การแทรกแซงของ Phenylethanoid Glycosides จาก Cistanche Tubulosa ด้วย MTT Assay

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu และ Yu-Qi Gao

เชิงนามธรรม:

การทดสอบ MTT เป็นวิธีการคัดกรอง มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวัดความมีชีวิตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่าการทดสอบ MTT อาจไม่สะท้อนผลกระทบของCistanche tubulosaสารสกัดเอธานอลต่อความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 เพื่อตรวจสอบและระบุส่วนประกอบที่รับผิดชอบในการสังเกตการณ์ที่ขัดแย้งกันของการทดสอบ MTT, echinacoside และ acteoside แยก phenylethanoid glycosides หลักสองชนิดจากสารสกัด C. tubulosa ethanolic ข้อมูลที่ได้จาก CCK-8, Hoechst 33342 และ annexin V-FITC/PI assays เสนอแนะว่ากลุ่ม caffeoyl ที่มีอยู่ในสารประกอบที่แยกได้ทั้งสองชนิดมีส่วนรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันของการทดสอบ MTT ข้อมูลเหล่านี้เน้นย้ำถึงความจำเป็นในการใช้วิธีการต่างๆ ที่หลากหลายเพื่อกำหนดผลของยาต่อความมีชีวิตของเซลล์เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างผลลัพธ์ที่ทำให้เข้าใจผิด

คำสำคัญ: การทดสอบ MTT;ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์; กรดคาเฟอีน; ความมีชีวิตของเซลล์ การรบกวน

บทนำ

พืชกาฝากCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (วงศ์ Orobanchaceae) มีการกระจายอย่างกว้างขวางในประเทศแอฟริกาเหนือ อาหรับ และเอเชีย [1]. เกิดจากCistanche tubulosaและCistanche deserticolaมีความสำคัญในการแพทย์แผนจีน โดยมีการใช้รักษาอาการหย่อนสมรรถภาพทางเพศ ภาวะเป็นหมัน โรคปวดเอว และอาการท้องผูกเนื่องจากความเฉื่อยของลำไส้ [2] นอกจากนี้ สารสกัดเอธานอลจาก Cistanche tubulosa ยังแสดงให้เห็นว่ามีผลในการป้องกันภาวะขาดออกซิเจนในสมองในหนูทดลองอย่างมีนัยสำคัญ [3]

เซลล์บุผนังหลอดเลือดมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของความดันโลหิตสูงในปอดที่ขาดออกซิเจน สายเซลล์บุผนังหลอดเลือด EA.hy926 คล้ายกันมากกับเซลล์บุผนังหลอดเลือดปฐมภูมิ ในระหว่างการศึกษาของเราเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านภาวะขาดออกซิเจนของCistanche tubulosaสารสกัดเอธานอลบนเซลล์บุผนังหลอดเลือด EA.hy926 เราสังเกตว่า 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) การทดสอบ ซึ่งมักใช้ในการประเมินความมีชีวิตของเซลล์ในการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์และการออกฤทธิ์ของเซลล์ ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันโดยแสดงความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 ที่เพิ่มขึ้นหลังการรักษา

การประเมินความมีชีวิตของเซลล์อย่างแม่นยำเป็นสิ่งสำคัญในการระบุถึงผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์หรือป้องกันเซลล์ของยา ดังนั้นเราจึงตรวจสอบส่วนประกอบที่มีอยู่ในสารสกัดเอธานอลของ C. tubulosa ที่อาจรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันซึ่งสังเกตได้จากการทดสอบ MTT เราแยกฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (PhGs) หลักสองชนิดจากสารสกัดเอทานอล C. tubulosa, echinacoside (ต่อไปนี้เป็นสารประกอบ 1) และแอคทีโอไซด์ (ต่อไปนี้จะเรียกว่าสารประกอบ 2) และกำหนดผลของพวกมันต่อความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 โดยใช้วิธีการที่หลากหลาย นอกจากนี้ เพื่อที่จะชี้แจงเพิ่มเติมว่าหมู่แทนที่ใดของสารประกอบ 1 และ 2 ที่อาจรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้ง เราได้ทดสอบ aglycones, กรด caffeic (ต่อไปนี้จะเรียกว่าสารประกอบ 3) และ 3,4-dihydroxylphenylethanol (ต่อไปนี้จะเรียกว่าสารประกอบ 4) เกี่ยวกับความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 โดยใช้วิธีการเดียวกัน

