การแสดงออกของยีนภูมิคุ้มกันและเครือข่ายการทำงานในคลาสโรคไตอักเสบลูปัสที่แตกต่างกัน Ⅰ

เชิงนามธรรม

วัตถุประสงค์ เพื่อสำรวจยูทิลิตี้ของแพลตฟอร์ม NanoString ในชี้แจงไตการถอดเสียงภูมิคุ้มกันสำหรับโรคไตอักเสบลูปัสคลาส III, IV และ V (LN) โดยใช้กลุ่มย้อนหลังของพาราฟินที่ฝังด้วยฟอร์มาลินคงที่(FFPE) เนื้อเยื่อชิ้นเนื้อไต

วิธีการ: การวิเคราะห์การถอดเสียงของยีนภูมิคุ้มกันดำเนินการโดยใช้แพลตฟอร์ม NanoString nCounter บน RNA จาก LN (n{0}}), โรคเยื่อบางชั้นใต้ดิน (TBM) (n=14) และโรคไตอักเสบแบบเยื่อ (MN) (n{ {2}}) FFPEการตรวจชิ้นเนื้อไตเนื้อเยื่อ. ตัวอย่าง LN ประกอบด้วยชิ้นเนื้อประเภท III (n{0}}), IV (n=23) และ V (n{2}}) เดี่ยวที่ไม่มีรอยโรคผสม ทำการแสดงออกของยีนที่แตกต่างด้วย NanoString nSolver พร้อมการแสดงภาพของแปลงภูเขาไฟและแผนที่ความร้อนที่สร้างขึ้นใน R การถอดเสียงที่สำคัญถูกสอบปากคำเพื่อระบุเครือข่ายการทำงานโดยใช้เงื่อนไข STRING และ Gene ontogeny

คลิกที่นี่เพื่อรับสูตรสมุนไพรของ CISTANCHE สำหรับไต

ผลลัพธ์ เมื่อเปรียบเทียบกับ TBM เราระบุยีนที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ 52 ยีนซึ่งพบได้ทั่วไปใน LN ทั้งสามคลาส การวิเคราะห์วิถีแสดงให้เห็นการปรับปรุงสำหรับการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอน (IFN) ชนิดที่ 1 ส่วนเสริม และวิถีทาง MHC II โดยส่วนใหญ่แสดงการแสดงออกที่สูงที่สุดในคลาส IV LN การตรวจชิ้นเนื้อคลาส IV LN ของเรายังแสดงให้เห็นการควบคุมการส่งสัญญาณ NF-κBและการเสริมภูมิคุ้มกันอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับการตรวจชิ้นเนื้อคลาส V LN การถอดเสียงจากวิถี IFN ประเภทที่ 1 แยกแยะคลาส V LN จาก MN

การวิเคราะห์การถอดเสียงในส่วนของไตทั้งหมดของเราให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับโปรไฟล์โมเลกุลของคลาส III, IV และ V LN ข้อมูลเน้นย้ำถึงวิถีทางที่สำคัญซึ่งพบได้ทั่วไปในทั้งสามคลาสและวิถีทางที่ได้รับการเสริมสมรรถนะในการตรวจชิ้นเนื้อ LN ระดับ IV ของเรา ความสามารถในการเปิดเผยวิถีทางโมเลกุลใน LN โดยใช้ส่วนการตรวจชิ้นเนื้อ FFPE ทั้งหมดอาจมีประโยชน์ทางคลินิกในการเลือกการรักษาสำหรับ LN

การแนะนำ

โรคไตอักเสบลูปัส(LN) เป็นการสำแดงที่สำคัญของระบบโรคลูปัส erythematosus(SLE) และพัฒนาในผู้ป่วยประมาณ 40%1 ความชุกของโรคนี้ได้รับอิทธิพลจากอายุ (สูงขึ้นในวัยเด็กที่เริ่มมีอาการ SLE) และเชื้อชาติ (สูงกว่าในผู้ป่วยที่ไม่ใช่คนผิวขาว) และมีความสัมพันธ์แบบผกผันกับสถานะทางเศรษฐกิจและสังคม2การตรวจชิ้นเนื้อไตเป็นส่วนสำคัญของการจัดการ LN3 4 และมีความพยายามที่สำคัญเพื่อเชื่อมโยงการเปลี่ยนแปลงที่พบในการตรวจชิ้นเนื้อกับการเกิดโรค การเลือกการรักษา และการพยากรณ์โรค1 สิ่งสำคัญสำหรับสิ่งนี้คือการพัฒนาระบบการจำแนกประเภท LN ที่รวมเอา คำจำกัดความที่เป็นมาตรฐานของรอยโรคการตัดชิ้นเนื้อเพื่อลดความแปรปรวนในการรายงานระหว่างกัน

