระต่าย IgGซื้อมาจาก Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) รีเอเจนต์อื่น ๆ ทั้งหมดรวมถึง -MSH ซื้อจาก Sigma–Aldrich Chemical Co.

4.2. การเชื่อมต่อระดับโมเลกุลของไทโรซิเนส

สำหรับการศึกษาการเทียบท่า โครงสร้างผลึกของไทโรซิเนส (PDB: 3NM8) ได้มาจากธนาคารข้อมูลโปรตีน. การศึกษาการเทียบท่าดำเนินการโดยใช้ CDOCKERใน Accelrys Discovery Studio 30 (Accelrys, Inc., ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) เมื่อมีนิวคลีโอไทด์ครบลำดับถูกปกคลุมด้วยกริดตัวรับ สันนิษฐานว่าลิแกนด์เลือกตำแหน่งด็อกกิ้งที่ดีที่สุด [42]. ขั้นตอนการเชื่อมต่อถูกกล่าวถึงในการศึกษาก่อนหน้า มีสามขั้นตอนสั้น ๆ ดังนี้: (1)การแปลงโครงสร้าง 2 มิติเป็นโครงสร้าง 3 มิติ (2) การคำนวณค่าธรรมเนียม และ (3) การเพิ่มของอะตอมของไฮโดรเจนโดยใช้โปรแกรมเชื่อมต่อแบบยืดหยุ่น [31,43].

4.3. การเตรียม IOE และการแยก IPA

IO เก็บเกี่ยวในเดือนมิถุนายน 2018 ตามแนวชายฝั่งตะวันออกของเกาะเชจู ประเทศเกาหลี สาหร่ายถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำประปาเพื่อขจัดเกลือ, epiphytes และทรายที่ติดอยู่กับพื้นผิว ต่อไปก็ระมัดระวังล้างด้วยน้ำจืดและเก็บรักษาไว้ในตู้เย็นทางการแพทย์ที่−20 ◦ค. หลังจากนั้นก็แช่แข็งสาหร่ายถูกทำให้แห้งและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องบดก่อนการสกัด IOE ถูกแยกออกเป็น 50 เปอร์เซ็นต์เอทานอล (v/v, ในน้ำ) ภายใต้การกวนเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงกรอง ตัวกรองสารสกัดเข้มข้นภายใต้การบีบอัดและทำให้แห้งจนเป็นผง (IOE) เอทานอล 50 เปอร์เซ็นต์สารสกัด IO ดำเนินการโดย Shinwoo Co. Ltd. (Lot No. SW9E29SA, Gyeonggi-do, Korea) IPA เคยเป็นแยกได้จาก IOE ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [9]. โดยสังเขป IOE ถูกแยกส่วนโดยใช้แรงเหวี่ยงโครมาโตกราฟีแบบแบ่งพาร์ติชัน รวบรวมเศษส่วนทั้งหมดและในที่สุด IPA ก็ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย aคอลัมน์ HPLC กึ่งเตรียม (YMC-Pack ODS-A, 10 มม., 250 มม., 5 ม.) IPA ถูกกำหนดให้เป็นโพลีฟีนอลและโครงสร้างทางเคมี (รูปที่ S1, วัสดุเสริม) ถูกระบุผ่าน LC/นางสาวการวิเคราะห์ด้วยมวลm/z ของ 992.1315 ซึ่งบ่งชี้สูตรโมเลกุลของ C96H66O48 (พ.ศ.2529.26น้ำหนักโมเลกุลที่คำนวณได้∆0.6, [M − 2H] 2−).

4.4. กำเนิดและการบำรุงรักษา Parent Zebrafish

ปลาซีเบราฟิชตัวเต็มวัยได้มาจากตัวแทนจำหน่ายเชิงพาณิชย์ (โซลอควาเรียม โซล เกาหลี) และ 10 ตัวปลาถูกเก็บรักษาไว้ในถังอะคริลิก 3-L ที่ 28.5◦C ด้วยแสง 14:10 ชม.: รอบมืด Zebrafish เป็นให้อาหารวันละสองครั้งเป็นเวลา 6 วัน⁄สัปดาห์ ด้วยอาหารเสริม Tetramin เกล็ด (SEWHAPET Food Co.,กรุงโซลประเทศเกาหลีใต้). เก็บตัวอ่อนภายใน 30 นาทีโดยการวางไข่ตามธรรมชาติและกระตุ้นในตอนเช้าด้วยการเปิดไฟ การทดลอง zebrafish ได้รับการอนุมัติจาก Animal Care and Useคณะกรรมการมหาวิทยาลัยแห่งชาติเชจู (การอนุมัติหมายเลข 2017-0001)

