คอนจูเกตแอนติบอดีที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันกระตุ้นการกระตุ้นมัยอีลอยด์ที่แข็งแกร่งและภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่ทนทาน (ตอนที่ 1)

หากต้องการเรียนรู้ข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อdavid.wan@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

ตัวรับการรู้จำรูปแบบโดยกำเนิด ซึ่งรวมถึงตัวรับที่เหมือนโทร (TLR) สามารถเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกและภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกที่ปรับตัวได้เฉพาะอย่างไรก็ตาม TLR agonists ยังไม่ได้รับการยอมรับอย่างดีเนื่องจากความเป็นพิษที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันอย่างกว้างขวางหลังจากการบริหารอย่างเป็นระบบเพื่อออกแบบการบำบัดที่เหมาะสมกับการนำส่งอย่างเป็นระบบและความสามารถในการกระตุ้นการตอบสนองที่มุ่งเป้าไปที่เนื้องอก เราได้พัฒนาคลาสใหม่ของคอนจูเกตแอนติบอดีที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน (ISAC) ที่ประกอบรวมด้วย TLR7/8 อะโกนิสต์ที่คอนจูเกตกับแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายเนื้องอกยาต้าน-HER2 ISAC ที่บริหารให้อย่างเป็นระบบสามารถทนต่อในร่างกายได้ดี และกระตุ้นการกระตุ้นที่แข็งแกร่งของเซลล์มัยอีลอยด์ในเนื้องอก ส่งผลให้เกิดการขจัดเนื้องอกและหน่วยความจำทางภูมิคุ้มกันที่ตามมาศักยภาพ ในหลอดทดลอง และประสิทธิภาพ ในร่างกาย ต้องการกิจกรรมควบคู่ที่ขับเคลื่อนโดยฟังก์ชัน Fc ที่ไม่เสียหายและความเป็นเอกเทศของ TLR เพื่อให้เกิดการสร้างเซลล์ฟาโกไซโตซิสและภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่อาศัยทีเซลล์หน่วยความจำทางภูมิคุ้มกันที่อาศัย ISAC ไม่จำกัดเฉพาะ HER2 เนื่องจากหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย ISAC ได้รับการปกป้องจากการท้าทายซ้ำด้วยเนื้องอกเชิงลบของ HER2-ผลลัพธ์เหล่านี้ให้เหตุผลที่ชัดเจนสำหรับการพัฒนาทางคลินิกของ ISAC และแสดงให้เห็นว่าการทำงานร่วมกันระหว่างการส่งสัญญาณ Fc R และ TLR7/8 ก่อให้เกิดกลไกของภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่อาศัย ISAC

คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Cistanche

บทนำ

ก่อนสิ้นสุดศตวรรษที่ 20 ผู้ป่วยโรคมะเร็งโดยทั่วไปมีวิธีการรักษาสามแบบ ได้แก่ การผ่าตัด การฉายรังสี และเคมีบำบัด การเกิดขึ้นของภูมิคุ้มกันบำบัดมะเร็งได้เพิ่มรูปแบบที่สี่ที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งขยายขอบเขตของรายการด้านเนื้องอกวิทยาอย่างมาก โดยเริ่มจากการอนุมัติของ rituximab สำหรับมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดนอน-ฮอดจ์กิน และขยายไปสู่การใช้สารยับยั้งจุดตรวจ 1,2 อย่างกว้างขวาง อย่างไรก็ตาม การบำบัดแบบใดแบบหนึ่ง ซึ่งรวมถึงการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน ถูกจำกัดชั่วคราว เว้นแต่จะทำให้เกิดการตอบสนองทางชีววิทยาและภูมิคุ้มกันที่คงทน ซึ่งจะเอาชนะความแตกต่างของเนื้องอกและภาระการกลายพันธุ์ 3-5 สารยับยั้งจุดตรวจ เช่น แอนติ-PD-1 และแอนติบอดี PD-L1 ปรับปรุงผลลัพธ์อย่างมากในหลายข้อบ่งชี้ รวมถึงในผู้ป่วยที่มีภาระการกลายพันธุ์ของเนื้องอกสูงหรือความไม่เสถียรของไมโครแซทเทลไลท์ และปัจจัยหนึ่งที่กำหนดความอ่อนไหวของเนื้องอกต่อการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันของจุดตรวจคือขอบเขตของก่อน - การแทรกซึมของทีเซลล์ที่มีอยู่ ผู้ป่วยที่มีเนื้องอก "เย็น" ที่มีการแทรกซึมของ T เซลล์เบาบางจะตอบสนองต่อการปิดล้อมด่านน้อยกว่าและมีการพยากรณ์โรคที่แย่กว่าเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยที่มีเนื้องอกที่ "ร้อน" ที่มี T เซลล์ที่ตอบสนองต่อเนื้องอกที่กดภูมิคุ้มกันอยู่ภายในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) 6,7 . การตรวจชิ้นเนื้อเนื้องอกและอิมมูโนฮิสโตเคมีบ่งชี้ว่าเซลล์ที่สร้างแอนติเจน (APC) ระดับมืออาชีพ เช่น เซลล์เดนไดรต์ (DCs) มักจะพบบ่อยภายใน TME มากกว่าทีเซลล์ แม้ว่าจะยังไวต่อกลไกกดภูมิคุ้มกัน 8,9 เนื่องจากการปรากฏตัวของเซลล์มัยอีลอยด์ใน TME และบทบาทของพวกเขาในการส่งเสริมการกระตุ้นทีเซลล์ มีความพยายามเพิ่มขึ้นในการพัฒนาวิธีการรักษาที่กระตุ้น APC ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันทีเซลล์อย่างกว้างขวางและการตอบสนองภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกที่มีประสิทธิผล

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >ผู้บริจาค 9 ราย (d) Rituximab ทำปฏิกิริยากับ SATA ผ่านทางไลซีนเรซิดิวเพื่อแปลงเอมีนอิสระให้เป็นกลุ่มซัลฟไฮดริลที่ได้รับการป้องกันก่อนดีอะซิทิเลชันด้วยไฮดรอกซีลามีนและปฏิกิริยาที่ตามมากับ T785-MCC เพื่อให้ผลเป็นริตูซิแมบ-ISAC (e) การวิเคราะห์ LC-MS ของริตูซิแมบ-ISAC หลังการบำบัดด้วย PNGase F DAR ถูกคำนวณตามการเติมมวลเชื่อมโยง-อะโกนิสต์ที่ 606 ก./โมล (f) ริตูซิแมบหรือริตูซิแมบ-ISAC ที่ติดฉลากเรืองแสงถูกบ่มด้วยเซลล์เนื้องอก CD20 บวกกับโทเลโดที่ 4 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนการวิเคราะห์ผ่านโฟลว์ไซโตเมทรี ข้อมูลมาจากการทดลอง 1 รายการที่มีตัวอย่างสามเท่าและเป็นตัวแทนของการทดลอง 2 รายการ(gh) APC ที่เป็นมัยอีลอยด์ของมนุษย์ที่แยกออกมาใหม่ถูกเพาะเลี้ยงด้วย rituximab, T785, rituximab และ T785 หรือ rituximab-ISAC ในการมีอยู่ของ CD20 ที่ติดฉลาก CFSE บวกกับเซลล์เนื้องอก Toledo ที่อัตราส่วนเอฟเฟกต์ต่อเป้าหมาย 3: 1 ความเข้มข้นของริตูซิแมบถูกแสดงบนแกน X ด้วยความเข้มข้นของ T785 ในการสอบวิเคราะห์เหล่านี้ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณของ T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >ผู้บริจาค 10 ราย (ค่าเฉลี่ยและ SEM); *ป<0.05,><0.01,><0.001,><>