การจำแนกประเภทฉันทามติของสมาคมโรคไต/พยาธิวิทยาไตนานาชาติ (ISN/RPS) ปี 2003 ของ LN5 อธิบายไว้ 6 คลาส: LN ของ mesangial ขั้นต่ำ (คลาส I); LN ที่มีการงอกของ mesangial (คลาส II); โฟกัส LN (คลาส III); LN แบบกระจายซึ่งสามารถแบ่งเพิ่มเติมได้เป็น LN ที่มีการเจริญแบบแบ่งส่วนแบบกระจาย (คลาส IV-S) และแบบกระจายทั่วโลก (คลาส IV-G) LN แบบเยื่อ (คลาส V) และ LN การเกิดสเกลโรซิงขั้นสูง (คลาส VI) แอคทีฟ (A เช่น ภาวะไฮเปอร์เซลล์ของต่อมหมวกไต, เนื้อร้ายไฟบรินอยด์, เสี้ยวของเซลล์และไมโครเซลล์) และเรื้อรัง (C, เช่น, เส้นโลหิตตีบของไต, เสี้ยวของเส้นใย) รอยโรคของไตยังถูกกำหนดและแสดงไว้เมื่ออธิบายคลาส III และ IV ตัวอย่างเช่น คลาส IV-G (A) อธิบายการกระจาย LN ของการงอกขยายทั่วโลกที่มีรอยโรคที่ทำงานอยู่ มีการเสนอการปรับปรุงการจำแนกประเภทนี้ 6 ข้อเสนอแนะรวมถึงการกำจัดการแบ่งย่อยคลาส IV-S และ IV-G เนื่องจากสิ่งเหล่านี้ไม่ส่งผลต่อผลลัพธ์ ในการวิเคราะห์เมตา การเกิดของอย่างใดอย่างหนึ่งโรคไตระยะสุดท้ายหรือเพิ่มครีเอตินีนในซีรั่มเป็นสองเท่าไม่แตกต่างกันระหว่างคลาส IV-S และ IV-G7 นอกจากนี้ยังเสนอให้แทนที่ตัวอธิบายที่ใช้งานและเรื้อรังด้วยดัชนีกิจกรรมและเรื้อรังที่ได้มาจากกิจกรรม lupus และระบบการให้คะแนนของ NIH8 ดังนั้นจึงช่วยให้สามารถประเมินเชิงปริมาณของกิจกรรม (a คะแนนของ 0 ถึง 24) และเรื้อรัง (คะแนนของ 0 ถึง 12)

ระดับ LN มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการแจ้งการจัดการ 3 แนะนำให้ใช้การกดภูมิคุ้มกันใน LN ระดับแอคทีฟ III และ IV แต่ไม่ใช่ใน LN ระดับ II การตัดสินใจกระตุ้นภูมิคุ้มกันในระดับ V LN นั้นได้รับอิทธิพลจากระดับโปรตีนในปัสสาวะและการตอบสนองต่อการปิดล้อมของ renin-angiotensin-aldosterone ความล้มเหลวในการควบคุมโปรตีนในปัสสาวะ 12 เดือนหลังการรักษาสัมพันธ์กับการลุกลามของโรคไตเรื้อรัง9–11 ดังนั้นเป้าหมายการจัดการคือการลดโปรตีนในปัสสาวะโดยมีเป้าหมายเพื่อการตอบสนองทางคลินิกที่สมบูรณ์ (<0.5–0.7 g per 24 hours).

