YKL เพิ่มขึ้น-40 แต่ไม่มีระดับโปรตีน C-Reactive ในผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์Ⅱ

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. ผู้บริจาคมนุษย์

อาสาสมัครทั้งหมด 123 คนถูกรวมไว้ในการศึกษานี้: (1) ผู้สูงอายุที่ไม่มีภาวะสมองเสื่อมโดยไม่มีหลักฐานของโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท (กลุ่มควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ) ที่จัดอยู่ในประเภทกลุ่มควบคุม (n=37); (2) MCI เนื่องจากผู้ป่วย AD (MCI) (n=22); (3) ผู้ป่วย AD ที่ไม่รุนแรง/ปานกลาง-รุนแรงที่น่าจะเป็นได้ (n=34); (4) ผู้ป่วย PD (n=30) ผู้เข้าร่วมการศึกษาได้รับการลงทะเบียนจาก Memory Clinic (กลุ่มควบคุม, MCI และ AD) และหน่วยความผิดปกติของการเคลื่อนไหว (ผู้เข้าร่วม PD) ของ Hospital Universitario 12 de Octubre (มาดริด ประเทศสเปน) ลักษณะทางประชากรศาสตร์และทางคลินิกแสดงอยู่ในตารางที่ 1

ผู้เข้าร่วมทั้งหมดถูกจัดประเภทโดยใช้เกณฑ์การวินิจฉัยที่กำหนดขึ้นเป็นผู้ที่มี MCI หรือน่าจะเป็น AD dementia [43–45] การวินิจฉัยขึ้นอยู่กับการประเมินทางคลินิกโดยละเอียด การประเมินทางประสาทจิตวิทยา และการสร้างภาพทางระบบประสาท (MRI) ความบกพร่องในการทำงานวัดได้จากคะแนน Clinical Dementia Rating (CDR) [46]

คลิกเพื่อดู tcm สำหรับการรักษาโรคพาร์กินสันและโรคอัลไซเมอร์

ผู้ป่วย PD ได้รับการวินิจฉัยตามเกณฑ์การวินิจฉัยทางคลินิกของ Movement Disorder Society (MDS) [47] และเป็นไปตามเกณฑ์ทั้งหมดสำหรับ PD ที่จัดตั้งขึ้นทางคลินิก ผู้ป่วย PD ไม่ได้อ้างถึงการร้องเรียนทางความคิดและไม่แสดงอาการของภาวะสมองเสื่อม กลุ่มควบคุมประกอบด้วยบุคคลปกติทางสติปัญญาที่มีอายุ 50 ปีขึ้นไป ไม่มีอาการทางคลินิกของความบกพร่องทางสติปัญญาและประวัติโรคทางระบบประสาทหรือทางจิตเวช

เกณฑ์การคัดออกสำหรับผู้เข้าร่วมทุกคนมีโรคหลอดเลือดสมองที่มีนัยสำคัญร่วมกัน และหลักฐานของโรคร่วมทางระบบประสาท จิตเวช ยา หรือทางการแพทย์ที่ไม่ใช่ระบบประสาทที่อาจส่งผลต่อการรับรู้หรือการทำงานของมอเตอร์ ได้รับการอนุมัติการศึกษาจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยของ Hospital Universitario 12 de Octubre และผู้เข้าร่วมทั้งหมดให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร

2.2. ตัวอย่างของเหลว

เก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังจากทุกวิชา (รวมถึงผู้ป่วยที่มีสุขภาพดีและอาสาสมัคร MCI, AD และ PD) และดำเนินการตามขั้นตอนมาตรฐานโดยการเจาะเอวในหลอดโพลีโพรพิลีนปลอดเชื้อขนาด 15 มล. จากนั้น ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาทีที่ 4 ◦ซ ​​เป็นเวลา 10 นาที ส่วนส่วนเกินของตะกอนถูกเก็บไว้ที่ −80 ◦C ในหลอดพอลิโพรพิลีนไครโอเจนิก 0.5 มล. ที่มี Protease Inhibitor Cocktail (โรช, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์)

ตัวอย่างเลือดได้มาจากการเจาะเส้นเลือดในช่องท้องจากผู้ป่วยและอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี พลาสมาถูกแยกได้จากเลือดครบส่วนที่เก็บในหลอด EDTA-2Na ขนาด 7 มล. ปั่นแยกเลือดครบส่วนด้วยความเร็ว 2,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนและแบ่งส่วนในหลอดพอลิโพรพิลีนไครโอเจนิกด้วย Protease Inhibitor Cocktail (โรช, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) และเก็บไว้ที่ −80 ◦C

2.3. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

เนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าของวงโคจรหลังการชันสูตรได้มาจากผู้บริจาคสมองที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรค AD และบุคคลควบคุม ตัวอย่างแช่แข็งจัดทำโดย Institute of Neuropathology Brain Bank IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat ประเทศสเปน) ได้รับความยินยอมตามหัวข้อตามประกาศของเฮลซิงกิ และการอนุมัติมาจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยของสถาบันที่รับผิดชอบ

สำหรับทุกกรณี มีความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร อาสาสมัครได้รับเลือกตามการวินิจฉัยหลังการตายของโรค AD ตามพยาธิสภาพของเส้นประสาทที่พันกันของเส้นประสาทและแผ่นโลหะ A [48] กรณี AD มีการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพของ AD สูง (Braak stage V/VI และคะแนน neuritic plaque score ปานกลางถึงบ่อย) ผู้เข้าร่วมการควบคุมได้รับการพิจารณาว่ามี/ไม่มีอาการทางระบบประสาทหรือมีการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพทางระบบประสาทในระดับต่ำ กลุ่มตัวอย่างทั้งหมด 24 ตัวอย่างถูกจัดประเภทเป็น AD และกลุ่มควบคุม ดังแสดงในตารางที่ 2

2.4. การทำให้บริสุทธิ์ของ DNA และการสร้างจีโนไทป์ของ Apolipoprotein E (APOE)

DNA จีโนมสกัดจากเลือดส่วนปลายโดยใช้ QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตรวจพบความหลากหลายของ APOE C112R และ R158C ของมนุษย์เพื่อระบุอัลลีล APOE ε2, ε3 และ ε4 โดยใช้ชุดเครื่องมือ LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Basel, สวิตเซอร์แลนด์) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.5. การวิเคราะห์โปรตีน

วิเคราะห์ความเข้มข้นของน้ำไขสันหลังและพลาสมาของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพการอักเสบของระบบประสาท (YKL-40 และ CRP) โดยใช้ชุด ELISA (Human Chitinase 3-เช่น 1 Quantikine ELISA kit (DC3L10), R&D; Human CRP Quantikine ELISA kit (DCRP{ {5}}), R&D) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตรวจสอบระดับโปรตีน YKL-40 และ GFAP ของสมองด้วย Western blotting เนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าของวงโคจรหลังการชันสูตรได้มาจากผู้บริจาคสมองที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรค AD และบุคคลควบคุม

โดยสังเขป ตัวอย่างเปลือกสมองส่วนหน้าของวงโคจรในสมองของมนุษย์ถูกบ่มและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน lysis บัฟเฟอร์ (50 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4 ที่มี 2 mM EDTA, 0.2 เปอร์เซ็นต์ Nonidet P-40, 1 mM PMSF, Protease, และสารยับยั้งฟอสฟาเตส (Phosphatase Inhibitor Cocktails; Roche, Basel, Switzerland) และปั่นแยกเป็นเวลา 10 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาทีที่ 4 ◦C ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกู้คืนและเก็บไว้ที่ −80 ◦C ปริมาณโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้วิธี BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ผสมโปรตีนในปริมาณที่เท่ากัน (20 µg สำหรับ YKL-40 และ 5 µg สำหรับ GFAP) ด้วยตัวอย่างบัฟเฟอร์ของ Laemmli ที่เสริมด้วย -mercaptoethanol, ให้ความร้อนถึง 95 ◦C เป็นเวลา 5 นาที, ได้รับการแก้ไขโดย NuPAGE Bis-Tris Gels 10 เปอร์เซ็นต์ ( Thermo Fisher Scientific, MA, USA) และถ่ายโอนไปยังเยื่อ polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, MA, USA)

หลังจากนั้น เมมเบรนถูกบล็อกและบ่มข้ามคืนที่ 4 ◦ซ ​​ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ: แอนติบอดีชนิดโมโนโคลนอลกระต่ายชนิดรีคอมบิแนนท์-40 (ab255297, 1:500, Abcam) และแอนติบอดีชนิดโมโนโคลนัลแอนติบอดี GFAP ของหนูเมาส์ (G3893, 1 :0000, ซิกมา อัลดริช). จากนั้น เมมเบรนถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตจากพืชชนิดหนึ่ง (HRP) ที่เหมาะสม (G-21234, 1:5000, Thermo Fisher Scientific, MA, USA; ab97023, 1:40000, Abcam)

การโหลดโปรตีนถูกตรวจสอบโดยใช้โมโนโคลนอล HRP-คอนจูเกตแอนติบอดีของเมาส์เทียบกับ -tubulin (ab40742, 1:5000, Abcam) สำหรับ YKL-40 หรือต้าน -actin (A1978, Sigma Aldrich) สำหรับการตรวจจับ GFAP อิมมูโนคอมเพล็กซ์ถูกเปิดเผยโดยรีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนซ์ที่ปรับปรุงแล้ว (ECL Clarity; Bio-Rad, CA, USA) Densitometric quantification ดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, USA) แถบโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุมการโหลดและแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม

2.6. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติและกราฟดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, USA) และ Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad เวอร์ชัน 8.00, La Jolla, CA, USA) หลังจากประเมินความเป็นปกติของการกระจาย ความแตกต่างของ CSF และระดับ YKL ในพลาสมา-40 และ CRP ระหว่างกลุ่มได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบอันดับ Kruskal–Wallis แบบไม่อิงพารามิเตอร์ ค่า p สำหรับการเปรียบเทียบแบบคู่จะแสดงด้วยการแก้ไข Bonferroni แบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นพหุคูณเชิงพรรณนาดำเนินการเพื่ออธิบายตัวแปรที่ก่อกวน (อายุ เพศ และ APOE ε4) ในการวิเคราะห์การเชื่อมโยง CSF YKL-40

ปฏิสัมพันธ์ของตัวแปรที่สับสนกับการวินิจฉัยทางคลินิกไม่รวมอยู่ในแบบจำลอง (นัยสำคัญสำหรับปฏิสัมพันธ์ทั้งชุด: p > 0.10) ค่าสัมประสิทธิ์การถดถอยจะแสดงเป็น "b" ความแตกต่างในการกระจายเพศ อายุของผู้เข้าร่วม อายุที่เริ่มมีอาการ และปีตั้งแต่เริ่มมีอาการของโรคระหว่างกลุ่มได้รับการประเมินด้วยการทดสอบ Pearson chi-squared และ ANOVA ตามความเหมาะสม

ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างตัวบ่งชี้ทางชีวภาพและคุณลักษณะทางประชากรด้วยการทดสอบสหสัมพันธ์ของเพียร์สัน การทดสอบของนักเรียน และการทดสอบ Mann-Whitney U ตามความเหมาะสม การทดสอบแนวโน้มแบบไม่อิงพารามิเตอร์ (การทดสอบแนวโน้มของ Jonckheere) ดำเนินการเพื่อประเมินการมีอยู่ของแนวโน้มเมื่อการแสดงข้อมูลแสดงหมวดหมู่ตามลำดับ เส้นโค้ง ROC ถูกสร้างขึ้นหลังจากสร้างแบบจำลองการมีหรือไม่มีการวินิจฉัยทางคลินิกที่กำหนดด้วยการวิเคราะห์โลจิสติกแบบถดถอย

ระดับการแสดงออกของ Western blot ของ YKL{{0}} และ GFAP ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามการควบคุมการโหลดตามลำดับ ( -tubulin และ -actin) และเปรียบเทียบกับค่าเฉลี่ยของอัตราส่วนการควบคุมด้วยการทดสอบ Mann–Whitney U แบบไม่อิงพารามิเตอร์ ในกราฟ ระดับ CSF และพลาสมา YKL-40 และ CRP จะแสดงเป็นค่ามัธยฐานและค่าพิสัยระหว่างควอไทล์ การแสดงออกของสมองของ YKL-40 แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) ในทุกกรณี มีการกำหนดนัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0.05

กลไกของ Cistanche รักษาโรคอัลไซเมอร์ & โรคพาร์กินสัน

Cistanche เป็นสมุนไพรที่ถูกนำมาใช้แบบดั้งเดิมในการแพทย์แผนจีนเพื่อรักษาสภาวะสุขภาพต่างๆ รวมถึงความผิดปกติของระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์ (AD) และโรคพาร์กินสัน (PD) Cistanche ประกอบด้วยสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิด รวมทั้ง phenylethanoid glycosides และ iridoid glycosides ซึ่งมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และป้องกันระบบประสาท สารประกอบเหล่านี้ช่วยปกป้องเซลล์ประสาทจากความเสียหายที่เกิดจากอนุมูลอิสระและกระบวนการอักเสบ ซึ่งเชื่อว่ามีส่วนช่วยในการพัฒนาและความก้าวหน้าของ AD และ PD

นอกจากนี้ Cistanche ยังช่วยเพิ่มระดับของสารสื่อประสาทบางชนิดในสมอง รวมถึงโดปามีนและอะเซทิลโคลีน ซึ่งมีความสำคัญต่อการทำงานของสมองตามปกติ โดยการเพิ่มระดับสารสื่อประสาทเหล่านี้ Cistanche อาจช่วยปรับปรุงการทำงานของการรับรู้และลดอาการของ AD และ PD

โดยรวมแล้ว กลไกของ Cistanche ในการรักษา AD และ PD เกี่ยวข้องกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และป้องกันระบบประสาท เช่นเดียวกับความสามารถในการเพิ่มระดับสารสื่อประสาทในสมอง

ยังมีต่อ...

วิคเตอร์ อันโตนิโอ บลังโก-ปาลเมโร 1,2,3,† , มาร์กอส รูบิโอ-เฟร์นันเดซ 1,2,†, เดซีเร อันเตเกรา 1,2, อัลเบร์โต วิลลาเรโฮ-กาเลนเด 1,2,3, โฆเซ อันโตนิโอ โมลินา 1,2,3, อิซิโดร เฟอร์เรร์ 1,4,5,6 , เฟร์นันโด บาร์โตโลเม 1,2,* และ เอวา คาร์โร 1,2,*

1 Network Center for Biomedical Research in Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 28031 Madrid, สเปน; victorb1989@gmail.com (วบ-ป.); marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.); eeara@yahoo.es (ดา); avgalende@yahoo.es (เอวี-จี); cvillaiza@telefonica.net (แยม); 8082ifa@gmail.com (หาก)

2 กลุ่มโรคเกี่ยวกับระบบประสาท, โรงพยาบาล 12 de Octubre Research Institute (imas12), 28041 Madrid, สเปน

3 Neurology Service Hospital Universitario 12 de Octubre, 28041 มาดริด สเปน

4 สถาบันวิจัยชีวการแพทย์ Bellvitge (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, E08907 บาร์เซโลนา สเปน

5 Department of Pathology and Experimental Therapeutics, University of Barcelona, ​​E08900 Barcelona, ​​Spain 6 Institute of Neurosciences, University of Barcelona, ​​E08000 Barcelona, ​​สเปน * การติดต่อ: fbartolome.imas12@h12o.es (FB); carroeva@h12o.es (EC); โทรศัพท์: บวก 34-913908765 (FB & EC); โทรสาร: บวก 34-913908544 (FB & EC)