ผลลัพธ์และการอภิปราย

การระบุสารประกอบ

โครงสร้างของสารประกอบสองชนิดที่แยกได้จากสารสกัดเอธานอลจาก C. tubulosa ถูกระบุโดยการวิเคราะห์ด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้านิวเคลียร์ (NMR) และการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี (MS) และแสดงไว้ในรูปที่ 1 สารประกอบ 1 ถูกระบุเป็นอิชินาโคไซด์โดยการเปรียบเทียบกับ NMR ที่รายงานก่อนหน้านี้ (ตาราง 1) และ MS (m/z 785 [M−H]− ) ข้อมูล [4] สเปกตรัม NMR ของสารประกอบ 2 มีความคล้ายคลึงกันอย่างมากกับพวกของสารประกอบ 1 ยกเว้นการไม่มีอยู่ของหมู่ -D-กลูโคราโนซิล (ตารางที่ 1) สารประกอบ 2 (m/z 623 [M−H]− ) ถูกระบุเป็นแอกทิโอไซด์ [5] อย่างสำคัญ สารประกอบทั้งสองมี aglycone เหมือนกัน ซึ่งรวมถึงกรด caffeic (สารประกอบ 3) และ 3,4-dihydroxylphenylethanol (สารประกอบ 4)

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

การสอบวิเคราะห์ MTT และ CCK{{0}} ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ผลของสารประกอบ 1-4 ต่อความอยู่รอดของเซลล์ EA.hy926 การทดสอบ MTT แสดงให้เห็นว่าความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2 หรือ 3 μM 25 และ 50 μM (166.3 เปอร์เซ็นต์ และ 174.1 เปอร์เซ็นต์ สำหรับสารประกอบ 1, 205.8 เปอร์เซ็นต์ และ 224.3 เปอร์เซ็นต์ สำหรับสารประกอบ 2, และ 164.8 เปอร์เซ็นต์ และ 189.6 เปอร์เซ็นต์ สำหรับสารประกอบ 3, ตามลำดับ; p < 0.05)="" เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม="" (รูปที่="" 2a)="" นอกจากนี้="" การตรวจสอบทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ระบุว่าการบำบัดด้วยสารประกอบ="" 50="" ไมโครเมตร="" 1,="" 2="" หรือ="" 3="" ช่วยเพิ่มการก่อตัวของผลึกฟอร์มาซานสีม่วง="" ซึ่งถือเป็นตัวบ่งชี้โดยตรงของสัดส่วนของเซลล์ที่มีชีวิต="" (รูปที่="" 3)="" ในทางกลับกัน="" การทดสอบ="" cck-8="" เสนอว่าความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยสารประกอบ="" 12.5,="" 25="" และ="" 50="" ไมโครโมลาร์="" 1,="" 2="" หรือ="" 3="" (75.5="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" 45.1="" เปอร์เซ็นต์="" และ="" 43.7="" เปอร์เซ็นต์="" สำหรับสารประกอบ="" 1,="" 85.5="" เปอร์เซ็นต์="" 51.8="" เปอร์เซ็นต์="" และ="" 34.3="" เปอร์เซ็นต์สำหรับสารประกอบ="" 2="" และ="" 64.5="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" 48.2="" เปอร์เซ็นต์="" และ="" 36.4="" เปอร์เซ็นต์="" สำหรับสารประกอบ="" 3="" ตามลำดับ;="" p="">< 0.05)="" เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม="" (รูปที่="" 2b)="" สารประกอบ="" 4="" ไม่ส่งผลต่อความอยู่รอดของเซลล์ในการสอบวิเคราะห์="" mtt="" หรือ="" cck-8="" อย่างใดอย่างหนึ่ง="" ความคลาดเคลื่อนระหว่างผลลัพธ์ที่ได้จากการสอบวิเคราะห์ทั้งสองแบบเสนอแนะว่าหนึ่งในสองการสอบวิเคราะห์อาจไม่ได้สะท้อนถึงผลกระทบของสารประกอบ="" 1="" และ="" 2="" อย่างถูกต้องต่อความมีชีวิตของเซลล์="">

