Human Alpha Defensin 5 การแสดงออกในไตของมนุษย์และทางเดินปัสสาวะ

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: ali.ma@wecistanche.com

จอห์น เดวิด สเปนเซอร์ และคณะ

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง:กลไกที่รักษาความเป็นหมันในทางเดินปัสสาวะนั้นไม่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ การศึกษาล่าสุดได้แสดงนัยถึงความสำคัญของเปปไทด์ต้านจุลชีพ (AMP) ในการปกป้องระบบทางเดินปัสสาวะจากการติดเชื้อ ที่นี่ เราอธิบายลักษณะการแสดงออกและความเกี่ยวข้องของมนุษย์ AMP alpha-defensin 5 (HD5) ในมนุษย์ไตและทางเดินปัสสาวะในรายปกติและผู้ติดเชื้อ

ระเบียบวิธี/ผลการวิจัยหลัก:การใช้ RNA ที่แยกได้จากมนุษย์ไต, ท่อไต และเนื้อเยื่อกระเพาะปัสสาวะ เราทำ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณเพื่อแสดงให้เห็นว่า DEFA5 ซึ่งเป็นยีนเข้ารหัส HD5 นั้นแสดงออกผ่านทางเดินปัสสาวะ ด้วย pyelonephritis การแสดงออกของ DEFA5 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไต. การใช้การวิเคราะห์อิมมูโนบลอตทำให้การผลิต HD5 เพิ่มขึ้นด้วย pyelonephritis ภูมิคุ้มกัน HD5 ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยัง urothelium ของกระเพาะปัสสาวะและท่อไต ในไตนั้น HD5 ส่วนใหญ่ถูกผลิตขึ้นในท่อไตส่วนปลายและรวบรวมท่อ การใช้ immunoblot และ ELISA assays ทำให้ HD5 ไม่ถูกตรวจพบเป็นประจำในตัวอย่างปัสสาวะของมนุษย์ที่ไม่ติดเชื้อ ในขณะที่หมายถึงการผลิต HD5 ในปัสสาวะเพิ่มขึ้นเมื่อมีการติดเชื้อ E.coli ทางเดินปัสสาวะ

ข้อสรุป/ความสำคัญ:DEFA5 แสดงออกไปทั่วทางเดินปัสสาวะในผู้ป่วยที่ไม่ติดเชื้อ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HD5 จะแสดงทั่วทั้ง urothelium ของทางเดินปัสสาวะส่วนล่างและในท่อรวบรวมของไต. เมื่อติดเชื้อ การแสดงออกของ HD5 จะเพิ่มขึ้นในไตและตรวจพบระดับในปัสสาวะ ตามความรู้ของเรา การค้นพบของเราถือเป็นครั้งแรกในการวัดปริมาณการแสดงออกของ HD5 และการผลิตในไตของมนุษย์ นอกจากนี้ นี่เป็นรายงานฉบับแรกที่ตรวจพบว่ามี HD5 ในตัวอย่างปัสสาวะที่ติดเชื้อ ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า HD5 อาจมีบทบาทสำคัญในการรักษาความเป็นหมันของระบบทางเดินปัสสาวะ

ผลข้างเคียงของ Cistanche และ Cistanche tubulosa สำหรับไตโรคคลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

บทนำ

ทางเดินปัสสาวะ นอกเหนือไปจากท่อปัสสาวะ มักจะเป็นหมัน แม้ว่าจะอยู่ใกล้กับฟลอราในอุจจาระก็ตาม กลไกที่แม่นยำซึ่งระบบทางเดินปัสสาวะรักษาความเป็นหมันนั้นไม่เป็นที่เข้าใจกันดีนัก กลไกที่เสนอซึ่งมีส่วนในการป้องกันระบบทางเดินปัสสาวะ ได้แก่ การไหลของปัสสาวะ การเปลี่ยนแปลงค่า pH และ osmolarity ของปัสสาวะ การล้างกระเพาะปัสสาวะตามปกติ ส่วนประกอบป้องกันสารเคมีของ uroepithelium และการหลั่งของเยื่อบุผิว/การไหลเข้าของเซลล์ภูมิคุ้มกันของเอฟเฟกต์ด้วยการกระตุ้นแบคทีเรีย [1] นอกจากนี้ เปปไทด์ต้านจุลชีพ (AMPs) เพิ่งแสดงให้เห็นว่ามีบทบาทสำคัญในการรักษาความเป็นหมันของระบบทางเดินปัสสาวะ [2] AMP ซึ่งทำหน้าที่เป็นยาปฏิชีวนะตามธรรมชาติที่ผลิตโดยสิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมด เป็นส่วนประกอบที่แพร่หลายของระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด AMP คือโมเลกุลของประจุบวกที่แสดงออกโดยเซลล์เม็ดเลือดขาวฟาโกไซติกและเซลล์เยื่อบุผิว ในมนุษย์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอื่นๆ defensins เป็นตระกูลหลักของ AMP Defensins มักมีฤทธิ์ต้านจุลชีพในวงกว้างต่อแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ ไวรัส เชื้อรา และโปรโตซัว [2,3] ดีเฟนซินถูกสังเคราะห์ในขั้นต้นเป็นพรีโพรโปรตีนและผ่านกระบวนการแปรรูปเพื่อให้เปปไทด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่เจริญเต็มที่ [4] ในมนุษย์ defensins ถูกจำแนกเป็นหนึ่งในสองตระกูลขึ้นอยู่กับรูปแบบการเชื่อมโยงซัลไฟด์ - alpha-defensins หรือ beta-defensins [5]

