การยับยั้งการรวมตัวของอะไมลอยด์เบต้าและการสะสมของสารสกัดจากน้ำ Cistanche Tubulosa

1. บทนำ

ภาวะสมองเสื่อมเป็นโรคชราเรื้อรังชนิดหนึ่งที่พบบ่อยที่สุด ในปี 2558 รายงานโรคอัลไซเมอร์โลกประเมินว่ามีผู้ป่วยโรคสมองเสื่อมประมาณ 46.8 ล้านคน และคาดว่าจะมีจำนวน 74.7 ล้านคนในปี 2573 และ 131.5 ล้านคนในปี 2593 ประชากรโรคสมองเสื่อมทั่วโลกจะเพิ่มขึ้นทุกปีและควบคุมไม่ได้ในอนาคต . รายจ่ายด้านการรักษาพยาบาลทั่วโลกในการรักษาภาวะสมองเสื่อมมีมูลค่าเกือบ 604 พันล้านดอลลาร์สหรัฐในปี พ.ศ. 2553 และคาดว่าจะสูงถึง 1,000 พันล้านดอลลาร์สหรัฐในปี พ.ศ. 2573 ผู้ป่วยภาวะสมองเสื่อมมีความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตจากอุบัติเหตุมากขึ้น ดังนั้นจึงจำเป็นต้องได้รับการดูแลทางการแพทย์มากขึ้น นี่เป็นภาระหนักสำหรับผู้ดูแลครอบครัวผู้ป่วยสมองเสื่อม ผลกระทบของภาวะสมองเสื่อมต่อผู้ดูแล ครอบครัว และสังคมสามารถก่อให้เกิดความเครียดทางร่างกาย จิตใจ ชีวิต และเศรษฐกิจได้อย่างมาก ภาวะสมองเสื่อมมีสองรูปแบบหลักๆ ได้แก่ โรคอัลไซเมอร์ (AD) และภาวะสมองเสื่อมจากหลอดเลือด AD เป็นโรคสมองเสื่อมที่พบบ่อยที่สุด และเป็นความผิดปกติของระบบประสาทเสื่อมแบบก้าวหน้าและไม่สามารถรักษาให้หายได้ AD เป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับที่ 6 ในสหรัฐอเมริกาในปี 2558

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับป้องกันโฆษณา PHGS75% ECH 30% ACT 12%

การศึกษาล่าสุดสนับสนุนว่าความเป็นพิษของเซลล์ประสาทที่เกิดจากการรวมตัวของอะไมลอยด์เปปไทด์ (A) (โล่) และการรวมตัวของโปรตีนเอกภาพ (พันกัน) มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเกิดโรค AD การสะสมของ A และโปรตีนเทาว์ในสมองอาจทำให้เซลล์ประสาทเสียหายและสูญเสียความจำได้ โอลิโกเมอร์ A ที่ไม่ละลายน้ำรวมตัวกันในเนื้อเยื่อนอกเซลล์และมีรายงานว่านำไปสู่ความผิดปกติของไซแนปติก ความเป็นพิษของเซลล์ประสาท และการตายของเซลล์ น่าเสียดายที่ ยังไม่มีการรักษาที่มีประสิทธิภาพในการล้าง A และโปรตีนเทาว์ ยับยั้งการก่อตัวหรือโอลิโกเมอไรเซชันของ A และระงับหรือรักษาความเสียหายของเซลล์ประสาทที่ไม่สามารถรักษาให้หายได้ สารที่ใช้รักษาโรคในปัจจุบัน เช่น กาแลนทามีนและโดเนเพซิล ซึ่งเป็นสารยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเตอเรส สามารถช่วยบรรเทาอาการความจำเสื่อมได้ชั่วคราวโดยการเพิ่มระดับสารสื่อประสาทเท่านั้น ในปี 2012 ไม่มียาใดที่สามารถลดผลกระทบของ A ในการศึกษาทางคลินิกของผู้ป่วย AD รายใหญ่ได้ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการวิจัยวิธีการรักษาแบบใหม่เพื่อระงับความชุกของโรคอัลไซเมอร์อย่างเร่งด่วน เมื่อเร็วๆ นี้ไอออนของโลหะได้รับการพิจารณาว่าเป็นปัจจัยสำคัญที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการรวมตัวของ A สารคีเลเตอร์โลหะถือเป็นสารประกอบตะกั่วที่มีศักยภาพ ถือเป็นกลยุทธ์ใหม่สำหรับแนวทางต่อต้าน AD