การประเมินการตายของเซลล์โดย Hoechst Staining

Hoechst 33342 เป็นคราบ DNA ที่ซึมผ่านเซลล์ได้ ซึ่งถูกกระตุ้นด้วยแสงอัลตราไวโอเลตและปล่อยแสงฟลูออเรสเซนซ์สีน้ำเงินที่ 460 ถึง 490 นาโนเมตร โครมาตินที่ควบแน่นของเซลล์อะพอพโทติกมีคราบสีสว่างกว่าโครมาตินของเซลล์ปกติ [6] ในขณะที่เซลล์ควบคุมแสดงโครมาติน ออร์แกเนลล์ปกติ และเยื่อหุ้มเซลล์ที่ไม่บุบสลายอย่างสม่ำเสมอ เซลล์ที่ถูกบ่มด้วยสารประกอบ 50 ไมโครโมลาร์ 1, 2 หรือ 3 เป็นเวลา 48 ชั่วโมงแสดงการย้อมตามปกติของเซลล์อะพอพโทติก (รูปที่ 4A) ในทางกลับกัน การเผยให้เซลล์ถึง 50 ไมโครโมลาร์ของสารประกอบ 4 ไม่ได้เพิ่มจำนวนของนิวเคลียสของอะพอพโทติกเมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดกลุ่มควบคุม

การวิเคราะห์โฟลไซโตเมทริกของเซลล์อะพอพโทติก

การสอบวิเคราะห์การย้อมสีสองครั้งของภาคผนวก V-FITC/PI ระบุเซลล์อะพอพโทติกโดยการจับที่มีสัมพรรคภาพสูงของภาคผนวก V-FITC กับฟอสฟาติดิลซีรีน ซึ่งถูกทำให้เป็นภายนอกในเซลล์ที่เกิดการตายของเซลล์ [7] ในการสอบวิเคราะห์นี้ เซลล์ที่มีชีวิตไม่ได้จับกับภาคผนวก V หรือ PI และด้วยเหตุนี้จึงไม่ถูกย้อม (ควอแดรนต์ล่างซ้าย) เซลล์อะพอพโทติกในระยะแรกจะถูกย้อมเป็นสีเขียวโดยการจับของภาคผนวก V-FITC (จตุภาคขวาล่าง) และเซลล์อะพอพโทติกช่วงปลาย เป็นสีเขียวและสีแดงโดยการจับของภาคผนวก V-FITC กับฟอสฟาติดิลซีรีนและ PI กับเซลล์เนื้อตาย ตามลำดับ (จตุภาคบนขวา) ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4B เซลล์ที่ถูกบ่มด้วยสารประกอบ 50 ไมโครโมลาร์ 1, 2 หรือ 3 เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ apoptotic เพิ่มขึ้นจาก 3.74 เปอร์เซ็นต์ (เซลล์ควบคุม) เป็น 10.32 เปอร์เซ็นต์ , 12.95 เปอร์เซ็นต์ และ 11.30 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม สารประกอบ 4 ไม่ได้เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ EA.hy926 ที่เป็นอะพอพโทติก

สอดคล้องกับผลลัพธ์ที่ได้จากการสอบวิเคราะห์ CCK-8 และโดยการย้อมสี Hoechst 33342 การสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่าสารประกอบ 1, 2 และ 3 ทำให้เกิดการตายของเซลล์ EA.hy926 โดยรวมแล้ว การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 ที่สังเกตได้จากการทดสอบ MTT หลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 1-3 ให้ผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ

การอภิปราย

ในปี 1983 Mosmann ได้พัฒนาการทดสอบไมโครเพลท MTT เกี่ยวกับสีสำหรับวัดการเพิ่มจำนวนเซลล์และความเป็นพิษต่อเซลล์ [8] การทดสอบและการดัดแปลงแบบง่ายๆ นี้ ถูกใช้อย่างกว้างขวางในห้องปฏิบัติการชีววิทยาเซลล์ทั่วโลก การศึกษาการแบ่งส่วนในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมระบุว่า NADH ของโคแฟกเตอร์ไพริดีนที่รีดิวซ์คือ NADH มีหน้าที่ในการลด MTT ส่วนใหญ่ สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการศึกษาโดยใช้เซลล์ทั้งหมด [9] ดังนั้นการลด MTT จึงสัมพันธ์กับเซลล์ที่มีฤทธิ์ในการเผาผลาญและไม่เพียงควบคู่ไปกับการหายใจของไมโตคอนเดรีย แต่ยังรวมถึงไซโตพลาสซึมและเยื่อหุ้มเซลล์ที่ไม่ใช่ไมโตคอนเดรีย ซึ่งรวมถึงช่องเอนโดโซม/ไลโซโซมและเยื่อหุ้มพลาสมา [10] ประจุบวกสุทธิบนโมเลกุล MTT เป็นปัจจัยหลักสำหรับการดูดซึมของเซลล์ผ่านศักยภาพของเมมเบรนในพลาสมา

อย่างน่าสังเกต การสอบวิเคราะห์ MTT อาจสะท้อนผลจริงที่สารประกอบที่ทดสอบมีต่อเซลล์จำเพาะในบางครั้งไม่แม่นยำ อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการระบุโครงสร้างหรือกลุ่มทางเคมีที่อาจก่อให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันในการทดสอบ MTT การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่าการทดสอบ MTT สามารถประเมินผลการต้านการเพิ่มจำนวนของ (−)-epigallocatechin-3-gallate ซึ่งเป็นโพลีฟีนอลที่มีมากที่สุดในชาเขียวต่ำกว่าความเป็นจริง [11] ในการศึกษาโดยใช้ MTT assay เพื่อตรวจหาปฏิกิริยาเคมีของเนื้องอก ยาเคมีบำบัดต้านมะเร็ง เช่น epirubicin, paclitaxel, docetaxel และ imatinib mesylate (Gleevec) แสดงให้เห็นว่าเซลล์มีชีวิตเพิ่มขึ้น [12,13] นอกจากนี้ ผลการศึกษาจำนวนหนึ่งรายงานว่าสารสกัดจากพืชบางชนิดและโพลีฟีนอลที่ออกฤทธิ์รีดอกซ์อาจรบกวนการทดสอบ MTT เนื่องจากจะลดเกลือ MTT เททราโซเลียมโดยตรงในกรณีที่ไม่มีเซลล์ [14]

ความจำเป็นในการละลายผลึกฟอร์มาซาน MTT ก่อนการวิเคราะห์ด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกในเครื่องอ่านไมโครเพลทและลักษณะจุดสิ้นสุดโดยธรรมชาติของปฏิกิริยาจำกัดการใช้การทดสอบ MTT เฉพาะบางแอปพลิเคชัน สิ่งนี้นำไปสู่การพัฒนาของสารคล้ายเตตทราโซเลียมซึ่งฟีนิลมอยอิตีถูกตกแต่งด้วยหมู่ซัลโฟเนตที่มีประจุลบ เช่น 2,3-บิส-(2-เมทอกซี-4-ไนโตร- 5- ซัลโฟฟีนิล)-2H-tetrazolium-5-คาร์บอกซาไมด์ (XTT), เกลือภายในที่มีประจุลบ [15] และ 3-(4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) ซึ่งเป็นเกลือชั้นในที่มีกรดอ่อนๆ ซึ่งสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับ MTT [16] . การปรับเปลี่ยนเหล่านี้ส่งผลให้มีการผลิตผลิตภัณฑ์ฟอร์มาซานที่ละลายได้ปานกลางในการเพาะเลี้ยง ซึ่งขจัดความต้องการของขั้นตอนการทำให้ละลายก่อนการหาปริมาณ ในทำนองเดียวกัน เมื่อประจุลบที่เพิ่มขึ้นของโมเลกุลเหล่านี้ลดความสามารถในการเคลื่อนที่ข้ามเยื่อหุ้มเซลล์ [17] ตัวรับอิเล็กตรอนระดับกลาง (IEA) เช่น 1-methoxy-5-methyl phenazinium methyl sulfate ({{25) }}methoxy PMS) จำเป็นต่อการลดสีย้อมเตตราโซลหรือเพื่อเพิ่มอัตราการลดลง