คลาส LN เพียงอย่างเดียวมีประสิทธิภาพน้อยกว่าในการแจ้งผลลัพธ์เพราะว่าปัจจัยเสี่ยงต่อการเกิดโรคไตเรื้อรังรวมลักษณะทางคลินิกและเนื่องจากมีคุณลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาที่ไม่ได้บันทึกไว้ในคำจำกัดความของคลาส LN ซึ่งรวมถึงระดับของพังผืดคั่นระหว่างหน้าและ tubular atrophy (IFTA) และรอยโรคของไตที่เฉพาะเจาะจง เช่น fibrinoid necrosis และ fibrous crescents12 การหาปริมาณของรอยโรคในไตแต่ละรายที่เลือกและกำหนดไว้อย่างชัดเจนสามารถแจ้งการพยากรณ์โรคได้ สิ่งนี้เห็นได้ชัดเจนในโรคไตของ IgA ซึ่งการให้คะแนนของเซลล์ mesangial, เซลล์ชั้นนอกของหลอดเลือดมากเกินไป, เส้นโลหิตตีบส่วน, การฝ่อของท่อ, พังผืดคั่นระหว่างหน้า และเสี้ยววงเดือนเพื่อสร้างคะแนน MEST-C ได้รับการแสดงเพื่อช่วยทำนายความเสี่ยง 13–15 การแก้ไขที่เสนอใน ISN /RPS 2003 การจำแนกประเภท LN ที่เป็นเอกฉันท์อาจแก้ไขข้อบกพร่องเหล่านี้6 แต่ยังคงมีการระบุล่วงหน้าเกี่ยวกับการใช้สัณฐานวิทยา ด้วยเหตุนี้ จึงจำเป็นต้องศึกษาวิถีทางระดับโมเลกุลภายในการตัดชิ้นเนื้อ LN และทำความเข้าใจว่าสิ่งเหล่านี้เกี่ยวข้องกับประเภทของ LN อย่างไร16 17 และผลการรักษา18 19 ในแง่ของประโยชน์ใช้สอยทางคลินิก การวิเคราะห์การถอดเสียงของการตัดชิ้นเนื้อไตมีความสำคัญมากที่สุด ขั้นสูงในการวินิจฉัยการปฏิเสธไตที่ใช้แอนติบอดีเป็นสื่อกลาง โดยมีการเพิ่มการแสดงออกของการถอดเสียงยีนในเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อซึ่งอยู่ระหว่างการตรวจสอบความถูกต้อง ได้ถูกเพิ่มเข้าในเกณฑ์ทางสัณฐานวิทยาที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว20 เพื่อพิจารณาประโยชน์ของการใช้ข้อมูลการถอดเสียงเพื่อปรับปรุงประโยชน์ทางคลินิกของไต การตรวจชิ้นเนื้อใน SLE เราใช้เทคโนโลยี NanoString เพื่อศึกษาการแสดงออกของบันทึกภูมิคุ้มกันและการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับ 750 รายการในส่วนที่ฝังพาราฟินแบบตรึงฟอร์มาลิน (FFPE) จากการตัดชิ้นเนื้อ 55 LN, การตัดชิ้นเนื้อ 14 ชิ้นด้วยโรคเยื่อบางชั้นใต้ดิน (TBM) และการตัดชิ้นเนื้อ 9 ชิ้นด้วย โรคไตเยื่อ (MN)

วิธีการ

ตัวอย่าง: เนื้อเยื่อชิ้นเนื้อไต FFPE ได้มาจากตัวอย่าง LN, TBM และ MN ที่เก็บถาวรส่วนเกินสำหรับการใช้งานทางคลินิก และมีเนื้อเยื่อเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ ไม่รวมการตรวจชิ้นเนื้อ Lupus ที่มีรอยโรคผสมหรือมีรอยแผลเป็นที่สำคัญ TBM ถูกใช้เพื่อควบคุมโรคเนื่องจากขาดการตัดชิ้นเนื้อไตตามปกติ พารามิเตอร์ทางคลินิกถูกรวบรวมจากบันทึกสุขภาพย้อนหลัง ได้รับเมทริกซ์คะแนน Interferon (IFN) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ 21 การตอบสนองที่สมบูรณ์ถูกกำหนดให้เป็นอัตราส่วนโปรตีน/ครีเอตินีนในปัสสาวะ (uPCR) ของ<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% ภายใน 1 ปีหลังการตรวจชิ้นเนื้อ การตอบสนองบางส่วนถูกกำหนดให้เป็น uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

การสกัดอาร์เอ็นเอ

microtome ได้รับส่วนเนื้อเยื่อทั้งหมดที่มีความหนา 10 μm หกส่วนจากบล็อก FFPE แต่ละบล็อก หลังจากกำจัดส่วน 4 μm สองส่วนออก เพื่อป้องกันการปนเปื้อนข้าม อุปกรณ์ได้รับการทำความสะอาดด้วย RNase Away ระหว่างตัวอย่าง และใช้ใบมีดใหม่สำหรับแต่ละตัวอย่าง การแยก RNA ของเนื้อเยื่อทั้งหมดดำเนินการในวันเดียวกันโดยใช้ชุด RNeasy FFPE (Qiagen, # 73504) และความเข้มข้นของ RNA ได้รับการประเมินโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; ข้อมูลเสริมออนไลน์ S1)