ในทางเดินปัสสาวะ beta-defensins แสดงออกอย่างกว้างขวางทั่ว uroepithelium เซลล์เยื่อบุผิวที่บุผิวไตลูปของ Henle, ท่อส่วนปลาย และท่อรวบรวมซึ่งแสดงออกถึงเบตา-ดีเฟนซิน 1 ของมนุษย์ (hBD1) อย่างเป็นองค์ประกอบ แม้ว่าระดับ hBD1 ในปัสสาวะจะไม่เพียงพอต่อการฆ่าเชื้อแบคทีเรียที่บุกรุก แต่ hBD1 ให้สารเคลือบต้านจุลชีพที่ออกฤทธิ์เร็วของลูเมนของท่อและป้องกันการติดเชื้อโดยการยับยั้งการยึดติดของแบคทีเรียกับยูโรทีเลียม [6] การศึกษาล่าสุดระบุว่าสถานะรีดอกซ์ของ hBD1 ส่งผลอย่างมีนัยสำคัญต่อศักยภาพในการต้านจุลชีพ เช่น เปปไทด์ที่รีดิวซ์มีศักยภาพมากกว่ารูปแบบออกซิไดซ์ที่เชื่อมโยงกับไดซัลไฟด์ [7] ความสำคัญของสิ่งนี้ที่พื้นผิว urothelial ยังไม่ได้รับการพิจารณา defensin อีกตัวหนึ่งคือ human beta-defensin 2 (hBD2) ไม่ได้แสดงออกในเนื้อเยื่อไตที่แข็งแรง อย่างไรก็ตามการแสดงออกของ hBD2 เกิดจากการติดเชื้อ [8]

บทบาทของ alpha-defensins ที่ได้จากเยื่อบุผิวนั้นไม่ได้อธิบายไว้อย่างดีในทางเดินปัสสาวะซึ่งแตกต่างจาก beta-defensins การแสดงออกและการทำงานของ alpha-defensins HD5 และ HD6 ส่วนใหญ่ได้รับการรายงานในลำไส้เล็กซึ่ง Panethcells หลั่งเข้าไปในลำไส้เล็กและมีส่วนทำให้สมดุลของจุลินทรีย์ในลำไส้ [9] นอกจากนี้ HD5 ยังได้รับการแปลในระบบสืบพันธุ์เพศชายและเพศหญิงด้วยหลักฐานที่บ่งชี้ว่าเป็นสิ่งที่เหนี่ยวนำให้เกิดและมีความสำคัญในการกำจัดการติดเชื้อ [10,11,12] ตรวจพบ HD5 ของปัสสาวะในผู้ป่วยที่ได้รับการสร้างใหม่ ileal neobladder และการผันท่อปัสสาวะ ileal โดยที่แหล่งที่มาของการผลิต HD5 นั้นให้เครดิตกับเซลล์ Paneth ileal เป็นหลัก [13,14] HD5 มีฤทธิ์ต้านแบคทีเรียต่อแบคทีเรียแกรมบวกที่ทำให้เกิดโรคในระบบทางเดินปัสสาวะทั่วไปและแบคทีเรียแกรมลบ [15] HD5 ยังมีฤทธิ์ต้านจุลชีพต่อต้านไวรัสที่ทำให้เกิดโรคในระบบทางเดินปัสสาวะ เช่น ไวรัสอะดีโนไวรัสและไวรัส BK [16,17,18] ในการศึกษานี้ เราให้คำอธิบายเบื้องต้นและการหาปริมาณการแสดงออกของ HD5 ในมนุษย์ไตและกำหนดนิพจน์เพิ่มเติมในทางเดินปัสสาวะส่วนล่างในระหว่างการเป็นหมันและการติดเชื้อ

ผลลัพธ์

DEFA5 mRNA ถูกแสดงออกในกระเพาะปัสสาวะ ท่อไต และไตของมนุษย์

PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณแสดงให้เห็นว่ากระเพาะปัสสาวะ ท่อไต และ . ที่ทดสอบทั้งหมดไตตัวอย่างที่ไม่มีการติดเชื้อแสดง DEFA5 การแสดงออกของ DEFA5 ในทางเดินปัสสาวะส่วนล่างมีนัยสำคัญมากกว่าทางเดินปัสสาวะส่วนบน (p= 0.014) ในกระเพาะปัสสาวะ (n=4) การแสดงออกของ DEFA5 เฉลี่ยคือ 4,656637 การถอดเสียงต่อ 10 ng RNA และในท่อไต (n=4) การแสดงออกของ DEFA5 เฉลี่ยคือ 4,1126170 การถอดเสียงต่อ 10 ngRNA (รูปที่ 1A) . ในไต (n=6) การแสดงออกของ DEFA5 เฉลี่ยคือ 2,9376274 การถอดเสียงต่อ 10 ng RNA การแสดงออกของ DEFA5 ถูกวิเคราะห์แยกกันในคอร์เทกซ์ของไต ไขกระดูก และเชิงกราน การแสดงออกของ DEFA5 ไม่แปรผันอย่างมีนัยสำคัญตามบริเวณไต (p= 0.45)

การแสดงออกของ DEFA5 และการแสดงออกของเปปไทด์ HD5 เพิ่มขึ้นด้วย pyelonephritis

การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการบนเนื้อเยื่อไตด้วยpyelonephritis แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของ DEFA5 เมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อไตที่ไม่ติดเชื้อ Withpyelonephritis (n= 6) การแสดงออกของ DEFA5 เฉลี่ยเพิ่มขึ้นเป็น 7,82961,052 การถอดเสียงต่อ 10 ng RNA (p= 0.019) (รูปที่ 2A)

เพื่อประเมินการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นด้วย pyelone-phritis เราได้ทำการวิเคราะห์ immunoblot ในลักษณะเดียวกันไตเนื้อเยื่อที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เพื่อประเมินการเพิ่มขึ้นพร้อมกันในการผลิต HD5 เปปไทด์ (รูปที่ 2B แผงตรงกลาง) การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันโดยใช้ polyclonal HD5 antisera แสดงให้เห็นการผลิตเปปไทด์ HD5 ในเนื้อเยื่อไตที่มี pyelonephritis มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (n {{5} }) เทียบกับไม่ติดเชื้อไตเนื้อเยื่อ(n=6) ไม่ติดเชื้อไตเนื้อเยื่อแสดง 300625 ng HD5 / กรัมน้ำหนักเนื้อเยื่อเปียกในขณะที่ไตเนื้อเยื่อที่มี pyelonephritisexpressed 600621 ng HD5/กรัม น้ำหนักเนื้อเยื่อเปียก (p,0.0001) บลอตถูกโพรบซ้ำด้วย GAPDH เพื่อทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการโหลด (รูปที่ 2B, แผงตรงกลาง) และคราบซิลเวอร์ยังถูกดำเนินการเพื่อยืนยันการโหลดโปรตีนที่เท่ากัน (รูปที่ 2B, แผงด้านบน)

เปปไทด์ HD5 ผลิตขึ้นทั่วไตและทางเดินปัสสาวะของมนุษย์

ทำการสร้างภูมิคุ้มกันเพื่อจำกัดการผลิต HD5 ในทางเดินปัสสาวะ อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) แสดงให้เห็นว่า HD5immunoreactivity มีอยู่ทั่ว urothelium ของท่อไตและกระเพาะปัสสาวะของตัวอย่างที่ตรวจสอบทั้งหมด (n=4, รูปที่ 3) IHC ยังแสดงให้เห็นว่า HD5 ถูกผลิตขึ้นในท่อของเยื่อหุ้มสมองของไตและไขกระดูกของทั้งหมด ตัวอย่าง (n= 6, รูปที่ 4) อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (IF) แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ HD5 นั้นยิ่งใหญ่ที่สุดในปลายไตและท่อรวบรวม (รูปที่ 5) interstitium และ glomeruli ไม่แสดง HD5 immunoreactivity การสร้างภูมิคุ้มกันที่แสดงไว้ในรูปที่ 3, 4 และ 5 ถูกดำเนินการโดยใช้โมโนโคลนัลแอนติ-HD5 แอนติบอดีของหนูเมาส์ (8C8) ที่จดจำ HD5 โปรเปปไทด์ (Abcam, Cambridge, MA) ผลลัพธ์มีความคล้ายคลึงกันเมื่อใช้แอนติบอดีโพลีโคลนัลแอนตี้-HD5 ของกระต่ายที่รู้จักโปรเปปไทด์ HD5 และเปปไทด์ที่โตเต็มที่ (ไม่แสดงข้อมูล) ซึ่งบ่งชี้ว่า HD5 ถูกเก็บไว้เป็นโปรเปปไทด์

ด้วย pyelonephritis ภูมิคุ้มกัน HD5 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด HD5 immunoreactivity เพิ่มขึ้นทั่วทั้ง nephron ใกล้เคียง, nephron ปลายและท่อรวบรวม (รูปที่ 4 และรูปที่ 5) ในตัวอย่างที่ไม่ติดเชื้อ glomeruli และ interstitium ไม่มีการแสดงออกของ HD5 เมื่อติดเชื้อ กลุ่มควบคุมเชิงลบไม่แสดงปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันของ HD5

ปัสสาวะของมนุษย์ที่ติดเชื้อมีความเข้มข้นของเปปไทด์ HD5 ที่วัดได้

การวิเคราะห์อิมมูโนโบลต์โดยใช้โพลีโคลนอลแอนติซีรัมของกระต่ายที่ตรวจพบสารตั้งต้น proHD5 และรูปแบบที่ผ่านการประมวลผลเพิ่มเติมระบุระดับ HD5 ที่วัดได้ในตัวอย่างปัสสาวะที่ทดสอบแล้ว 13 ตัวอย่างจากเชื้อ E.coli ที่ทำให้เกิดโรคในระบบทางเดินปัสสาวะ (รูปที่ 6A และ B) ในปัจจุบัน ระดับ HD5 ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานของครีเอตินินในปัสสาวะ อยู่ในช่วง 299.8–669.7630 ng HD5/mg ของปัสสาวะ Cr (110.67 ng/mL–276.67 ng/mL) ซึ่งสอดคล้องกับ 11.10–27.67 nmol/L ตัวอย่างปัสสาวะที่ติดเชื้อภายใน (n=15), HD5 อยู่ที่หรือต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับที่ (,50 ng) การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) ในตัวอย่างปัสสาวะเดียวกัน โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีของเมาส์ (8C8) ที่ตรวจพบเฉพาะสารตั้งต้น proHD5 ตรวจพบระดับ proHD5 ที่วัดได้ในตัวอย่างที่ติดเชื้อ 13 ตัวอย่างจาก 15 ตัวอย่างที่ทดสอบ ความเข้มข้นของ proHD5 ในปัสสาวะอยู่ระหว่าง 122.78–490.060.03 ng HD5/mg ของปัสสาวะ Cr (30.02 ng/mL–200.5 ng/mL) เมื่อมี (รูปที่ 7)

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราได้จัดเตรียมลักษณะเบื้องต้นของ HD5 ในมนุษย์ไต, ท่อไต และ กระเพาะปัสสาวะ HD5 ได้รับการแสดงว่าเป็น AMP ที่สำคัญที่ป้องกันการติดเชื้อที่แพร่กระจายในลำไส้และได้รับการควบคุมในระบบสืบพันธุ์ระหว่างการติดเชื้อ[11,18,19,20,21] AMP ที่ได้จากเยื่อบุผิว เช่น HD5 ได้รับการแสดงว่ามีความสำคัญในการรักษาความเป็นหมันในทางเดินปัสสาวะ[8,22,23,24] ข้อบกพร่องในการป้องกันเยื่อเมือกโดยธรรมชาติเหล่านี้อาจส่งผลให้เกิดการติดเชื้อเฉียบพลันและ/หรือเรื้อรัง [25,26]

ผลลัพธ์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณของเราแสดงให้เห็นว่า DEFA5 นั้นแสดงออกในมนุษย์ไต, ท่อไต และกระเพาะปัสสาวะ การแสดงออกของ DEFA5 เพิ่มขึ้นจากทางเดินปัสสาวะส่วนบนไปยังทางเดินปัสสาวะส่วนล่าง - ตามการไหลของกระแสปัสสาวะและความใกล้ชิดที่เพิ่มขึ้นกับจุดบุกรุกของจุลินทรีย์ ตามความรู้ของเรา นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกเพื่อวัดปริมาณการแสดงออกของ DEFA5 ในไตและกระเพาะปัสสาวะของมนุษย์ เมื่อเร็ว ๆ นี้ Townes et al ได้แสดงให้เห็นว่าท่อไตส่วนปลายปกติสามารถแสดงออก DEFA5 [14] ผลลัพธ์ของเรายังชี้ให้เห็นว่า DEFA5 นั้นแสดงออกโดยท่อไตส่วนปลาย แม้ว่าการแสดงออกของ DEFA5 ในทางเดินปัสสาวะจะต่ำกว่าที่พบในเนื้อเยื่อทางเดินอาหารเกือบ 100-เท่า แต่การแสดงออกของ DEFA5 พื้นฐานของเยื่อบุทางเดินปัสสาวะนั้นเทียบได้กับการแสดงออกของแอมพลิฟายเออร์ทางเดินปัสสาวะที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เช่น cathelicidin, hBD-1, hBD -2 และไรโบนิวคลีเอส 7[6,8,22,24,27]

ตรงกันข้ามกับระบบทางเดินอาหารที่เจริญเต็มที่ซึ่ง DEFA5 แสดงออกที่ระดับสูงทั้งในสภาวะสุขภาพและการติดเชื้อ/การอักเสบ ข้อมูล PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณของเราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ DEFA5 ในไตมีการควบคุมการติดเชื้ออย่างมีนัยสำคัญ [27,28,29] รูปแบบการแสดงออกที่เหนี่ยวนำไม่ได้นี้คล้ายคลึงกับการแสดงออกของ DEFA5 ในระบบสืบพันธุ์เพศหญิงซึ่งการแสดงออกของ DEFA5 เพิ่มขึ้นด้วยอาการปีกมดลูกอักเสบ [30] ในทางเดินปัสสาวะ Townes et al ได้แสดงให้เห็นถึงแนวโน้มที่จะมีการแสดงออกของ DEFA5 ของท่อไตมากขึ้นในผู้ป่วยที่เป็นโรค UTIs ที่ได้รับการเปลี่ยนท่อปัสสาวะในท่อทางเดินปัสสาวะ [14]

การวิเคราะห์อิมมูโนบลอตของเราช่วยเสริมข้อมูล PCR แบบเรียลไทม์โดยแสดงให้เห็นว่าการผลิตเปปไทด์ HD5 เพิ่มขึ้นด้วย pyelonephritis รูปแบบที่กระตุ้นได้ของการผลิต HD5 นี้คล้ายคลึงกับที่พบในสมาชิกบางกลุ่มของตระกูล beta-defensin hBD2 แสดงรูปแบบการผลิตที่เหนี่ยวนำให้เกิดการติดเชื้อในทางเดินปัสสาวะและ/หรือ pyelonephritis เรื้อรัง [8,31,32] การผลิต HD5เปปไทด์แสดงให้เห็นว่าเพิ่มขึ้นในระบบสืบพันธุ์สตรีส่วนบนและท่อปัสสาวะชายที่มีการอักเสบ [11,30]

การใช้ภูมิคุ้มกันบกพร่อง เราแสดงให้เห็นว่า HD5 มีการผลิตอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งยูโรทีเลียมของท่อไตและกระเพาะปัสสาวะ เนื่องจาก UTIs ส่วนใหญ่เกิดจากอุจจาระที่ลุกลามเข้าไปในกระเพาะปัสสาวะ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของ HD5 มีอยู่ในบริเวณที่มีการสัมผัสกับจุลินทรีย์บ่อยที่สุด [33] ดังนั้น HD5 จึงอยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสมในการป้องกันการติดเชื้อจุลินทรีย์จากน้อยไปมาก ในไต, HD5 ส่วนใหญ่ผลิตขึ้นในท่อไตส่วนปลายและท่อเก็บสะสม การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า HD5 ถูกผลิตขึ้นในสถานที่ซึ่งจะถูกจัดตำแหน่งให้มีฤทธิ์ต้านจุลชีพที่เหมาะสมที่สุด การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติต้านจุลชีพของ defensins ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเกลือ – โดยความเข้มข้นของเกลือที่สูงขึ้นจะทำให้ฤทธิ์ต้านจุลชีพลดลง [23,34,35] เราคาดการณ์ว่าความเข้มข้นของเกลือต่ำของเนฟรอนส่วนปลายและท่อเก็บสะสมจะทำให้เกิดสภาพแวดล้อมที่เอื้ออำนวยต่อการออกฤทธิ์ต้านจุลชีพ HD5

การวิเคราะห์อิมมูโนโบลต์และ ELISA ยังแสดงให้เห็นว่า HD5 ถูกขับออกทางปัสสาวะที่ระดับต่ำ เมื่อพิจารณาจากขนาด (8.1 kDa และ3.7 kDa) และประจุบวกของ proHD5 และ HD5 ที่ผ่านกระบวนการเต็มที่แล้ว เป็นไปได้ว่าเปปไทด์ HD5 ในปัสสาวะบางตัวมีต้นกำเนิดมาจากพลาสมาฟิลเทรตอย่างน้อยบางส่วน กระนั้น มีหลักฐานเพียงเล็กน้อยที่บ่งชี้ว่า HD5 ยังคงมีอยู่ในพลาสมา [27] นอกจากนี้ เพื่อให้ปรากฏในปัสสาวะ HD5 จะต้องหลบหนีกลไกการดูดซึมเปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพในท่อใกล้เคียง [6,36] สุดท้าย ตัวอย่างปัสสาวะที่ใช้ผ่านการหมุนเหวี่ยงก่อนทำการวิเคราะห์ โดยกำจัดแหล่ง HD5 ของเซลล์

ที่ความเข้มข้นที่ตรวจพบ HD5 ในปัสสาวะไม่น่าจะเป็นยาต้านจุลชีพโดยตรงกับจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคในระบบทางเดินปัสสาวะ เนื่องจาก HD5 ที่ผ่านกระบวนการเต็มที่จะมีความเข้มข้นในการยับยั้งน้อยที่สุด (MIC) ระหว่าง 6-10 มก./มล. ต่อแบคทีเรียจีนิกชนิดแกรมลบทั่วไป [15] อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของผิวเยื่อเมือกมีแนวโน้มที่จะสูงขึ้น นอกจากนี้ การวิเคราะห์อิมมูโนบลอตยังแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของ HD5 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไต. ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า HD5 เกี่ยวข้องกับการป้องกันเยื่อเมือกของทางเดินปัสสาวะ จะเห็นรูปแบบที่คล้ายคลึงกันกับ hBD1 ซึ่งความเข้มข้นของ hBD1 ในปัสสาวะไม่เพียงพอที่จะแสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพ แต่ตรวจพบความเข้มข้นของเปปไทด์ที่สูงขึ้นใกล้กับท่อไต [6,31]

เนื่องจาก IHC แสดงให้เห็นว่า proHD5 เป็นรูปแบบหลักของ HD5 ในไตและเนื่องจากตรวจพบทั้งผู้ใหญ่และ proHD5 ในปัสสาวะ เราคาดว่า HD5 จะหลั่งสารตั้งต้นโมเลกุลเป็นหลัก จากนั้นจึงผ่านกระบวนการสลายโปรตีนเพื่อสร้างรูปแบบที่โตเต็มที่ ซึ่งคล้ายกับระบบทางเดินอาหารและทางเดินปัสสาวะ [11,30,37] ในลำไส้เล็ก เซลล์ Paneth ผลิต trypsin ซึ่งแยก HD5 propeptide เพื่อให้เปปไทด์ที่ผ่านกระบวนการเต็มที่เป็นรูปแบบเด่นในลำไส้เล็ก [37] ในท่อปัสสาวะของผู้ชาย เอ็นไซม์ในการประมวลผลและกระตุ้นการทำงานของ HD5 ที่สำคัญคือโปรตีเอสนิวโทรฟิลซึ่งมีสาเหตุมาจากนิวโทรฟิลที่ถูกคัดเลือกไปยังบริเวณที่ติดเชื้อ [11] การมีส่วนร่วมของทริปซิโนเจนเยื่อบุผิว ทริปซินในปัสสาวะ และ/หรือนิวโทรฟิลโปรตีเอสในการประมวลผล HD5 ในทางเดินปัสสาวะระหว่างการติดเชื้อยังคงต้องพิจารณา นอกจากนี้ ยังต้องพิจารณาผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงในสภาพแวดล้อมของปัสสาวะต่อการทำงานของ HD5 (การเปลี่ยนแปลงของออสโมลาริตี ค่าความเป็นกรด-ด่าง และความเข้มข้นของประจุบวก)

โดยสรุป นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่ระบุและวัดปริมาณการแสดงออกและการผลิต HD5 ในทางเดินปัสสาวะ ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า HD5 เป็น AMP ที่ได้จากเยื่อบุผิวที่อาจมีบทบาทสำคัญในการสร้างภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติของ uroepithe lium ของมนุษย์ที่ป้องกันการเคลื่อนย้ายของเชื้อโรคที่บุกรุกเข้าสู่กระแสเลือด การอธิบายปัจจัยที่ควบคุมการผลิต HD5 อาจให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคของ UTI ในผู้ป่วยที่มีความเสี่ยงต่อการติดเชื้อ UTI และผู้ป่วยที่ติดเชื้อเรื้อรัง

วิธีการ

อนุมัติการเรียน

ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้ป่วยทุกรายที่เข้าร่วมในการศึกษานี้ สำหรับอาสาสมัครที่อายุน้อยกว่า 18 ปี ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้ปกครอง/ผู้ปกครอง คณะกรรมการพิจารณาสถาบัน NationwideChildren's Hospital (NCH) อนุมัติการศึกษานี้พร้อมกับกระบวนการให้ความยินยอมและเอกสาร (IRB07-00383)

ตัวอย่างเนื้อเยื่อและปัสสาวะของมนุษย์

ท่อไตส่วนปลายและเนื้อเยื่อกระเพาะปัสสาวะที่ไม่ติดเชื้อ (n= 4) ได้มาจากเด็กที่ได้รับการปลูกถ่ายท่อไตใหม่ด้วยเหตุผลอื่นนอกเหนือจากการติดเชื้อซ้ำ ไม่ติดเชื้อไตตัวอย่าง (n=6) ได้รับจากผู้ป่วยที่ได้รับการผ่าตัดไตสำหรับเนื้องอกในไต ตัวอย่างเนื้อเยื่อไม่มีสัญญาณของโรคหรือการอักเสบในระดับมหภาคไตเนื้อเยื่อจากผู้ป่วยที่มี pyelonephritis เรื้อรังถูกจัดเตรียมโดย Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38] นักพยาธิวิทยาอิสระสองคนยืนยันการวินิจฉัยทางจุลพยาธิวิทยาของ pyelonephritis ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งแบบสแน็ปอินหรือถูกรักษาไว้เป็นส่วนที่ฝังพาราฟินที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินที่เป็นกลาง ส่วนของเนื้อเยื่อไตที่ไม่ติดเชื้อถูกผ่าออกเป็นเยื่อหุ้มสมอง ไขกระดูก หรือกระดูกเชิงกรานของไตก่อนเก็บรักษา (n=4)

เก็บตัวอย่างปัสสาวะที่ไม่ติดเชื้อและติดเชื้อจากเด็กที่นำส่งแผนกฉุกเฉินของ NCH หรือคลินิกโรคไต การวินิจฉัย UTI เกิดจากวัฒนธรรมปัสสาวะในเชิงบวกตาม American Academy of PediatricsGuidelines [39] ตัวอย่างปัสสาวะที่ติดเชื้อทั้งหมดมี E.coli .106 CFU/mL ค่า pH ของปัสสาวะอยู่ระหว่าง 5.5 ถึง 8.5 (ค่าเฉลี่ยของปัสสาวะ 6.9) ไม่ได้วัดองค์ประกอบไอออนิกในปัสสาวะ ตัวอย่างปัสสาวะถูกปั่นเหวี่ยงเพื่อขจัดตะกอนในปัสสาวะ และเติมค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอส (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)

การแยกกรดไรโบนิวคลีอิกและการถอดความแบบย้อนกลับ

RNA ทั้งหมดแยกได้จากเนื้อเยื่อที่ถูกแช่แข็งโดยใช้ PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA) การสังเคราะห์ ForcDNA อาร์เอ็นเอทั้งหมด 4-8 มก. ถูกคัดลอกย้อนกลับด้วย Superscript III reverse transcriptase โดยใช้ไพรเมอร์ oligo-(dT)12–18 ตามโปรโตคอลของซัพพลายเออร์ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

การโคลนพลาสมิดเฉพาะยีนสำหรับเส้นโค้งมาตรฐาน

การเข้ารหัส cDNA DEFA5 และ GAPDH ถูกโคลนให้เป็น 4-Topo plasmid vector (Invitrogen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต พลาสมิดถูกจัดลำดับเพื่อยืนยันว่าถูกต้อง

ได้รับสิ่งปลูกสร้าง การเจือจางแบบอนุกรมของพลาสมิดที่จำเพาะต่อยีนถูกหาปริมาณ (โดยการดูดกลืนแสงสเปกโตรโฟโตเมตริกที่ 260 และ agarose gel electrophoresis ที่ย้อมด้วยเอธิเดียมโบรไมด์) และใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์เพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับแต่ละปฏิกิริยา

PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ

PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ cDNA แบบสายเดี่ยวจากมนุษย์ไต, ท่อไต และเนื้อเยื่อกระเพาะปัสสาวะที่มีคู่ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์จำเพาะโดยใช้ 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)PCR exon junction spanning primers ได้รับการออกแบบและยืนยันลำดับโดยใช้ DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward primer) : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 และ DEFA5 reverse primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39)

โดยสังเขป cDNA ที่สอดคล้องกับ 10 ng RNA ทำหน้าที่เป็น atemplate ในปฏิกิริยา 25 มล. ที่มี 2.0 mM ของไพรเมอร์แต่ละตัวและ 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR สีเขียวผสม เงื่อนไข PCR คือ: การทำให้เสียสภาพเริ่มต้นที่ 95uC เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วย 40 รอบโดยแต่ละรอบประกอบด้วยการเสียสภาพที่94uC เป็นเวลา 30 วินาที การหลอมที่ 64uC เป็นเวลา 30 วินาที และการขยายที่ 72uC เป็นเวลา 30 วินาที การเปล่งแสงเรืองแสงแบบวงจรต่อวงจรถูกเฝ้าติดตามที่ 530 นาโนเมตร และวิเคราะห์โดยใช้ 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems) มาตรฐานพลาสมิดที่จำเพาะต่อยีนรวมอยู่ในปฏิกิริยาทุกชุด การควบคุมเชิงบวก RNA ileum ของเทอร์มินัลถูกรวมเข้ากับปฏิกิริยาแต่ละชุด และเปรียบเทียบผลลัพธ์กับมาตรฐานที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ [27]

เพื่อยืนยันการขยาย PCR ของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ ตัวอย่างคือตัวอย่างที่ถูกวิเคราะห์โดยอิเล็กโตรโฟรีซิสบนเจล agarose 1.5 เปอร์เซ็นต์ ผลิตภัณฑ์ถูกมองเห็นโดย ethidium bromidestaining และเปรียบเทียบกับมาตรฐานขนาด DNA เพื่อยืนยันขนาดผลิตภัณฑ์ที่คาดการณ์ไว้ (ไม่แสดง) นอกจากนี้ กราฟโปรไฟล์อุณหภูมิหลอมเหลวของปฏิกิริยา PCR ทุกตัวถูกกำหนดหาที่จุดสิ้นสุดของแต่ละปฏิกิริยา

แอนติบอดี HD5

HD5 โปรเปปไทด์ (AA20-94) และรูปแบบที่ประมวลผลบางส่วน (AA36-94 และ 56–94) ถูกระบุโดยใช้โมโนโคลนัลของหนูเมาส์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาด (8C8) แอนติ-HD5 แอนติบอดี (Abcam) HD5 โปรเปปไทด์และ เปปไทด์ที่เจริญเต็มที่ (AA63-94) ถูกระบุโดยใช้โพลีโคลนัลแอนติซีรัมของกระต่ายที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[13,40]

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

ส่วนเดียวกันไตตัวอย่างที่ใช้ในการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (น้ำหนักเปียก 3-6 มก.) ถูกบดโดยใช้ครกและสากในไนโตรเจนเหลวและละลายในบัฟเฟอร์ RIPA ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส สกัดโปรตีนในปัสสาวะจากตัวอย่างปัสสาวะโดยใช้ชุดไมโครโปรตีนความเข้มข้นของโปรตีนในปัสสาวะ Proteospin (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada) ความเข้มข้นของโปรตีนในไตและปัสสาวะถูกหาปริมาณโดยใช้การทดสอบ Bradford Assay และยืนยันโดยใช้การอ่านค่า anOD280 นาโนเมตร ความเข้มข้นที่เท่ากันของเนื้อเยื่อไตหรือโปรตีนในปัสสาวะถูกบรรจุลงในเจลไล่ระดับโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 18 เปอร์เซ็นต์และอยู่ภายใต้อิเล็กโตรโฟรีซิส เพื่อให้แน่ใจว่าโหลดโปรตีนเท่ากัน คราบสีเงินถูกดำเนินการ

หลังจากการแยกด้วยไฟฟ้า โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส หลังจากการตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์ 0.05 เปอร์เซ็นต์ใน TBS เยื่อหุ้มถูกบล็อกในนมปราศจากไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 ถึง 60 นาที และบ่มในการเจือจาง 1:1,000 ของกระต่ายโพลีโคลนัล HD5 antiserum ข้ามคืน . หลังจากการล้าง แอนติบอดีทุติยภูมิ IgG ต้านแรบบิทเปอร์ออกซิเดสที่คอนจูเกตที่ต้านกระต่ายถูกเจือจาง 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ภูมิคุ้มกันจากไตเนื้อเยื่อยังถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีต้าน GAPDH (Sigma Aldrich) เป็นเวลาสองชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและจากนั้นจึงบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่อธิบายไว้ข้างต้น โปรตีนถูกมองเห็นโดยใช้ระบบตรวจจับ ECL และฟิล์มเคมีเรืองแสงตามคำแนะนำของผู้ผลิต (BioExpress, Kaysville, UT, USA)

HD5 ถูกหาปริมาณโดยการเปรียบเทียบความเข้มของแถบที่เป็นผลลัพธ์กับการเจือจางแบบอนุกรมของโปรตีน proHD5 มาตรฐานลูกผสม (Peptides International, Louisville, KY, USA)ไตความเข้มข้น HD5 ถูกทำให้เป็นมาตรฐานต่อน้ำหนักเนื้อเยื่อเปียก ความเข้มข้นของ HD 5 ในปัสสาวะถูกหารด้วยครีเอตินีนในปัสสาวะเพื่อสร้างอัตราส่วน HD5- ต่อครีเอตินีนในปัสสาวะที่เป็นมาตรฐาน (มก./มก.) เพื่ออธิบายการเจือจางของปัสสาวะ ความเข้มข้นของครีเอตินินในปัสสาวะถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบไมโครเพลทครีเอตินินของ Oxford Biomedical Research (โรเชสเตอร์ฮิลส์, มิชิแกน, สหรัฐอเมริกา)

อิมมูโนฮิสโตเคมี

หลังจากการดีพาราฟินไลเซชัน การคืนน้ำ และการดึงแอนติเจน บล็อกไบโอตินและบล็อกโปรตีนที่ปราศจากซีรัมถูกดำเนินการ (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA) สไลด์ถูกบ่มข้ามคืนที่ 4uC ด้วยโมโนโคลนัลหนูเมาส์ HD5(8C8) แอนติบอดี (1:2{{10}}0; Abcam) หรือโพลีโคลนัลแอนติซีรัม (1:500) ของกระต่ายที่ตามด้วยแอนติบอดีต้านโพลีวาเลนต์ไบโอตินิลเลตที่เจือปน Streptavidin/HRP (ห้องปฏิบัติการ ScyTek) ส่วนต่าง ๆ ได้รับการพัฒนาโดยใช้ไดอะมิโนเบนซิดีนเตตระคลอไรด์ 0.1 เปอร์เซ็นต์กับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 0.02 เปอร์เซ็นต์และย้อมทับด้วยฮีมาทอกซิลิน ส่วนควบคุมเชิงลบถูกบ่มด้วยซีรัมที่ไม่มีภูมิคุ้มกันแทนที่ HD5 แอนติบอดี

อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบสองฉลากถูกดำเนินการเพื่อช่วยจำกัดการแสดงออกของ HD5 ในไต. ท่อรวบรวมได้รับการติดฉลากสองครั้งสำหรับเซลล์หลักที่มีแอนติบอดีต่ออะควาโพรินจากแพะโพลีโคลนัล -2 แอนติบอดี (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41] ลูปของ Henle ถูกติดฉลากสองครั้งด้วยเมาส์โพลีโคลนัลแอนติ-ฮิวแมน uromodulin แอนติบอดี (Sigma-Aldrich) และหลอดที่อยู่ใกล้เคียงถูกติดฉลากสองครั้งด้วยแพะ polyclonalantihuman aquaporin-1 (ซานตาครูซ) [41,42] Rhodamine Donkey polyclonal anti-goat (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rhodamine goat anti-mouse (JacksonImmunoResearch Laboratories) และ FITC donkey polyclonal anti-rabbit (Santa Cruz) ทำหน้าที่เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ

ทุกส่วนจัดทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ข้างต้น พวกมันถูกบ่มด้วยส่วนผสมของแอนติซีราของหนูกับ HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) ในห้อง อุณหภูมิ 90 นาที แอนติบอดีทุติยภูมิถูกนำไปใช้เป็นเวลา 90 นาทีที่อุณหภูมิห้องและส่วนต่างๆ ถูกยึดติดโดยใช้สื่อสำหรับยึดติดด้วย DAPI เซรั่มที่ไม่มีภูมิคุ้มกันถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ สไลด์ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ aLeica DM4000B และถ่ายภาพแบบดิจิทัลโดยใช้กล้อง/ซอฟต์แวร์ Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA)

ELISA

Link Biotin Antibody Labelling Kit, Novus Biologicals) โมโนโคลนัลแอนติบอดีของเมาส์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง, สเตรปทาวิดิน-ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (Biolegend, San Diego CA, USA) ถูกเติมเป็นเวลา 30 นาที หลังจากการบ่มด้วยสารละลายซับสเตรต TMB เป็นเวลา 15 นาที (Kem-En-Tec Diagnostics) ปฏิกิริยาสิ้นสุดลงด้วยสารละลาย STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) และอ่านที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร ความเข้มข้นของ HD5 จากการทดสอบ ELISA ถูกหารด้วยปัสสาวะครีเอตินีนเพื่อสร้างอัตราส่วน HD5- ต่อครีเอตินีนในปัสสาวะที่เป็นมาตรฐาน (มก./มก.) เพื่ออธิบายการเจือจางของปัสสาวะตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

อ้างอิง

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) แนวคิดปัจจุบันของกลไกการป้องกันระดับโมเลกุลที่ทำงานในระหว่างการติดเชื้อทางเดินปัสสาวะ วารสารยุโรปของการตรวจสอบทางคลินิก 38 Suppl 2: 29–38

2. Zasloff M (2007) เปปไทด์ต้านจุลชีพ ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด และทางเดินปัสสาวะที่ปลอดเชื้อตามปกติ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 18: 2810–2816

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensins: เปปไทด์ต้านจุลชีพและ cytotoxic ของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) การประมวลผลหลังการแปลของ defensins ในเซลล์ไมอีลอยด์ของมนุษย์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ เลือด 79: 1538–1544

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) beta-defensin-1 และ alpha-defensins ของมนุษย์ถูกเข้ารหัสโดยยีนที่อยู่ติดกัน: สองตระกูลเปปไทด์ที่มีโทโพโลยีไดซัลไฟด์ต่างกันมีบรรพบุรุษร่วมกัน จีโนม 43: 316–320

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr. และอื่น ๆ (1998) เบต้าดีเฟนซินของมนุษย์-1: เปปไทด์ต้านจุลชีพของเนื้อเยื่อเกี่ยวกับระบบทางเดินปัสสาวะ J Clin ลงทุน 101: 1633–1642

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, และคณะ (2011) การลดพันธะซัลไฟด์เปิดโปงกิจกรรมต้านจุลชีพที่มีศักยภาพของ beta-defensin ของมนุษย์ 1 ธรรมชาติ 469: 419–423

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U และอื่น ๆ (2002) การแสดงออกของ beta-defensins 1 และ 2 ในไตที่มีการติดเชื้อแบคทีเรียเรื้อรัง BMC ติดเชื้อ Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Paneth cell defensins: โมเลกุลเอฟเฟกเตอร์ที่สำคัญของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ ธุรกรรมทางชีวเคมีของสังคม 34: 263–266

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C และอื่น ๆ (1998) การแสดงออกของยีน การสร้างภูมิคุ้มกัน และการหลั่งของดีเฟนซินของมนุษย์-5 ในระบบสืบพันธุ์เพศหญิงของมนุษย์ แอม เจ ปทุม 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, และคณะ (2005) โปรไฟล์ Defensin ที่แตกต่างกันใน Neisseria gonorrhoeae และ Chlamydia trachomatis urethritis เผยให้เห็นปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์เยื่อบุผิวกับนิวโทรฟิลแบบใหม่ ภูมิคุ้มกันติดเชื้อ 73: 4823–4833

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D และอื่น ๆ (2003) การแสดงออกของ defensins ต้านจุลชีพในระบบสืบพันธุ์เพศชายของหนู หนู และมนุษย์ ชีววิทยาของการสืบพันธุ์ 68: 95–104

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, และคณะ (1998) การแยกสารป้องกันในลำไส้ของมนุษย์ออกจากปัสสาวะของกระเพาะปัสสาวะ ileal FEBS จดหมาย 434: 272–276

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) ความทนทานต่อแบคทีเรียในปัสสาวะหลังจากการผันปัสสาวะเชื่อมโยงกับกิจกรรมเปปไทด์ต้านจุลชีพ ระบบทางเดินปัสสาวะ 77: 509 e501–508

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) ฤทธิ์ต้านแบคทีเรียและกลไกของ recombinant human alpha defensin 5 กับสายพันธุ์ที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะทางคลินิก Afr J Microbiol ความละเอียด 4: 626–633

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epithelial defensins บั่นทอนการติดเชื้อ adenoviral: ความหมายสำหรับการรักษาด้วยยีน adenovirus-mediated การบำบัดด้วยยีนของมนุษย์ 10: 957–964

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) กลไกการวางตัวเป็นกลางของ adenovirus โดย alpha-defensins ของมนุษย์ เซลล์โฮสต์และจุลินทรีย์ 3: 11–19

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, และคณะ (2008) alpha-defensins ของมนุษย์ยับยั้งการติดไวรัส BK โดยการรวม virion และปิดกั้นการจับกับเซลล์เจ้าบ้าน วารสารเคมีชีวภาพ 283: 31125–31132

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF และอื่น ๆ (2009) การศึกษาภูมิคุ้มกันเฉพาะที่ของการติดเชื้อที่อวัยวะเพศส่วนล่าง จงหัวฟู่จังเค่อซ่าจื่อ 44: 13–15

20. Quayle AJ (2002) การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและในระยะเริ่มต้นต่อความท้าทายของเชื้อโรคในระบบสืบพันธุ์เพศหญิงและบทบาทสำคัญของเซลล์เยื่อบุผิว วารสารภูมิคุ้มกันวิทยาการเจริญพันธุ์ 57: 61–79