ก้านแห้งของ Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong ได้รับการเก็บเกี่ยวอย่างกว้างขวางในทะเลทราย Xhinjang ประเทศจีน เป็นยาจีนโบราณที่สำคัญซึ่งอยู่ในยาชูกำลังจีนที่ได้รับการจัดทำดัชนีไว้ในเภสัชตำรับจีน และใช้มานานนับพันปีในการรักษาความอ่อนแอทางร่างกาย ภาวะไตบกพร่อง ภาวะมีบุตรยาก การหลงลืม ความอ่อนแอ และท้องผูกในวัยชราสารสกัดจากน้ำ C. tubulosa (CTE)แคปซูลได้รับการอนุมัติให้เป็นยาทางพฤกษศาสตร์สำหรับโรคหลอดเลือดสมองเสื่อมในประเทศจีน จากการทดลองทางคลินิกกับผู้ป่วย 18 รายที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรค AD ระดับเล็กน้อยถึงปานกลาง พบว่าแคปซูล CTE ช่วยให้ผู้ป่วยมีสภาวะความจำที่เสถียรมากขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับสารยับยั้งอะซิติลโคลีนเอสเตอเรส ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา CTE ลดการสะสมของอะไมลอยด์เปปไทด์ (A ) และปรับปรุงการสูญเสียความทรงจำในหนูที่มีลักษณะคล้ายโรคอัลไซเมอร์ Phenylethanoid glycosides, echinacoside (1), acteoside (2) และ isoacteoside (3) ถือเป็นองค์ประกอบหลักของ CTE สารประกอบ 1 มีฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทเพื่อต่อต้านความเป็นพิษของ 1-เมทิล-4-ฟีนิล-1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP), 1-เมทิล{{13 }}ฟีนิลไพริดิเนียม ไอออน (MPP+) และ 6-ไฮดรอกซีโดปามีน (6-OHDA) รายงานก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า 1 ระงับ A oligomerization และความเป็นพิษในการศึกษา ในหลอดทดลอง และยับยั้งการสะสม A ปรับปรุงความจำบกพร่องและความผิดปกติทางการรับรู้ในหนูที่เกิดจาก A สารประกอบ 2 และ 3 เพิ่มการเสื่อมสลายของ A และลดโอลิโกเมอไรเซชัน ในหลอดทดลอง ลดลง สารประกอบ 3 ลดการสะสม A ในหนูแรทที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย A จากการศึกษาเหล่านี้ C. tubulosa ได้พิสูจน์แล้วว่ามีศักยภาพในการรักษา AD ได้ CTE เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการรวมตัวและการสะสมของสารต่อต้านเอ เพื่อให้เข้าใจกลไก CTE ได้ชัดเจนยิ่งขึ้น เราจำเป็นต้องมีวิธีที่สะดวกและมีประสิทธิภาพในการระบุส่วนประกอบออกฤทธิ์ รวมถึงเนื้อหาในตัวอย่างเนื้อเยื่อสมอง การศึกษาส่วนใหญ่ได้รับการออกแบบเพื่อการหาปริมาณของเอไคนาโคไซด์ แอกทีโอไซด์ และไอโซแอคทีโอไซด์ในสมุนไพรหรืออาหารโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) แต่มีเพียงสองการศึกษาเท่านั้นที่ใช้ตรวจวัดในซีรั่มหรือเนื้อเยื่อ อย่างไรก็ตาม ไม่มีรายงานการวิเคราะห์พร้อมกัน 1–3 ในเนื้อเยื่อสมองหลังการบริหารช่องปากด้วย CTE นอกจากนี้ การศึกษาล่าสุดยังไม่ชัดเจนว่าส่วนประกอบออกฤทธิ์ของ CTE หรือสารเมตาบอไลต์ของพวกมันสามารถผ่านอุปสรรคในเลือดและสมองและออกฤทธิ์ต่อเซลล์ประสาทในสมองได้สำเร็จหรือไม่ ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงให้วิธีการขั้นสูงและละเอียดอ่อนพร้อมหลักฐานที่น่าเชื่อถือซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงกลไกพื้นฐานของ CTE ที่ต่อต้านการรวมตัวและการสะสมของ A

2. ผลลัพธ์

2.1. การแยกและการจำแนกสารประกอบหลักสามชนิด (1–3)

ก้านแห้งของ C. tubulosa ถูกสกัดด้วย EtOH 75% ที่อุณหภูมิห้อง สารสกัด EtOH เข้มข้น 75% นำไปผ่านเรซินและโครมาโทกราฟีคอลัมน์ C18 เพื่อให้สารประกอบหลักสามชนิด ได้แก่ เอไคนาโคไซด์ (1)แอกทีโอไซด์ (2) และไอโซแอคทีโอไซด์(3). โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายโดยการวิเคราะห์สเปกโทรสโกปี NMR (Nuclear Magnetic Resonance) และ ESI-MS (มวลไอออไนเซชันด้วยไฟฟ้า) และโดยการเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรม (รูปที่ 1 ตัวเลขวัสดุเสริม S3 – S11)

2.2. การทดสอบเนื้อหาฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) จาก CTE