ขณะนี้มีการบันทึกเป็นอย่างดีว่าการนำส่งสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันในท้องถิ่นในแบบจำลองพรีคลินิกสามารถตั้งโปรแกรม APC ที่มีเนื้องอกที่อาศัยอยู่ใหม่อีกครั้งในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นซึ่งสามารถประมวลผลและนำเสนอแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก ซึ่งรวมถึงนีโอแอนติเจน ไปยังเซลล์ T ที่ต่อมาเป็นสื่อกลางในการต่อต้านภูมิคุ้มกันของเนื้องอก 10–13 . กลยุทธ์หนึ่งที่บุกเบิกโดย Carmi และคณะ แสดงให้เห็นว่าการนำส่งแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายเนื้องอก allogeneic ภายในเนื้องอกด้วยตัวรับ Toll-like (TLR)-3 เอกหรือด้วย APC ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกที่ได้รับการช่วยเหลือจาก TNF และ CD40L ซึ่งนำไปสู่การดูดซึมแอนติเจนที่เพิ่มขึ้นและ การชักนำให้เกิดภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกทีเซลล์ในภายหลัง กลยุทธ์แบบผสมผสานนี้ ซึ่งใช้ประโยชน์จากฟังก์ชันของแอนติบอดีเอฟเฟกเตอร์กับ TLR agonist นำไปสู่การกำจัดเนื้องอกปฐมภูมิและรอยโรคในระยะแพร่กระจาย และปกป้องโฮสต์จากการกลับเป็นซ้ำของเนื้องอก 11,14 ในทำนองเดียวกัน แอนติ-OX40 แอนติบอดีแบบอะโกนิสติกร่วมกับ TLR9 อะโกนิสต์, CpG, APC ที่ถูกกระตุ้นและทีเซลล์ภายในเนื้องอก ส่งผลให้เกิดประสิทธิภาพที่น่าประทับใจในการต้านเนื้องอกหลายชนิดในหนูเมาส์ 13 การแปลผลที่มีประสิทธิภาพของกลยุทธ์การกระตุ้น APC ในคลินิกคือ ตรวจสอบในข้อบ่งชี้หลายข้อที่มีข้อมูลทางคลินิกในผู้ป่วยที่มีเนื้องอก ซึ่งแนะนำว่าการนำส่ง TLR9 agonists ภายในเนื้องอกร่วมกับแอนติบอดีต้าน PD-1 สามารถนำไปสู่การหดตัวของเนื้องอกและการตอบสนองของ abscopal ในแผลที่ไม่ได้ฉีด 15 ในทำนองเดียวกัน กลุ่มต่างๆ กำลังติดตามตัวเร่งปฏิกิริยา TLR7 / 8 สำหรับภูมิคุ้มกันบำบัดเนื้องอก เนื่องจากรูปแบบการแสดงออกของ TLR7/8 ใน APC ของมนุษย์สะท้อนรูปแบบการแสดงออกของ TLR7 และ TLR9 ใน APCs16–18 ของหนูได้อย่างใกล้ชิดยิ่งขึ้น ในท้ายที่สุด การใช้กลยุทธ์การนำส่งภายในเนื้องอก หากมีประสิทธิภาพ จะถูกจำกัดโดยการเข้าถึงได้ของเนื้องอก เนื่องจากการนำส่งอย่างเป็นระบบของตัวเอกภูมิคุ้มกันที่กำหนดเป้าหมาย APC ถูกจำกัดโดยความเป็นพิษ ครึ่งชีวิตสั้น และการนำส่งที่ต่ำกว่าที่เหมาะสมไปยังไซต์เป้าหมายเป้าหมายของเราคือการออกแบบคอนจูเกตแอนติบอดีที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน (ISAC) ซึ่งประกอบด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มุ่งเป้าไปที่เนื้องอกที่คอนจูเกตกับตัวเอกทางภูมิคุ้มกันเป็นวิธีการรักษาแบบใหม่เพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่ทนทาน การบริหารระบบของ ISAC ทำให้เกิดการเปิดใช้งาน APC ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นใน TME ที่ขึ้นอยู่กับ Fcฟังก์ชันเอฟเฟกต์และการเปิดใช้งาน TLR ในขณะที่หลีกเลี่ยงความเป็นพิษทั่วไปที่เกี่ยวข้องกับการนำส่ง TLR agonists อย่างเป็นระบบ ยิ่งกว่านั้น การบริหารให้อย่างเป็นระบบของคอนจูเกตเหล่านี้กับหนูเมาส์ที่มีเนื้องอกเปิดใช้งานการประมวลผลแอนติเจนและการนำเสนอต่อทีเซลล์ที่นำไปสู่ภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่ยั่งยืนในหลายแบบจำลองที่ต้านทานต่อแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายเนื้องอกที่ไม่ถูกคอนจูเกต

ผลลัพธ์

การออกแบบและการแสดงคุณลักษณะของ ISAC เพื่อให้เกิดการคอนจูเกตของ TLR อะโกนิสต์กับแอนติบอดี เครื่องมือเชื่อมต่อระดับโมเลกุลถูกใช้เพื่อออกแบบ TLR7/8 อะโกนิสต์ (T785) แบบใหม่ที่มีบิวทิล-เอมีนซึ่งทำหน้าที่เป็นจุดยึดติดกับแอนติบอดีที่ตัวทำละลายเข้าถึงได้ ( รูปที่ 1A, รูปที่ 1A–C เพิ่มเติม) T785 มีส่วนร่วมกับ TLR7 ของมนุษย์ด้วย EC50 ที่ 0.643 μM และ TLR8 ของมนุษย์ที่มี EC50 ที่ 1.60 μM ในสายพันธุ์ของเซลล์ HEK293 ที่แสดงร่วมกันกับนักข่าวอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสที่หลั่งออกมาซึ่งเหนี่ยวนำโดย NF-κB และ TLR7 หรือ TLR8 อย่างใดอย่างหนึ่ง (รูปที่ 1B) ). ความจำเพาะของ T785 สำหรับ TLR7/8 ได้รับการยืนยันโดยการไร้ความสามารถของ T785 เพื่อกระตุ้นกิจกรรม NF-κB ในเซลล์ตัวรายงาน HEK293 ที่ไม่มีการแสดงออกของ TLR7/8 (รูปที่ 2A เสริม) เพื่อยืนยันการออกฤทธิ์ของอะโกนิสติกในเซลล์ปฐมภูมิ โมโนไซต์และ DC ที่แยกออกมาใหม่ เรียกว่า APC ที่เป็นมัยอีลอยด์ (โมโนไซต์ ~96 เปอร์เซ็นต์, DC 4 เปอร์เซ็นต์; รูปที่ 3A เพิ่มเติม) ซึ่งแสดงออกทั้ง TLR7 และ TLR8 ถูกกระตุ้นในชั่วข้ามคืนด้วย 1 ไมโครโมลาร์ T785 หรือ R848, ตัวเร่งปฏิกิริยา TLR7/8 ที่จัดตั้งขึ้นอย่างดีและมีลักษณะเฉพาะ 19. T785 และ R848 กระตุ้น APC แบบมัยอีลอยด์ในระดับที่ใกล้เคียงกัน (รูปที่ 1C) 20,21 การมีฤทธิ์ของ T785 ยังได้รับการยืนยันในดีซีพลาสมาซีทอยด์ของมนุษย์ที่เพิ่งถูกแยกเดี่ยว (pDCs) ซึ่งแสดงออกถึง TLR7 แต่ไม่ใช่ TLR8 (รูปที่ 2B เสริม) เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ ISAC ในการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองของมนุษย์ ISAC ถูกสร้างขึ้นด้วย rituximab (รูปที่ 1D) ซึ่งเป็นโมโนโคลนัลแอนติบอดีต้าน CD20 ที่ได้รับการตรวจสอบทางคลินิกแล้ว ซึ่งใช้ในการรักษามะเร็งชนิดบีเซลล์ โดยการคอนจูเกตกับ T785 ในปฏิกิริยาหลายขั้นตอน ด้วยตัวเชื่อมขวางแบบเฮเทอโรไบฟังก์ชันที่เข้ากันได้ 22 T785-ประสิทธิภาพคอนจูเกตของ ISAC ถูกวัดโดย LC-MS หลังจากการดีไกลโคซิเลชันด้วย PNGase F ทำให้เกิดอัตราส่วนระหว่างยาต่อแอนติบอดี (DAR) เฉลี่ยที่ 1.71 (รูปที่ 1E) เรายืนยันว่า ISAC ยังคงการจับที่เปรียบเทียบได้กับ CD20 หลังจากการทดลองโฟลว์ไซโตเมทรีกับ CD20- ที่แสดงเส้นเซลล์เนื้องอกของโทเลโด ซึ่งเป็นสายเซลล์ที่มีลักษณะเฉพาะที่ดีที่ได้มาจากผู้ป่วยที่มีมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดแพร่กระจาย (รูปที่ 1F) 23 T 785-การผูกมัด ISAC กับตัวรับ Fc ของมนุษย์ (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) ได้รับการประเมินโดย Biacore และเทียบได้กับ rituximab (ตารางเสริม 1) ISAC กระตุ้น APCs ที่เป็นมัยอีลอยด์ของมนุษย์ ศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ rituximab T{{77 }}ISAC ได้รับการประเมินหลังจากการเพาะเลี้ยงร่วมกันของ APC แบบมัยอีลอยด์ของมนุษย์ที่แยกได้ใหม่ด้วย CD20 ที่ติดฉลาก CFSE บวกกับเซลล์เนื้องอก Toledo เป็นเวลา 18 ชั่วโมง Myeloid APCs ที่เพาะเลี้ยงด้วย rituximab T785-ISAC ได้รับการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาอย่างรวดเร็วซึ่งสอดคล้องกับสัณฐานวิทยาของ DCs ในขณะที่ DC morphology ไม่ใช่ สังเกตพบในโคคัลเจอร์ที่ถูกบ่มด้วยริตูซิแมบ, T785 หรือของผสมที่เท่ากันของริตูซิแมบและ T785 (รูปที่ 1G) APC ที่ถูกกระตุ้นด้วยริตูซิแมบ T785-ISAC ยังคงทำงานได้และเดนไดรต์ในสัณฐานวิทยานานถึงแปดวันในขณะที่ APC ที่ถูกกระตุ้นด้วยของผสมส่วนใหญ่ไม่สามารถทำงานได้ในวันที่แปด (รูปที่ 1H) การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีแบบหลายสีหลังจาก 18 ชั่วโมง บ่งชี้ว่า APC ถูกกระตุ้นด้วย rituximab T785-ISAC ลดระดับ CD14 และ CD16 และ CD123 ที่ถูกควบคุมร่วมกัน เครื่องหมายที่ผิวเซลล์แสดงได้รับการควบคุมบน myeloid DCs 24 ในทางกลับกัน APC ที่ถูกกระตุ้นด้วย rituximabT785 หรือของผสมไม่ได้มอดูเลตการแสดงออกของเครื่องหมายเหล่านี้ (รูปที่ 1I, รูปที่ 4A เพิ่มเติม, กลวิธีเกตติ้งที่บรรยายไว้ในรูปที่ 3BC)

APC ของมนุษย์ที่ถูกกระตุ้นด้วย rituximab T785-ISAC ยังเพิ่ม CD โมเลกุล costimulatory ที่ควบคุมด้วย86ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา โดยมีแนวโน้มที่คล้ายคลึงกันที่สังเกตได้จากการปรับเพิ่ม CD40 และ HLA-DR ที่สอดคล้องกับฟีโนไทป์ของ APC ที่ถูกกระตุ้น (รูปที่ 1I & เพิ่มเติมรูปที่ 4B). การเปลี่ยนแปลงที่ขึ้นกับปริมาณการใช้ในการแสดงออกของมาร์กเกอร์บนพื้นผิวมีความสอดคล้องไม่ว่าประเมินเป็นค่ามัธยฐานของความเข้มการเรืองแสง (MFI, รูปที่ 1) หรือเป็นเปอร์เซ็นต์ของประชากรทั้งหมดของเซลล์ที่เป็นบวกสำหรับมาร์กเกอร์ตามลำดับ (รูปที่ 5 เสริม) การวิเคราะห์ที่ตามมาของส่วนลอยเหนือตะกอนที่ปราศจากเซลล์แสดงให้เห็นว่า APC ที่กระตุ้นด้วย rituximab T785-ISAC หลั่ง TNF และ IL ในปริมาณที่สูงขึ้น-1 (รูปที่ 2J และรูปที่ 4C เพิ่มเติม) ศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ T785-ISACs ไม่ได้จำกัดอยู่ที่ rituximab เนื่องจาก T785-ISAC ที่สร้างขึ้นด้วย trastuzumab ยังกระตุ้นการกระตุ้นมัยอีลอยด์ที่ได้รับการปรับปรุง (รูปที่ 4D เพิ่มเติม) ความสามารถของ APC ที่กระตุ้นด้วย ISAC เพื่อกระตุ้นการนำเสนอแอนติเจนและการผสมข้ามของของ CD8 บวกทีเซลล์ถูกประเมินโดยใช้ระบบแอนติเจนแบบจำลองโอวัลบูมิน (OVA) 25,26 CD11c ม้ามบวก DC ที่แยกได้จากหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่าถูกเพาะเลี้ยงในชั่วข้ามคืนด้วยสารเชิงซ้อนของภูมิคุ้มกันที่ก่อรูปขึ้นด้วย OVA และแอนติบอดีต้าน OVA หรือ ISAC อย่างใดอย่างหนึ่ง DC ที่บรรจุ OVA ถูกหาปริมาณและบ่มด้วย OT-I CD8 บวกกับทีเซลล์ซึ่งมีความจำเพาะของ TCR สำหรับเปปไทด์ OVA, SIINFEKL, ทำให้เกิดภาวะเชิงซ้อนด้วย MHC-I การนำเสนอข้ามที่ปรับปรุงโดยอาศัย Anti-OVA ของ ISAC ตามที่วัดโดยปริมาณของ MHC-I, เปปไทด์ SIINFEKL ที่ถูกจับ และ cross-priming ที่ปรับปรุงให้ดีขึ้นตามที่วัดโดย CD8 บวกกับการเพิ่มจำนวนทีเซลล์ (รูปที่ 6A และ 6B) ISAC กระตุ้น TLR ที่ถูกขยาย และการส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ Fc R ใน APC ของมนุษย์ที่เป็นมัยอีลอยด์ การเปิดใช้งาน Fc Rs และ TLRs ทำให้เกิดการเรียงซ้อนสัญญาณฟอสโฟที่ซับซ้อน และขนาดและลักษณะของการตอบสนองเหล่านี้แตกต่างกันในกลุ่มย่อยของเซลล์ภูมิคุ้มกันต่างๆ 27 เราตรวจสอบเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่ปลายน้ำที่ทำงานในส่วนต่างๆ ชนิดเซลล์ภายในเซลล์เพาะเลี้ยงเนื้องอก PBMC ที่กระตุ้นด้วยริตูซิแมบ T785-ISAC เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมของผสมที่เท่าเทียมกันโดยใช้แมสไซโตเมทรี (CyTOF) 28. กลุ่มย่อยของเม็ดเลือดขาว (เช่น โมโนไซต์, CD4 บวกทีเซลล์) ถูกระบุผ่านการจัดกลุ่มของ SPADE โดยใช้เครื่องหมายของเชื้อสาย ด้วยเซลล์เป้าหมายซึ่งครอบคลุมทั้งเซลล์เนื้องอก CD20 บวกกับโทลีโดและบีเซลล์ที่มีสุขภาพดี 29 เหตุการณ์ฟอสฟอรีเลชันที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณ TLR (pIRF7) และ Fc R (pERK1/2) เพิ่มขึ้น 15 นาทีหลังการกระตุ้นด้วย T785-ISAC ในโมโนไซต์และ cDCs เมื่อเปรียบเทียบกับของผสมของส่วนประกอบแต่ละส่วน 30,31 การส่งสัญญาณภายในเซลล์ส่วนใหญ่จำกัดเฉพาะเซลล์ที่มีต้นกำเนิดจากมัยอีลอยด์ (โมโนไซต์และ cDC) เช่นเดียวกับ pDC ซึ่งทั้งหมดแสดง Fc Rs และ TLR7 และ/หรือ TLR8 ที่จำเป็น ในโมโนไซต์และ cDC การกระตุ้นที่เหนี่ยวนำโดย ISAC ยังส่งผลให้มีฟอสโฟรีเลชั่นที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ MAPKAPK2, p38, CREB และโปรตีนไรโบโซม S6 (RPS6) ซึ่งเป็นข้อกำหนดสำหรับการเริ่มต้นการสังเคราะห์โปรตีนปลายทาง (รูปที่ 2A–C และรูปที่ 7A เพิ่มเติม) CD141 บวก cDC และ CD1c บวก cDC แสดงระดับที่เปรียบเทียบได้ของ pIRF7 ทั่วทั้งชุดย่อยของ CDC ทั้งสอง ในขณะที่ระดับของ RPS6 และ pERK1/2 มีแนวโน้มสูงขึ้นใน CD141 บวก cDC ซึ่งยอดเยี่ยมใน CD8 บวก T เซลล์ไพรมิงและการนำเสนอข้ามแอนติเจน เมื่อเปรียบเทียบกับ CD1c บวก cDC (รูปที่ 7B เสริม)

จลนพลศาสตร์ของการกระตุ้น T785-ISAC นั้นสอดคล้องกับไดนามิกของการส่งสัญญาณที่คาดไว้: ฟอสโฟรีเลชัน ERK1/2 สูงสุดหลังจาก 5 นาที ในขณะที่คู่หูที่ปลายน้ำ RPS6 ไม่ถึงระดับฟอสโฟรีเลชันสูงสุดจนกว่าจะถึงเวลา 15-นาที (เสริม) รูปที่ 7C) จลนพลศาสตร์นี้สนับสนุนไดนามิกที่คาดหวังเนื่องจากการส่งสัญญาณแพร่กระจายเมื่อเวลาผ่านไป และแสดงให้เห็นว่ามีการตอบสนองต่อการส่งสัญญาณที่ต่อเนื่องและขยายเพิ่มขึ้นต่อการกระตุ้น ISAC ของ APC จากการตอบสนองที่เพิ่มขึ้นที่สังเกตได้หลังจากการกระตุ้น ISAC ที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ Fc R และ TLR ต่อไป เราใช้การประมาณค่าข้อมูลร่วมกันแบบมีเงื่อนไข-ความหนาแน่นใหม่ (DREMI) และอัลกอริทึมการสร้างภาพจำลองความหนาแน่นตามเงื่อนไข (DREVI) เพื่อหาปริมาณความแรงของความสัมพันธ์แบบคู่ภายใน เส้นทางการส่งสัญญาณ Fc R และ TLR 32. อัลกอริธึมเหล่านี้สร้างแผนภาพ DREVI สำหรับการแสดงภาพ โดยที่พื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) เป็นตัวบ่งชี้ความเข้มของสัญญาณโดยรวม จุดเปลี่ยน (IP) คือการวัดเกณฑ์การเปิดใช้งาน และ คะแนน DREMI หาปริมาณการพึ่งพาอาศัยกันของฟอสโฟโปรตีนสองชนิดที่เป็นปัญหา การวิเคราะห์นี้ระบุคะแนน DREMI ที่เพิ่มขึ้นซึ่งบ่งชี้ถึงการพึ่งพาแบบคู่ที่เพิ่มขึ้นระหว่างโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ Fc R และ TLR หลังการกระตุ้น T785-ISAC เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมของผสมที่เท่ากัน (รูปที่ 2D) การพึ่งพาอาศัยกันอย่างแข็งแกร่งระหว่าง pERK1/2 และ pIRF7 ได้รับการสังเกตอย่างเฉพาะตัวหลังจากการกระตุ้นด้วย T785-ISAC แต่ไม่ใช่ของผสม ตามที่ระบุโดยคะแนน DREMI ที่เพิ่มขึ้น ความเข้มของสัญญาณที่ขยาย และเกณฑ์การกระตุ้นที่ลดลงที่จำเป็นสำหรับ IRF7 ฟอสโฟรีเลชัน (รูปที่ 2D ). การวิเคราะห์นี้ยังบ่งชี้ถึงเกณฑ์การกระตุ้นที่ลดลงซึ่งจำเป็นเพื่อเริ่มต้นการแปลโปรตีน (RPS6 ฟอสโฟรีเลชั่น) หลังการกระตุ้น ISAC ตามที่หาปริมาณโดยคะแนน DREMI ที่เพิ่มขึ้นและ IP ที่ลดลงสำหรับการรวมกันเป็นคู่ของ pERK1/2-pRPS6 และ pIRF7-pRPS6 . นอกจากนี้ ระดับของฟอสโฟรีเลชัน RPS6 ถูกขยายโดยเป็นผลมาจากฟอสโฟรีเลชัน ERK1/2 หรือ IRF7 ตามที่กำหนดโดย AUC แบบคู่ที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 2D) ผลลัพธ์ที่รวมกันเหล่านี้ไม่เพียงแต่ยืนยันการส่งสัญญาณของ ISAC ผ่านทางวิถี Fc R และ TLR ที่คาดหวังเท่านั้น แต่ยังสนับสนุนการทำงานร่วมกันระหว่างสองวิถีซึ่งส่งผลให้เกิดเกณฑ์การกระตุ้นที่ลดลงและความเข้มของสัญญาณที่ขยายขึ้น