การวิเคราะห์ถอดเสียง

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >สองเท่า (เฉลี่ย +2 SD) ของโพรบควบคุมเชิงลบ การนับถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของยีนดูแลทำความสะอาด 10 ยีน (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB และ ZC3H14) ที่เลือกเมื่อแสดงออกในตัวอย่างทุกประเภท จำนวนที่ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับตัวอย่างทั้งหมดแสดงอยู่ในข้อมูลเสริมออนไลน์ S2

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การแสดงออกของยีนดิฟเฟอเรนเชียล (DGE) ดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ขั้นสูงของโซลเวอร์ (V.4) อัลกอริธึมคู่เร็ว/ประมาณ ซึ่งใช้แบบจำลองทวินามลบแบบง่ายสำหรับโพรบทั้งหมด ยกเว้นในกรณีที่อัลกอริธึมไม่มาบรรจบกันและใช้วิธีการถดถอยเชิงเส้นถูกนำมาใช้ LN, MN หรือคลาส LN (III, IV และ V) ถูกใช้เป็นตัวแปรอิสระและ TBM เป็นกลุ่มอ้างอิงของเรา การนับเกณฑ์กำหนดไว้ที่ 100 และความถี่ในการสังเกตภายในกลุ่มตัวอย่างตั้งไว้ที่ 8% ค่า P ถูกปรับโดยใช้วิธี Benjamini-Hochberg โดยมีเกณฑ์การค้นพบที่ผิดพลาดสำหรับการตั้งค่าที่ 0.05 แปลงภูเขาไฟถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ Enhanced Volcano (//github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) ในการแสดงภาพเครือข่ายการเชื่อมโยงโปรตีนเชิงหน้าที่ R.22 ดำเนินการโดยใช้ฐานข้อมูล STRING (https:// string-db.org/) โดยใช้เครือข่าย STRING เต็มรูปแบบ ขอบเครือข่ายถูกกำหนดโดยความเชื่อมั่น และการโต้ตอบถูกกำหนดให้เป็นคะแนนปฏิสัมพันธ์ที่มีความเชื่อมั่นสูงสุด ( มากกว่าหรือเท่ากับ 0.9) โหนดที่ตัดการเชื่อมต่อภายในเครือข่ายไม่แสดงขึ้นมา ยีนที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญได้รับการประเมินเพื่อเพิ่มคุณค่าของคำศัพท์ Gene Ontology (GO) (กระบวนการทางชีวภาพ, ฟังก์ชั่นโมเลกุล, องค์ประกอบเซลลูล่าร์), วิถีทางของปฏิกิริยาและกลุ่มเครือข่ายท้องถิ่น STRING เครือข่ายปฏิสัมพันธ์แบบมองเห็นถูกสร้างขึ้นด้วยการเสริมประสิทธิภาพการทำงานในแง่ GO (กระบวนการทางชีวภาพ) และการวิเคราะห์ STRING แผนภาพเวนน์ตามสัดส่วนพื้นที่ของยีนที่แสดงออกแตกต่างกันที่ทับซ้อนกันระหว่างคลาสย่อย LN ถูกสร้างขึ้นด้วย BioVenn (www.biovenn. nl)23 ข้อมูลจากซอฟต์แวร์ตัวแก้ปัญหาการวิเคราะห์ขั้นสูงถูกอ่านในสภาพแวดล้อมทางสถิติ R และการแสดงภาพข้อมูลดำเนินการโดยใช้ boxplots การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก แปลงภูเขาไฟและแผนที่ความร้อน แผนที่ความร้อนถูกสร้างขึ้นโดยใช้คะแนน Z ของการนับที่ทำให้เป็นมาตรฐานและแผนที่ความร้อนในกลุ่ม R ถูกวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ การวิเคราะห์ความแปรปรวนด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบพหุคูณของ Sidak ใช้สำหรับการเปรียบเทียบกลุ่มต่างๆ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ GraphPad Prism (V.8.0)

คำแถลงการมีส่วนร่วมของผู้ป่วยและสาธารณะ (PPI)

การศึกษานี้เป็นส่วนหนึ่งของกลุ่มความร่วมมือ MASTERPLANS และผู้ทำงานร่วมกันของผู้ป่วยได้มีส่วนร่วมในทุกสายงานรวมถึงการศึกษานี้ด้วย อภิธานศัพท์จัดทำขึ้นโดย PPI เพื่อให้มีส่วนร่วมกับชุมชนผู้ป่วยในวงกว้างยิ่งขึ้น และผลการวิจัยก็รวมอยู่ในวันทบทวนด้วย บทวิจารณ์สิ่งพิมพ์จะถูกแชร์บนเว็บไซต์ MASTERPLANS (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans)

บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950

เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-ร้านค้า

รับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับไต