ฤทธิ์ต้านความชราในหลอดทดลองของสารสกัดเอทานอลจากเงาะสีชมพู (Nephelium Lappaceum Linn.) สำหรับการทาผิวหนัง ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม

ความชราของผิวมีลักษณะพิเศษต่างๆ เช่น รอยย่น การสูญเสียความยืดหยุ่น ความหย่อนคล้อย ผิวหยาบกร้าน ฝ้า และกระ การวิจัยหลายประเภทมุ่งเน้นไปที่การป้องกันและรักษาความร่วงโรยของผิวด้วยส่วนผสมจากธรรมชาติมากมาย การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินฤทธิ์ต้านความชราของสารสกัดเอทานอลของเงาะสีชมพู (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) จากใบ (L) กิ่ง (B) เมล็ด (S) และเปลือกจาก ผลสุก (R) และผลอ่อน (Y) ผลผลิตเงาะสีชมพู (PR) ทั้งหมดที่สกัดโดยวิธี Maceration (M) และการสกัดแบบ Soxhlet (Sox) โดยใช้เอทานอลร้อยละ 95 เป็นตัวทำละลาย มีค่าตั้งแต่ร้อยละ 10.62 ถึง 30 .63 เปอร์เซ็นต์ . พบฟลาโวนอยด์เป็นสารพฤกษเคมีหลักในสารสกัด PR เกือบทั้งหมด สารสกัด PR-YM และ PR-Y-Sox ให้ปริมาณฟีนอลทั้งหมดสูงสุดโดยการทดสอบ Folin-Ciocalteu ที่ 67.60 ± 4.38 mgGAE/g และปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดโดยการวิเคราะห์สีอะลูมินัมคลอไรด์ที่ปรับปรุงแล้วที่ 678.72 ± 23.59 mgQE/g ตามลำดับ สารสกัด PR-LM มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงสุดสามชนิด การกำจัดอนุมูลอิสระ (SC50 จาก 0.320 ± 0.{{40}}70 มก./มล.) , การยับยั้งการเกิด lipid peroxidation (LC50 ของ 0.274 ± 0.029 มก./มล.) และกิจกรรมขับโลหะ (MC50 ของ 0.203 ± 0.021 มก./มล.) สารสกัด PR ทั้งหมดที่ 0.01 และ 0.1 มก./มล. ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อเซลล์ B16F10 และเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ ตามลำดับ ในทำนองเดียวกัน สารสกัด PR-R-Sox แสดงการต่อต้านเมลาโนเจเนซิสสูงสุดบนเซลล์ B16F10 (52. 7 ± 0.9 เปอร์เซ็นต์ ) และกิจกรรมการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสจากเห็ด (IC50 ที่ 0.04 ± 0.02 มก./มล.) ซึ่งเปรียบเทียบได้อย่างมีนัยสำคัญกับ กรดโคจิก (p < 0.05) สารสกัด PR-Y-Sox แสดงการสังเคราะห์คอลลาเจนโดยวิธี Sirius Red และการกระตุ้นยีนต่อต้านวัย (Sirt1 และ Foxo1) บนเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังโดยวิธี RT-PCR ซึ่งคล้ายกับมาตรฐาน ʟ-ascorbic acid และ เรสเวอราทรอลตามลำดับ การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าสารสกัด PR-R-Sox และ PR-Y-Sox สามารถพัฒนาต่อไปเป็นสารต่อต้านริ้วรอยตามธรรมชาติสำหรับไวท์เทนนิ่งและต่อต้านริ้วรอยในอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง เวชสำอาง และเภสัชกรรม 2023 ผู้แต่ง จัดพิมพ์โดย Elsevier BV ในนามของมหาวิทยาลัย King Saud

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และมีความสามารถในการกำจัดชนิดของออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาและป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่ ฉันจะซื้อ Cistanche ได้ที่ไหน

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. บทนำ

ทั่วโลก ประชากรสูงอายุในโลกเติบโตเร็วกว่ากลุ่มอายุอื่นๆ ทั้งหมด องค์การอนามัยโลกประเมินว่าประชากรโลกที่มีอายุมากกว่า 60 ปีขึ้นไปจะมีจำนวน 2.1 พันล้านคนในปี พ.ศ. 2593 และจะเผชิญกับโรคทั่วไป เช่น ข้อเข่าเสื่อม เบาหวาน สูญเสียการได้ยิน โรคอัลไซเมอร์ โรคปอดอุดกั้นเรื้อรัง (COPDs) ภาวะซึมเศร้า และภาวะสมองเสื่อม มะเร็ง และโรคทางระบบประสาทและหลอดเลือดหัวใจ (Darawsha et al., 2021, WHO, 2021) ผิวหนังเป็นอวัยวะหนึ่งที่มองเห็นได้ชัดเจนที่สุดในระหว่างกระบวนการชรา ความชราของผิวเกี่ยวข้องกับการสื่อสารทางสังคม เพราะรูปร่างหน้าตาที่ดีจะสร้างความประทับใจและเพิ่มความมั่นใจในตนเอง ความชราของผิวหนังได้รับผลกระทบจากปัจจัยทางสิ่งแวดล้อมหรือภายนอก เช่น มลภาวะในอากาศ สารพิษจากสิ่งแวดล้อม รังสียูวี และการสูบบุหรี่ และจากปัจจัยภายใน เช่น พันธุกรรม เมแทบอลิซึมของเซลล์ ฮอร์โมน และกระบวนการเมตาบอลิซึม (Darawsha et al., 2021) การวิจัยล่าสุดหลายประเภทมุ่งเน้นไปที่การรักษาสุขภาพผิวโดยการชะลอ ป้องกัน และรักษาความชรา เพื่อปรับปรุงลักษณะที่ปรากฏของผิวโดยการสร้างใหม่และกระตุ้นกระบวนการทางสรีรวิทยาตามธรรมชาติเพื่อปกป้องผิวจากความชรา

สายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) จากความเครียดออกซิเดชันของเซลล์สามารถทำให้เกิดการตายของเซลล์อะพอพโทซิสโดยการกระตุ้นกระบวนการอักเสบและเส้นทางการส่งสัญญาณ การเพิ่มระดับของโลหะโปรตีน (MMPs) การสลายตัวของไขมันไม่อิ่มตัว และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของไฟบริลลา โปรตีนรวมถึงคอลลาเจนและอีลาสตินที่เกิดจากความชราของผิว (Miastkowska and Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021) จากการสร้างเมลาโนเจเนซิส เมลานินเป็นเม็ดสีโพลีฟีนอลที่ผลิตในเมลาโนโซมของเมลาโนไซต์ที่อยู่ในดวงตา ขน และผิวหนังของสัตว์ และสามารถปกป้องผิวหนังที่ได้รับความเสียหายจากรังสีอัลตราไวโอเลต (Ali และ Naaz, 2018) ไทโรซิเนสเป็นเอนไซม์ที่ประกอบด้วยทองแดง ซึ่งสามารถเปลี่ยน L-tyrosine เป็น L-dopa และ L-dopa เป็น odopaquinone-H plus โดยปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันและปฏิกิริยาออกซิเดชัน จากนั้นจึงผ่านตัวกลางไปสู่เมลานินในที่สุด (Solano, 2018) ROS ยังมีบทบาทสำคัญในการควบคุมความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของเซลล์ในเซลล์เมลาโนไซต์ซึ่งเป็นเซลล์เดนไดรติกที่จำกัดอยู่ในชั้นฐานของหนังกำพร้าในผิวหนัง สารสื่อกลางการอักเสบในผิวหนัง เช่น อินเตอร์ลิวคิน (IL), พรอสตาแกลนดิน E2, ปัจจัยการตายของเนื้อร้ายของเนื้องอก และอินเตอร์เฟอรอน-แกมมา ซึ่งส่วนใหญ่หลั่งโดยเซลล์ Th, ลิมโฟไซต์, เซลล์เดนไดรต์ และโมโนไซต์ ควบคุมการกระตุ้นการทำงานของไทโรซิเนสและควบคุม TYRP{{11 }} และ TYRP-2 แสดงออกและส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเมลาโนไซต์ซึ่งเกี่ยวข้องกับการผลิตเมลานิน (Fu et al., 2020) อย่างไรก็ตาม การผลิตที่มากเกินไปและการสะสมของเมลานินที่สูงทำให้เกิดอายุของผิวหนัง เช่น ฝ้า กระ จุดด่างดำ เลนติโก และความผิดปกติของการสร้างเม็ดสีมากเกินไป ซึ่งอาจเป็นสิ่งที่ไม่พึงปรารถนาในด้านความสวยงาม (Ali and Naaz, 2018)

Sirtuins คือนิวเคลียสนิโคตินาไมด์อะดีนีนไดนิวคลีโอไทด์ (NAD บวก )-ขึ้นอยู่กับคลาส III ฮิสโตนดีอะเซทิเลสที่ควบคุมการชราภาพของเซลล์และการตายของเซลล์ และการเติบโตของเซลล์โดยการควบคุม p53, ปัจจัยการถอดรหัสแบบฟอร์กเฮด (FOXO) และแกมมาตัวรับที่กระตุ้นการทำงานของเซลล์เพอรอกซิโซม (PPAR-c) ที่เกี่ยวข้อง ระเบียบของเมแทบอลิซึม ความแตกต่างของเซลล์ การอยู่รอด และการแก่ชรา (Son et al., 2021). SIRT1, SIRT6 และ SIRT7 ที่ไม่บ่อยนักในตระกูล Sirtuin ได้รับการควบคุมสำหรับปัญหาทางผิวหนัง รวมถึงการอักเสบของผิวหนัง การติดเชื้อที่ผิวหนัง มะเร็ง โรคภูมิคุ้มกันทำลายตัวเอง โรคผิวหนังที่สืบทอดมา โดยเฉพาะอายุของผิวหนัง (Son et al., 2021) เช่นกัน FOXO1 เป็นปัจจัยการถอดความที่อยู่ในไซโตพลาสซึม SIRT1 deacetylates FOXO1 และเปิดใช้งานการถอดรหัส FoxO1 ในหลายเส้นทางเช่น MAPK (mitogen-activated protein kinase), โปรตีนไคเนส (AKT) และทางเดิน homeobox ของตับอ่อนและลำไส้เล็กส่วนต้น-1 (Pdx1) (Sin et al., 2015) . การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ Sirt1 และ Foxo1 mRNA ควบคุมเมแทบอลิซึมของกลูโคส การซ่อมแซม DNA การป้องกันระบบประสาท การแยกความแตกต่าง การป้องกันหลอดเลือด และการหลั่งอินซูลิน และลดอายุและโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ เช่น ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การชราภาพของเซลล์ การเสื่อมสภาพของระบบประสาท การอักเสบ การดื้อต่ออินซูลิน โรคหัวใจและหลอดเลือด ไขมันพอกตับ ไขมันพอกตับ ตลอดจนอายุของผิวหนัง (Son et al., 2021)

พระราชบัญญัติยา (ยา) และเครื่องสำอาง พ.ศ. 2483 นิยามยาว่า "ยาทั้งหมดสำหรับใช้ภายในและภายนอกของมนุษย์หรือสัตว์ และสารทั้งหมดที่มีจุดประสงค์เพื่อใช้ในการวินิจฉัย รักษา บรรเทา หรือป้องกัน โรคหรือความผิดปกติใด ๆ ในมนุษย์หรือสัตว์" เครื่องสำอาง คือ สิ่งของใด ๆ ที่มุ่งหมายเพื่อใช้ถู เท โรย หรือฉีด นำเข้า หรือใช้กับส่วนใด ๆ ของร่างกายมนุษย์เพื่อชำระล้าง ทำให้สวยงาม ส่งเสริมความน่าดึงดูด หรือเปลี่ยนแปลง ลักษณะภายนอก และรวมถึงสิ่งของใดๆ ที่มีไว้สำหรับใช้เป็นส่วนประกอบของเครื่องสำอาง Cosmeceuticals เป็นลูกผสมระหว่างเครื่องสำอางและเวชภัณฑ์ที่มีวัตถุประสงค์เพื่อส่งเสริมสุขภาพและความงามผ่านส่วนผสมที่มีอิทธิพลต่อพื้นผิวและการทำงานทางชีวภาพของผิว (Joshi และ Pawar, 2015) ปัจจุบัน การต่อต้านริ้วรอย เครื่องสำอาง เวชสำอาง และเวชภัณฑ์ประกอบด้วยสารที่ออกฤทธิ์ต่อต้านอนุมูลอิสระ เช่น วิตามินอี วิตามินซี กลูตาไธโอน และโคเอนไซม์ คิวเท็น และชะลอความแก่ของผิวจากริ้วรอยและฝ้า เช่น กรดนิวคลีอิก โปรตีนไฮโดรไลเสต สารสกัดจากสาหร่าย น้ำมันพืช ไฟโตฮอร์โมน ไซโตไคน์และนิวโรเปปไทด์ (Kim et al., 2015, Miastkowska and Sikora, 2018) รวมทั้งโพลีฟีนอลและฟลาโวนอยด์จากสารสกัดจากพืชธรรมชาติหลายชนิด เช่น สารสกัด Vigna subterranean, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus comosus และ Manihot esculenta (ชุโตประภัสร์ et al., 2020; Ding et al., 2020 Boonpisuttinant et al., 2022, Jampa et al., 2022)