รูปที่ 3: ISAC ต้องการฟังก์ชันเอฟเฟกเตอร์ของ Fc และตัวเอก TLR เพื่อไกล่เกลี่ยการกระตุ้นมัยอีลอยด์ APC ที่เป็นมัยอีลอยด์ของมนุษย์ที่แยกออกมาใหม่ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 18 ชั่วโมงต่อหน้า CD20 บวกกับเซลล์เนื้องอกโทเลโดที่อัตราส่วนเอฟเฟกเตอร์ต่อเป้าหมาย 3: 1 และ (a) 80 นาโนโมลาร์ ของริตูซิแมบ-ISAC ที่มีหรือไม่มี 1 ไมโครโมลาร์ R406, (b) ริตูซิแมบ-ISAC บนไอโซไทป์ของแอนติบอดีที่ระบุ (c) ริตูซิแมบ-ISAC หรือริตูซิแมบ-ISAC ที่ถูกดีไกลโคซิเลต (ISAC-deglycosylated) (ac) เซลล์ถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีและข้อมูลถูกรายงานเป็นค่ามัธยฐานของความเข้มการเรืองแสง (d) เซลล์ตัวรายงาน HEK-Blue-TLR7 หรือ TLR8 ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 18 ชั่วโมงต่อหน้า T785 หรือ TLRnull ก่อนการประเมินกิจกรรม SEAP ที่เกิดจาก NF-κB ข้อมูลที่แสดงคือจากการทดลอง 1 ครั้งและตัวแทนของการทดลองอย่างน้อย 3 ครั้ง (e) APC แบบมัยอีลอยด์ของมนุษย์ที่แยกได้ใหม่ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 18 ชั่วโมงต่อหน้าเซลล์เนื้องอก CD20 บวกกับ Toledo และ rituximab-ISAC ที่ระบุ และวิเคราะห์โดยโฟลว์ ไซโตเมทรี (ข้อมูลที่แสดงเป็นค่ามัธยฐานความเข้มของการเรืองแสง) (ae) ข้อมูลที่แสดงเป็นตัวแทนของการทดลองเพิ่มเติม 1-4 ครั้งและผู้บริจาคมากกว่าหรือเท่ากับ 3 รายสำหรับการทดสอบแต่ละครั้ง (ค่าเฉลี่ยและ SEM) นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดเป็น *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC ต้องการฟังก์ชันเอฟเฟกเตอร์ Fc เพื่อไกล่เกลี่ยการเปิดใช้งานของ APC แบบไมอีลอยด์ การมีส่วนร่วมของกิจกรรม Fc ต่อฟังก์ชัน ISAC ได้รับการตรวจสอบหลังจากการระเหยของการส่งสัญญาณ Fc R ที่ปลายน้ำด้วย R406 ซึ่งเป็นตัวยับยั้งไคเนสโมเลกุลขนาดเล็กของ Syk ที่ป้องกันการถ่ายทอดสัญญาณที่ปลายทางของการเปิดใช้งาน Fc Rs 33,34 . การเติม R406 ที่ยกเลิกการกระตุ้นด้วย T785-การกระตุ้นด้วยมัยอีลอยด์ที่มี T785-โดย ISAC ตามหลักฐานที่แสดงให้เห็นโดยการขาดการควบคุมที่เพิ่มขึ้นของ CD โมเลกุล costimulatory86 แต่ไม่ได้เปลี่ยนแปลงการตอบสนองของเซลล์ต่อการกระตุ้น TLR7/8 โดย T785 (รูปที่ 3A & เพิ่มเติมรูปที่ 8) การยับยั้ง Syk ด้วย R406 ยังยกเลิกการส่งสัญญาณถูกสังเกตพบในโมโนไซต์หลังจากการกระตุ้น T785-ISAC ด้วยลดระดับ MAPKAPK ที่มีฟอสโฟรีเลต -2, ERK1/2 และ IRF7 ที่วัดได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 7D เสริม)เมื่อพิจารณาจากข้อมูลเหล่านี้ ริตูซิแมบ T785-ISAC ถูกสร้างสูตรด้วย DAR ที่เปรียบเทียบกันได้บนแต่ละไอโซไทป์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติสี่ชนิดเพื่อกำหนดขอบเขตที่การออกฤทธิ์ของ T785-ISAC แปรผันกับสัมพรรคภาพการจับ Fc R 35,36 ที่ทราบ นอกจากนี้ยังทำการตรวจสอบ ISAC ริตูซิแมบ Aglycosylated และ fucosylated ด้วย เนื่องจากไกลโคซิเลชันเลิกจับ Fc R ขณะที่ฟูโคซิเลชันเพิ่มสัมพรรคภาพการจับสำหรับ FCGR3A 37 ความสามารถในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ rituximab T785-ISAC มีความสัมพันธ์กับสัมพรรคภาพ Fc R ของไอโซไทป์ของแอนติบอดี (รูปที่ 3B). ในทางกลับกัน IgG1 ที่ถูกฟิวโคซิเลต (IgG1-AF), wildtype IgG1 และ IgG3 T785-ISACs กระตุ้นการกระตุ้นมัยอีลอยด์ด้วย IgG1-AF T785-ISAC ที่เหนี่ยวนำค่าสูงสุด ระดับของการควบคุม CD86 (รูปที่ 3B) ดีไกลโคซิเลชันของริตูซิแมบชนิดพันธุ์ป่า T785-ISAC ที่มี PNGase F ซึ่งลดสัมพรรคภาพการจับ Fc-Fc R ส่งผลให้เกิดการออกฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันของ ISAC ในหลอดทดลองที่ลดลง ซึ่งสนับสนุนความสำคัญของบริเวณ Fc ที่ออกฤทธิ์เชิงหน้าที่ (รูปที่ 3C)

ISAC ต้องการ TLR agonism เพื่อไกล่เกลี่ยการกระตุ้น myeloid การมีส่วนร่วมของกิจกรรม TLR บนฟังก์ชัน ISAC ถูกตรวจสอบหลังจากการระเหยของ TLR agonism โดยการกำจัด 2-อะมิโน ไพริดีนออกจาก T785 ที่เชื่อว่าก่อตัวเป็นสะพานเกลือที่มีแอสพาเทตตกค้างที่สำคัญในการจับ กระเป๋าของ TLR7 และ TLR8 38 (TLRnull, รูปที่ 3D) สารประกอบ TLRnull ถูกคอนจูเกตกับริตูซิแมบ (TLRnull ISAC) และประเมินสำหรับศักยภาพในการกระตุ้นมัยอีลอยด์ในการมีอยู่ของ CD20 บวกกับเซลล์เนื้องอกในหลอดทดลอง TLRnull ISAC ไม่ได้กระตุ้นการปรับเพิ่มของ CD โมเลกุลคอสซิมูเลเตอร์86 หรือมอดูเลตการแสดงออกของ CD14 หรือ CD123 ซึ่งบ่งชี้ว่า TLR agonism จำเป็นสำหรับฟีโนไทป์การกระตุ้นที่สังเกตพบด้วย T785-ISAC (รูปที่ 3E) นอกจากนี้ TLRnull ISAC ไม่ได้กระตุ้นฟอสโฟรีเลชั่นของ IRF-7 ในโมโนไซต์ ซึ่งสอดคล้องกับการไม่สามารถมีส่วนร่วมกับ TLR7/8 (รูปที่ 7E เพิ่มเติม) ที่บริหารให้ trastuzumab T785-ISAC อย่างเป็นระบบช่วยกำจัดเนื้องอกในกรณีที่ไม่มี การมีฤทธิ์ของเซลล์ B, T หรือ NK ในแบบจำลองเนื้องอกในการปลูกถ่ายวิวิธวิสัยของมนุษย์ ความสามารถของ ISAC ในการเหนี่ยวนำการทำลายเนื้องอกที่เป็นสื่อกลางด้วยมัยอีลอยด์และนิวโทรฟิลในกรณีที่ไม่มีกิจกรรมของเซลล์ B, T และ NK ถูกประเมินโดยใช้แบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์มนุษย์ 39,40 Trastuzumab ซึ่งเป็นแอนติบอดีสำหรับกำหนดเป้าหมาย HER2- ที่ได้รับการตรวจสอบทางคลินิกแล้ว ได้รับการคัดเลือกสำหรับการตรวจสอบเพื่อตรวจสอบว่า trastuzumab T785-ISAC สามารถเอาชนะการดื้อต่อเนื้องอกต่อ trastuzumab ใน HER2 ร่วมกับแบบจำลองเนื้องอกที่เป็นของแข็งได้หรือไม่ (รูปที่ 4 และรูปที่ 9 เพิ่มเติม ) 41,42. อย่างแรก การบริหารให้อย่างเป็นระบบของ trastuzumab T785-ISAC ถูกเปรียบเทียบกับการนำส่งภายในเนื้องอกของส่วนผสมของ trastuzumab และ T785 trastuzumab T785-ISAC กระตุ้นการถดถอยของเนื้องอกและการกวาดล้างในขณะที่การนำส่งส่วนผสมที่เท่ากันของส่วนประกอบให้ประโยชน์ในการรักษาน้อยที่สุดเมื่อเทียบกับ trastuzumab เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4A) การศึกษาที่ตามมาซึ่งเปรียบเทียบ ISAC ที่มุ่งเป้าไปที่เนื้องอกกับกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ที่เหมาะสมของพวกมันยืนยันว่าการมีฤทธิ์ต้านเนื้องอกจำเป็นต้องมีการกำหนดเป้าหมายที่เนื้องอก (รูปที่ 4B และรูปที่ 10 เพิ่มเติม) ที่สำคัญ การบริหารให้อย่างเป็นระบบของ trastuzumab T785- ISAC และกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ของมันนั้นสามารถทนต่อยาได้ดี โดยมีผลกระทบต่อน้ำหนักตัวน้อยที่สุด (รูปที่ 11 เพิ่มเติม)เพื่อตรวจสอบว่ากลไกการออกฤทธิ์ที่เอื้อต่อประสิทธิภาพของ ISAC ในร่างกาย นั้นคล้ายกับที่อธิบายไว้ในหลอดทดลองหรือไม่ Fc-institution (trastuzumab N297A-ISAC) และ trastuzumab TLRnull-ISACs ได้รับการทดสอบในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธเนื้องอกในเต้านมเดียวกันในขนานกับไวลด์ไทป์ trastuzumab T785-ISACในขณะที่ทราสตูซูแมบ T785-ISAC นำไปสู่การถดถอยและการขจัดของเนื้องอก ทั้ง ISAC ที่ไร้ความสามารถและ TLRnull ของ TLR ล้มเหลวในการกระตุ้นการออกฤทธิ์ต้านเนื้องอก (รูปที่ 4C)ข้อมูลเหล่านี้ร่วมกันบ่งชี้ถึงความต้องการสำหรับการกำหนดเป้าหมายเนื้องอกและทั้งการมีส่วนร่วมของ Fc R และ TLR สำหรับการออกฤทธิ์ต้านเนื้องอกของ ISAC