4.5. การวัดปริมาณเมลานินในตัวอ่อนปลาม้าลาย

IPA และ IOE และเครื่องกระตุ้น - ใช้ความเข้มข้นของ MSH เพื่อตรวจสอบผลกระทบของความเข้มข้นในการพัฒนาตัวอ่อน ตัวอ่อน zebrafish สิบห้าตัว (3–4 hpf) ถูกเพาะในแต่ละตัวหลุมที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงตัวอ่อนขนาด 1.9 มล. ใน 12-จานเพาะหลุม ตัวอย่างทดสอบถูกละลายใน 1 เปอร์เซ็นต์ DMSO กับ 1× พีบีเอสและผสมให้เข้ากัน ทุกเช้าสำหรับ 5 pdf แรก เอ็มบริโอที่มีชีวิตคือแจกแจงเพื่อให้ได้มาตรวัดความอยู่รอด ในการตรวจสอบเนื้อหาเมลานิน, ตัวอ่อนที่7–9 hpf ถูกเพาะลงใน 6-จานหลุมที่มีตัวอ่อน 30 ตัวในแต่ละหลุมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ 2.7-มิลลิลิตรหลังจาก 3 วัน ล้างตัวอ่อน 2 ครั้งด้วย 1× PBS เพื่อกำจัดรีเอเจนต์ที่ตกค้างหรืออนุภาคและตัวอ่อนจำนวนใกล้เคียงกันถูกใส่เข้าไปในท่ออี ก่อนตรวจวัดค่าเมลานินเนื้อหา, ตัวอ่อนหลายตัวของแต่ละกลุ่มถูกจับด้วยกล้องจุลทรรศน์, และที่เหลือถูกปั่นแยก.

หลังจากการปั่นแยก เม็ดถูกละลายใน 1 มล. ของ 1 N NaOH ที่ 90◦C เป็นเวลา 60 นาที ส่วนผสมจากนั้นจึงถูกหมุนอย่างแรงเพื่อละลายเม็ดสีเมลานิน การดูดซับของสารเหนือตะกอนคือวัดได้ที่ 490 นาโนเมตร ผลลัพธ์ถูกนำไปเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมซึ่งถือว่าเป็นตัวแทนของหนึ่งร้อย. ปริมาณเมลานินได้รับการปรับเทียบตามปริมาณโปรตีนและการสังเกตซ้ำในสามเท่า

4.6. ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ IPA และ IOE ในเซลล์ B16F10

เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู B16F10 ได้รับมาจาก ATCC (American Type Culture Collection,มานาสซาส เวอร์จิเนีย สหรัฐอเมริกา) เซลล์ B16F10 ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย 100 U/มิลลิลิตรของเพนิซิลลิน100 µg/มิลลิลิตรของสเตรปโตมัยซิน และ FBS 10 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นเซลล์จะถูกบ่มในบรรยากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่37 ◦C แล้วนำไปเพาะเลี้ยงย่อยทุกๆ 3-5 วัน ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ IPA และ IOE ต่อ B16F10เซลล์ถูกตรวจสอบผ่าน colorimetric MTT assay กล่าวโดยสังเขป เซลล์ถูกเพาะใน 24-เพลตหลุมที่ a

ความเข้มข้น 2× 104เซลล์/มล. ประมาณ 16 ชั่วโมงหลังจากการเพาะ เซลล์จะถูกบ่มด้วย IPA และ IOEที่แตกต่างกันความเข้มข้นเป็นเวลา 72 ชั่วโมง และพิจารณาความมีชีวิตของพวกมัน

4.7. การกำหนดปริมาณเมลานินของเซลล์

ปริมาณเมลานินของเซลล์ถูกวัดโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [33]. เซลล์(2 × 104 เซลล์/มล) ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ IPA และ IOE เป็นเวลา 72 ชั่วโมง; ดังนั้น,พวกเขาถูกล้างด้วย PBS ที่เย็นจัด โดยสังเขป เซลล์ถูกบ่มที่ 80◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน 1 มล. ของ 1 Nนาโอ/DMSO ร้อยละ 10 และถูกทำให้เป็นน้ำวนเพื่อละลายเมลานิน: วัดค่าการดูดกลืนแสงที่450 นาโนเมตร ความหนาแน่นเชิงแสงของการยับยั้งในกลุ่มควบคุมถือเป็น 100 เปอร์เซ็นต์ ข้อมูลที่มีนำเสนอในรูปของค่าเฉลี่ยร้อยละและผลลัพธ์ถูกทำซ้ำเป็นสามเท่า