วิธีการทดสอบได้รับการตรวจสอบความถูกต้องสำหรับการวิเคราะห์ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ สารประกอบ 1–3 (5.0 มก.) ได้รับการชั่งน้ำหนักอย่างแม่นยำและผสมกับเมทานอล 50% (40 มล.) ของผสมถูกโซนิกเป็นเวลา 5 นาที สารละลายมาตรฐานของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) สามชนิดถูกผสมเป็นสารละลายน้ำสต๊อกมาตรฐาน (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) สารละลายสต็อกมาตรฐานถูกใช้เพื่อเตรียมความเข้มข้นที่แตกต่างกันห้าความเข้มข้น (5, 10, 25, 50 และ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของสารละลายที่ระบุ ตามลำดับ โดยการเจือจางด้วยปริมาตรอนุกรมของเมทานอล 50% เส้นโค้งฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (UPLC) ตั้งแต่ 5–100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และเป็นเส้นตรงตามลำดับ (1, r2= 0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2= 0.9998) ความแม่นยำระหว่างวันและระหว่างวัน [% RSD (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์) อยู่ที่ 0.1 ถึง 1.8%] และความแม่นยำ (95.6–104.2%) เป็นที่ยอมรับโดย UPLC เป็นเวลา 1–3 UPLC หาปริมาณปริมาณ 1, 2 และ 3 ของเนื้อหา CTE เป็น 254, 38 และ 41 มก./กรัม ตามลำดับ (รูปที่ S2)

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับการรักษาผู้ป่วยโฆษณา PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. การตรวจสอบ UPLC/MS/MS

ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) ถูกผสมและถูกแทงด้วยเนื้อเยื่อสมองหนูที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและวิเคราะห์โดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง - สเปกโตรมิเตอร์มวลตีคู่ (UPLC / MS / MS) ด้วยการสกัดเฟสของแข็ง ขีดจำกัดล่างของการตรวจจับ (LLOQ) ที่ 1–3 คือ 0.2 ng/mL การกู้คืนฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วด้วยเนื้อเยื่อสมองที่เป็นเนื้อเดียวกัน (10 ng/mL) ที่ 91.39% สำหรับ 1, 89.54% สำหรับ 2 และ 96.81% สำหรับ 3 ตามลำดับ (รูปที่ 2)

2.4. การวิเคราะห์เนื้อเยื่อสมองของหนูที่เหมือนโฆษณา

หลังจากการบริหารช่องปากด้วย CTE เป็นเวลา 14 วัน (200 มก./กก./วัน) เนื้อเยื่อสมองของหนูที่มีลักษณะคล้าย AD จะถูกรวบรวมและแบ่งออกเป็นสองส่วน ได้แก่ ฮิบโปแคมปัสและสเตรียตัม และทั้งสองถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน เนื่องจากฮิบโปแคมปัสและสเตรทัมโฮโมจีเนตจากหนูแต่ละตัวมีจำนวนน้อยเกินไปที่จะถูกบรรจุลงในการสกัดแบบเฟสของแข็ง และเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการทดลองมากเกินไป ฮิบโปแคมปัสและสเตรตัมโฮโมจีเนตจากหนูแต่ละตัวสี่ตัวถูกผสมลงในตัวอย่างที่วิเคราะห์สำหรับ UPLC/MS/MS โดยใช้ของแข็ง วิธีการแยกเฟส (รูปที่ 3A, B) ตรวจพบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) ในฮิบโปแคมปัส (รูปที่ 3A) และ striatum (รูปที่ 3B) ไม่มีจุดสูงสุดที่มีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อสมองว่าง (รูปที่ 3C) ในฮิบโปแคมปัส ปริมาณเอคินาโคไซด์คือ 11.97 ± 0.34 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ปริมาณแอคทีโอไซด์คือ 1.25 ± 0.16 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และปริมาณไอโซแอคทีโอไซด์คือ 1.38 ± 0.08 นาโนกรัม /มล. ใน striatum ปริมาณเอคินาโคไซด์คือ 22.60 ± 1.69 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ปริมาณแอคทีโอไซด์คือ 2.03 ± 0.61 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และปริมาณไอโซแอคทีโอไซด์คือ 4.90 ± 0.64 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ดังที่แสดงในรูปที่ 4 CTE จะผ่านสิ่งกีดขวางเลือดและสมองตามปริมาณที่ตรวจพบได้อย่างมีนัยสำคัญคือ 1–3 ในฮิบโปแคมปัสและ striatum เนื้อหาของ 1 สูงกว่า 2 และ 3 ใน CTE มากโดยการวิเคราะห์ UPLC (รูปที่ S2) ดังนั้นจึงสมเหตุสมผลที่จะสังเกตว่า 1 คือเนื้อเยื่อสมองสูงที่สุดหลังการให้ CTE ในช่องปาก

2.5. กิจกรรมฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) การคีเลติ้งโลหะ

ในเอกสารวิจัย การกำหนดหาสารประกอบที่ปราศจากและสารเชิงซ้อนของโลหะของพวกมันถูกดำเนินการโดยใช้ HPLC การวัดการออกฤทธิ์ของคีเลชั่นได้รับการวิเคราะห์โดย UPLC ในการศึกษานี้ สารละลาย 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) แต่ละตัวถูกเติมลงในสารละลาย 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของทองแดง (Cu), แคลเซียม (Ca), แมกนีเซียม (Mg), สังกะสี (Zn), เหล็ก (Fe ) หรือซีรั่มของหนูตามลำดับ สารประกอบแต่ละชนิดที่มีสารละลายโลหะหรือซีรัมแต่ละตัวถูกวิเคราะห์โดย UPLC ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) แสดงกิจกรรมการคีเลตโลหะด้วยเหล็กและซีรั่ม (รูปที่ 5 วัสดุเสริมรูปที่ S1)

2.6. การวิเคราะห์ Echinacoside (1) ใน Rat Serum ใน Vivo

เพื่อให้เข้าใจการกระจายตัวของเอคินาโคไซด์ในซีรั่มของหนู ซีรั่มจะถูกรวบรวมจากเวลาเริ่มต้นจนถึง 720 นาทีหลังการให้เอไคนาโคไซด์ (1) ทางปาก (100 มก./กก.) และวิเคราะห์โดย UPLC รูปที่ 6 แสดงความเข้มข้นเทียบกับโปรไฟล์เวลาของเอชินาโคไซด์ในซีรั่มของหนู

3. การอภิปราย

ภาวะสมองเสื่อม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง AD คือความชราและโรคเรื้อรังที่ไม่สามารถรักษาให้หายได้ ซึ่งนำไปสู่คำถามแบบกอร์เดียน โรคที่ผ่านไม่ได้นี้นำไปสู่ปัญหาเศรษฐกิจร้ายแรงซึ่งมีภาระทางการเงินมหาศาลและเพิ่มมากขึ้น นักวิจัย AD ทั่วโลกได้ใช้ความพยายามอย่างมากในการตรวจสอบยาต่อต้าน AD ใหม่แต่ล้มเหลวในการทดลองทางคลินิกขนาดใหญ่หลายครั้งโดยกำหนดเป้าหมายไปที่ A ในปี 2012 ยกเว้นการกำหนดเป้าหมายโดยตรงที่ A ภาวะสมดุลของไอออนของโลหะในสมองถือเป็นเหตุผลสำคัญที่เกี่ยวข้องกับการรวมตัวและการสะสมของ A ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของ AD ดังนั้นไอออนของโลหะจึงมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของ AD และสมมติฐานการขับโลหะจึงกลายเป็นทิศทางการวิจัยที่สำคัญ

จากการศึกษาครั้งก่อนของเราCTE แสดงกิจกรรมต่อต้านภาวะสมองเสื่อมที่อาจเกิดขึ้น- แม้แต่ในการศึกษาทางคลินิกของมนุษย์ หลังจากการรักษาด้วยแคปซูล CTE สำหรับผู้ป่วย AD ระดับปานกลางเป็นเวลา 1 ปี คะแนน Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog) จะไม่แสดงการเสื่อมสภาพอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับก่อนการรักษา CTE รักษาคะแนน ADAS-cog ของผู้ป่วย AD ให้คงที่ แต่ยาที่ต้องสั่งโดยแพทย์อื่นๆ ไม่ได้เป็นเช่นนั้น ทางเลือกเดียวของยาที่ต้องสั่งโดยแพทย์ที่ได้รับอนุญาตสำหรับการรักษาด้วยโฆษณาคือสารยับยั้งอะซิทิลโคลีนเอสเตอเรส (AChEIs) เช่น โดเนเพซิล และกาแลนทามีน ซึ่งทำให้อาการ AD ดีขึ้นในระยะสั้น แต่การเสื่อมสภาพจะเกิดขึ้นหลังการรักษา 1 ปี จากการศึกษาทางคลินิก CTE มีโอกาสที่จะเป็นแนวทางการรักษาที่มีศักยภาพสำหรับการพัฒนาสารต่อต้าน AD จากรายงานก่อนหน้านี้ของเรา echinacoside (1), acteoside (2) และ isoacteoside (3) จะปกป้องเซลล์ประสาทจากความเสียหายโดย A ลด oligomerization ในหลอดทดลอง และปรับปรุงความผิดปกติทางความรู้ความเข้าใจที่เกิดจาก A ในร่างกาย อย่างมีนัยสำคัญ การศึกษาในหลอดทดลองระบุว่าขนาดยาออกฤทธิ์ 1–3 สูงถึง 5{{10}} ไมโครกรัม/มิลลิลิตร อย่างไรก็ตาม การศึกษาก่อนหน้านี้พิจารณาว่าการดูดซึมทางปากของ 1 และ 2 ต่ำมาก (0.83% สำหรับ 1 และ 0.12% สำหรับ 2) ในหนู ไม่สามารถระบุสารประกอบ 1 ในซีรั่มของมนุษย์ได้หลังจากการบริหารยาเม็ดเอ็กไคนาเซียทางปาก การศึกษาปัจจุบันแสดงให้เห็นว่า 1–3 มีการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์และการดูดซึมในเซลล์ลำไส้ต่ำ และส่วนใหญ่ 1 จะถูกเผาผลาญในท่อทางเดินอาหาร ปริมาณสารประกอบ 2 ในซีรั่มของหนูเป็นเพียงประมาณ 4.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร หลังจากการฉีดเข้าเส้นเลือดดำเป็นเวลา 15 นาทีด้วยขนาดยา 10 มก./กก. ของแอคทีโอไซด์ อย่างไรก็ตาม การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า 1–3 จะถูกตรวจพบในฮิบโปแคมปัสและ striatum ของเนื้อเยื่อสมองหนูหลังจากการบริหารช่องปากด้วย CTE (รูปที่ 3 และ 4) นอกจากนี้ รูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าปริมาณสารประกอบ 1 ในซีรั่มของหนูแรทเพิ่มขึ้นประมาณ 5 เท่าจาก 15 นาทีเป็น 720 นาทีหลังการบริหารให้สารประกอบ 1 ทางปาก (100 มก./กก.) เราพิจารณาว่าฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ของ CTE จะผ่านอุปสรรคในเลือดและสมอง และจะมีการดำเนินการคีเลชันระหว่าง CTE และโลหะ คีเลชั่นเป็นปฏิกิริยาเคมีที่ผันกลับได้ ธาตุเหล็กเป็นองค์ประกอบสำคัญในซีรั่มและสมอง [10,40] รูปที่ 5 แสดงให้เห็นว่าฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์สามชนิดจะมีฤทธิ์เป็นคีเลตโลหะกับธาตุเหล็กและซีรั่ม เหล็กและซีรั่มเปลี่ยนพื้นที่เวลาการเก็บรักษาสูงสุดของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์สามชนิด การขับธาตุเหล็กอาจเป็นเหตุผลสำคัญที่นำไปสู่การระบุการดูดซึมของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ต่ำมากอย่างไม่ถูกต้อง ดังนั้น จึงควรพิจารณากิจกรรมการคีเลตโลหะในซีรั่มในเลือดและการวิเคราะห์สมองของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ CTE ทั้งสามชนิด เพื่อนำการดูดซึมกลับคืนมาและเภสัชจลนศาสตร์ที่แท้จริง นอกจากนี้ ผลลัพธ์ยังบ่งชี้ว่าฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) สามชนิดจะผ่านอุปสรรคเลือดและสมองและมาถึงเนื้อเยื่อสมองผ่านการไหลเวียนของร่างกาย การศึกษานี้พัฒนาวิธีการที่รวดเร็วและละเอียดอ่อนที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ 1–3 โดยใช้ UPLC/MS/MS และให้หลักฐานที่มีประสิทธิภาพเพื่อพิสูจน์ว่าฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (1–3) เป็นองค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของ CTE