ไม่นานมานี้ เกลือเตตราโซเลียมที่ละลายน้ำได้รุ่นใหม่ได้รับการพัฒนา โดย WST-1 เป็นแบบอย่าง [18] WST-1 ซึ่งเป็นเกลือชั้นในที่มีไดซัลโฟเนตที่มีประจุลบซึ่งมีเรซิดิวไอโอดีน มีความเสถียรมากกว่า XTT และ MTS เมื่อมี 1-เมทอกซี PMS ซึ่งเป็น IEA บังคับ สิ่งนี้นำไปสู่การตลาดของ WST-1/1-methoxy PMS เป็นชุดการเพิ่มจำนวนเซลล์ตัวทำปฏิกิริยาเดี่ยวที่สะดวก เกลือเตตตราโซเลียมอื่นๆ อีกหลายตัวในซีรีส์ WST ได้รับการพัฒนา ซึ่งมีประโยชน์มากที่สุดซึ่งอาจเป็น WST-8 [19] WST-8 ดูเหมือนจะมีคุณสมบัติในการลดระดับเซลล์ที่คล้ายคลึงกันอย่างมากกับ WST-1 และกำลังวางตลาดอย่างอิสระในฐานะการทดสอบ CCK-8 WST-8 เป็นเซลล์ที่ไม่สามารถซึมผ่านได้ ดังนั้นจึงลดลงนอกเซลล์ ผ่านการขนส่งอิเล็กตรอนจาก NADH ภายในเซลล์ไปยัง WST-8 ผ่านเยื่อหุ้มพลาสมาที่อาศัย 1-methoxy PMS แม้ว่าทั้งการลด MTT และ WST-8/1-methoxy PMS จะถูกขับเคลื่อนโดย NADH ภายในเซลล์ แต่แหล่งที่มาของ NADH ดูเหมือนจะแตกต่างกันภายในสองวิธีนี้ WST-8/1-การลด PMS ของเมทอกซีขึ้นอยู่กับกระสวย malate/aspartate ที่เชื่อมโยงวัฏจักรของกรดไตรคาร์บอกซิลิกของไมโตคอนเดรีย-NADH กับช่องว่างนอกไมโตคอนเดรีย [20]

ในการทดลองเบื้องต้น เรายืนยันว่าสารประกอบ 1, 2, 3 และ 4 ไม่สามารถลดเกลือ MTT tetrazolium ได้โดยตรง (ไม่แสดง) ในการศึกษานี้ อิทธิพลโดยตรงของสารประกอบด้วยตัวทำปฏิกิริยาถูกกำจัดโดยการล้างไมโครเพลทอย่างระมัดระวังด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนเติมสารละลาย MTT หรือ CCK-8 ตามที่ระบุไว้ในโปรโตคอลของผู้ผลิต อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ที่ได้จากการใช้ทั้งสองวิธียังคงขัดแย้งกันอยู่ (รูปที่ 2) ตามที่คาดไว้ การฟักตัวของเซลล์ที่มีสารประกอบ 1, 2 และ 3 เพิ่มการลดลงของเกลือเตตตราโซเลียมเป็นฟอร์มาซานสีม่วง เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3) ชี้ให้เห็นว่าการลดเพียงเกลือเตตตราโซเลียมเมื่อมีสารประกอบเฉพาะ ไม่เพียงพอที่จะตัดสินความสามารถของสารประกอบในการรบกวนการทดสอบ MTT

เพื่อตรวจสอบว่าสารประกอบ 1, 2, 3 และ 4 สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ EA.hy926 ได้หรือไม่ การประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์และการทำให้เป็นภายนอกของฟอสฟาติดิลเซอรีน อย่างสม่ำเสมอกับการลดลงของความมีชีวิตของเซลล์ที่สังเกตได้จากการสอบวิเคราะห์ CCK-8 ผลลัพธ์ของการย้อมสี Hoechst และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้ภาคผนวก V-FITC/PI เสนอแนะว่าการยับยั้งการเจริญเติบโตที่สังเกตพบหลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2 และ 3 คือ เนื่องจากอย่างน้อยก็ส่วนหนึ่งจากการตายของเซลล์ EA.hy926 ผลลัพธ์ของเรายังสนับสนุนแนวคิดที่ว่ากลุ่มคาเฟอีนที่มีอยู่ในทั้งสารประกอบ 1 และ 2 มีส่วนรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันที่ได้รับจากการทดสอบ MTT

