ภาวะอุณหภูมิต่ำกว่าปกติที่เกิดจาก Oxcarbazepine หลังจากภาวะสมองขาดเลือดชั่วคราวออกแรงปกป้องระบบประสาทเพื่อการรักษาผ่านศักยภาพของตัวรับชั่วคราว Vanilloid ประเภท 1 และ 4 ใน Gerbils ตอนที่ 3
Jul 26, 2024
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. สัตว์ทดลอง
หนูเจอร์บิลตัวผู้ (จำนวนทั้งหมด=252) ถูกนำมาใช้เมื่ออายุ 6 เดือน (น้ำหนักตัว 63–78 กรัม) หนูเจอร์บิลได้รับการอบรมในศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแห่งชาติคังวอน (ชุนชอน ประเทศเกาหลี)
เจอร์บิลเป็นสัตว์ตัวน้อยที่น่ารักมาก พวกเขาอาศัยอยู่ในพื้นที่ทะเลทราย ขุดถ้ำเก่ง และมีสัญชาตญาณที่แข็งแกร่งในการเก็บและหาอาหาร ในบรรดาเจ้าตัวน้อยเหล่านี้ หนูเจอร์บิลตัวผู้มีความจำที่ดีเป็นพิเศษ ซึ่งทำให้ผู้คนอยากรู้ความลับของพวกเขา
ประการแรก เมื่อหนูเจอร์บิลตัวผู้มองหาอาหาร พวกมันจะใช้ชุดสัญญาณต่างๆ เช่น จุดสังเกตและภูมิประเทศ เพื่อกำหนดทิศทาง ผ่านการสังเกตและการปฏิบัติมาเป็นเวลานาน พวกเขาได้สร้าง "ระบบสารสนเทศทางภูมิศาสตร์" ของตนเองขึ้นมา ในทางตรงกันข้าม หนูเจอร์บิลตัวเมียมีความจำที่แย่กว่าสำหรับสัญญาณเหล่านี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสภาพแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลา
ประการที่สองหนูเจอร์บิลตัวผู้ยังแสดงความทรงจำที่แข็งแกร่งเมื่อต่อสู้กับศัตรูธรรมชาติ ตามที่นักวิทยาศาสตร์กล่าวว่าเมื่อหนูเจอร์บิลถูกคุกคาม พวกมันจะเข้าไปในโพรงอย่างรวดเร็วและพยายามหลบหนี แต่เมื่อเผชิญกับภัยคุกคามแบบเดียวกัน หนูเจอร์บิลตัวผู้จะจดจำรูปแบบการโจมตีของศัตรูธรรมชาติและหลีกเลี่ยงพวกมัน เพิ่มโอกาสในการเอาชีวิตรอด
สุดท้ายแล้ว ความทรงจำของหนูเจอร์บิลตัวผู้ก็อยู่ที่พฤติกรรมทางสังคมของพวกมันที่มีต่อกันด้วย หนูเจอร์บิลแต่ละตัวมีกลิ่นเฉพาะตัว เมื่อพวกเขาพบกับหนูเจอร์บิลตัวอื่น พวกเขาจะใช้ประสาทสัมผัสในการดมกลิ่นเพื่อระบุตัวตนและสถานะของกันและกัน ความสามารถในการจดจำนี้ไม่เพียงแต่ทำให้หนูเจอร์บิลสามารถสร้างการเชื่อมต่อทางสังคมที่ค่อนข้างเสถียร แต่ยังเป็นการรับประกันที่สำคัญสำหรับการสืบพันธุ์อีกด้วย
โดยสรุป ความสัมพันธ์ระหว่างหนูเจอร์บิลตัวผู้กับความทรงจำแยกจากกันไม่ได้ ในกระบวนการแสวงหาความอยู่รอดและการสืบพันธุ์ในธรรมชาติ พวกมันอาศัยความทรงจำที่แข็งแกร่งในการปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมและพัฒนาตนเองอย่างต่อเนื่อง ในฐานะมนุษย์ เราควรเรียนรู้จากคนตัวเล็กเหล่านี้และฝึกฝนความทรงจำของเราอยู่เสมอเพื่อปรับตัวให้เข้ากับโลกที่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลานี้ได้ดียิ่งขึ้น จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำของเรา และ Cistanche ก็สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมากเพราะยังสามารถควบคุมความสมดุลของสารสื่อประสาท เช่น การเพิ่มระดับอะเซทิลโคลีนและปัจจัยการเจริญเติบโต ซึ่งมีความสำคัญมากต่อความจำและการเรียนรู้ นอกจากนี้ Cistanche ยังช่วยเพิ่มการไหลเวียนของเลือดและส่งเสริมการส่งออกซิเจน ซึ่งช่วยให้สมองได้รับสารอาหารและพลังงานที่เพียงพอ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความมีชีวิตชีวาและความอดทนของสมอง
คลิกรู้เพื่อเพิ่มพลังหน่วยความจำ
สำหรับการศึกษานี้ เกณฑ์วิธีการทดลองได้รับการอนุมัติ (หมายเลขอนุมัติ KW-200113-1; วันที่อนุมัติ 18 กุมภาพันธ์ 2020) โดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน
ระเบียบวิธีวิจัยปฏิบัติตามแนวทางที่แนะนำใน "กฎหมายและนโยบายระหว่างประเทศปัจจุบัน" ของแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง ซึ่งจัดพิมพ์โดย The National Academies Press (8th Ed., 2011)
4.2. กลุ่มการทดลอง การเหนี่ยวนำ tFI และการบำบัด HyT และ OXC
เพื่อพิสูจน์ผลการป้องกันของ OXC ต่อการบาดเจ็บที่ขาดเลือดตาม FI ในหนูเจอร์บิล หนูเจอร์บิลถูกแบ่งออกเป็นหกกลุ่ม: (1) กลุ่มเสแสร้ง+ยานพาหนะ (n=24);(2) กลุ่ม tFI+ยานพาหนะ (n {{5 }}); (3) กลุ่มเสแสร้ง+HyT (n=24); (4) กลุ่ม tFI+HyT (n=60);(5) กลุ่มเสแสม+OXC (200 มก./กก.) (n=24); และ (6) หมู่ tFI+OXC (n=60)
หนูเจอร์บิลเจ็ดและห้าตัวในกลุ่ม tFI สามกลุ่มถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตและการตรวจเนื้อเยื่อวิทยา ตามลำดับที่ 30 นาที, 12 ชั่วโมง, 1 วัน, 2 วัน และ 4 วันหลังการดำเนินการ tFI และในกลุ่มหลอกลวงทั้งสามกลุ่ม เจ็ดและห้ากลุ่ม หนูเจอร์บิลถูกนำมาใช้ที่ 30 นาทีและ 4 วันหลังจากการดำเนินการหลอกลวงเพื่อลดจำนวนให้เหลือน้อยที่สุด ในการทดลองนี้ tFI ได้รับการพัฒนาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [34]
กล่าวโดยสรุป คือ ให้ยาสลบเดอะเจอร์บิลด้วยไอโซฟลูเรน 2.5% (ในออกซิเจน 32% และไนตรัสออกไซด์ 68%) ภายใต้การดมยาสลบ หลอดเลือดแดงที่พบบ่อยทั้งสองถูกแยกออกจากปลอกหุ้มหลอดเลือดแดงคาโรติดและถูกปิดด้วยคลิปโป่งพอง (Yasargil FE 723K) (เอสคูแลป, ทัทลิงเกน, ประเทศเยอรมนี ) เป็นเวลาห้านาที
การหยุดส่งเลือดไปยังสมองอย่างสมบูรณ์แบบได้รับการยืนยันผ่านการสังเกตการไหลเวียนของเลือดแดงในหลอดเลือดแดงจอประสาทตาทั้งสอง (สาขาของหลอดเลือดแดงภายในหลอดเลือดแดงภายใน) โดยใช้กล้องตรวจตา (HEINE K180®) จาก Heine Optotechnik (Herrsching ประเทศเยอรมนี)
อุณหภูมิของร่างกายก่อนและระหว่างการผ่าตัดในทุกกลุ่มถูกควบคุมที่อุณหภูมิปกติ (37 ± 0.2 ◦C) โดยใช้ผ้าห่มเทอร์โมเมตริก หลังจากการบดบังเป็นเวลาห้านาที คลิปต่างๆ ก็ถูกลบออก
ในการศึกษานี้ มีการผ่าตัดหลอกโดยให้พวกเขาเข้ารับการผ่าตัด tFI เดียวกันโดยไม่มีการบดเคี้ยวของหลอดเลือดแดงคาโรติดร่วม HyT ในกลุ่ม sham+HyT และ tFI+HyT สองกลุ่มถูกควบคุม (คล้ายกับการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิร่างกายใน tFI+ OXC group) โดยการทำความเย็นทั้งร่างกายด้วยน้ำแข็งประคบเป็นเวลาหกชั่วโมง
อุณหภูมิร่างกายของกลุ่ม sham + OXC และ tFI + OXC สองกลุ่มถูกบันทึกเป็นเวลาหกชั่วโมงหลังจากการฉีดเข้าช่องท้องทันทีที่ 200 มก. / กก. OXC (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, USA) หลังจากการผ่าตัด tFI
ขนาดยาของ OXC ถูกเลือกตามการศึกษาวิจัยก่อนหน้านี้ที่รายงานว่า OXC ขนาด 200 มก./กก. ป้องกันการตายของเซลล์ในสมองได้อย่างมีประสิทธิภาพหลังจาก [36] เพื่อบันทึกการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิร่างกาย อุณหภูมิของร่างกายจะถูกวัดในช่องทวารหนักทุกๆ หนึ่งชั่วโมงหลังจาก tFI เกินกว่า เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ภายใต้อุณหภูมิห้องโดยรอบ (ประมาณ 22 ◦C)
หนูเจอร์บิลได้รับเวลาพักฟื้นสี่วันหลังจาก tFI เนื่องจากเซลล์เสี้ยมที่อยู่ในบริเวณ hippocampal CA1 เริ่มตายในสี่วันหลังจาก tFI [30,34,62]
4.3. การทดสอบ SMA
ทำการทดสอบ SMA เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของการสมาธิสั้นในทุกกลุ่ม โดยสรุป ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [63] การทดสอบ SMA เสร็จสิ้นในวันที่ 1 หลังจาก tFI เนื่องจากการเคลื่อนที่ไปถึงจุดสูงสุดในวันที่ 1 หลังจากได้รับบาดเจ็บจากการขาดเลือดหลังจาก tFI
หนูเจอร์บิลของทุกกลุ่มได้รับการปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมเป็นเวลาสองชั่วโมง และพวกมันถูกวางไว้ในกรงทุ่งโล่ง (กว้าง 44 ซม.; ยาว 44 ซม.; สูง 30) ได้มาจาก Ugo Basile SRL(Gemonio, Italy) โดยในแนวนอนขนานกันสองตัว ติดตั้งลำแสงอินฟราเรด 4 × 8 จากพื้นเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง SMA ได้รับการบันทึกโดยใช้ Photobeam Activity System-Home Cage จาก San Diego Instruments (ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)
การเคลื่อนไหว (วิถีและระยะทางที่เดินทางทั้งหมด) ถูกตรวจพบผ่านการหยุดชะงักของลำแสงอินฟราเรดที่เกิดจากโฟโตเซลล์
SMA ได้รับการตรวจสอบอย่างต่อเนื่องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง และข้อมูลถูกรวบรวมโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ AMB จาก IPC Electronics (คัมเบรีย สหราชอาณาจักร)
การรวบรวมข้อมูลเริ่มต้น 15 นาทีหลังจากความคุ้นเคยในกรงเปิด สุดท้าย ผลลัพธ์ที่ได้จะถูกประเมินเป็นระยะทาง (เมตร) ของการเคลื่อนไหวในช่วงทดสอบ (หนึ่งชั่วโมง)
4.4. การทดสอบฟังก์ชันทางปัญญา
4.4.1. แรมที
เพื่อเปรียบเทียบหน่วยความจำเชิงพื้นที่ในทุกกลุ่ม RAMT ได้ดำเนินการตามการศึกษาก่อนหน้านี้ [38,44] เขาวงกตแขนรัศมี 8- จาก Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA) ถูกนำมาใช้สำหรับการทดสอบนี้
เครื่องดนตรีเขาวงกตประกอบด้วยแท่นกลางและแขนแปดข้าง (ความกว้างแขนแต่ละข้าง 5 ซม. สูง 9 ซม. ยาว 35 ซม.) หนูเจอร์บิลถูกฝึกวันละครั้งเป็นเวลาสามวันก่อน
กล่าวคือ อาหารเม็ดที่ได้รับจาก DBL Co (ชุงบุค เกาหลี) จะถูกวางไว้ที่ส่วนปลายของแขนแต่ละข้าง และหนูเจอร์บิลแต่ละตัวก็ถูกวางบนแท่นกลาง หลังจากนั้น หนูเจอร์บิลก็มองหาอาหาร
หลังจากการดำเนินการหลอกลวงหรือ tFI การทดสอบจริงจะดำเนินการวันละครั้งเป็นเวลาสี่วัน โดยเริ่มจากหนึ่งวันหลังจากการดำเนินการ
สำหรับการวิเคราะห์ มีการประเมินจำนวนข้อผิดพลาด โดยเกิดข้อผิดพลาด 1 ครั้งทุกครั้งที่หนูเจอร์บิลเข้าไปในแขนที่มีการเยี่ยมชมมาก่อน การทดสอบเสร็จสิ้นเมื่อหนูเจอร์บิลกินอาหาร
4.4.2. กทท
เพื่อเปรียบเทียบหน่วยความจำระยะสั้นระหว่างกลุ่ม PAT ได้ดำเนินการตามวิธีที่รายงานก่อนหน้านี้ [64,65] พร้อมการแก้ไขบางอย่าง กล่าวโดยสรุป หนูเจอร์บิลได้รับการทดสอบโดยใช้ระบบหลีกเลี่ยงราศีเมถุน (GEM 392) จาก San Diego Instruments (ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ซึ่งประกอบด้วยสองช่อง (มืดและสว่าง) ที่สื่อสารกันผ่านประตูเลื่อนแนวตั้ง
ช่วงการทดลองดำเนินการในสองขั้นตอน: ช่วงการฝึกอบรมและช่วงการทดสอบจริงดำเนินการหนึ่งวันก่อนและสี่วันหลังจาก tFI หรือการปฏิบัติการหลอกลวง
การทดสอบจริงดำเนินการ 20 นาทีหลังเซสชั่นการฝึกอบรม โดยวัดเวลาแฝง (วินาที) ระหว่างอยู่ในห้องมืด กล่าวคือ ในช่วงฝึกซ้อม หนูเจอร์บิลได้รับอนุญาตให้สำรวจทั้งสองช่องอย่างอิสระเป็นเวลาหนึ่งนาทีในขณะที่ประตูถูกเปิด .
หลังจากนั้น เมื่อหนูเจอร์บิลเข้าไปในห้องมืด ประตูก็ปิดลง และหนูเจอร์บิลได้รับไฟฟ้าช็อตด้วยเท้า (0.5 mA) จากตะแกรงเหล็กบนพื้นเป็นเวลาห้าวินาที
ในเซสชั่นการทดสอบจริง ในวันที่ 4 หลังจาก tFI หนูเจอร์บิลถูกวางลงในช่องแสง และเวลาแฝงในช่องแสงถูกบันทึกก่อนเข้าสู่ช่องมืด
4.5. การวิเคราะห์ Western Blot สำหรับ TRPV1 และ TRPV4
เพื่อตรวจสอบระดับการแสดงออกของ TRPV1 และ TRPV4 ใน gerbil hippocampal CA1 เทคนิค Western blot ได้ดำเนินการตามวิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [66,67]
โดยสรุป ตามตารางเวลาที่กำหนด (30 นาที, 12 ชั่วโมง, 1 วัน, 2 วัน และ 4 วันหลังการผ่าตัดหลอกหรือ tFI) หนูเจอร์บิล (n=5 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ได้รับการดมยาสลบเพื่อการการุณยฆาตโดยการฉีดเข้าช่องท้องด้วย โซเดียมเพนโทบาร์บิทอล 200 มก./กก. (JW Pharm.Co., Ltd., โซล, เกาหลี)
หลังจากนั้น สมองของพวกเขาถูกเก็บเกี่ยวและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ (PBS, pH 7.4) ที่มีเอทิลีนไกลคอล-บิส 0.1 มิลลิโมลาร์ ( อะมิโนเอทิล อีเทอร์)-N, N, N{{ 11}}, กรดเอทิลีนไดอามีนเตตราอะซิติก (EGTA) N0- (pH 8.0), กรดเอทิลีนไดเอมีนเตตราอะซิติก (EDTA) 10- มิลลิโมลาร์ (pH 8.0), 0.2% โนนิเดต P{{17 }}, โซเดียม ไพโรฟอสเฟต 15 มิลลิโมลาร์, 100 มิลลิโมลาร์ -กลีเซอโรฟอสเฟต, โซเดียม ออร์โทวานาเดต 2 มิลลิโมลาร์, NaF 50 มิลลิโมลาร์, NaCl 150 มิลลิโมลาร์, 1 มิลลิโมลาร์เมทิลซัลโฟนิล ฟลูออไรด์ (PMSF) และ 1 มิลลิโมลาร์ ไดไทโอไทรทอล (DTT)
จากนั้นตัวอย่างจะถูกปั่นแยกและนำส่วนเหนือตะกอนไปตรวจสอบระดับโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบ Micro BCA จาก Thermo Fisher Scientific Inc (วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) พร้อมด้วยอัลบูมิน bovineserum จาก Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA)
ส่วนลงตัวซึ่งรวมถึงโปรตีนทั้งหมด 20 ไมโครกรัมถูกต้มในบัฟเฟอร์สำหรับการโหลด, ทริส 150 มิลลิโมลาร์ (pH 6.8) ที่มีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) 6%, DTT 3 มิลลิโมลาร์, โบรโมฟีนอลบลู 0.3% และกลีเซอรอล 30%
ตัวอย่างถูกแยกด้วย 10% SDS-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (PAGE) จากนั้น เทเจลจะถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสจาก Pall Co (อีสต์ฮิลส์, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) ที่อุณหภูมิ 350 mA และ 4 ◦C เป็นเวลา 90 นาที
เพื่อป้องกันการย้อมสีที่ไม่เฉพาะเจาะจง ให้บ่มเยื่อในนมที่สกัดไขมัน 5% เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้น พวกมันได้รับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันกับแอนติบอดีปฐมภูมิแต่ละตัว: กระต่ายต่อต้าน TRPV1 (เจือจาง 1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), กระต่ายต่อต้าน TRPV4 (เจือจาง 1:1000) (Abcam) และกระต่ายต่อต้าน- - แอกติน (เจือจาง 1:2000)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 7 ชั่วโมง
ต่อจากนั้นพวกเขาถูกทำปฏิกิริยากับมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HRP) - คอนจูเกตลาต่อต้านกระต่าย IgG (เจือจาง 1:4500) (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ในที่สุด ชุดเคมีเรืองแสงที่ใช้อะลูมิเนียมจาก Thermo Fisher Scientific Inc (วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงการมองเห็น
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [68] immunoblots ของ TRPV1 และ TRPV4 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ Scion Image จาก Scion Crop (Frederick, MD, USA) แถบถูกสแกน และทำการวิเคราะห์ความหนาแน่น ระดับโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานเทียบกับระดับ -แอกตินที่สอดคล้องกัน
4.6. การเตรียมส่วนเนื้อเยื่อวิทยา
สำหรับการตรวจทางอิมมูโนฮิสโตเคมีและจุลพยาธิวิทยา หนูเจอร์บิล (n=7 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ถูกสังเวยตามตารางเวลาที่กำหนด (30 นาที, 12 ชั่วโมง, 1 วัน, 2 วัน และ 4 วันหลังจาก tFI หรือการผ่าตัดเสแสร้ง)
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [34] หนูเจอร์บิลได้รับการดมยาสลบอย่างล้ำลึกด้วยเพนโทบาร์บิทอล โซเดียม (200 มก./กก.) (JW Pharmaceutical, Seoul,Korea) ภายใต้การดมยาสลบ หนูเจอร์บิลถูกล้างข้ามหัวใจด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ (pH 7.4) และตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์, pH 7.4)
ต่อจากนั้น ได้รับสมองของพวกเขาและหลังการตรึงโดยใช้สารตรึงเดียวกันเป็นเวลาหกชั่วโมง หลังจากนั้น เนื้อเยื่อสมองถูกตัด (ความหนา 25 µm ของระนาบโคโรนา) ในอะคริโอสแตท (Leica, Wetzlar, Germany)
4.7. การย้อมสีฮิสโตเคมีโดยใช้ CV
เพื่อตรวจสอบความเสียหายทางสัณฐานวิทยาและเส้นประสาทในฮิบโปของแต่ละกลุ่ม ทำการย้อมสีเครซิลไวโอเล็ต (CV) ตามที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [69] โดยย่อ Cresyl Violet Acetate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ถูกละลายที่ 1.0% (w/v) ในน้ำกลั่น และกรดอะซิติกน้ำแข็ง (0.28 %) ถูกเพิ่มเข้าไปในโซลูชันนี้ ส่วนต่างๆ ย้อมและติดด้วยยาหม่องแคนาดา (คันโต โตเกียว ญี่ปุ่น)
4.8. FJ B การย้อมสี
ทำการย้อมสี FJ B เพื่อตรวจสอบความเสื่อมของเส้นประสาท (ความตายหรือการสูญเสีย) ตามขั้นตอนที่เผยแพร่ [34] ส่วนของสมองที่เตรียมไว้ถูกแช่ในโซเดียมไฮดรอกไซด์ 1% แล้วถ่ายโอนไปยัง 0.0 โพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 6% ทันที และทำปฏิกิริยาทันทีกับฟลูออโร-เจด บี 0.0004% (ฮิสโตเคม) , เจฟเฟอร์สัน, อาร์คันซอ, สหรัฐอเมริกา)
ล้างส่วนต่างๆ เป็นเวลาสั้นๆ และวางบนเครื่องอุ่นสไลด์ (ประมาณ 50 ◦C) เพื่อทำปฏิกิริยากับ FJ B เพื่อประเมินผลการรักษาของ OXC ต่อ tFI จำนวนเซลล์ FJ B+ จะถูกนับในภูมิภาค CA1 ตามวิธีการที่เผยแพร่ใน [ 70].
โดยสรุป ภาพดิจิทัลของ FJ B+cells ถูกจับจากห้าส่วนต่อหนูเจอร์บิลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเอพิฟลูออเรสเซนต์ (Carl Zeiss) (โอเบอร์โคเชน ประเทศเยอรมนี) ที่ความยาวคลื่น 450–490 นาโนเมตร เซลล์ถูกนับใน 250 µm2 ซึ่งรวมถึง SP ที่ศูนย์กลางของภูมิภาค CA1 โดยใช้ระบบวิเคราะห์ภาพ (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA)
4.9. อิมมูโนวิทยา
เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของ NeuN, TRPV1 และ TRPV4 ในภูมิภาค CA1 ได้ทำการดำเนินการอิมมูโนฮิสโตเคมีทั่วไป โดยสรุป ตามวิธีการที่ตีพิมพ์ [34] ส่วนสมองที่เตรียมไว้ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ-เมาส์แอนตี้-NeuN (เจือจาง, 1:1100) (เคมิคอน, เตเมคูลา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา), ต่อต้านเมาส์ TRPV1(เจือจาง, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK) และกระต่ายต้าน TRPV4 (เจือจาง, 1:500) (Abcam,Cambridge, UK)
หลังจากนั้น ส่วนที่ฟักตัวเหล่านี้จะถูกบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิที่เกี่ยวข้อง (เจือจาง, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) และพัฒนาโดยใช้ Vectastain ABC (เจือจาง, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA , สหรัฐอเมริกา) สุดท้าย ส่วนที่ได้รับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันเหล่านี้มีสีหลังจากการมองเห็นด้วย 3,3'-ไดอะมิโนเบนซิดีน
จำนวนเซลล์ NeuN+ ถูกนับดังนี้ ภาพดิจิทัลของเซลล์ NeuN+ ถูกจับจากห้าส่วนต่อหนูเจอร์บิลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (AxioM1) (Carl Zeiss ประเทศเยอรมนี)
เซลล์ถูกนับในลักษณะเดียวกันกับจำนวนเซลล์ FJ B+ เพื่อประเมินความหนาแน่นของโครงสร้าง TRPV1+ และ TRPV4+ พื้นที่ที่เกี่ยวข้องในภูมิภาค CA1 ถูกใช้เป็นห้าส่วนต่อสัตว์หนึ่งตัว ภาพของโครงสร้าง TRPV1+ และ TRPV4+ ถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง AxioM1 (Carl Zeiss) (เยอรมนี)
ความหนาแน่นของโครงสร้าง TRPV{{0}} และ TRPV4+ ได้รับการประเมินเป็นความหนาแน่นเชิงแสงสัมพัทธ์ (ROD) ด้วยเหตุนี้ ภาพจึงถูกเปลี่ยนให้เป็นระดับสีเทาปานกลาง ROD ถูกนำเสนอเป็นเปอร์เซ็นต์โดยใช้ Adobe Photoshop (เวอร์ชัน 8.0) และซอฟต์แวร์ NIH Image J (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, Bethesda, MD, USA)
4.10. การวิเคราะห์ทางสถิติ
เรานำเสนอข้อมูลเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA) ความแตกต่างในค่าเฉลี่ยระหว่างกลุ่มการทดลองได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) แบบสองทางด้วยการทดสอบเปรียบเทียบแบบหลายรายการหลังการผ่าตัดเพื่อชี้แจงความแตกต่างที่เกี่ยวข้องกับ tFI ในทุกกลุ่ม พิจารณานัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0 05.
ผลงานของผู้เขียน: แนวความคิด: M.-HW และ T.-KL; ระเบียบวิธี J.-CL และ DWK ซอฟต์แวร์ H.-IK และ MCS; การตรวจสอบความถูกต้อง JHA IJK และ JHP; การสืบสวน, J.-CL, H.-IK และ M.CS; การดูแลจัดการข้อมูล JHC, IJK และ JHP; การเตรียมการเขียนต้นฉบับร่าง H.-IK และ J.-CL; การเขียน-ทบทวนและเรียบเรียง M.-HW; การกำกับดูแล ส.-SL; การบริหารโครงการ ม.-HW; Funding Acquisition, S.-SL และ T.-KL ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและตกลงกับต้นฉบับที่ตีพิมพ์แล้ว
เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807) ซึ่งได้รับทุนสนับสนุนจาก National Research Foundation (NRF) ของเกาหลี และโดยโครงการวิจัยวิทยาศาสตร์ขั้นพื้นฐานผ่าน National Research Foundation of Korea (NRF) ได้รับทุนจากกระทรวงศึกษาธิการ (NRF-2020R1I1A1A01070897)
คำแถลงของคณะกรรมการพิจารณาประจำสถาบัน: หนูเจอร์บิลได้รับการอบรมในศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแห่งชาติคังวอน (ชุนชอน ประเทศเกาหลี) สำหรับการศึกษานี้ เกณฑ์วิธีการทดลองได้รับการอนุมัติ (หมายเลขอนุมัติ KW-200113-1; วันที่อนุมัติ 18 กุมภาพันธ์ 2020) โดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน
ระเบียบวิธีการวิจัยเป็นไปตามแนวทางที่แนะนำใน "กฎหมายและนโยบายระหว่างประเทศปัจจุบัน" ของแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง ซึ่งจัดพิมพ์โดยสำนักพิมพ์ National Academies (8th Ed., 2011)
คำชี้แจงความยินยอม: ไม่เกี่ยวข้อง
คำชี้แจงความพร้อมของข้อมูล: ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษานี้มีให้ตามคำขอจากผู้เขียนที่เกี่ยวข้อง
กิตติกรรมประกาศ: ผู้เขียนขอขอบคุณ Hyun Sook Kim และ Seung Uk Lee สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิคในการศึกษานี้
ความขัดแย้งทางผลประโยชน์: ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางการเงิน
คำย่อ
CA1: ฟิลด์ย่อย Cornu Ammonis 1; ระบบประสาทส่วนกลาง, ระบบประสาทส่วนกลาง; CV, สีม่วงเครซิล; DG, dentate gyrus; FJ B, ฟลูออโร-หยก B; HyT อุณหภูมิต่ำ; NeuN นิวเคลียสของเซลล์ประสาท; OXC, ออกคาร์บาเซพีน; PAT การทดสอบการหลีกเลี่ยงแบบพาสซีฟ ROD ความหนาแน่นของแสงสัมพัทธ์ SMA กิจกรรมมอเตอร์ที่เกิดขึ้นเอง SO, stratum oriens; SP, เสี้ยมชั้น Stratum; SR, ชั้นเรเดียตัม; tFI, ภาวะขาดเลือดสมองชั่วคราว; TRPV1, วานิลลอยด์ที่มีศักยภาพของตัวรับชั่วคราวชนิด 1
อ้างอิง
1. บุสโต ร.; ดีทริช, WD; ลูกโลก ของฉัน; บัลเดส, I.; ไชน์เบิร์ก, พี.; Ginsberg, MD ความแตกต่างเล็กน้อยของอุณหภูมิสมองภายในร่างกายเป็นตัวกำหนดขอบเขตของการบาดเจ็บของเส้นประสาทขาดเลือด เจ. เซเรบ. Metab การไหลเวียนของเลือด 1987, 7, 729–738. [CrossRef] [PubMed]
2. เฮอร์ เจ.; Hachinski, V. Hypothermia เป็นวิธีการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับภาวะขาดเลือดในสมอง เซเรโบรวาสค์ Metab สมอง รายได้ 1993, 5,277–300.
3. พยาบาล ส.; Corbett, D. การป้องกันระบบประสาทหลังจากอุณหภูมิที่ไม่รุนแรงที่เกิดจากยาเป็นเวลาหลายวัน เจ. เซเรบ. Metab การไหลเวียนของเลือด 1996, 16,474–480. [ครอสอ้างอิง]
4. ฟิชเชอร์ ม.; เฟอเออร์สไตน์ ก.; ฮาวเวลล์ส DW; เฮิร์น, PD; เคนท์, เท็กซัส; ซาวิทซ์, ศรี; แท้จริงแล้ว EH; Group, S. อัปเดตคำแนะนำพรีคลินิกโต๊ะกลมอุตสาหกรรมวิชาการรักษาโรคหลอดเลือดสมอง โรคหลอดเลือดสมอง 2009, 40, 2244–2250 [ครอสอ้างอิง]
5. หลิว ล.; Yenari, MA การบำบัดภาวะอุณหภูมิต่ำ: กลไกการป้องกันระบบประสาท ด้านหน้า. ไบโอไซ 2007, 12, 816–825. [ครอสอ้างอิง]
6. ไลเดน, พีดี; ครีเกอร์ ด.; เยนาริ ม.; Dietrich, WD การบำบัดภาวะอุณหภูมิต่ำสำหรับโรคหลอดเลือดสมองเฉียบพลัน นานาชาติ เจ. โรคหลอดเลือดสมอง 2549, 1, 9–19. [CrossRef] [PubMed]
7. Klassman, L. การรักษาอุณหภูมิในโรคหลอดเลือดสมองเฉียบพลัน เจ. นิวโรไซ. พยาบาล 2011, 43, 94–103. [ครอสอ้างอิง]
8. กรอยส์แมน, ลิทัวเนีย; เอ็มมานูเอล บริติชแอร์เวย์; คิม-เทนเซอร์, แมสซาชูเซตส์; สูง, GY; Mack, WJ การรักษาอุณหภูมิในโรคหลอดเลือดสมองตีบเฉียบพลัน Neurosurg โฟกัส 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]
9. ชวาบ ส.; จอร์เจียดิส ด.; เบอร์รูชอต เจ.; เชลลิงเจอร์, พีดี; กราฟฟาจิโน, ค.; Mayer, SA ความเป็นไปได้และความปลอดภัยของภาวะอุณหภูมิร่างกายต่ำกว่าปกติหลังเกิดภาวะกล้ามเนื้อสมองตายขนาดใหญ่ โรคหลอดเลือดสมอง 2001, 32, 2033–2035 [ครอสอ้างอิง]
10. แคทซ์ แอลเอ็ม; ยัง, AS; แฟรงค์ เจอี; วังย.; Park, K. อุณหภูมิควบคุมลดความเครียดออกซิเดชั่นในสมองหลังจากขาดเลือดขาดเลือด การทำงานของสมอง 2004, 1017, 85–91. [ครอสอ้างอิง]
11. หลิว ก.; ข่านฮ.; เกิง เอ็กซ์.; จาง เจ.; Ding, Y. เภสัชวิทยาอุณหภูมิ: มีศักยภาพในการรักษาโรคหลอดเลือดสมองในอนาคตหรือไม่? นิวรอล. Res.2016, 38, 478–490. [ครอสอ้างอิง]
12. หม่า เจ.; วังย.; วังซ.; หลี่ฮ.; วังซ.; Chen, G. ผลการป้องกันระบบประสาทของภาวะอุณหภูมิร่างกายลดลงจากยาในโรคของระบบประสาทส่วนกลาง สกุลเงิน เป้าหมายยา 2017, 18, 1392–1398 [ครอสอ้างอิง]
13. กาลาเบรซี ป.; คูปินี, LM; เซนตอนเซ่, ด.; พิซานี ฟ.; Bernardi, G. ยากันชักเป็นกลยุทธ์ป้องกันระบบประสาทที่เป็นไปได้ในสมองขาดเลือด แอน. นิวรอล. 2003, 53, 693–702. [ครอสอ้างอิง]
14. ทานาคา ต.; Litofsky, NS ยารักษาโรคลมชักในการบาดเจ็บที่สมองในเด็ก ผู้เชี่ยวชาญ Rev. Neurother 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
