การระบุ ESTs ที่ตอบสนองต่อไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ Phenylethanoid Glycoside Biosynthesis ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ Cistanche Salsa

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เจ. เฉิน et al

เชิงนามธรรม
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสารกระตุ้นที่เกิดจากสิ่งมีชีวิตที่มีประสิทธิภาพซึ่งสามารถกระตุ้นการสังเคราะห์สารเมตาบอไลต์ทุติยภูมิในพืชได้ เราแสดงให้เห็นว่าในการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยของพืชสมุนไพรที่ทนต่อเกลือCistancheซัลซ่า, การผลิตส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพphenylethanoidไกลโคไซด์(PeG) เพิ่มขึ้นหลังการบำบัดด้วย H2O2 เพื่อระบุยีนที่เกี่ยวข้องกับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพที่ได้รับผลกระทบจาก H2O2 เราได้สร้างไลบรารีไฮบริไดเซชันการลบด้วยการปราบปรามของยีนที่ตอบสนองต่อ H2O2 โดยใช้Cistancheซัลซ่าเซลล์และระบุแท็กลำดับการแสดงออก 105 รายการ (EST) และ 85 ยีน คำอธิบายประกอบการทำงานของไลบรารี EST และการวิเคราะห์ภววิทยาของยีนแสดงยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียดต่างๆ การสังเคราะห์ทางชีวภาพของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิ และการควบคุมการถอดรหัส ในหมู่พวกเขา เราระบุยีนสองตัวที่เกี่ยวข้องกับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพ (4-คูมาเรต โคเอ็นไซม์ A ลิเกสและซินนาเมต 4-ไฮดรอกซีเลส) และปัจจัยการถอดรหัสชนิด WRKY สองตัว การแสดงออกของยีนที่เลือกหลังจากการบำบัดด้วย H2O2 ถูกวิเคราะห์โดย RT-qPCR การถอดความ PeG . ที่เพิ่มขึ้นในช่วงต้น(phenylethanoidไกลโคไซด์)ยีนเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพหลังการรักษาพบว่า H2O2 กระตุ้น PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพด้วยการควบคุมยีนที่สำคัญของมัน
คำหลักเพิ่มเติม: ซินนาเมต-4-ไฮดรอกซีเลส, 4-คูมาเรต โคเอ็นไซม์ A ลิเกส, การยับยั้งไฮบริไดเซชันแบบลบล้างCistancheซัลซ่า. phenylethanoidไกลโคไซด์

บทนำ

Cistancheซัลซ่าเป็นปรสิตพืชยืนต้นบนรากของ Haloxylos ammodendrun และเติบโตในพื้นที่ทะเลทรายทางตะวันตกของจีน เป็นเวลาหลายศตวรรษCistancheได้ถูกนำมาใช้เป็นยาสมุนไพรพื้นบ้าน (Wang et al. 2012) ส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพคือphenylethanoidไกลโคไซด์(PeGs) ซึ่งมีผลอย่างน่าทึ่งต่อการขจัด reactive oxygen species (ROS) การป้องกันรังสี การเพิ่มภูมิคุ้มกัน และการต่อต้านริ้วรอย (Nan et al. 2013) PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในCistancheเริ่มต้นจากฟีนิลอะลานีน (รูปที่ 1 Suppl.) และกรดคาเฟอีนที่สังเคราะห์ขึ้นจะถูกไกลโคซิเลตเพิ่มเติมเพื่อสร้าง PeGs ต่างๆ(phenylethanoidไกลโคไซด์)(วัง et al. 2012). PeG หลักสามตัว(phenylethanoidไกลโคไซด์), echinacoside, acteoside และ 2'-acetylacteoside ถือเป็นส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์มากที่สุดในCistanche(โคบายาชิ et al. 1984). เพื่อที่จะปรับปรุงเนื้อหาของพวกเขาในCistancheการเพาะเลี้ยงเซลล์ สารกระตุ้นต่างๆ ได้รับการทดสอบแล้ว รวมทั้งไคโตซาน พูเทรสซีน Ag plus และความเครียดออสโมติก (Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu and Cheng 2008) อย่างไรก็ตาม ยีนที่เกี่ยวข้องกับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในCistancheยีนเส้นทางเมแทบอลิซึมของฟีนิลอะลานีนส่วนใหญ่มักไม่ค่อยถูกระบุ phenylalanine ammonia-lyase (PAL) ที่เข้ารหัสยีนเพิ่งถูกระบุใน Cistanche deserticola (Hu et al. 2011) การเข้ารหัสยีนอื่นๆ เช่น ซินนาเมต-4-ไฮดรอกซีเลส (C4H) ซึ่งสามารถเร่งการเปลี่ยนแปลงของซินนาเมตไปเป็นกรดคูมาริก และ 4-คูมาเรตโคเอ็นไซม์เอ ลิเกส (4CL) ซึ่งเป็นยีนที่จำเป็นสำหรับลิกนินและฟลาโวนอยด์ biosyntheses ไม่พบในCistanche.
เราใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์ของCistancheซัลซ่าเรียน PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพและการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้อง เรายังตรวจสอบผลกระทบของตัวกระตุ้น H2O2 ที่มีประสิทธิภาพต่อ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพ นอกจากนี้ เพื่อค้นหายีนที่ตอบสนองในระยะแรกที่เกี่ยวข้องกับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพ เราดำเนินการปราบปรามการผสมข้ามพันธุ์ (SSH) เพื่อสร้างไลบรารี cDNA ของยีนที่ตอบสนองต่อ H2O2-

รูปที่ 1. การแสดงออกของยีนสัมพัทธ์ที่กำหนดโดย RT-qPCR หลังการบำบัด H2O2 CsWRKY1 - ปัจจัยการถอดรหัส WRKY (Contig07), CsC4H1 - ซินนาเมต 4-ไฮดรอกซีเลส (Contig09), Cs4CL1 - 4-คูมาเรต: ลิเกส (Contig03), CsHSP1 - โปรตีนช็อตด้วยความร้อน 70 kDa (Contig 01) และ CsSOD1 - ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (Contig16) เซลล์ถูกบำบัดด้วย 80 ug dm-3 H2O2 ในตัวกลางที่เป็นของเหลวเป็นเวลา 2 ชั่วโมงและเปรียบเทียบการแสดงออกกับกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วยน้ำ หมายถึงบวก - SD ของการทำซ้ำทางชีวภาพสามครั้ง * - พี < 0.05,="" **="" -="" พี=""><>

วัสดุและวิธีการ

สายเซลล์ CS2001 ถูกสร้างขึ้นจากกลีบของCistancheซัลซ่า(CA Mey.) เบ็ครวบรวมที่จังหวัด Neimenggu และเพาะเลี้ยงย่อย วิธีการเพาะเลี้ยงคล้ายกับโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Liu et al. 2007) โดยทั่วไป สื่อที่เป็นของแข็ง Murashige และ Skoog (1962; MS) ถูกใช้สำหรับวัฒนธรรมย่อยและสื่อที่เป็นของเหลวสำหรับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพ (เป็นสื่อ MS ดัดแปลงที่เสริมด้วย 30 g dm-3 กลูโคสและ 2.0 มก. dm-3 อินโดล-3-กรดอะซิติก) สำหรับการบำบัดด้วย H2O2 เซลล์ 5.0 ± 0.2 กรัมในช่วงการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว โดยปกติ 20 ถึง 30 วันหลังจากที่พวกมันถูกเพาะเลี้ยงย่อยในตัวกลางที่เป็นของแข็ง ถูกฉีดวัคซีนลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวขนาด 50 ซม.3 ในขวดรูปชมพู่ขนาด 250 ซม.3 และเพาะเลี้ยงในที่มืดโดยมีหรือไม่มีความเข้มข้นของ H2O2 ต่างกัน PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)เนื้อหาหลังจากการเหนี่ยวนำ 10 วันโดย H2O2 ถูกวิเคราะห์ตามวิธีการที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Liu et al. 2007) โดยอิงจากโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบย้อนกลับเฟสที่มีการชะเกรเดียนท์ของเมทานอล

เซลล์ 2 ชั่วโมงหลังการบำบัดด้วย H2O2 ถูกรวบรวมจากสื่อโดยกระดาษกรองโดยใช้กรวยบุชเนอร์ จากนั้นเซลล์เหล่านั้นถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและบดเป็นผง ทุก ๆ 2 กรัมของผงเซลล์ถูกสลายโดยใช้ของผสมของ 1 cm3 ของ 2-mercaptoethanol, 1 cm3 ของ 200 g dm{{10}} sarcosyl, และ 8 cm3 ของบัฟเฟอร์ GTC (5 M guanidinium isothiocyanate, 62.5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6.25 mM EDTA, pH 8.0, 5 mM thiourea และ 10 mM dithiothreitol) จากนั้น เซลล์ถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาที จากนั้นปริมาตร 1/3 ของ 8.5 โมลาร์ CH3COOK, pH 6.0 ถูกเติม และเซลล์ถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาที และจากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 15 000 กรัม เป็นเวลา 15 นาที . ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเติมลงในปริมาตรที่เท่ากันของไอโซโพรพานอลเพื่อตกตะกอน RNA ทั้งหมด RNA ทั้งหมดถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมโดย RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต Messenger RNA แยกได้จาก RNA ทั้งหมดโดยใช้ Oligotex mRNA midi kit (Qiagen)

phenylethanoidไกลโคไซด์ในCistancheซัลซ่า

ไลบรารี SSH ถูกสร้างขึ้นจากกลุ่มควบคุมและ 30 เปอร์เซ็นต์ H2O2-กระตุ้นตัวอย่างเซลล์ 2 ชั่วโมงหลังจากการขับออกโดยใช้ชุดลบ cDNA ที่เลือก PCR (Clontech, Mountain View, USA) สำหรับการสร้างห้องสมุด ผลิตภัณฑ์ถูกทำให้บริสุทธิ์แยกกันโดยใช้ชุดเจลทำให้บริสุทธิ์ (Qiagen) และโคลนเป็นเวกเตอร์ pGEM โดยใช้ชุดโคลน TA (เทียนเกน ปักกิ่ง จีน) พลาสมิดจากโคลนอิสระถูกแยกออกและจัดลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ T7 ลำดับแท็กลำดับที่แสดงออก (EST) ทั้งหมดจากไลบรารี (โดยที่เอาลำดับเวกเตอร์ออก) ถูกใช้สำหรับการประกอบ contig ด้วย CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) ESTs ถูกจัดกลุ่มเป็น contigs และ singletons; ใช้สำหรับการค้นหาแบบเดียวกันโดยใช้โปรแกรม BLASTx ที่ NCBI (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov) จากนั้น ลำดับจะถูกทำหมายเหตุประกอบ วิเคราะห์ และจำแนกตามข้อกำหนดของยีนออนโทโลจี (GO) โดยใช้ Blast2GO (http://www. blast2go.com)
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (RT-qPCR) ถูกดำเนินการตาม Bustin และคณะ (2009). ตัวอย่าง cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ชุดรีเอเจนต์ PrimeScript RT (ตาการา ต้าเหลียน จีน) จาก RNA ทั้งหมด 0.5 ไมโครกรัม RT-qPCR ดำเนินการโดยใช้ SYBR Premix Ex Taq II และ ROX plus kits (Takara) ในระบบ PCR แบบเรียลไทม์ของ ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA) โดยมีการจำลองทางเทคนิคสามแบบ ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer3 ออนไลน์ตามคำแนะนำของ Takara; ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงไว้ในตารางที่ 1 Suppl การแสดงออกของยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น 18S RNA ซึ่งการแสดงออกนั้นคงที่ในตัวอย่างทั้งหมด

วิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้ R เวอร์ชัน 3.1.1 ความสำคัญของความแตกต่างได้รับการตรวจสอบโดยการทดสอบ t ของนักเรียน

ผลลัพธ์

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ทำให้เกิดการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PeGs หลักทั้งสามตัว(phenylethanoidไกลโคไซด์)ในCistancheซัลซ่าเซลล์แขวนลอย (ตารางที่ 1) แต่ไม่มีผลที่ชัดเจนต่อการเติบโตของเซลล์ (รูปที่ S2) เนื้อหาของ echinacoside เพิ่มขึ้นแล้วหลังจากการรักษาด้วย H2O2 10 ug dm-3 H2O2 (P < 0.05)="" พบว่ามีการเพิ่มขึ้นหลังจาก="" 20="" ug="" dm="" -3="" การบำบัดด้วย="" h2o2="" (p="">< 0.01)="" และการเพิ่มขึ้นสูงสุดคือหลังการรักษา="" h2o2="" ขนาด="" 40,="" 80="" และ="" 160="" ug="" dm-3="" ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันถูกแสดงสำหรับแอกทีโอไซด์="" แต่เนื้อหาของแอกทิโอไซด์มีจุดสูงสุดหลังจากการบำบัดด้วย="" h2o2="" ขนาด="" 80="" ug="" dm-3="" การสังเคราะห์ทางชีวภาพของ="" 2'-อะซิติแลคติโอไซด์มีความไวต่อการบำบัด="" h2o2="" น้อยกว่า;="" ปริมาณที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.05)="" อยู่ที่ความเข้มข้นของ="" h2o2="" มากกว่า="" 40="" ug="" dm-3="" หลังการรักษา="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2="" จำนวน="" peg="">(phenylethanoidไกลโคไซด์)เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.01)="" เหนือการควบคุม="">
เพื่อสร้างห้องสมุดที่สมบูรณ์สำหรับยีนที่ตอบสนองในระยะแรกซึ่งควบคุมโดย H2O2 เราใช้ cDNA จากCistancheซัลซ่าเซลล์แขวนลอยที่บำบัดด้วย 80 ug dm-3 H2O2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การหาลำดับแบบผ่านครั้งเดียว 129 สำเนาพันธุ์ลูกผสมในคลัง SSH ให้ผล EST ที่สะอาด 105 ตัวหลังจากการยกเว้นลำดับเวกเตอร์ ESTs ที่ชัดเจนเหล่านี้ใช้สำหรับการประกอบโดย CAP3 และสร้าง 18 contigs และ 67 singletons (ตารางที่ 2) ดังนั้น 85 ยีนจึงถูกแยกออกในห้องสมุดนี้ ความยาวเฉลี่ยของ EST ที่สะอาด 105 คือ 527 bp ซึ่งเพียงพอสำหรับการจำแนกการทำงานตามความคล้ายคลึงกันตามลำดับ

phenylethanoidไกลโคไซด์ในCistancheซัลซ่า

BLASTx ดึงยีนทั้งหมด 85 ยีนที่ได้รับในห้องสมุดเทียบกับฐานข้อมูลโปรตีนที่ไม่ซ้ำซ้อนของ GenBank สำหรับความคล้ายคลึงของลำดับ (ค่า E น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001) ยีน 21 ยีนไม่พบการฮิตในฐานข้อมูล ยีนเหล่านี้อาจเฉพาะเจาะจงกับCistancheซัลซ่า. ผลลัพธ์ด้วย BLASThits ถูกนำเข้าไปยังซอฟต์แวร์ Blast2GO สำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มประสิทธิภาพของ GO และ KEGG จากยีน 64 ยีนที่มีการโจมตี BLAST มี 50 ยีนที่มีคำอธิบายประกอบตามคำอธิบายของยีนที่คล้ายคลึงกันจากสปีชีส์อื่น ยีนที่มีคำอธิบายประกอบได้รับการตั้งชื่อตามคำอธิบายของการโจมตี BLAST การวิเคราะห์ GO (รูปที่ 3 Suppl.) แสดงให้เห็นว่าใน 50 ยีนเหล่านี้ มี 14 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อสิ่งเร้า และยีนมากกว่า 30 ยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเผาผลาญ (ตารางที่ 1 และ 2) ในบรรดายีนเหล่านี้ โฮโมล็อกของยีนวิถีการสังเคราะห์ทาง PeG สองตัวถูกแยกออกตามที่คาดไว้: 4-coumarate coenzyme A ligase (ชื่อ Cs4CL1: Contig03) และ cinnamate 4-hydroxylase (ชื่อ CsC4H1: Contig14) นอกจากนี้ RT-qPCR ถูกดำเนินการเพื่อยืนยันการแสดงออกที่เหนี่ยวนำให้เกิดของยีนจากคลังหลังการบำบัด H2O2

เพื่อยืนยันว่ายีนที่จำเป็นที่ระบุจากไลบรารี SSH นั้นตอบสนองต่อการบำบัดด้วย H2O2 การแสดงออกของ PeG สองตัว(phenylethanoidไกลโคไซด์)ยีนที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพ (Cs4CL1, CsC4H1), ยีนที่เหนี่ยวนำโดย ROS สองตัว (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099) และยีนคล้ายปัจจัยการถอดรหัสของตระกูล WRKY (CsWRKY1: Contig 07) หนึ่งตัวถูกวัดโดย RT-qPCR หลังการรักษา ด้วย H2O2 (รูปที่ 1) นิพจน์ CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 และ CsWRKY1 ได้รับการควบคุมมากกว่า 15-เท่า, 3-เท่า, 45-เท่า และ 4-เท่า ตามลำดับ 2 ชั่วโมงหลังจาก H2O2 การรักษา. การแสดงออกของ CsHSP1 เปลี่ยนแปลงเพียง 1.8 เท่าหลังการบำบัด H2O2
ระยะเวลาในการแสดงออกของ CsWRKY1, CsC4H1 และ Cs4CL1 หลังการบำบัด H2O2 ถูกวิเคราะห์เพิ่มเติมโดย RT-qPCR (รูปที่ 2) การแสดงออกของ CsC4H1 และ Cs4CL1 เพิ่มขึ้นอย่างมาก (มากกว่า 80-เท่าและ 50-เท่าตามลำดับ) หลังการบำบัด 16-ชม. และจากนั้นปรับลดหลังจาก 32 ชั่วโมง นิพจน์ของ CsWRKY1 ได้รับการควบคุมมากกว่า 20-เท่าในเวลา 4 ชั่วโมง แล้วลดลงจาก 8 ชั่วโมงหลังจากนั้น (รูปที่ 2)

รูปที่ 2 การแสดงออกสัมพัทธ์ของ CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) และ Cs4CL1 (C) ในช่วงเวลาที่ต่างกันหลังการรักษาด้วย 80 ug dm-3 H2O2 นิพจน์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับกลุ่มควบคุม (บำบัดด้วยน้ำ). หมายถึงบวก - SD ของการทำซ้ำทางชีวภาพสามครั้ง * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

การอภิปราย

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสารกระตุ้นพืชที่รู้จักกันดีซึ่งแสดงผลต่างๆ ต่อพืช เช่นเดียวกับ ROS มันสามารถกระตุ้นระบบกำจัด ROS ซึ่งประกอบด้วย superoxide dismutase, catalase, peroxidases ฯลฯ และทำหน้าที่เป็นสัญญาณปลายน้ำของเกลือ osmotic และการคายน้ำ

ความเครียด (Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014) มีข้อเสนอแนะว่าการสร้าง H2O2 ในพืชนั้นมาพร้อมกับการเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ทางเมตาบอไลต์ทุติยภูมิในCistancheซัลซ่าการเพาะเลี้ยงเซลล์ ตามที่คาดไว้ ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่า PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในซิสแทนเช่ ซัลซ่าการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกชักนำหลังจากการบำบัดด้วย H2O2 (ตารางที่ 1) เนื้อหาของ PeG หลักสามตัว(phenylethanoidไกลโคไซด์)เพิ่มขึ้นหลังจากการบำบัดด้วย H2O2 ซึ่งบ่งชี้ว่ามีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PeGs ยีนที่ได้รับการเสริมสมรรถนะในไลบรารี SSH ชี้ให้เห็นถึงผลกระทบต่อ PeGs . เพิ่มเติม(phenylethanoidไกลโคไซด์)การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ทางชีวภาพในซิสแทนเช่ ซัลซ่า.

ยีนที่ตอบสนองต่อ H2O2-ที่รู้จักมากมาย เช่น ascorbate peroxidase (CISTH069, Karyotou และ Donaldson 2005), h-quinone oxidoreductase (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 2014), และยีนตอบสนองการดื้อต่อโรค (Contig10, Nanda, et al. 2010) ได้รับการเสริมสมรรถนะในไลบรารี SSH (ตารางที่ 3 ตารางที่ 2 Suppl.) ยีนที่ตอบสนองต่อ ROS ทั่วไปเหล่านี้บางตัวที่มีการแสดงออกที่เหนี่ยวนำหลังจากการบำบัดด้วย H2O2 ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดย RT-qPCR (รูปที่ 1 และ 2) ซึ่งบ่งชี้ว่าไลบรารี SSH ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมถูกสร้างขึ้นที่นี่ ยีนเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพ PeG สองตัว, CsC4H1 และ Cs4CL1 ยังพบในคลังนี้และการแสดงออกของยีนสองตัวนี้ถูกเหนี่ยวนำโดยการบำบัด H2O2 ในลักษณะที่ขึ้นกับเวลา (รูปที่ 2) แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย H2O2 ทำให้เกิด PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในระดับพันธุกรรมผ่านการควบคุมยีนวิถีทาง PAL อย่างไรก็ตาม PAL และยีนสังเคราะห์ PeGs ปลายน้ำอื่นๆ (Wang et al. 2012) ไม่ได้ระบุในไลบรารี SSH อาจเป็นเพราะห้องสมุดไม่ได้จัดลำดับอย่างเพียงพอ ความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกที่เหนี่ยวนำโดย CsC4H1 และ Cs4CL1 และการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PeG ที่เพิ่มขึ้นหลังการบำบัดด้วย H2O2 ควรได้รับการชี้แจงโดยการวิเคราะห์เพิ่มเติม

นอกเหนือจากยีนทางเดิน PAL ที่เหนี่ยวนำโดยการบำบัดด้วย H2O2 แล้ว ยังพบปัจจัยการถอดรหัสแฟมิลี WRKY สองตัว (CsWRKY1, CsWRKY2) ในไลบรารี SSH (ตารางที่ 3 และตารางที่ 2 Suppl.) และการแสดงออกที่เหนี่ยวนำด้วย CsWRKY1 ได้รับการยืนยันโดย RT-qPCR . การแสดงออกของมันตอบสนองต่อการบำบัด H2O2 เร็วกว่าการแสดงออกของยีน PAL pathway สองยีน Cs4CL1 และ CsC4H1 (รูปที่ 2) จากการศึกษาก่อนหน้านี้ มีการสังเกตการแสดงออกร่วมของปัจจัยการถอดรหัส WRKY และยีนทางเดิน PAL ในข้าว (Gupta et al. 2012) นอกจากนี้ การแสดงออกของยีน PAL ยังได้รับการควบคุมใน OsWRKY03 over-expression mutant (Liu et al. 2005) ปัจจัยการถอดรหัสครอบครัว WRKY สองประการที่กล่าวถึงข้างต้นอาจเกี่ยวข้องกับ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในCistancheซัลซ่า. สิ่งที่น่าสนใจคือ พบ ESTs ที่เกี่ยวข้องกับการคายน้ำ (CISTH067, CISTH064) ในไลบรารี SSH ซึ่งอาจแนะนำว่าการบำบัดด้วย H2O2 เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีนที่ตอบสนองต่อการคายน้ำในCistancheซัลซ่าตามที่สังเกตได้ในพืชชนิดอื่น (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013) ยีนที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณจิบเบอเรลลิน (GA) หนึ่งยีนที่มีลักษณะคล้ายตัวรับจิบเบอเรลลิน gid1b (CISTH092) ถูกระบุในคลัง SSH ซึ่งบอกเป็นนัยถึงการเชื่อมต่อของการส่งสัญญาณ GA และการบำบัดด้วย H2O2 ในCistancheซัลซ่าซึ่งมีรายงานในข้าวบาร์เลย์ด้วย (Bahin et al. 2011) อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันว่ายีนเหล่านี้เกี่ยวข้องกับ PeGs . หรือไม่(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพ นอกเหนือจากยีนที่กล่าวถึงข้างต้น ไลบรารี SSH ที่สร้างขึ้นที่นี่ยังนำเสนอยีนที่มีหรือไม่มี BLAST hits ช่วยเพิ่มความเข้าใจของเราเกี่ยวกับผลกระทบของ H2O2 ต่อ C. salsa และให้ข้อมูลยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ PeGs ก่อน

โดยสรุป เราได้ประเมินผลกระทบของ H2O2 ต่อ PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การเหนี่ยวนำในCistancheซัลซ่าการเพาะเลี้ยงเซลล์ คลัง SSH ถูกสร้างขึ้นหลังจากการบำบัดด้วย H2O2 และการแสดงออกของยีนที่เลือกได้รับการยืนยันโดย RT-qPCR ยีนที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสังเคราะห์ด้วย PeG สองยีนและยีนที่ตอบสนองต่อ H2O2-ยีนอื่นๆ ถูกระบุ การค้นพบนี้จะขยายความเข้าใจของเราเกี่ยวกับ H2O2-ที่ถูกเหนี่ยวนำโดย PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การสังเคราะห์ทางชีวภาพในCistancheซัลซ่าในระดับโมเลกุล โดยให้ข้อมูลสำหรับการจัดการยีนของCistancheซัลซ่าการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อปรับปรุง PeGs(phenylethanoidไกลโคไซด์)การผลิต.

จาก: ' การระบุ EST ที่ตอบสนองต่อไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางไกลโคไซด์ของฟีนิลทานอยด์ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ Cistanche salsa' โดยเจ. เฉิน et al.

--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN และคณะ DOI: 10.1007/s10535-015-0541-ปี

อ้างอิง

Bahin, E. , Bailly, C. , Sotta, B. , Kranner, I. , Corbineau, F. , Leymarie, J.: Crosstalk ระหว่างสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยาและเส้นทางการส่งสัญญาณของฮอร์โมนควบคุมการพักตัวของเมล็ดพืชในข้าวบาร์เลย์ - สภาพแวดล้อมของเซลล์พืช 34: 980-993, 2011.
Baruah, K. , Norouzitallab, P. , Linayati, L. , Sorgeloos, P. , Bossie,r P.: ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาที่เกิดจากผลิตภัณฑ์กระตุ้นโปรตีนช็อตด้วยความร้อน (Hsp) มีส่วนช่วยในการผลิต Hsp70 และ Hsp{{1} }ภูมิคุ้มกันป้องกันที่เป็นสื่อกลางใน Artemia franciscana กับ vibrios ที่ทำให้เกิดโรค - เดฟ คอมพ์ อิมมูนอล 46: 470-479, 2014.
Bello, RI, Gomez-Diaz, C., Navarro, F., Alcain, FJ, Villalba, JM: การแสดงออกของ NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 ในเซลล์ HeLa  บทบาทของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และระยะการเจริญเติบโต - เจ. ไบโอล. เคมี. 276: 44379-44384, 2001.
Bustin, SA, Vandesompele, J. , Pfaffl, MW: การกำหนดมาตรฐานของ qPCR และ RT-qPCR - ยีนต์ อังกฤษ เทคโนโลยีชีวภาพ ข่าว 29: 40-43, 2009.
Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., N, I W., Liu, CZ:Cistancheวัฒนธรรมการแขวนลอยของเซลล์ Deserticola:phenylethanoidไกลโคไซด์การสังเคราะห์ทางชีวภาพและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ - กระบวนการไบโอเคมี 40: 3119-3124, 2005.
Cheng, XY, Zhou, HY, Cui, X., Ni, W., Liu, CZ การปรับปรุงphenylethanoidไกลโคไซด์การสังเคราะห์ทางชีวภาพในCistancheการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย Deserticola โดยไคโตซานอิลิซิเตอร์ - เจ. ไบโอเทคโนล. 121: 253-260, 2006.
Furlan, A. , Llanes, A. , Luna, V. , Castro, S.: กรด Abscisic ไกล่เกลี่ยการผลิตไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในถั่วลิสงที่เกิดจากความเครียดจากน้ำ - ไบโอล. ปลูก. 57: 555-558, 2013.
Gupta, SK, Ra,i AK, Kanwar, SS, Chand, D., Singh, NK, Sharma, TR: Pi54 ยีนต้านทานการระเบิดที่ใช้งานได้เพียงตัวเดียวกระตุ้นกลไกการป้องกันที่ซับซ้อนในข้าว - เจ ประสบการณ์ บอท. 63: 757-772, 2012.
Hu, GS, Jia, JM, Hur, YJ, Chung, YS, Lee, JH, Yun, DJ, Chung, WS, Yi, GH, Kim, TH, Kim, DH: ลักษณะทางโมเลกุลของยีน phenylalanine ammonia-lyase จากCistancheทะเลทราย - โมล ไบโอล. ตัวแทน 38: 3741-3750, 2011.
Kar, RK: พืชตอบสนองต่อความเครียดจากน้ำ: บทบาทของชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา - พฤติกรรมสัญญาณพืช 6: 1741-1745, 2011.
Karyotou, K. , Donaldson, RP: Ascorbate peroxidase ผู้เก็บขยะไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในเยื่อ glyoxysomal - อาร์คเอช ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ 434: 248-257, 2005.
Kobayashi, H. , Karasawa, H. , Miyase, T. , Fukushima, S.: การศึกษาองค์ประกอบของcistancheคือเฮิร์บ 4. การแยกและโครงสร้างของฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์ใหม่ 2 ชนิด ซิสตาโนไซด์-ซี และซิสตาโนไซด์-ดี - เคมี. เภสัช. วัว. 32: 3880-3885, 1984.

Liu, CZ, Cheng, XY: การเพิ่มประสิทธิภาพของphenylethanoidไกลโคไซด์การสังเคราะห์ทางชีวภาพในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของCistancheDeserticola โดยความเครียดออสโมติก - Plant Cell Rep. 27: 357-362, 2008.
Liu, JY, Guo, ZG, Zeng, ZL: ปรับปรุงการสะสมของphenylethanoidไกลโคไซด์โดยการป้อนสารตั้งต้นสู่การเลี้ยงแบบแขวนลอยของCistancheซัลซ่า. - ไบโอเคม อังกฤษ จ. 33: 88-93, 2007.
Liu, XQ, Bai, XQ, Qian, Q., Wang, XJ, Chen, MS, Chu, CC: OsWRKY03, ตัวกระตุ้นการถอดรหัสข้าวที่ทำหน้าที่ในเส้นทางส่งสัญญาณการป้องกันต้นน้ำของ OsNPR1 - ความละเอียดของเซลล์ 15: 593-603, 2005.
Murashige, T. , Skoog, F.: สื่อที่แก้ไขสำหรับการเติบโตอย่างรวดเร็วและการวิเคราะห์ทางชีวภาพด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อยาสูบ - ฟิสิออล ปลูก. 15: 473-497, 1962.
น่าน ZD เซง KW Shi, SP, Zhao, MB, Jiang, Y. , Tu, PF:ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ด้วยฤทธิ์ต้านการอักเสบจากลำต้นของCistancheDeserticola เพาะเลี้ยงในทะเลทรายทาริม - Fitoterapia 89: 167-174, 2013.
Nanda, AK, Andrio, E. , Marino, D. , Pauly, N. , Dunand, C.: ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาระหว่างปฏิกิริยาระหว่างพืชกับจุลินทรีย์ในช่วงต้น - เจ อินทิกร์ ไบโอลพืช. 52: 195-204, 2010.
Ouyang, J. , Wang, XD, Zhao, B. , Wang, YC: ปรับปรุงการผลิตของphenylethanoid ไกลโคไซด์โดยการป้อนสารตั้งต้นในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของCistancheทะเลทราย - กระบวนการไบโอเคมี 40: 3480-3484, 2005a.
Ouyang, J. , Wang, XD, Zhao, B. , Wang, YC: ปรับปรุงการผลิตของphenylethanoidไกลโคไซด์โดยCistancheเซลล์ Deserticola ที่เพาะเลี้ยงในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบวงในของ airlift พร้อมด้วยตัวยกตะแกรง - เอ็นไซม์ ไมโครไบโอล เทค 36: 982-988, 2005b.
Salcedo-Morales, G. , Jimenez-Aparicio, AR, Cruz-Sosa, F. , Trejo-Tapia, G.: ลักษณะทางกายวิภาคและฮิสโตเคมีของ in vitro haustorium จากรากของ Castilleja tenuiflora - ไบโอล. ปลูก. 58: 164-168, 2014.
Sathiyaraj, G. , Srinivasan, S. , Kim, YJ, Lee, OR, Parvin, S. , Balusamy, SR, Khorolragchaa, A., Yang, DC: การเคยชินของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ช่วยเพิ่มความทนทานต่อเกลือโดยการกระตุ้นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันใน โสม Panax CA เมเยอร์ - โมล ไบโอล. ตัวแทน 41: 3761-3771, 2014.
Schmidt, R., Mieulet, D., Hubberten, HM, Obata, T., Hoefgen, R., Fernie, AR, Fisahn, J., Segundo, BS, Guiderdoni, E., Schippers, JHM, Mueller-Roeber, B.: SALTRESPONSIVE ERF1 ควบคุมการส่งสัญญาณที่ขึ้นกับชนิดของออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาระหว่างการตอบสนองเบื้องต้นต่อความเครียดจากเกลือ
ในข้าว - Plant Cell 25: 2115-2131, 2013.
Wang, T., Zhang, XY, Xie, WY:CistancheDeserticola YC Ma "โสมทะเลทราย": บทวิจารณ์ - อาเมอร์ เจ.ชิน. เมดิ. 40: 1123-1141, 2012.
Wi, SG, Chung, BY, Kim, JH, Lee, KS, Kim, JS รูปแบบการสะสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในฝักข้าวภายใต้ความเครียดจากเกลือ - ไบโอล. ปลูก. 50: 469-472, 2006.
Zhou, XF, Jin, YH, Yoo, CY, Lin, XL, Kim, WY, Yun, DJ, Bressan, RA, Hasegawa, PM, Jin, JB: CYCLIN H1 ควบคุมการตอบสนองความเครียดจากภัยแล้งและการเปิดปากใบที่เกิดจากแสงสีฟ้าโดย ยับยั้งการสะสมของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยาใน Arabidopsis - พืช Physiol. 162: 1030-1041, 2013.