การมีส่วนร่วมที่แตกต่างกันของนิวโทรฟิลเทียบกับเซลล์มัยอีลอยด์อื่นๆ ในการเป็นสื่อกลางในการออกฤทธิ์ต้านเนื้องอกถูกประเมินโดยการลดจำนวนที่จำเพาะต่อเซลล์นิวโทรฟิลถูกทำให้หมดไปโดยใช้แอนติบอดี Ly6G ในขณะที่การพร่องของทั้งนิวโทรฟิลและ APC ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ (โมโนไซต์)บรรลุผลได้ด้วยแอนติบอดีต้าน Gr1เซลล์ฟาโกไซติกหมดไปโดยใช้ไลโปโซมที่บรรจุโคลโดรเนตเราพบว่าเซลล์ฟาโกไซติก สันนิษฐานว่าน่าจะเป็นมาโครฟาจ มีส่วนสำคัญในการไกล่เกลี่ยการต่อต้านเนื้องอกหลังการรักษาด้วย ISAC (รูปที่ 4D)อย่างไรก็ตาม การลดลงของนิวโทรฟิลด้วยสารต้าน Ly6G ไม่มีผลกระทบต่อประสิทธิภาพของ ISACการสูญเสีย Gr1 ไม่ได้ส่งผลกระทบทันทีต่อประสิทธิภาพที่อาศัย ISAC แต่ลดระยะเวลาของการควบคุมเนื้องอก (รูปที่ 4D)เพื่อตรวจสอบความสามารถของ T785-ISACs ในการควบคุมการเติบโตของเนื้องอกในแบบจำลองที่มีค่าต่ำกว่าการแสดงออกของ HER2 ต่อไปเราได้จำลองประสิทธิภาพในแบบจำลองเนื้องอกที่แสดงออกปานกลางซึ่งดื้อต่อทราสตูซูแมบ HER2- JIMT-1กลุ่มเซลล์มะเร็ง JIMT-1 คาดว่าจะมีสำเนา HER2 ของพื้นผิวประมาณ 6.5 x105 และแสดงระดับที่ลดลงของHER2 เมื่อเปรียบเทียบกับสายเซลล์เนื้องอก HCC1954 โดยโฟลว์ไซโตเมทรี 43ในขณะที่trastuzumab T785-ISAC ชะลอการเติบโตของเนื้องอกอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับไอโซไทป์ ISAC หรือกลุ่มควบคุมทราสตูซูแมบ ไม่พบการถดถอยของเนื้องอกหรือการขจัดออก (รูปที่ 4E)เราตั้งสมมติฐานว่าเพอร์ตูซูแมบ ซึ่งจับอีพิโทป HER2 ที่แตกต่างจากตำแหน่งการจับของทราสตูซูแมบ จะเพิ่มการจัดกลุ่ม Fc และต่อมาปรับปรุง ADCP และประสิทธิภาพของ ISAC ในแบบจำลอง JIMT-1การรวมกันของทราสตูซูแมบ T785-ISAC กับเพอร์ตูซูแมบนำไปสู่ประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและการถดถอยของเนื้องอกที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 4F)หากไม่มีการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ trastuzumab T785-ISAC การผสมผสานของ pertuzumab กับ trastuzumab ก็ไม่มีประโยชน์อะไร

ต่อไปเราจะตรวจสอบเหตุการณ์ระดับโมเลกุลและระดับเซลล์ที่กระตุ้นโดย trastuzumab T785-ISAC ที่ส่งผลให้เกิดประสิทธิภาพในการต่อต้านเนื้องอกในที่สุดการแสดงออกของยีนในระยะแรกเปลี่ยนแปลงในเนื้องอกวัดด้วยแผงโปรไฟล์ภูมิคุ้มกันมะเร็งตับของเมาส์ NanoString เผยให้เห็นการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 13.7 เปอร์เซ็นต์ของยีนภายใน 24 ชั่วโมงของการรักษา ซึ่งรวมถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณและการกระตุ้น TLR7 (IRF-7, ยีนที่เกี่ยวข้องกับ NF-kB)เมื่อเทียบกับ 0-0.1 เปอร์เซ็นต์หลังการรักษาด้วย trastuzumab หรือ isotype T785-ISAC (รูปที่ 4G) 44การวิเคราะห์เส้นทางการแสดงออกของยีนที่ประเมินโดย nSolver Advanced Analysis Pathway Score เผยให้เห็นการควบคุมที่สำคัญของลายเซ็นยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่สำคัญ (ฟังก์ชันมาโครฟาจ, ฟังก์ชัน DC, การประมวลผลแอนติเจน & การนำเสนอ) ซึ่งเป็นสอดคล้องกับการค้นพบ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ที่การกระทำระหว่างกันของ Fc-Fc R มีความสำคัญสำหรับการออกฤทธิ์ที่อาศัย ISAC (รูปที่ 4H และรูปที่ 12 เพิ่มเติม)คะแนนลายเซ็นของยีนที่เกี่ยวข้องกับคีโมไคน์และไซโตไคน์เพิ่มขึ้นอย่างมากหลังการบำบัดด้วยทราสตูซูแมบ T785-ISAC ที่สอดคล้องกับการหาปริมาณโปรตีนที่ทำการวัดการหลั่งไซโทไคน์และคีโมไคน์ภายในเนื้องอก 24 ชั่วโมงหลังการบริหารให้ (รูปที่ 4Hและรูปที่ 13 เพิ่มเติม)การค้นพบนี้สอดคล้องกับข้อมูลประสิทธิภาพ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย บ่งชี้ว่าการตอบสนองที่อาศัย TLR- และ Fc R ที่แข็งแกร่งถูกเหนี่ยวนำโดย ISAC

โฟลว์ไซโตเมทรีและ IHC ถูกใช้เพื่อประเมินว่าการกระตุ้นที่อาศัย T785-ที่เป็นสื่อกลางของ ISAC และการแสดงออกของคีโมไคน์ที่เพิ่มขึ้นในท้ายที่สุดนำไปสู่การคัดเลือกเซลล์อิมมูนเอฟเฟกเตอร์หรือไม่การแทรกซึมของภูมิคุ้มกันแบบมัยอีลอยด์ถูกสร้างโปรไฟล์โดยโฟลว์ ไซโตเมทรี 24 ชั่วโมงและ 7 วันหลังการบริหารให้ยาทราสตูซูแมบ T785-ISAC หรือทราสตูซูแมบครั้งเดียว และเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่บำบัดการวิเคราะห์เนื้องอก 24 ชั่วโมงหลังการรักษาเปิดเผยการแทรกซึมของ CD11b บวก Ly6C บวกโมโนไซต์ และ CD11b บวก Ly6G บวกกับแกรนูโลไซต์ในเนื้องอกที่บำบัดด้วยทราสตูซูแมบหรือทราสตูซูแมบ T785-ISAC เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 4I)เจ็ดวันหลังการรักษา CD11b บวก CD11c บวก F4/80 บวก myeloid APC ที่เป็นบวกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่ได้รับ trastuzumab T785-ISAC เมื่อเทียบกับtrastuzumab หรือกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 4I) 45,46การเพิ่มขึ้นของ myeloid APCs อาจเป็นเนื่องมาจากการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการผลิตคีโมไคน์ที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์หลังการรักษาด้วยยา trastuzumab T785-ISACแม้ว่าความถี่ของ myeloid APCs จะไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 24-timepoint ชั่วโมง เซลล์ของฟีโนไทป์นี้ถูกกระตุ้นหลังจากการบำบัดด้วย trastuzumab T785-ISAC ที่วัดโดยการเพิ่มการควบคุม CD40 บนผิวเซลล์ เปรียบเทียบกับประชากรกลุ่มเดียวกันจากทราสตูซูแมบหรือกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 4I)การค้นพบนี้ พร้อมด้วยข้อมูล NanoString แสดงให้เห็นเพิ่มเติมถึงความสามารถของ trastuzumab T785-ISAC ในการดึงดูดและกระตุ้นเซลล์มัยอีลอยด์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกเมื่อพิจารณาจากผลบวกของ CD11b ของ myeloid APCs ที่สังเกตพบหนึ่งสัปดาห์หลังการรักษา การแทรกซึมในระยะแรกของ monocytes อาจเป็นสารตั้งต้นของประชากร myeloid APCs ที่เจริญเต็มที่ในเนื้องอกที่บำบัดด้วย ISAC แต่ไม่ได้อยู่ในเนื้องอกที่บำบัดด้วยทราสตูซูแมบอย่างไรก็ตาม ยังคงต้องพิจารณาว่าเหตุการณ์ที่ใกล้เคียงการอักเสบที่วัดได้ 24 ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้น ISAC โดย NanoString และ MSD ส่งผลต่อเหตุการณ์ส่วนปลาย เช่น การเจริญเต็มที่ของเซลล์ไมอีลอยด์ในสภาวะแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่เปลี่ยนรูป ณ จุดเวลา 6-วันภายหลัง และท้ายที่สุดก็ส่งผลต่อการถดถอยและการกวาดล้างของเนื้องอก
สุดท้าย IHC ถูกดำเนินการเพื่อประเมินการมีอยู่และตำแหน่งของประชากรเซลล์ภูมิคุ้มกันที่สำคัญในเนื้องอกหลังการบำบัดด้วยทราสตูซูแมบ T785-ISAC เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมของมันสอดคล้องกับโฟลว์ไซโตเมตรีในวันที่ 7, F4/80 แสดงออกเซลล์ในเนื้องอกและบริเวณช่องท้องเพิ่มขึ้นในวันที่ 9 หลังการบำบัดเพียงครั้งเดียวด้วย trastuzumab T785-ISAC (รูปที่ 4J)นอกจากนี้ การบำบัดด้วย ISAC แบบมุ่งเป้ายังส่งผลให้เซลล์ CD11c plus เพิ่มขึ้นอย่างมากในบริเวณปริกำเนิดที่ไม่พบหลังจากการบำบัดด้วยแอนติบอดี rHER2 หรือการบำบัดด้วยไอโซไทป์หรือไอโซไทป์-ISAC (รูปที่ 4J)การยกระดับในเซลล์ CD11c บวกโดยทั้งโฟลว์ ไซโตเมทรีและ IHC ยังแสดงให้เห็นในข้อมูล NanoString ซึ่งการแสดงออกของ mRNA ของ ITGAX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 6 และ 9 หลังการบริหารให้ trastuzumab T785-ISAC (รูปที่ 14 เพิ่มเติม)

รูปที่ 5: T785-ISACs กระตุ้นผลต้านเนื้องอกที่แข็งแกร่งในแบบจำลองเนื้องอกสังเคราะห์ MMC (ah) หนูเมาส์ FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) ถูกปลูกฝังด้วยสายเซลล์เนื้องอก MMC (a) หนูเมาส์เพศเมียถูกสุ่มเมื่อปริมาตรเนื้องอกถึงประมาณ 500 mm3 จากนั้นหนูเมาส์ถูกบำบัดโดยการฉีดในช่องท้องด้วย 5 มก./กก. q5d x 2 ของแอนติบอดี HER2 ที่ต้านหนูของหนูเมาส์, HER2 T ที่ต้านหนูเมาส์ HER2 T785-ISAC หรือไอโซไทป์ T785-ISAC (TA99) ของหนูเมาส์ =4-7 หนูต่อแขน) (b, c) หนูเมาส์เพศผู้ถูกสุ่มแบบสุ่มเมื่อปริมาตรเนื้องอกถึงประมาณ 500 มม.3 และถูกบำบัดล่วงหน้าซึ่งเริ่มต้นหนึ่งวันก่อนวันที่เริ่มต้นการบำบัดด้วยไลโปโซมที่บรรจุคลอโดรเนตหรือควบคุมสำหรับการทำลายฟาโกไซต์ (6 รอบ จนถึงวันที่ 15) หรือสารต้าน -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 วันหลังจากการรักษาครั้งสุดท้ายของพวกเขาถูกท้าทายด้วยเซลล์เนื้องอก MMC หนูเมาส์ที่ไร้เดียงสาเป็นเนื้องอกทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการฝัง (n=5 หนูต่อกลุ่ม) (โฆษณา) ข้อมูลเป็นตัวแทนของการทดลองอย่างน้อย 2 ครั้ง หนูถูกการุณยฆาตอย่างมนุษย์เมื่อเกิดเนื้องอกถึง 2,000 mm3 ข้อมูลจะแสดงสำหรับกลุ่มที่ไม่มีเนื้องอกถึง2,000 mm3. (ei) กลุ่มของหนูเมาส์ถูกสุ่มเมื่อปริมาตรเนื้องอกของเนื้องอก MMC ถึงประมาณ 500 mm3 และบำบัดด้วย ISAC 5 มก./กก. หรือแอนติบอดีควบคุมที่ให้ยาในวันที่ 0 และวันที่ 5 เนื้องอกถูกประมวลผลสำหรับการวัดไซโตไคน์โดย MSD , การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี, การหาปริมาณ NanoString mRNA หรือฟอร์มาลินคงที่และฝังพาราฟินสำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมีตามเวลาที่แสดง (e) แผนภาพภูเขาไฟแสดงการเปลี่ยนแปลง log2 พับของการแสดงออกของยีนในเนื้องอกที่ควบคุมด้วยไอโซไทป์ที่บำบัดและบำบัดด้วย NanoString ที่ 24 ชั่วโมง (n=5 หนูเมาส์ต่อกลุ่ม) การเปลี่ยนแปลงที่มีค่า p ที่ปรับแล้วเป็น < 0.05="" จะแสดงเป็นสีแดง="" (f)="" คะแนนลายเซ็นของยีนที่หาปริมาณโดย="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" สำหรับเนื้องอกที่วิเคราะห์="" 24="" ชั่วโมงหลังการรักษา="" (n="5" หนูต่อกลุ่ม)="" (g,="" h)="" การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีขององค์ประกอบเซลล์เนื้องอกและสถานะการกระตุ้น="" 24="" ชั่วโมงและ="" 6="" วันหลังการเริ่มต้นของการบำบัด="" (n="4" หนูเมาส์ต่อกลุ่ม)="" ข้อมูลเป็นตัวแทนของการทดลองอย่างน้อย="" 2="" ครั้ง="">ภาพที่แสดงให้เห็นรวมทั้งการหาปริมาณของ F4/80, CD11c และ CD8 IHC ของเนื้องอกที่เก็บเกี่ยวได้ 6 วันหลังจากการบำบัดที่ระบุแต่ละครั้ง แท่งมาตราส่วนมีขนาด 50 μm (ai) ข้อมูลถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ยและ SEM *ป<0.05,><0.01,><0.001,><>

T785-ที่มุ่งเป้าไปที่เนื้องอกกระตุ้นการถดถอยของเนื้องอกในแบบจำลองเนื้องอก MMC ที่สังเคราะห์ได้
เพื่อประเมินความสามารถของ ISAC ในการไกล่เกลี่ยประสิทธิภาพในการต่อต้านเนื้องอกเมื่อมีเซลล์ B, T และ NK เราใช้เซลล์สายเซลล์มะเร็งเต้านม HER2 (rHER2) ที่แสดงการแสดงออกของหนูเมาส์ซึ่งได้มาจากเต้านมที่เกิดขึ้นเอง มะเร็งใน rHER2- ซึ่งแสดงออก FVB หนูเมาส์เพื่อลดการสร้างภูมิคุ้มกันข้ามสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ rHER2 ใน MMC หนูทดลองแปลงพันธุ์ที่แสดงออกในหนู Her2 ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ MMTV ถูกใช้เป็นโฮสต์ (รูปที่ 15 เสริม) 47. ใช้ประโยชน์จากการมีระบบภูมิคุ้มกันที่สมบูรณ์ครบถ้วน เรามุ่งเป้าที่จะประเมินความสามารถของ ISAC ในการต่อสู้กับเนื้องอกที่มีภาระเนื้องอกขนาดใหญ่ 500 mm3 เนื่องจากเนื้องอกที่ใหญ่กว่านั้นโดยทั่วไป ยากต่อการรักษาในแบบจำลองก่อนคลินิก 48 การบริหารอย่างเป็นระบบของการรักษาทั้งหมด รวมทั้ง rHER2 T785-ISAC นั้นทนได้ดี โดยมีผลกระทบต่อน้ำหนักตัวน้อยที่สุด (รูปที่ 16A เสริม) อย่างไรก็ตาม มีเพียง rHER2 T785-ISAC เท่านั้นที่สามารถรักษาหนูที่มีเนื้องอกขนาดใหญ่และก่อตัวขึ้นได้ (รูปที่ 5A) ตามที่เห็นในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธวิสัย, การศึกษาการพร่องของเซลล์แสดงให้เห็นว่าการออกฤทธิ์ต้านเนื้องอกที่มีนัยสำคัญหายไปเมื่อเซลล์ฟาโกไซติกถูกทำให้หมดด้วยไลโปโซมที่บรรจุโคลโดรเนต (รูปที่ 5B) ในขณะที่ ISAC ไม่ได้ถูกคาดหวังให้กระทำการโดยตรงบนทีเซลล์ หนูเมาส์ที่บำบัดไว้ล่วงหน้าด้วยซีดี8-แอนติบอดีที่ทำลายล้างสูญเสียความสามารถในการกำจัดเนื้องอกหลังจากการบริหารให้ rHER2 T785-ISAC สองครั้ง (รูปที่ 5C) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า ISAC ที่มุ่งเป้าไปที่เนื้องอกสามารถกระทำโดยอ้อมผ่านทางทีเซลล์ ตามการนำเสนอของแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก สอดคล้องกับความจำทางภูมิคุ้มกันของหนูที่หายขาดของเนื้องอก MMC หลังการบำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC ได้รับการปกป้องจากการซ้ำของเนื้องอก (รูปที่ 5D)

เพื่อตรวจสอบกลไกที่เป็นพื้นฐานของประสิทธิภาพของ ISAC ในรูปแบบซินเจนีกเพิ่มเติม ต่อไปเราจะตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ การถอดรหัส และไซโตไคน์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกหลังการให้ยา ISAC หนูเมาส์สองกลุ่มที่มีเนื้องอก MMC ขนาดใหญ่ถูกบำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC หรือกลุ่มควบคุม เนื้องอกจากกลุ่มแรกถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังการให้ยา (วันที่ 1) เมื่อเนื้องอกทั้งหมดมีขนาดใกล้เคียงกัน (รูปที่ 16B เสริม) กลุ่มอื่นได้รับขนาดยาที่สอง 5 วันหลังจากครั้งแรก จากนั้นเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงต่อมา (วันที่ 6) ซึ่งจุดที่เนื้องอกในกลุ่มการบำบัดทั้งหมดเติบโตอย่างวัดได้ยกเว้นกลุ่มที่บำบัดด้วย T785-ISAC (รูปที่ 16B เสริม) ). วิเคราะห์เนื้องอกโดย IHC, การแสดงออกของ mRNA และการคัดหลั่งไซโตไคน์ในโปรตีนไลเสต สนับสนุนการสังเกตของเราเพิ่มเติมในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธวิสัยที่จำเป็นต้องมีการกำหนดเป้าหมายเนื้องอกสำหรับกิจกรรมของ ISAC การวิเคราะห์ mRNA ของเนื้องอก 24 ชั่วโมงหลังการรักษาด้วย rHER2 T785-ISAC พบว่ามีการควบคุมยีนที่เพิ่มขึ้นอย่างมากถึง 34.1 เปอร์เซ็นต์ในภูมิคุ้มกันของแพน-มะเร็งของเมาส์ NanoString แผงโปรไฟล์เปรียบเทียบกับเนื้องอกที่ได้รับไอโซไทป์ แอนติบอดีต้าน rHER2 เพียงอย่างเดียวมีผลกระทบเพียงเล็กน้อยต่อการแสดงออกของยีน (3.5 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่วิเคราะห์) ในขณะที่ไอโซไทป์ที่ไม่เป็นเป้าหมาย T785-ISAC ไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของยีน (รูปที่ 5E) ตามที่เห็นในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ HCC1954 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณและการกระตุ้นที่เป็นสื่อกลางของ TLR7-ถูกเพิ่มการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญโดย rHER2 T785-ISAC ที่กำหนดเป้าหมายเนื้องอก ซึ่งบ่งชี้ถึงการตอบสนองที่อาศัย TLR ที่แข็งแกร่ง (รูปที่ 5E) การวิเคราะห์เส้นทางการแสดงออกของยีนแสดงให้เห็นอีกครั้งว่ามีการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของลายเซ็นของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่สำคัญ ซึ่งรวมถึงลายเซ็นสำหรับการวิเคราะห์เส้นทางการแสดงออกของยีน เผยให้เห็นการปรับที่เพิ่มขึ้นของลายเซ็นของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่สำคัญหลังการรักษาด้วย rHER2 T785-ISAC รวมถึงสิ่งที่เกี่ยวข้องกับคีโมไคน์ และไซโตไคน์ (รูปที่ 5F) การหาปริมาณโปรตีนถูกดำเนินการบนเนื้องอกเดียวกันกับที่วิเคราะห์โดย NanoString และสอดคล้องกับการค้นพบลายเซ็นของยีน ระดับที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของไซโตไคน์และคีโมไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบถูกวัดที่ 24 ชั่วโมงหลังการบำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC (รูปที่ 17 เพิ่มเติม) ). คะแนนลายเซ็นของยีนยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญสำหรับการประมวลผลและการนำเสนอแอนติเจน, ฟังก์ชันเซลล์เดนไดรต์ และฟังก์ชันมาโครฟาจ ซึ่งสนับสนุนเพิ่มเติมโดยอาศัย anFc-Fc R และการตอบสนองที่ขับเคลื่อนด้วยฟาโกไซโตซิส 24 ชั่วโมงหลัง rHER2 T785-ISACการรักษา (รูปที่ 5F และรูปที่ 18 เพิ่มเติม) นอกเหนือจากคะแนนลายเซ็นของยีนที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญซึ่งเชื่อมโยงกับการตอบสนองที่เป็นสื่อกลางของ TLR- และ Fc R แล้ว คะแนนลายเซ็นของยีนสำหรับฟังก์ชันทีเซลล์ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใน 24 ชั่วโมงของการบำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC ซึ่งสนับสนุนเพิ่มเติม พบว่าทีเซลล์จำเป็นสำหรับประสิทธิภาพที่เป็นสื่อกลางของ ISAC (รูปที่ 5F และรูปที่ 18 เพิ่มเติม)