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับการป้องกันโรคอัลไซเมอร์ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. วัสดุจากพืช

รวบรวมลำต้นของ C. tubulosa ในเดือนพฤษภาคม 2559 จากหางโจวประเทศจีน โรงงานดังกล่าวได้รับการระบุด้วยตัวอย่าง Dr. Lin HC Voucher (หมายเลข 20016CT) ที่ถูกฝากไว้ที่ Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., หางโจว, จีน

4.2. การแยกและการทำให้บริสุทธิ์

ก้าน C. tubulosa แห้งถูกบดเป็นผงแล้วสกัดห้าครั้งด้วย EtOH 75% หลังจากการระเหยตัวทำละลายภายใต้ความดันที่ลดลง สารสกัดหยาบจะถูกนำไปผ่านโครมาโตกราฟีคอลัมน์ Macroporous Resin AB-8 พร้อมระบบตัวทำละลายแบบไล่ระดับ H2O/EtOH จาก 20% EtOH ไปจนถึง 100% EtOH ตามโครมาโทกราฟีแบบชั้นบาง เศษส่วนสี่ส่วน (Fr.1~Fr.4) ถูกรวบรวมเพื่อการแยกเพิ่มเติม คุณพ่อ 2 ถูกนำไปยังโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) แบบเตรียมบนคอลัมน์ COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 มม. × 20 มม. id, 5 µm) โดยใช้อะซีโตไนไตรล์ 18% เป็นระบบเฟสเคลื่อนที่ อัตราการไหลคือ 15 มล./นาที มีการคัดเลือกจุดสูงสุดที่น่าสนใจสามจุดหลัก เศษส่วนที่มีสารประกอบเป้าหมายถูกควบแน่นเพิ่มเติมจนแห้งและได้ 1, 2 และ 3 ตามลำดับ

4.3. การวิเคราะห์เชิงทดลอง

ได้รับสเปกตรัม 1H และ 13C NMR โดยใช้สเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) โดยมี tetramethylsilane (TMS) เป็นมาตรฐานภายใน HPLC การเตรียมการดำเนินการโดยใช้คอลัมน์แบบรีเวิร์สเฟส (คอลัมน์ Cosmosil C18-AR-II, 250 มม. × 20 มม. id; Nacalai Tesque, Inc., เกียวโต, ญี่ปุ่น) บนซีรีส์ Shimadzu LC-6AD อุปกรณ์ที่มีเครื่องตรวจจับ Prominence HPLC UV-Vis (เกียวโต ประเทศญี่ปุ่น)

เอชินาโคไซด์ (1): ผงสีขาว; ESI−MS m/z: 785 [M - H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H-6), 2.79 ( 2H, t, J=5.2 เฮิร์ตซ์, H-7), 3.56 (1H, ม., ฮา-8), 3.79 (1H, ม., H-30 ), 3.91 (1H, ม, Hb-8), 4.29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4.38 (1H, d, J {{4{ {80}}}}.9 เฮิร์ตซ์ H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 เฮิร์ตซ์ H-40 ), 5.17(1H, d, J=1.5 เฮิร์ตซ์, รา-H-1), 6.27 (1H, d, J=15.9 เฮิร์ตซ์, ชม.-800 ), 6.58 (1H, วว, เจ=8.1,2.0 เฮิรตซ์, ชม-6), 6.67 (1H, ง, เจ=8.1 เฮิร์ตซ์ H-5), 6.70 (1H, d, J=2.0 เฮิร์ตซ์, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 เฮิร์ตซ์, H-500 ), 6.94 (1H, dd, J=8.3, 2.0 เฮิร์ตซ์, H-600 ), 7.05 (1H, d, J=2.0 เฮิร์ตซ์, H-200 ), δ 7.59 (1H, d, J=15.9 เฮิร์ตซ์, H-700 ); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18.5 (Rha-C-6), 36.6 (C-7), 62.6 (Glc-C-6), 69.4 (C{{ 125}} ), 70.5 (C-40 ), 70.6 (Rha-C-5), 71.5 (Glc-C-4), 72.0 (Rha-C-3) , 72.3 (C-8), 72.4 (Rha-C-2), 73.8 (Rha-C-4), 74.7 (C-50 ), 75.1 (Glc-C -2), 76.1 (C-20 ), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30 ) , 103.1 (Rha-C-1), 104.2 (C-10 ), 104.7 (Glc-C-1), 114.7 (C-200 ), 115.3 (C{{ 189}} ), 116.3 (C-500 ), 116.5 (C-2), 117.1 (C-5), 121.3 (C-6), 123.3 (C{{ 204}} ), 127.6 (C-100 ), 131.5 (C-1), 144.7 (C-3), 146.1 (C-4), 146.9 (C{{ 219}} ), 148.2 (C-700 ), 149.8 (C-300 ), 168.5 (C-900 ) (รูปที่ S3–S5)

Acteoside (2): ผงสีขาว; ESI−MS m/z: 623 [M - H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94 (3H, d, J =5.9 Hz, H-6000 ), 2.68 (2H, ม, H-7), 4.33 (1H, d, J=7.8 เฮิร์ตซ์, H-100 ), 4.70 (1H, t , เจ=9.{{160}} เฮิร์ตซ์, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}} ), 6.18 (1H, d, J=15.9 เฮิร์ตซ์, H-80 ), 6.48 (1H, dd, J=7.9, 1.4 เฮิร์ตซ์, H{{ 45}}), 6.62 (1H, d, J=7.1 เฮิร์ตซ์, H-5), 6.73 (1H, d, J=2.0 เฮิร์ตซ์, H{{57} }), 6.75 (1H, d, J=7.9 เฮิร์ตซ์, H-50 ), 6.97 (1H, d, J=8.1 เฮิร์ตซ์, H-60 ) , 7.01 (1H, s, H-20 ), 7.44 (1H, d, J=15.8 เฮิร์ตซ์, H-70 ); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18.2 (C-6000 ), 35.1 (C-7), 60.8 (C-600 ), 68.8 (C{{95} } ), 69.2 (C-400 ), 70.3 (C-3000 ), 70.3 (C-8), 70.4 (C-2000 ), 70.6 (C{{110} } ), 71.7 (C-500 ), 74.5 (C-200 ), 79.2 (C-300 ), 101.3 (C-1000 ), 102.3 (C{{125} } ), 113.6 (C-80 ), 114.7 (C-20 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ), 116.3 (C{{140} }), 119.6 (C-6), 121.5 (C-60 ), 125.6 (C-10 ), 129.2 (C-1), 143.6 (C{{155} }), 145.0 (C-3), 145.0 (C-30 ), 145.6 (C-70 ), 148.5 (C-40 ), 165.7 (C{{170} } ) (รูปที่ S6–S8) Isoacteoside (3): ผงสีขาว; ESI−MS m/z: 623 [M - H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H-6000 ), 2.65 (2H, m, H-7) 4.35 (1H, d, J=10.0 เฮิร์ตซ์, H-100 ), 5.10 (1H, s, H-1000 ), 6.27 (1H, d, J=15 .9 เฮิร์ตซ์ สูง{-80 ), 6.45 (1H, วว, เจ=8.0, 1.8 เฮิรตซ์, สูง-6), 6.58 (1H, d, เจ=8 .8 เฮิร์ตซ์, สูง{-5), 6.73 (1H, d, เจ=1.6 เฮิร์ตซ์, H-2), 6.74 (1H, d, เจ=8.1 เฮิร์ตซ์ H-50 ), 6.94 (1H, d, J=8.2 เฮิร์ตซ์, H-60 ), 7.04 (1H, s, H-20 ), 7.46 ( 1H, d, J=15.8 เฮิร์ตซ์, H-70 ); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17.9 (C-6000 ), 35.2 (C-7), 63.5 (C-600 ), 68.2 (C-5000 ), 70.4 (C-400 ), 70.6 (C-3000 ), 71.7 (C-8), 72.1 (C-2000 ), 73.7 (C-4000 ), 74.1 (C-500 ), 74.5 (C-200 ), 80.9 (C-300 ), 100.7 (C-1000 ), 102.7 (C-100 ), 113.9 (C-20 ), 114.9 (C-80 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ), 116.3 (C-2 ), 119.6 (ค-6), 121.5 (ค-60 ), 125.5 (ค-10 ), 129.2 (ค-1), 143.5 (ค-4 ), 145.0 (ค-3), 145.3 (ค-30 ), 145.6 (ค-70 ), 148.5 (ค-40 ), 165.6 (ค-90 ) (รูปที่ S9–S11)

4.4. การเตรียมสารสกัดน้ำ C. Tubulosa (CTE)

ผงต้นกำเนิดของ C. tubulosa ถูกสกัดสองครั้งโดยการไหลย้อนด้วยน้ำเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง และกรองสารละลายสารสกัดออก สารสกัดน้ำที่ผ่านการกรอง (CTE) ถูกเก็บไว้ที่ 4 ◦C ก่อนการใช้งาน

4.5. แบบจำลองสัตว์และกำหนดการทดลอง

แบบจำลองหนูที่เหมือน AD และตารางการทดลองที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นไปตามที่กำหนดไว้ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา [19] หลังจากฉีด A 1–42 (300 มิลลิโมล/วัน) เข้าไปในโพรงสมองเป็นเวลาอย่างน้อยสองสัปดาห์ขึ้นไป หนูที่มีลักษณะคล้าย AD จะได้รับ CTE (200 มก./มล.) โดยการบริหารช่องปากในวันถัดไป หลังจากให้ยาไป 14 วัน หนูจะต้องเสียสละเพื่อรวบรวมเนื้อเยื่อสมอง เพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดทางการทดลองมากเกินไป ตัวอย่างจากหนูสี่ตัวแต่ละตัวจะถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นตัวอย่างเดียว มีสามตัวอย่างสำหรับแต่ละกลุ่ม

4.6. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

ซื้อเมทานอล (เกรด HPLC) จากเมอร์ค (ดาร์มสตัดท์ ประเทศเยอรมนี) ซื้อกรดฟอร์มิก (98% สำหรับการวิเคราะห์, ACS) จาก Panreac (บาร์เซโลนา, สเปน) ซื้อ Acetonitrile (เกรด HPLC) จาก JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA) เตรียมน้ำบริสุทธิ์โดยใช้ระบบ ELGA (วูดริดจ์ สหราชอาณาจักร) เฮสเพอริดินถูกซื้อจาก Chromadex และใช้เป็นมาตรฐานภายใน (IS) สำหรับการวิเคราะห์ UPLC

4.7. อุปกรณ์ UPLC/MS/MS

Waters Acquity TQD โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ (UPLC)/MS/MS System (Milford, MA, USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ UPLC/MS/MS การทดลองโครมาโตกราฟีถูกดำเนินการบนคอลัมน์ Acquity UPLC BEH C18 (2.1 × 100 มม., 1.7 ไมโครเมตร, น้ำ) ภายใต้การชะแบบเกรเดียนต์ที่อัตราการไหล 0.4 มล./นาที เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยกรดฟอร์มิก-น้ำ (1: 1000, ปริมาตร/ปริมาตร) (A) และกรดฟอร์มิก-อะซีโตไนไตรล์ (1: 1000, ปริมาตร/ปริมาตร) (B) โปรแกรมเวลาเป็นดังนี้: 0–5 นาที, A–B (92:8, v/v) เปลี่ยนเป็น A–B (62:38, v/v); 5–7 นาที AB (62:38, v/v); 7-7.1 นาที, AB (62:38, v/v) เปลี่ยนเป็น A–B (92: 8, v/v); 7.1–9 นาที (92: 8, v/v) ปริมาตรการฉีดคือ 5 ไมโครลิตรเข้าสู่ระบบ UPLC/MS/MS โดยมีแหล่งกำเนิดไอออนด้วยอิเล็กโทรสเปรย์เชิงลบ (ESI) โครมาโตกราฟีไอออนทั้งหมด (TIC) สำหรับ 1–3 ดำเนินการโดยใช้โหมดการตรวจสอบปฏิกิริยาหลายปฏิกิริยา (MRM) พารามิเตอร์มวลได้รับการปรับให้เหมาะสมเพื่อให้ได้สัญญาณที่มีความเข้มสูงที่ชัดเจนที่สุด ตัวเลือกพารามิเตอร์ที่ดีที่สุดอธิบายไว้เป็นแรงดันแคปิลลารี 3000 V, แรงดันไฟฟ้ากรวย 20 V, อุณหภูมิแหล่งกำเนิด 125 ◦C, อุณหภูมิการแยกสารละลาย 400 ◦C, การไหลของก๊าซกรวย 50 ลิตร/ชม., การไหลของก๊าซละลาย 900 ลิตร/ชม. และการชนกัน 38 eV พลังงาน. ข้อมูลถูกประมวลผลโดยซอฟต์แวร์ MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA)