เงาะสีชมพู หรือ เงาะสีชมปู (Nephelium lappaceum L.) เป็นพืชตระกูล Sapindaceae ซึ่งเป็นพืชพื้นเมืองของอำเภอขลุง จังหวัดจันทบุรี ทางภาคตะวันออกของประเทศไทย เงาะสีชมพู (PR) ผลไม้รสหวานและมีรสชาติดี มีลักษณะเปลือกบาง เปลือกสีชมพูอมเหลือง หนามสีชมพูอ่อน ปลายสีเขียวอ่อน ซึ่งแตกต่างจากชนิดอื่นๆ เช่น เงาะโรงเรียน และเงาะประสาน ซึ่งมีเปลือกและหนามสีแดงอ่อน สารพฤกษเคมีหลักที่พบในต้นเงาะ ได้แก่ กรดเอลลาจิก โคริลาจิน เจอรานิอิน เควอซีติน และรูติน (Phuong et al., 2019, Phuong et al., 2020) มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าเปลือกเงาะพันธุ์อื่นพบว่ามีสารประกอบฟีนอลสูงและมีฤทธิ์ทางชีวภาพหลายอย่าง เช่น ขจัดอนุมูลอิสระ DPPH ต้านการอักเสบ ต้านไวรัส ต้านมะเร็ง ต้านแบคทีเรีย (Chingsuwanrote et al. ., 2016; Hernández-Hernández et al., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari et al., 2017; Thitilertdecha and Rakariyatham, 2011) อย่างไรก็ตาม สารสกัดจากเงาะสีชมพูยังไม่มีรายงานทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับฤทธิ์ทางชีวภาพ โดยเฉพาะฤทธิ์ในการต่อต้านวัยเพื่อสุขภาพผิวและความงาม ดังนั้น การศึกษาในปัจจุบันจึงมีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินและประเมินศักยภาพของสารสกัด PR ในการใช้ผิวหนังในเครื่องสำอาง เวชสำอาง และเภสัชภัณฑ์ การตรวจสอบกิจกรรมทางชีวภาพในการต่อต้านริ้วรอย ในหลอดทดลอง รวมถึงการยับยั้งไทโรซิเนสและแอนติเมลาโนเจเนซิส การสังเคราะห์คอลลาเจนทางชีวภาพ และการกระตุ้นการแสดงออกของ Sirt1 และ Foxo1 mRNA และกิจกรรมต้านออกซิเดชันทั้งสามกิจกรรม ตลอดจนความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ บ่งชี้ถึงประสิทธิภาพ และความปลอดภัยของ PR สารสกัดที่สามารถนำไปพัฒนาต่อยอดเป็นผลิตภัณฑ์บำรุงผิวจากธรรมชาติ

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การเตรียมและการสกัด

เงาะสีชมพู (PR) 5 ส่วน ได้แก่ ใบ (L) กิ่ง (B) เมล็ด (S) และเปลือกผลสุก (R) และผลอ่อน (Y) จากอำเภอขลุง จันทบุรี ประเทศไทย ตั้งแต่เดือนมิถุนายนถึง สิงหาคม 2560 ตัวอย่างใบสำคัญระบุโดยนักพฤกษศาสตร์ที่หอพรรณไม้แห่งประเทศไทย และขึ้นทะเบียนหอพรรณไม้ (รหัส: RSPG-RMUTT-0102) ของนวัตกรรมผลิตภัณฑ์ธรรมชาติจากหน่วยวิจัยภูมิปัญญาไทย คณะการแพทย์บูรณาการ มทร. , ปทุมธานี, ประเทศไทย. เงาะสีชมพูทุกส่วนถูกตัด ล้างด้วยน้ำประปา ตากแห้งที่อุณหภูมิ 60 องศาในเตาอบลมร้อน และบดเป็นผงโดยใช้เครื่องบด ทุกส่วนของเงาะสีชมพูสกัดด้วยวิธี Maceration และ Soxhlet โดยใช้เอทานอลร้อยละ 95 เป็นตัวทำละลาย ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้บ่อยที่สุดในการสกัดพืชสมุนไพร เนื่องจากมีความปลอดภัยและประหยัด สรุป ผง PR แต่ละชนิด 10 กรัมถูกสกัดโดย (1): Maceration (M) ใน 100 มล. ของเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (บริษัท บางกอกแอลกอฮอล์ อินดัสเตรียล ประเทศไทย) ด้วยการเขย่าที่ 200 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้อง (25 ± 2 องศา ) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง; และ (2): การสกัดแบบ Soxhlet (Sox) ด้วยเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ (v/v) 100 มล. ที่อุณหภูมิ 80 ± 5 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นสารสกัดจะถูกกรองผ่านสำลีก่อนแล้วจึงผ่านกระดาษกรองที่เชื่อมต่อกับปั๊มสุญญากาศ ตัวกรองถูกรวบรวม รวมและทำให้แห้งโดยเครื่องระเหยแบบหมุน สารสกัดหยาบของ PR ถูกเก็บไว้ในขวดแก้วและเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาจนกว่าจะใช้ ผลผลิตการสกัดดำเนินการตามน้ำหนักแห้ง เอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ใช้เป็นตัวทำละลายในการละลายสารสกัด PR ก่อนการทดลอง

2.2. ไฟโตเคมิคอล ฟีนอลทั้งหมดและฟลาโวนอยด์ และปริมาณเควอซิติน

พฤกษเคมี เช่น แอนทราควิโนน อัลคาลอยด์ แคโรทีนอยด์ ไกลโคไซด์ ฟลาโวนอยด์ แทนนิน และแซนโทนของสารสกัด PR ได้รับการตรวจสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (บุญพิสุทธินันท์ et al., 2022) ผลลัพธ์เชิงคุณภาพแสดงเป็น ( บวก ) สำหรับการมีอยู่ และ (-) สำหรับการไม่มีสารพฤกษเคมี ปริมาณฟีนอลทั้งหมด (TPC) ได้รับการวิเคราะห์โดยการทดสอบ Folin-Ciocalteu ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Boonpisuttinant et al., 2022) โดยสังเขป สารสกัด PR 50 ล., Folin-Ciocalteu reagent 75 ล. (Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) และ 75 ล. ของ 7.5 เปอร์เซ็นต์ (w/v) Na2CO3 (Loba Chemie, อินเดีย) ถูกเพิ่มลงใน {{13} }ไมโครเพลทอย่างดี ผสมเบา ๆ แล้วบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 90 นาที จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 725 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท ปริมาณฟีนอลคำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐานของกรดแกลลิก (Sigma-Aldrich, USA) ผลลัพธ์ได้ดำเนินการเป็นมิลลิกรัมของกรดแกลลิกเทียบเท่า (GAE)/กรัมของสารสกัด

ปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC) โดยวิธีอะลูมิเนียมคลอไรด์ดัดแปลงถูกวิเคราะห์ตาม Shraim et al (2564). โดยสังเขป สารสกัด PR 50 ล., AlCl3 10 เปอร์เซ็นต์ 25 ล. (BDH Prolabo Chemicals, เบลเยียม) และ 100 ล. ของ NaNO2 5 เปอร์เซ็นต์ (Loba Chemie, อินเดีย) ถูกเติมลงใน 96-แผ่นไมโครเพลท หลังจากการบ่มเป็นเวลา 5 นาที จานถูกเติม 25 ลิตรของ NaOH 1 โมลาร์ (BDH Prolabo Chemicals ประเทศเบลเยียม) ปฏิกิริยาได้รับอนุญาตโดยการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท ปริมาณฟลาโวนอยด์คำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐานของเควอซิทิน (Sigma-Aldrich, USA) ผลลัพธ์ได้ดำเนินการเป็น mg ของ Quercetin เทียบเท่า (QE)/g ของสารสกัด

เนื้อหาเควอซิตินในสารสกัด PR ได้รับการตรวจสอบโดยวิธี HPLC (ไชคห์และเชน, 2018) โดยสังเขป ปริมาณเควอซิทินมาตรฐานที่ชั่งน้ำหนักอย่างถูกต้องถูกละลายในเมทานอลในขวดวัดปริมาตร 100 มล. เพื่อให้ได้สารละลายสต็อก 1,000 ลิตร/มล. สารละลายมาตรฐานต่อมาถูกเจือจาง 2-เท่าๆ กันเป็น 3.125 มก./มล. สำหรับการเตรียมตัวอย่าง สารสกัด 2.5 กรัมละลายในเมทานอล 25 มล. ในขวดวัดปริมาตร 25 มล. เพื่อให้ได้ 1,000 มก./มล. การวิเคราะห์ทั้งหมดดำเนินการบนระบบ Agilent 1260 infinity HPLC (Waters, Milford, MA, USA) ที่ติดตั้งตัวตรวจจับโฟโตไดโอดอาร์เรย์ คอลัมน์วิเคราะห์ที่ใช้คือคอลัมน์ขยาย Agilent Zorbax C18 (5l × 100 มม. × 4.6 มม.) ที่มีเฟสเคลื่อนที่ของเมทานอล: กรดออร์โธฟอสฟอริก 0.1 เปอร์เซ็นต์ (75:25) ที่อัตราการไหล 0.6 มล./นาที อุณหภูมิคอลัมน์ถูกรักษาไว้ที่ 25 องศา และตั้งค่าความยาวคลื่นการตรวจจับไว้ที่ 370 นาโนเมตร สารละลายและตัวทำละลายทั้งหมดถูกกรองผ่านตัวกรอง 0.22 lm และไล่แก๊สออก ปริมาตรการฉีดตัวอย่างคือ 10 ล. และเวลาดำเนินการคือ 8 นาที

2.3. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ

2.3.1. กิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระ

ฤทธิ์ในการกำจัดอนุมูลอิสระของสารสกัด PR ทดสอบโดยวิธี 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) โดย Boonpisuttinant et al. (2019). สารสกัด PR จำนวน 100 มล. หรือกรดแอสคอร์บิก (Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) จำนวน 100 มล. เป็นตัวควบคุมเชิงบวก และสารละลาย DPPH (ซิกมา-อัลดริช สหรัฐอเมริกา) 0.1 มก./มล. ในเอทานอลสัมบูรณ์ 100 มล. ถูกเติมลงใน ไมโครเพลท 96 หลุม หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 515 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของกิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH ถูกคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

เปอร์เซ็นต์กิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

โดยที่ A0 คือค่าการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุม และ A1 คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง จากนั้น ความเข้มข้นที่ให้การกำจัดอนุมูลอิสระ 50 เปอร์เซ็นต์ (SC50) จะถูกคำนวณจากกราฟที่ลงจุดระหว่างเปอร์เซ็นต์การกำจัดอนุมูลอิสระและความเข้มข้นของตัวอย่าง

2.3.2. การยับยั้งการเกิด lipid peroxidation

ตรวจสอบการยับยั้ง lipid peroxidation ของสารสกัด PR โดยวิธี Ferric-thiocyanate บุญพิสุทธินันท์ และคณะ (2562). ปริมาณ 50 มล. ของสารสกัด PR หรือ a-tocopherol (Sigma-Aldrich, USA) เป็นตัวควบคุมเชิงบวกและ 50 lL ของกรดไลโนเลอิกใน 50 เปอร์เซ็นต์ (v/v) DMSO (Sigma-Aldrich, USA) ถูกเติมลงใน a ไมโครเพลท 96 หลุม ปฏิกิริยาเริ่มต้นโดยการเติม 50 ลิตรของ 5 mM NH4- SCN และ 50 ลิตรของ 2 mM FeCl2 หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาในที่มืดเป็นเวลา 60 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งการเกิด lipid peroxidation ถูกคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

โดยที่ A0 คือค่าการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุม และ A1 คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง ความเข้มข้นที่ให้ 50 เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งการเกิด lipid peroxidation (LC50) ถูกคำนวณจากกราฟที่ลงจุดระหว่างเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง lipid peroxidation และความเข้มข้นของตัวอย่าง

2.3.3. คีเลชั่นโลหะ

การทดสอบการขับโลหะของสารสกัด PR ด้วยวิธีเฟอรัสไอออนคีเลต (FIC) โดยบุญพิสุทธินันท์และคณะ (2562). ปริมาณ 50 มล. ของสารสกัด PR หรือ EDTA (Loba Chemie, อินเดีย) เป็นตัวควบคุมเชิงบวก, FeCl2 1 มก./มล. และ 50 มล. ของเฟอร์โรซีน 1 มก./มล. ใน HCl 1 เปอร์เซ็นต์ (TCI, สหรัฐอเมริกา) ถูกเติมลงใน ไมโครเพลท 96 หลุม หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 60 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของคีเลชั่นโลหะคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