ในการจำแนกลักษณะเฉพาะของเซลล์ภูมิคุ้มกันที่อาจมีส่วนในการเพิ่มขึ้นในระยะเริ่มต้นของการผลิตโปรอักเสบไซโตไคน์และคีโมไคน์ เนื้องอกถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี 24 ชั่วโมงหลังขนาดยาครั้งแรกของ rHER2 T785-ISAC หรือกลุ่มควบคุม และ 6 วันหลังการเริ่มต้นของ การรักษา 24 ชั่วโมงหลังการให้ยาครั้งที่สอง การวิเคราะห์เนื้องอกในวันที่ 1 เผยให้เห็นการแทรกซึมของ CD11b บวก Ly6C บวกโมโนไซต์ในเนื้องอกที่บำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC และ CD11b บวก Ly6G บวกกับแกรนูโลไซต์ในเนื้องอกที่บำบัดด้วย rHER2 mAb หรือ rHER2 T785-ISAC แต่ไม่ใช่กลุ่มควบคุมไอโซไทป์ ISAC หรือกลุ่มควบคุมแอนติบอดีไอโซไทป์ (รูปที่ 5G) ระดับของโมโนไซต์ยังเพิ่มขึ้นอีกในเนื้องอกที่บำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC หลัง 6 วัน คล้ายกับที่เราสังเกตเห็นในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ HCC1954 มัยอีลอยด์ APCs (CD11b บวก CD11c บวก F4/80 บวก ) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 6 หลังการรักษา rHER2 T785-ISAC เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5G และรูปที่ 19 เพิ่มเติม ). นอกจากนี้ พบว่า Myeloid APC ถูกกระตุ้นอย่างจำเพาะในกลุ่มที่บำบัดด้วย rHER2 T785- ISAC ที่จุดเวลาทั้งสอง ตามที่วัดโดยการปรับเพิ่ม CD40 บนผิวเซลล์ (รูปที่ 5H) ที่สำคัญ การเพิ่มขึ้นของ APCs ที่เป็นเนื้องอกไม่ได้ถูกวัดหลังจากการพร่องของฟาโกไซต์โดยใช้ไลโปโซมที่บรรจุโคลโดรเนต (รูปที่ 20) สุดท้าย IHC ถูกดำเนินการเพื่อประเมินการมีอยู่และตำแหน่งของประชากรเซลล์ภูมิคุ้มกันที่สำคัญในแบบจำลอง MMC หลังการบำบัดด้วย rHER2 T785-ISAC ดังที่เห็นในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธวิสัยของ HCC1954 การรักษาด้วย rHER2 T785-ISAC ส่งผลให้เซลล์ CD11c plus และ F4/80 plus เพิ่มขึ้นอย่างมากในบริเวณช่องท้องที่ไม่พบหลังจากการบำบัดด้วยแอนติบอดี rHER2 หรือการรักษาด้วยไอโซไทป์ หรือไอโซไทป์ T785-ISAC (รูปที่ 5I) สอดคล้องกับการแสดงออกในช่วงเริ่มต้นของคีโมไคน์ของทีเซลล์และคะแนนลายเซ็นของยีนที่เพิ่มขึ้นสำหรับฟังก์ชันทีเซลล์ การแทรกซึมที่มีนัยสำคัญของเซลล์ CD8 บวกถูกมองเห็นโดย IHC ภายในเนื้องอกของ rHER2 T785-หนูที่ได้รับการบำบัดด้วย ISAC ในวันที่ 6 ในขณะที่ การย้อมสี CD8 ในหนูเมาส์ที่บำบัดด้วยแอนติบอดีต้าน rHER2 หรือกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ยังคงต่ำ (รูปที่ 5I) การย้อมสี CD8 บวกกับ IHC ที่เพิ่มขึ้น ร่วมกับการแสดงออกของยีนที่ขยายเพิ่มของยีนที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของทีเซลล์และการขจัดเนื้องอกที่ขึ้นกับ CD8- สนับสนุนศักยภาพของ T785-ISAC ที่จะทำให้เนื้องอกเย็นร้อนขึ้นCL{ {58}}ISACs กระตุ้นการถดถอยของเนื้องอกใน HER2-ตัวกลางที่แสดงแบบจำลองเนื้องอกการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์เพื่อแสดงให้เห็นว่า ISAC เป็นแพลตฟอร์มที่แข็งแกร่งสำหรับน้ำหนักบรรทุกที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันหลายรายการ เราได้พัฒนา ISAC โดยใช้ตัวเอก TLR7 ที่รู้จักกันดี CL264 พร้อม DAR เทียบได้กับ trastuzumab T785-ISAC (รูปที่ 6A และรูปที่ 21 เพิ่มเติม) ความจุของ trastuzumab ISAC ที่ผลิตด้วย CL264 หรือ T785 เพื่อไกล่เกลี่ยการกระตุ้นมัยอีลอยด์ภายในเนื้องอกได้รับการประเมินในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ HCC1954 24 ชั่วโมงหลังจากการบริหารครั้งเดียวของ trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC หรือ trastuzumab T785-ISAC . การกระตุ้นมัยอีลอยด์ที่ได้รับการปรับปรุงถูกสังเกตพบด้วย trastuzumab CL264-ISAC ตามหลักฐานโดยการแสดงออกของ CD40 ที่เพิ่มขึ้นใน CD11b ที่แทรกซึมไปยังเนื้องอก บวก CD11c บวก F4/80 บวกกับ APC ของ myeloid เมื่อเปรียบเทียบกับ trastuzumab หรือ trastuzumab T785-ISAC (รูปที่ 6B ).เพื่อตรวจสอบว่าความสามารถในการกระตุ้นมัยอีลอยด์ที่เพิ่มขึ้นของ CL264-ISAC แปลเป็นการมีฤทธิ์ต้านเนื้องอกในร่างกายมากขึ้นหรือไม่ trastuzumab CL264-ISAC ถูกนำมาเปรียบเทียบกับT785-ISAC ในแบบจำลองเนื้องอก HER2High HCC1954 และ HER2Med JIMT-1 ในขณะที่ทั้งสองtrastuzumab ISAC เป็นสื่อกลางในการถดถอยของเนื้องอกโดยสมบูรณ์ในแบบจำลอง HCC1954 HER2High, CL264-ISAC แสดงให้เห็นการออกฤทธิ์ต้านเนื้องอกที่เพิ่มขึ้นในแบบจำลอง HER2Med ของ JIMT-1 ซึ่งแนะนำว่าศักยภาพของ ISAC และความสามารถในการกำหนดเป้าหมายเนื้องอกที่มีความหนาแน่นของแอนติเจนต่ำอาจ เชื่อมโยงกัน (รูปที่ 6C–D)

ISAC ทั้งสองได้รับการยอมรับอย่างดี แต่เราสังเกตเห็นการสูญเสียน้ำหนักตัวชั่วคราว 5-10 เปอร์เซ็นต์ในสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย trastuzumab CL264-ISAC หรือ rituximab CL264-ISAC โดยที่น้ำหนักตัวฟื้นตัวเป็น หรือสูงกว่าเส้นพื้นฐานโดยขนาดยาที่สาม (รูปที่ 16A เสริม) การคัดหลั่งไซโทไคน์ทั่วร่างถูกวัดหลังการบำบัดด้วย T785-ISAC หรือ CL264-ISAC ระดับ TNF ต่ำถูกวัดในซีรัมของสัตว์สี่ชั่วโมงหลังจากการบริหารให้ T785-ISAC ในขณะที่ทั้ง CL264-ไอโซไทป์ที่เป็นเป้าหมายและไอโซไทป์ทำให้เกิดระดับการคัดหลั่ง TNF ที่เป็นระบบสูงขึ้น (รูปที่ 11 เพิ่มเติม) . ไม่น่าเป็นไปได้ที่ผลกระทบเหล่านี้ระหว่าง T785 และ CL264 ISAC เกิดจากผลกระทบโดยตรงของ ISAC ต่อการเติบโตของเซลล์เนื้องอก เนื่องจาก ISAC ไม่ได้ยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งในหลอดทดลอง (รูปที่ 9) เพิ่มเติม

CL264-ISACs กระตุ้นการขจัดเนื้องอกและหน่วยความจำทางภูมิคุ้มกันในแบบจำลองเนื้องอกซินยีน เมื่อพิจารณาจากศักยภาพและประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้นที่สังเกตพบด้วย CL264-ISAC ในแบบจำลองการปลูกถ่ายเนื้อเยื่อของเนื้องอกในมนุษย์ที่มีความหนาแน่นของแอนติเจน HER2 ที่หลากหลาย เราจึงแสดงคุณลักษณะต่อไปของกิจกรรมของ CL 264-ISAC ในแบบจำลองเนื้องอกสังเคราะห์ คล้ายกับ T785-ISAC ในแบบจำลอง MMC, CL264-ISAC นำไปสู่การถดถอยและการขจัดเนื้องอกในลักษณะที่ขึ้นกับทีเซลล์ ซึ่งนำไปสู่หน่วยความจำภูมิคุ้มกันที่คงทน (รูปที่ 22A เสริม) เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ ISAC ในแบบจำลองเนื้องอกสังเคราะห์ที่มีการแสดงออกของแอนติเจนที่ลดลง เราได้พัฒนาสายพันธุ์ของเซลล์ CT26 ที่แสดงออก HER2 ของหนูแรทอย่างคงตัว (CT26-rHER2) อย่างสำคัญ ประมาณ 8.5 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CT26 ไม่แสดงออก rHER2 หลังจากการฝังเนื้องอก (รูปที่ 6E) หนู Wildtype Balb/c ที่ได้รับการรักษาด้วย rHER2 CL264-ISAC แสดงภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกอย่างมากในหนูที่ 75 เปอร์เซ็นต์ (6 จาก 8) กำจัดเนื้องอกและยังคงปราศจากเนื้องอกตลอดระยะเวลาของการทดลอง ในขณะที่ไม่มีหนูตัวใดที่บำบัดด้วยแอนติบอดีต้าน rHER2 ที่มีการถดถอยอย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 6F) การสูญเสียน้ำหนักชั่วคราวประมาณ 10 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวหลังการรักษา rHER2 CL264- ISAC ถูกสังเกตพบ โดยน้ำหนักตัวฟื้นตัวโดยแปดวันหลังการเริ่มต้นการศึกษา (รูปที่ 22B เสริม) เราประเมินว่า rHER2 CL264-ISAC เป็นสื่อกลางหน่วยความจำภูมิคุ้มกันกับเนื้องอกที่ไม่มีการแสดงออกของแอนติเจนที่เป็นเป้าหมาย rHER2 โดยท้าทายหนูที่รักษาเนื้องอก CT26-rHER2 ก่อนหน้านี้ด้วยเซลล์ CT26 ของผู้ปกครองที่ไม่มี rHER2 การแสดงออก. หนูเมาส์ที่รักษาให้หายขาดก่อนหน้านี้ของเนื้องอก CT26-rHER2 ที่มี rHER2 ISAC ได้รับการปกป้องอย่างเต็มที่จากความท้าทายด้วยสายเซลล์ CT26 ต้นกำเนิด (รูปที่ 6I) การทำให้เซลล์ CD4 และ CD8 T หมดลงก่อนการทำซ้ำของเนื้องอกแสดงให้เห็นว่าเซลล์ T จำเป็นสำหรับการป้องกัน สุดท้าย เราได้ทดสอบว่าหน่วยความจำทางภูมิคุ้มกันที่พัฒนาขึ้นในหนูที่เคยรักษาด้วย ISAC ก่อนหน้านี้นั้นจำเพาะต่อแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกของเนื้องอกหลักที่รับการรักษาหรือไม่ ในระหว่างการทดสอบซ้ำของเนื้องอก CT26 ของพ่อแม่ หนูถูกท้าทายพร้อมกันด้วยเนื้องอก 4T1 ที่แตกต่างกันซึ่งฝังไว้ที่ปีกข้างตรงข้าม ข้อมูลแสดงว่าการพัฒนาของหน่วยความจำภูมิคุ้มกันคือจำเพาะต่อแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก CT26 ซึ่งแตกต่างจาก rHER2 เนื่องจากการเติบโตของเนื้องอกของเนื้องอก 4T1 ไม่ได้รับผลกระทบ (รูปที่ 6G)