4.8. การจัดเตรียมตัวอย่าง

เนื้อเยื่อสมองของหนูใช้เมทานอล 50% เพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (เนื้อเยื่อ 1 กรัมต่อเมทานอล 5 มล.) โฮโมจีเนตถูกปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีที่ 4 ◦C เป็นเวลา 10 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอน (50 ไมโครลิตร) ที่มี IS 10 ไมโครลิตร (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เติมน้ำบริสุทธิ์ลงใน 1 มิลลิลิตร ของผสมถูกบรรจุอย่างระมัดระวังลงบนตลับ Oasis HLB (สมดุลที่ชอบน้ำ-ไลโปฟิลิก) (วอเตอร์ส, มิลฟอร์ด, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ซึ่งได้รับการชะด้วยเมทานอล 1 มิลลิลิตรแล้ว จากนั้นปรับสมดุลด้วยน้ำ 1 มิลลิลิตรภายใต้สภาวะสุญญากาศ หลังจากใช้เมทานอล 10% 1 มิลลิลิตรในการล้างคาร์ทริดจ์แล้ว ก็ใช้เมทานอล 1 มิลลิลิตรเพื่อชะล้างเพื่อให้ได้ตัวอย่างที่วิเคราะห์ ซึ่งถูกถ่ายโอนไปยังหลอดเอพเพนดอร์ฟขนาด 1.5 มิลลิลิตรอีกหลอดหนึ่งที่มีสารละลายกรดแอสคอร์บิก 10 ไมโครลิตร 10 ไมโครลิตรและทำให้แห้งโดยการระเหย สุดท้าย สารตกค้างจากตัวอย่างที่วิเคราะห์ถูกละลายในเมทานอล 50% 200 µL เพื่อการวิเคราะห์

4.9. การเตรียมเส้นโค้งมาตรฐานการสอบเทียบ

สารประกอบ 1–3 ถูกใช้เพื่อเตรียมมาตรฐานการสอบเทียบที่เติมตามลำดับลงในเนื้อเยื่อสมองที่เป็นเนื้อเดียวกันและเฮสเพอริดินเป็นมาตรฐานภายในเพื่อให้ได้ความเข้มข้นมาตรฐานการสอบเทียบขั้นสุดท้ายซึ่งก็คือ 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50.0 และ 100.0 นาโนกรัม/มิลลิลิตร

4.10. การตรวจสอบ

ได้รับเส้นโค้งมาตรฐานการสอบเทียบโดยใช้การทดสอบความเป็นเส้นตรงโดยใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน 5 แบบที่ 1–3 ในช่วง 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 และ 100.0 ng/mL ตามลำดับ และถือเป็นเส้นตรงที่มีค่าสัมประสิทธิ์การตัดสินใจมากกว่า 0.99 (R-กำลังสอง) ขีดจำกัดล่างของการตรวจจับ (LLOQ) ซึ่งกำหนดไว้ที่ ± 20% ของความเข้มข้นของตัวอย่างทดสอบ จะสร้างสัญญาณจุดสูงสุดแทนที่จะเป็นสัญญาณรบกวน ความน่าเชื่อถือและความถูกต้องของวิธีการวิเคราะห์ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบการฟื้นตัวที่ 10 นาโนกรัม/มิลลิลิตรของ 1–3

4.11. การทดสอบฤทธิ์คีเลตโลหะ

UPLC ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ผลการคีเลตของโลหะโดยใช้สารละลาย 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ CTE ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ 1–3 ที่มีสารละลายโลหะของทองแดง แคลเซียม แมกนีเซียม สังกะสี เหล็ก หรือซีรั่มของหนู 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สารประกอบแต่ละชนิดที่มีสารละลายโลหะหรือซีรัมแต่ละตัวถูกวิเคราะห์โดย UPLC เอฟเฟกต์คีเลตโลหะจะเปลี่ยนเวลาการกักเก็บเป็น 1–3 ในโครมาโตกราฟีของเหลว เปอร์เซ็นต์ของผลคีเลตของโลหะได้รับการคำนวณด้านล่าง และข้อมูลแสดงค่าเฉลี่ย ± SD (n=3)

5. สรุปผลการวิจัย

การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า 1–3 เป็นส่วนประกอบสำคัญของ CTE สำหรับกิจกรรมต่อต้านโฆษณา การขับธาตุเหล็กกลายเป็นแนวคิดใหม่ในการออกแบบยารุ่นใหม่สำหรับการรักษาโรค ADCTE เป็นยาจีนต้าน AD ทางพฤกษศาสตร์ที่มีศักยภาพกำหนดเป้าหมายการรวมตัวและการสะสม A ที่เกิดจากคีเลชั่นเหล็ก นอกจากนี้ เรายังพิสูจน์อีกว่า 1–3 จะเข้าถึงสมองผ่านทางเลือด ซึ่งก็คือ Blood-Brain Barrier (BBB) ส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์และการยืนยันกลไกพื้นฐานของ CTE จะช่วยควบคุมคุณภาพและการดูดซึมของผลิตภัณฑ์ได้อย่างมากในอนาคต ในเวลาเดียวกัน วิธีการวิเคราะห์ขั้นสูงและมีประสิทธิภาพที่นำเสนอจะเป็นประโยชน์ในการระบุ 1-3 ในพืช อาหาร เลือด และเนื้อเยื่อสมองสำหรับการวิจัยลายนิ้วมือทางเคมีและเภสัชจลนศาสตร์

ถังเก็บน้ำธรรมชาติสำหรับรักษาโรคอัลไซเมอร์ PHGS75% ECH 30% ACT 12%