โดยที่ A0 คือค่าการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุม และ A1 คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง ความเข้มข้นที่ให้ 50 เปอร์เซ็นต์ของคีเลชั่นโลหะ (MC50) ถูกคำนวณจากกราฟที่ลงจุดระหว่างเปอร์เซ็นต์ของคีเลชั่นโลหะและความเข้มข้นของตัวอย่าง

2.4. การยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

ฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสจากเห็ดของสารสกัด PR ถูกวิเคราะห์โดยวิธีโดปาโครมที่ปรับปรุงแล้ว (บุญพิสุทธินันท์ et al., 2022) ปริมาณ 50 ลิตรของสารสกัด PR หรือกรดโคจิก (ห้องปฏิบัติการวิจัยของ Sisco (SRL) ประเทศอินเดีย) เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก 50 ลิตรของ L-tyrosine (Sigma-) 0.1 มก./มล. Aldrich สหรัฐอเมริกา) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 มิลลิโมลาร์ 50 มล. และไทโรซิเนสเห็ด 0.1 มก./มล. 50 มล. (Sigma-Aldrich สหรัฐอเมริกา) ถูกเติมลงใน 96-หลุมไมโครเพลท ก่อนและหลังการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ในที่มืดเป็นเวลา 60 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดถูกคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

เปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด=[(A - B)-(C - D)]/=(A - B)×100 (4)

โดยที่ A คือค่าการดูดกลืนแสงของชิ้นงานหลังการบ่ม B คือค่าการดูดกลืนแสงของชิ้นงานก่อนการบ่ม C คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างหลังการบ่ม และ D คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างก่อนการบ่ม ความเข้มข้นที่ให้การยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส 50 เปอร์เซ็นต์ (IC50 มก./มล.) ถูกคำนวณจากกราฟที่ลงจุดระหว่างเปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนสและความเข้มข้นของตัวอย่าง

2.5. กิจกรรมต่อต้านความชราในหลอดทดลองในการเพาะเลี้ยงเซลล์

2.5.1. การเพาะเลี้ยงเซลล์

Murine melanomas (B16F10) และไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบการต่อต้านการสร้างเม็ดสี การสังเคราะห์คอลลาเจน และการต่อต้านริ้วรอยของการแสดงออกของ Sirt1 และ Foxo1 mRNA ตามลำดับ เซลล์ทั้งสองนี้ได้มาจาก American Type Culture Collection (ATCC) รัฐเวอร์จิเนีย ประเทศสหรัฐอเมริกา เพาะเลี้ยงเซลล์ใน Modified Eagle Medium (DMEM) ของ Dulbecco (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, USA) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA ), เพนิซิลลิน 100 IU/มล. และสเตรปโตมัยซิน 100 มก./มล. (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) ภายใต้สภาวะมาตรฐานที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ภายใต้ตู้บ่มคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ ก่อนการทดลอง

2.5.2. การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์

ความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัด PR ได้รับการตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อเมลาโนมาของหนู (B16F10) และไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์โดย 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay ตามที่ Boonpisuttinant et al ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (2565). ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ที่ความหนาแน่น 1 ×104 เซลล์ต่อหลุมถูกชุบใน 96-เพลตหลุม ปรับปริมาตรเป็น 180 มิลลิลิตรด้วย DMEM และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาภายใต้บรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงเติมสารสกัดที่ความเข้มข้นต่างๆ เซลล์ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ภายใต้บรรยากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ของ CO2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างด้วย 10 mM PBS ที่ pH 6.8 เป็นเวลา 3 ครั้ง และเติมสารละลาย MTT 0.5 mg/mL 1 มล. (Sigma-Aldrich, USA) หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 ชั่วโมง สารละลาย MTT จะถูกกำจัดออก และเติมไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) 100 มล. ลงในแต่ละหลุม จานถูกเขย่าเบา ๆ ที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของความมีชีวิตของเซลล์คำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

โดยที่ Acontrol คือค่าการดูดกลืนแสงของส่วนควบคุม และตัวอย่างคือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง

2.5.3. ต่อต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสบนเซลล์ B16F10

การตรวจสารต้านเมลาโนเจเนซิสบนเซลล์ B16F10 ของสารสกัด PR โดยใช้วิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยบุญพิสุทธินันท์และคณะ (2565). เซลล์ B16F10 ที่ความหนาแน่น 2.5×105 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะใน 6-จานหลุม และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาภายใต้บรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ข้ามคืน จากนั้นเติมสารสกัดที่ความเข้มข้น 0.01 มก./มล. กรดโคจิกถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก เซลล์ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาภายใต้บรรยากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ของ CO2 เป็นเวลา 72 ชั่วโมง หลังจากนั้น เก็บส่วนเหนือตะกอนในหลอดไมโครฟิวจ์ที่สะอาด ส่วนเซลล์ถูกล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 10 มิลลิโมลาร์ (PBS) ที่ pH 6.8 จำนวน 3 ครั้ง ละลายใน 200 มล. ของ NaOH 10 เปอร์เซ็นต์ และบ่มที่อุณหภูมิ 60 องศา 1 ชั่วโมง . วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรของสารเหนือตะกอนและไลเซทของเซลล์โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของปริมาณเมลานินคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

2.5.4. การสังเคราะห์คอลลาเจนบนไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์

ตรวจสอบการสังเคราะห์คอลลาเจนของสารสกัด PR ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยบุญพิสุทธินันท์และคณะ (2022). ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ที่ความหนาแน่น 5 × 105 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะลงใน 6-แผ่นหลุม และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาภายใต้บรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในชั่วข้ามคืน จากนั้นจึงเติมสารสกัดที่ความเข้มข้น 0.1 มก./มล. ʟ-แอสคอร์บิกแอซิดถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก เซลล์ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาภายใต้บรรยากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ของ CO2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างด้วย 10 mM PBS ที่ pH 6.8 เป็นเวลา 3 ครั้ง เติมสารละลาย Sirius red 0.1 เปอร์เซ็นต์ (w/v) 1 มิลลิลิตร (Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) ในกรดพิคริกอิ่มตัว (Sisco Research Laboratories (SRL ), อินเดีย) แล้วบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชม. สีย้อมถูกกำจัดออก และจานถูกล้างด้วย 1 มล. ของ 10 มิลลิโมลาร์ HCl (เมอร์ค มิลลิพอร์ เยอรมนี) 5 ครั้ง จากนั้น เซลล์ถูกละลายโดยเติม NaOH 0.1 โมลาร์ 1 มล. วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรของสารเหนือตะกอนและไลเซทของเซลล์โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์ของปริมาณคอลลาเจนคำนวณตามสูตรต่อไปนี้:

โดยที่ Csample คือเนื้อหาคอลลาเจนของตัวอย่าง และ Ccontrol คือเนื้อหาคอลลาเจนของกลุ่มควบคุม

2.5.5. การกระตุ้นยีนต่อต้านความชราบนไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์

การกระตุ้นยีนต่อต้านวัย (Foxo1 และ Sirt1) ของสารสกัด PR ถูกกำหนดโดย RT-PCR ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Polouliakh et al (2020) ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ที่ความหนาแน่น 5 ×105 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะลงใน 6-จานหลุมที่บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสภายใต้บรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ข้ามคืน จากนั้นเติมสารสกัดที่ความเข้มข้น 0.01 มก./มล. หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง RNA ทั้งหมดจะถูกสกัดด้วย NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปริมาณของ RNA ทั้งหมดถูกหาปริมาณโดย Qubit 2.0 fluorometer (Invitrogen, Massachusetts, USA.) ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ RT-PCR รวมถึง Foxo1, Sirt1 และ b-actin ถูกซื้อจาก Macrogen Oceania ประเทศออสเตรเลีย มีการติดตามลำดับของไพรเมอร์เฉพาะ Foxo1: 5′ -GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3′(ไปข้างหน้า) และ 5′-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3′(ย้อนกลับ); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(ข้างหน้า), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (ย้อนกลับ); และ b-actin: 5′ TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3′ (ไปข้างหน้า), 5′ -CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3′(ย้อนกลับ) ส่วนผสม PCR ประกอบด้วย 1x SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System with PlatinumTM Taq DNA Polymerase Supermix (Invitrogen, Massachusetts, USA.), 250 nM ของไพรเมอร์เฉพาะ และ 2 lg ของ RNA ปฏิกิริยา RT-PCR ทั้งหมดดำเนินการบน TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Göttingen, Germany) ภายใต้เงื่อนไขการขยาย: 60 องศา C 30 นาทีสำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ จากนั้น 40 รอบที่ 94 องศาเป็นเวลา 15 วินาทีของการเสียสภาพธรรมชาติ 55 องศาเซลเซียสสำหรับการหลอม 30 วินาที และ 68 องศาสำหรับการต่อ 30 วินาที และสุดท้ายที่อุณหภูมิ 68 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที หลังจากกระบวนการ RT-PCR แล้ว ผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกแยกออกจากเจลอะกาโรส 1.5 เปอร์เซ็นต์ผสมกับ Novel Juice 6x DNA Loading Buffer (GeneDireXTM ประเทศจีน) ดูด้วยทรานสลูมิเนเตอร์ แล้วถ่ายภาพโดยใช้ปริมาณที่หนึ่ง 4.6.8 (พื้นฐาน) (ไบโอ-ราด แลบบอราทอรีส์ อิงค์ แคลิฟอร์เนีย) ต่อจากนั้น ความหนาแน่นของแถบถูกวัดโดยใช้ Image J (เวอร์ชัน 1.47, สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, Bethesda, MD, USA) และถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับยีนการดูแลทำความสะอาด b-actin

2.6. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ของการทดลองอิสระ (n {{0}}) วิเคราะห์ความแตกต่างทางสถิติโดย ANOVA ด้วยการทดสอบ Tukey (p <0.05) ทดสอบความสัมพันธ์ระหว่างฤทธิ์ทางชีวภาพโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน

3. ผลลัพธ์

3.1. ผลการสกัด ลักษณะทางกายภาพ และปริมาณสารพฤกษเคมีของสารสกัด PR

ผลผลิตการสกัด ลักษณะทางกายภาพ และปริมาณพฤกษเคมีของสารสกัด PR แสดงไว้ในตารางที่ 1 ผลผลิตการสกัดของสารสกัด PR อยู่ระหว่างร้อยละ 10.62 ถึง 30.63 ส่วนประกอบทางพฤกษเคมีหลักของสารสกัด PR คือฟลาโวนอยด์ สารสกัดเงาะสีชมพูจากเมล็ด (PR-SM และ PR-S-Sox) นั้นไม่มีฟลาโวนอยด์ แต่แสดงเพียงไกลโคไซด์ซึ่งเป็นสารพฤกษเคมี เฉพาะ PR ที่สกัดจากเปลือกผลสุกและเปลือกอ่อนด้วย Maceration (M) แสดงว่ามีสารแซนโทนซึ่งเป็นโพลีฟีนอลที่ไม่ผ่านความร้อน นอกจากนี้ ผลผลิตการสกัดของสารสกัด PR โดยการสกัดแบบ Soxhlet (Sox) ดูเหมือนจะสูงกว่า Maceration (M)

3.2. ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) ฟลาโวนอยด์ (TFC) และเควอซิตินของสารสกัด PR

สารสกัด PR จากเปลือกผลอ่อนด้วยวิธี Maceration (PRY-M) ให้ปริมาณฟีนอลทั้งหมดสูงสุดโดยการทดสอบ FolinCiocalteu ที่ 67.60 ± 4.38 mgGAE/g ในขณะที่สารสกัด PR จากเปลือกผลอ่อนโดยวิธี การสกัดด้วยวิธี Soxhlet (PR-Y-Sox) ให้ปริมาณฟลาโวนอยด์รวมสูงสุดโดยการวิเคราะห์สีด้วยอะลูมิเนียมคลอไรด์ดัดแปลงที่ 678.72 ± 23.59 mgQE/g (รูปที่ 1) (p < 0.05) อย่างไรก็ตาม สารสกัด PR-BM, PR-SM และ PR-S-Sox ไม่พบปริมาณฟีนอล มีการเปิดเผยว่าสารสกัดจาก PR ทั้งหมดแสดงปริมาณเควอซิทินที่กำหนดโดยการวิเคราะห์ HPLC นอกจากนี้ สารสกัด PR จากเปลือกผลไม้สุกด้วยวิธี Maceration (PR-RM) ให้ปริมาณเควอซิตินสูงสุด 190.10 ± 0.28 lg/mL (รูปที่ 2)

3.3. สารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์เห็ดไทโรซิเนสของสารสกัด PR

ตารางที่ 2 แสดงฤทธิ์ต้านออกซิเดชันสามชนิด ได้แก่ ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระโดยวิธี DPPH, การยับยั้งลิพิดเปอร์ออกซิเดชันโดยวิธีเฟอริก-ไทโอไซยาเนต การคีเลชั่นโลหะด้วยวิธี FIC; และการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของเห็ดหลินจือ สารสกัด PR ส่วนใหญ่ยกเว้นสารสกัด PR-LM, PR-BM และ PR-S-Sox แสดงกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระที่เหนือกว่าด้วยช่วง SC5{{10}} ที่ 0.{ {18}}23 – {{20}}.045 มก./มล. ซึ่งเทียบได้กับกรด ʟ-แอสคอร์บิกมาตรฐาน (SC50 ของ 0 036 ± 0.{{40}}03 มก./มล.) ที่ p < 0.05. นอกจากนี้ สารสกัด PR-LM แสดงการยับยั้ง lipid peroxidation สูงสุดด้วย LC50 ที่ 0.274 ± 0.029 มก./มล. และฤทธิ์ขับโลหะด้วย MC50 0.203 ± 0.021 มก./มล. ซึ่งเทียบได้กับอะ-โทโคฟีรอลมาตรฐาน (LC50 เท่ากับ 0.122 ± 0.015 มก./มล.) และ EDTA (MC50 เท่ากับ 0.518 ± 0.034 มก./มล.) ตามลำดับ (p < 0.05) สารสกัด PR ทั้งหมดแสดงฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสจากเห็ด ในขณะที่สารสกัด PR-R-Sox แสดงฤทธิ์สูงสุดโดยมีค่า IC50 ที่ 0.04 ± 0.02 มก./มล. ซึ่งเทียบได้กับกรดโคจิกมาตรฐาน (IC50 ที่ 0.02 ± 0.01 มก. /ml) (p < 0.05).

3.4. ความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัด PR

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>ความมีชีวิตสัมพัทธ์ร้อยละ 80 เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการรักษา อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่สูงขึ้นของสารสกัด PR ทั้งหมดถือว่าเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์เหล่านั้น ไม่มีการทดสอบความเข้มข้นที่สูงกว่า 1 มก./มล. เนื่องจากไม่สามารถละลายในตัวทำละลายได้อย่างสมบูรณ์

3.5. Anti-melanogenesis ของสารสกัด PR

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 เปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเซลล์) (ไม่แสดงข้อมูล) รูปที่ 4 แสดงการต่อต้านเมลาโนเจเนซิสบนเซลล์ murine melanomas (B16F10) ของสารสกัด PR ที่ความเข้มข้น 0.01 มก./มล. สารสกัด PR ทั้งหมดแสดงแอนติเมลาโนเจเนซิสบนเซลล์ B16F10 พีอาร์สกัดจากใบ กิ่ง เมล็ด และผลสุกและผลอ่อนด้วยวิธีสกัดแบบ Soxhlet (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox และ PR-Y-Sox ) แสดงการต่อต้านเมลาโนเจเนซิสสูงสุดที่ร้อยละ 50.6–54.1 ซึ่งเหนือกว่ากรดโคจิกมาตรฐานอย่างมาก (ร้อยละ 37.9 ± 3.9) ประมาณ 1.5 เท่า ในขณะที่ฤทธิ์ของสารสกัด RB-M และ PR-YM เทียบได้กับ กรดโคจิกมาตรฐาน (p < 0.05)

3.6. กระตุ้นการสังเคราะห์คอลลาเจนของสารสกัด PR

สารสกัด PR ทั้งหมดที่ความเข้มข้น {{0}}.1 มก./มล. แสดงการกระตุ้นการสังเคราะห์คอลลาเจนบนไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ด้วยวิธีซิเรียสเรด ความเข้มข้นของ 0.1 มก./มล. ของสารสกัด PR และกรดแอสคอร์บิกเป็นความเข้มข้นสูงสุดที่ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนัง สารสกัด PR จากใบและกิ่งโดยวิธีสกัดแบบ Soxhlet (สารสกัด PR-LM และ PR-BM) แสดงให้เห็นถึงการสังเคราะห์คอลลาเจนสูงสุด (16.46 ± 0.{{20}}7 เปอร์เซ็นต์ และ 14.66 ± 0.09 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) ซึ่งต่ำกว่ามาตรฐาน ʟ-แอสคอร์บิกแอซิด (34.07 ± 0.03 เปอร์เซ็นต์ ) ประมาณ 2 เท่า (p < 0.05) (รูปที่ 5)

3.7. การกระตุ้นยีนต่อต้านความชรา

รูปที่ 6 แสดงการกระตุ้นของยีนต่อต้านความชรารวมถึงยีน Sirt1 และ Foxo1 บนไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ของสารสกัด PR ที่ 0.01 มก./มล. ถูกกำหนดโดยเทคนิค RT-PCR ความเข้มข้นของ {{20}}.01 มก./มล. ของสารสกัด PR และเรสเวอราทรอลเป็นความเข้มข้นสูงสุดที่ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ ที่น่าสนใจคือสารสกัด PR-L-Sox, PR-S-Sox, PRR-M, PR-R-Sox, PR-YM และ PR-Y-Sox ที่ความเข้มข้น 0.01 มก./มล. แสดงฤทธิ์กระตุ้นการต่อต้านริ้วรอย Foxo1 ได้สูงสุด การแสดงออกของ mRNA (495 bp) ซึ่งเหนือกว่า resveratrol มาตรฐานอย่างมากประมาณ 2 เท่า (p < 0.05) ในทางกลับกัน สารสกัด PR-S-Sox และ PR-Y-Sox แสดงการกระตุ้นการแสดงออกของ Sirt1 anti-aging mRNA สูงสุด (160 bp) ซึ่งต่ำกว่า resveratrol (p < 0.05) แม้ว่าสารสกัด PR เกือบทั้งหมดแสดงให้เห็นถึงการกระตุ้นการแสดงออกของยีนต่อต้านความชรา แต่สารสกัด PR-R-Sox และ PR-BM ไม่ได้กระตุ้นการแสดงออกของ Sirt1 และ Foxo1 ตามลำดับ

4. การอภิปราย

โดยปกติแล้วพืชธรรมชาติหลายชนิดจะได้รับการตรวจคัดกรองไฟโตเคมิคอล สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ และคุณสมบัติทางชีวภาพ เพื่อค้นหาส่วนผสมจากธรรมชาติที่มีแนวโน้มใหม่สำหรับยา อาหารเสริม และเครื่องสำอาง เงาะสีชมพูเป็นผลไม้ท้องถิ่นชนิดหนึ่งในอำเภอขลุง จังหวัดจันทบุรี ประเทศไทย มีรายงานทางวิทยาศาสตร์สองสามฉบับเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีวภาพและเภสัชกรรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งฤทธิ์ในการต่อต้านความชรา ในการศึกษานี้ได้ทำการสกัดเงาะสีชมพูทั้ง 5 ส่วน ได้แก่ ใบ กิ่ง เมล็ด และเปลือกของผลสุกและผลอ่อน โดยวิธี Maceration และ Soxhlet โดยใช้เอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์เป็นตัวทำละลาย ไฟโตเคมิคอลที่ค้นพบใหม่หลายชนิด รวมทั้งเควอซิทิน ซึ่งเป็นสารทุติยภูมิของพืช ได้รับการศึกษาเพื่อต่อต้านความชราในเซลล์ สัตว์ และมนุษย์ (Phuong et al., 2020) จากผลการศึกษาพบว่าฟลาโวนอยด์เป็นสารพฤกษเคมีหลักของสารสกัด PR ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าสารสกัดจากเงาะสายพันธุ์อื่นมีสารพฤกษเคมี ได้แก่ ฟลาโวนอยด์ แทนนิน และแคโรทีนอยด์ ซึ่งมีความสัมพันธ์กับคุณสมบัติในการต้านอนุมูลอิสระ (โรแมน, 2017) การไม่มีแซนโทนจากการสกัดแบบ Soxhlet อาจมาจากอุณหภูมิสูง (Yuvanatemiya et al. 2022, Sankeshwari et al., 2018) เควอซิทินเป็นหนึ่งในสารประกอบฟีนอลและฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่มากในผักและผลไม้หลายชนิด รวมทั้งในเงาะ (Phuong et al., 2020) ในการศึกษานี้ อุณหภูมิที่สูงขึ้น (80 องศาเซลเซียส) ของกระบวนการ Soxhlet สามารถสกัดสารที่ไม่มีความร้อนซึ่งรวมถึงเควอซิทินได้มากกว่ากระบวนการเย็น ปริมาณเควอซิตินที่กำหนดโดยการวิเคราะห์ HPLC สามารถใช้เป็นเครื่องหมายสำหรับการควบคุมคุณภาพของสารสกัด PR ในระดับการผลิต ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน (R2 ) ระหว่าง TFC และ TPC ของสารสกัด PR เท่ากับ 0.825 ซึ่งจำแนกความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งมาก (R2=± 0.80 ถึง ± 1.00) (p < 0.01) ซึ่งหมายความว่า ถ้า TFC เพิ่มขึ้น TPC ก็จะเพิ่มขึ้นอย่างมากเช่นกัน นอกจากนี้ ค่าสัมประสิทธิ์ R2 ระหว่าง TPC และปริมาณเควอซิทินของสารสกัด PR คือ 0.650 ซึ่งจำแนกความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่ง (R2=± 0.60 ถึง ± 0.79) (p < 0.05) ความแตกต่างของผลผลิตการสกัด สารพฤกษเคมี รวมทั้ง TPC, TFC และเควอซิตินของสารสกัด PR อาจได้รับผลกระทบจากตัวทำละลาย กระบวนการสกัด และอุณหภูมิ (Chutoprapat et al., 2020) งานวิจัยหลายชิ้นพบว่าสารประกอบฟลาโวนอยด์และฟีนอล รวมทั้งเควอซิทิน มีฤทธิ์ทางชีวภาพและเภสัชกรรมที่หลากหลาย รวมถึงการต่อต้านจุลินทรีย์ สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และฤทธิ์ต้านความชรา (Panche et al., 2016, Shahidi และ Yeo, 2018, Musika et al., 2021, Wang et al., 2022)

ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ อนุมูลออกซิเจนชนิดหรือ ROS สามารถก่อให้เกิดความเสียหายที่เกี่ยวข้องกับอายุในระดับเซลล์และเนื้อเยื่อ เร่งอายุตามลำดับเหตุการณ์และสิ่งแวดล้อมที่ก่อให้เกิดริ้วรอยและการสร้างเม็ดสีผิดปกติ (Papaccio et al., 2022) สารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติสามารถกำจัดอนุมูลอิสระ ซึ่งส่งผลให้ฤทธิ์ต้านการอักเสบลดลง ป้องกันมะเร็ง เบาหวาน และความผิดปกติของสมอง ลดความดันโลหิตและหลอดเลือด และชะลอความชราของผิวหนัง (Miracle Uwa, 2{{20} }17) การตรวจสอบอนุมูลอิสระ การยับยั้งการเกิด lipid peroxidation และการคีเลชั่นโลหะได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางว่าเป็นระบบเพื่อตรวจสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ สำหรับการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH อิเล็กตรอนคี่ในโมเลกุล DPPH จะลดลงโดยการรับอะตอมไฮโดรเจนจากสารต้านอนุมูลอิสระให้กลายเป็นโมเลกุลไฮดราซีน (Ionita, 2021) วิธีการ lipid peroxidation ขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาออกซิเดชันของไอออนทองแดง (II) ถึงทองแดง (III) ที่ถูกส่งผ่านโดยอิมัลชันของกรดไลโนเลอิก (Bakir et al., 2017) ในขณะที่วิธีการคีเลชั่นโลหะนั้นขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาออกซิเดชันของทองแดง (II) เพื่อสร้างสารเชิงซ้อนเฟอริก-เฟอโรซีน (Wong et al., 2014) การมีอยู่ของปริมาณฟลาโวนอยด์และฟีนอลในสารสกัด PR จากการศึกษานี้อาจมีส่วนช่วยในการต้านออกซิเดชันทั้งสามกิจกรรม พบว่าสารประกอบฟีนอล (เช่น corilagin, ellagic acid, geraniin และ quercetin) จากสารสกัดเงาะแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และการยับยั้ง lipid peroxidation (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al., 2019, Monrroy et al., 2020, Araujo et al., 2021) ซึ่งคล้ายกับรายงานก่อนหน้านี้ที่ว่าสารสกัดจากเปลือกเงาะสายพันธุ์อื่นมี TPC และ TFC สูง รวมทั้งแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แรงกว่า เช่น ABTS, DPPH, O2-scavenging, ferric reduction assay power (FRAP ), สารคีเลต และลิปิดเปอร์ออกซิเดชัน (Lourith et al., 2017, Rohman, 2017, Monrroy et al., 2020) ที่น่าสนใจคือ ค่าสัมประสิทธิ์ R2 ระหว่างการคีเลชั่นโลหะและการยับยั้ง lipid peroxidation ของสารสกัด PR แสดงความสัมพันธ์เชิงบวกที่แข็งแกร่งมากที่ 0.953 ซึ่งจำแนกความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งที่ระดับ p < 0.01 อย่างมีนัยสำคัญ

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】