คล้ายกับการค้นพบของเรา Rottlerin ซึ่งเป็นตัวเปิดช่องโพแทสเซียมสื่อกระแสไฟฟ้าขนาดใหญ่ที่มีศักยภาพ ไม่แสดงปฏิกิริยาต่อ MTT ในหลอดทดลอง อย่างไรก็ตาม ได้เพิ่มการก่อตัวของผลึกฟอร์มาซานภายในเซลล์อย่างมาก ซึ่งส่งผลให้เกิดความขัดแย้งอย่างเห็นได้ชัดกับการยับยั้ง Rottlerin ของ NF-κB และการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่สังเกตได้จากการวิเคราะห์ [3 H] - การรวมตัวของไทมิดีนในดีเอ็นเอ [21] กลไกที่ Rottlerin เพิ่มประสิทธิภาพการลด MTT เป็นผลมาจากการคลายตัวของไมโตคอนเดรีย [22] Rottlerin มีหมู่แทนที่กรดซินนาโมอิล เมื่อเปรียบเทียบกับกรดซินนาโมอิล สารประกอบ 3 มีไฮดรอกซิลเรซิดิวอีกสองตัว ซึ่งตั้งอยู่ที่ C-3 และ C-4 ดังนั้นเราจึงคาดการณ์ว่ากลไกที่สารประกอบ 1 และ 2 ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันในการทดสอบ MTT อาจเกี่ยวข้องกับผลการคลายตัวของไมโตคอนเดรีย เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ จำเป็นต้องมีการศึกษาเปรียบเทียบระหว่างสารประกอบ 1, 2 และตัวแยกสารเคมี เช่น ไตรฟลูออโรคาร์บอนิลไซยาไนด์ ฟีนิลไฮดราโซน (FCCP)

ส่วนทดลอง

รีเอเจนต์และเคมีภัณฑ์

สารประกอบ 3 (ผงกรดคาเฟอีน ความบริสุทธิ์=98.6 เปอร์เซ็นต์ ) ซื้อมาจาก Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) สารประกอบ 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol–oil, ความบริสุทธิ์=98.5 เปอร์เซ็นต์ ) ได้มาจาก Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) MTT และไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) ได้จาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) การทดสอบ CCK-8 ซื้อมาจาก Dojin Laboratories (คุมาโมโตะ ประเทศญี่ปุ่น) Hoechst 33342 และชุดตรวจจับการตายของเซลล์ V-FITC/PI ของภาคผนวกถูกซื้อจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (ไห่เหมิน ประเทศจีน)

วัสดุจากพืช

เก็บลำต้น C. tubulosa จากจังหวัด Yutian เขตปกครองตนเองซินเจียงอุยกูร์ ประเทศจีน ตัวอย่างบัตรกำนัลถูกฝากไว้ในห้องปฏิบัติการหลักของเวชศาสตร์ระดับความสูงที่ Third Military Medical University (Chongqing, China) และรับรองโดย Yi Zhang จาก Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, China)

การสกัดและการแยกวัสดุจากพืช

ก้าน C. tubulosa (0.6 กก.) ที่ตากด้วยอากาศถูกทำให้เป็นผงและสกัดด้วยเอทานอล 50 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 70 องศา หลังจากกำจัดตัวทำละลายออกภายใต้แรงดันที่ลดลง สารสกัดเอธานอล (212.5 กรัม) ถูกละลายและแขวนลอยในน้ำ (2 ลิตร) และสกัดด้วยเอ็น-บิวทานอล (2 ลิตร × 3) สารสกัด n-butanolic (110 ก.) ถูกโครมาโทกราฟีบนคอลัมน์โพลีเอไมด์และชะด้วยเอทานอล/น้ำ (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) ทำให้เกิดเศษส่วนห้าส่วน (A–E) . เศษส่วน B (65 กรัม) ถูกแยกส่วนบนคอลัมน์ ODS; การชะด้วยเอทานอล: น้ำ (1:9) สารประกอบที่แยกจากกัน 1 (3 ก.) เศษส่วน D (10.5 กรัม) ถูกแยกส่วนบนคอลัมน์ ODS; การชะด้วยเอทานอล/น้ำ (1:4) สารประกอบที่แยกจากกัน 2 (1 ก.)

สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกบนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance 600 ใน CD3OD โดยมี Tetramethylsilane (TMS) เป็นมาตรฐานภายใน แมสสเปกตรัมถูกดำเนินการบนแมสสเปกโตรมิเตอร์ BioTOF-Q

การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ EA.hy926 ได้มาจาก American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง RPMI 1640 เสริมด้วยซีรั่มโคนมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) และเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ในสภาพแวดล้อมที่มีความชื้นด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศา

ความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกประเมินโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT และ CCK{{0}} สารประกอบ 1 และ 2, และอะไกลโคนของพวกมัน, กรดคาเฟอีน (3) และ 3,4-ไดไฮดรอกซิลฟีนิลเอธานอล (4) ถูกละลายใน DMSO จนถึงความเข้มข้น DMSO สุดท้าย < 0.1="" เปอร์เซ็นต์="" (ปริมาตร/ปริมาตร)="">

เซลล์ EA.hy926 ถูกเพาะบนจาน 96-หลุมที่ 4 × 103 เซลล์/หลุม หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 ที่ 6.25–50 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อถูกกำจัดออกและเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (PBS) อะลิควอต (10 ไมโครลิตร) ของสารละลาย MTT สต็อก (5 มก.·มิลลิลิตร-1 ) ถูกเติมในแต่ละหลุมที่มีตัวกลาง 100 ไมโครลิตรและบ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากการฟักไข่ ตัวกลางถูกกำจัดออกและส่วนลิคอต 150 ไมโครลิตรของ DMSO ถูกเติมในแต่ละหลุมเพื่อทำให้ผลึกฟอร์มาซานละลายได้ วัดการดูดซับที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA) ความมีชีวิตของเซลล์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการลด MTT โดยกำหนดค่า 100 เปอร์เซ็นต์ให้กับการดูดกลืนแสงของเซลล์ควบคุม ทำการทดลองทั้งหมดสามครั้งและนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD)

การทดสอบ CCK-8 ถูกดำเนินการตามเอกสารที่มีการดัดแปลงเล็กน้อย [23] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์ถูกบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 6.25–50 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและล้างสองครั้งด้วย PBS ก่อนเติมสารละลาย 10 ไมโครลิตร CCK-8 และ 100 ไมโครลิตรของอาหารเลี้ยงเชื้อ หลังจากการบ่มไมโครเพลทที่ 37 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง การดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท ความมีชีวิตของเซลล์ถูกแสดงออกเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีชีวิตที่สัมพันธ์กับเซลล์ควบคุม (100 เปอร์เซ็นต์ ) การทดลองทั้งหมดดำเนินการสามครั้งและแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD

การประเมินการตายของเซลล์โดย Hoechst 33342 การย้อมสี

การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา Apoptotic สังเกตได้จากการย้อมสี Hoechst 33342 โดยย่อ เซลล์ EA.hy926 ถูกเพาะบนจาน 48-หลุม (2 × 104 เซลล์/หลุม) และบำบัดด้วยสารประกอบ 50 ไมโครโมลาร์ 1, 2, 3 หรือ 4 เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37 องศา ล้างสองครั้งด้วย PBS และตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS สองครั้ง เซลล์ถูกย้อมด้วย Hoechst 33342 (10 ug·mL-1 ) เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและล้างสองครั้งด้วย PBS นิวเคลียสที่ย้อม Hoechst ถูกมองเห็นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Olympus, Tokyo, Japan)

การวิเคราะห์การตายของเซลล์โดย Flow Cytometry

เซลล์อะพอพโทติกถูกตรวจพบโดยภาคผนวก V-FITC/PI การวิเคราะห์การย้อมสีสองครั้งและโฟลว์ไซโตเมทรี โดยสังเขป หลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 50 ไมโครโมลาร์ 1, 2, 3 หรือ 4 เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและแขวนลอยใหม่ใน PBS ที่ 1 × 105 เซลล์·มล.-1 หลังจากการปั่นแยกที่ 500× g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 25 องศา , 195 μL ของ annexin V-FITC binding buffer และ 5 μL ของ annexin V-FITC ถูกเติมลงไป หลังจากผสมน้ำวนอย่างอ่อนโยน ของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องในความมืด หลังจากการปั่นแยกที่ 500× g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 25 องศา 190 μL ของ FITC-conjugated annexin V binding buffer และ 10 μL PI ถูกเติมลงไป หลังจากผสมน้ำวนอย่างอ่อนโยน ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้ FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ภายใน 30 นาที

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลการทดลองทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างตัวอย่างทดลองและกลุ่มควบคุมที่เกี่ยวข้องได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 11.5) นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดไว้ที่ p <>

บทสรุป

ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าการประเมินจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตที่สังเกตได้ในการทดสอบ MTT ที่สูงเกินไปสามารถปกปิดความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบบางชนิดได้ ดังนั้น ในระหว่างกระบวนการคัดกรองยา เราแนะนำให้ใช้วิธีการที่หลากหลายในการกำหนดหาผลของสารประกอบจำเพาะในความอยู่รอดของเซลล์ (เช่น การสอบวิเคราะห์ CCK-8 และ 3 H-TdR) เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างผลลัพธ์ที่ทำให้เข้าใจผิด