Cistanche สามารถช่วยสุขภาพกระดูกได้อย่างไร?

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

[บทคัดย่อ]จุดประสงค์:เพื่อศึกษาความแตกต่างทิศทางของเซลล์ต้นกําเนิด mesenchymal ไขกระดูก (MSCs) ที่เกิดจากยาจีนโบราณไตตันและเพื่ออธิบายทฤษฎีของ "ไตควบคุมกระดูกและไขกระดูก" อย่างละเยด วิธีการ: น้ํายาจีนแผนโบราณ

ซิสตันเช่เอจินาโคไซด์สามารถบรรเทาโรคกระดูกพรุน

หนู SD ได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดดําเป็นเวลา 4 วันจากนั้นเลือดจะถูกรวบรวมจากหลอดเลือดแดงใหญ่ในช่องท้องเพื่อเตรียมเซรั่มยา M SCs รุ่นที่ 4 ได้รับการฉีดวัคซีนเป็นแผ่น 6 หลุมสองแผ่นที่ 5×106 แต่ละแผ่นมี 6 หลุมแบ่งออกเป็นกลุ่มว่าง

กลุ่มโมรินดาออฟฟิซินาลิส, กลุ่มยูคอมเมียอัลมอยด์, กลุ่ม psoralen,cistancheกลุ่มกลุ่ม epimedium เมื่อเซลล์เติบโตถึง 80% กลุ่มยาแผนจีนแต่ละกลุ่มจะถูกเพิ่มด้วยเซรั่ม LD M EM ที่มีส่วนผสมของยาและสื่อดั้งเดิมของกลุ่มเปล่าจะยังคงถูกเพาะเลี้ยงต่อไป ในวันที่ 10 ของการเหนี่ยวนําแผ่น 6 หลุมจะถูกนําออกสําหรับการย้อมสี ALP; กอันคือ 6 หลุมในวันที่ 20 ย้อมด้วย Alizarin Red ผลลัพธ์: กลุ่มโมรินดาออฟฟิซินาลิส, กลุ่มยูคอมเมียอัลมอยด์,ซิสตันเช่กลุ่ม, กลุ่ม Epimedium แสดงการย้อมสี ALP ในเชิงบวกในวันที่ 10, ก้อนแคลเซียมสีขาวถูกพบเห็นประมาณวันที่ 14, และการย้อมสีแดง Alizarin เป็นบวกในวันที่ 20. สรุป: "ไต

นําโดยทฤษฎีของ "กระดูกหลักและไขกระดูก" ยาจีนไตตันสามารถก่อให้เกิดกระดูกไขกระดูกเซลล์ต้นกําเนิด mesenchymal เพื่อแยกความแตกต่างเป็น osteoblasts

คําสําคัญ: ไขกระดูกเซลล์ต้นกําเนิด mesenchymal; กระดูกพรุน; ความแตกต่างโดยตรง

แพทย์แผนจีนเชื่อว่าไตครองกระดูกเก็บสาระสําคัญและผลิตไขกระดูก ทั้งการศึกษาทางคลินิกและการทดลองได้ยืนยันความสําคัญแนวทางทางคลินิกของทฤษฎีนี้ แต่ไม่มีการวิจัยใด ๆ เกี่ยวกับการเหนี่ยวนําความแตกต่างของเซลล์ต้นกําเนิดไขกระดูก mesenchymal (MSCs) M SCs เป็นสเต็มเซลล์สําหรับผู้ใหญ่ที่มีพหูพจน์ชนิดหนึ่งซึ่งส่วนใหญ่มีอยู่ในไขกระดูก แต่ยังอยู่ในเนื้อเยื่อภายนอกของต้นกําเนิด mesenchymal ในช่วงตัวอ่อนเช่นไฟโบรบลาสต์ผิวหนังเซลล์ต้นกําเนิดไขมันเซลล์ดาวเทียมกล้ามเนื้อโครงร่างและเซลล์บุผนังหลอดเลือด ไขกระดูก M SCs (BM SCs) เป็นส่วนประกอบของสโตรมาไขกระดูก หลังจากถูกแยกและเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองภายใต้เงื่อนไขการเหนี่ยวนําบางอย่างพวกเขามีความสามารถในการแยกความแตกต่างเป็น osteoblasts, chondrocytes, เซลล์ประสาท, adipocytes, cardiomyocytes ฯลฯ ในหลาย ๆ ด้าน แหล่งที่มาหลักของเซลล์เมล็ดในวิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกคือ osteoblasts และ BMSCs แม้ว่า osteoblasts จะมีฤทธิ์เป็น osteogenic ที่ดี แต่ก็มีข้อ จํากัด ในแหล่งที่มายากที่จะแยกและได้รับในปริมาณมากและมีศักยภาพไม่เพียงพอสําหรับการขยายตัวขนาดใหญ่ในหลอดทดลองซึ่งยากที่จะตอบสนองความต้องการของการใช้งานทางคลินิกในวิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูก BM SCs ไม่เพียง แต่มีศักยภาพในการแยกความแตกต่างของกระดูกที่ดีและศักยภาพในการสร้างความแตกต่างสูง กิจกรรม osteogenic ศักยภาพในการแพร่กระจายที่แข็งแกร่งและแหล่งที่สะดวกสามารถตอบสนองวิศวกรรมเนื้อเยื่ออัตโนมัติ

ซิสตันเช่เอจินาโคไซด์สามารถรักษาได้โรคกระดูกพรุน

1 วัสดุและวิธีการ

1.1 วัสดุ

1.1.1 สัตว์ทดลอง

หนู SPF SD สิบสองตัวที่มีน้ําหนัก 120 กรัม ~ 150 กรัมไม่ จํากัด เฉพาะเพศชายและเพศหญิงซึ่งจัดทําโดยศูนย์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนกวางโจว

1.1.2 รีเอเจนต์และอุปกรณ์ Haiclone L-DM EM medium, ไฮโคลนอเมริกาใต้ทารกในครรภ์วัวเซรั่ม (FBS), โมรินดาออฟฟิซินาลิส, Psoralen, Eucommia, Cistanche, Epimedium ผงยาจีน, DM SO (sigma), Alizarin red (กวางโจว Weijia), คราบอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), ตับอ่อน 0.25% (บริษัท GI BCO) ตัวกรองเข็มฉีดยา 0.22μm (M I LL Ipo re), ขวดเพาะเลี้ยงขนาด 75 ซม.2, แผ่น 96 หลุม, แผ่น 6 หลุม (corning) เครื่องระเหยแบบโรตารี่, เครื่องอ่านไมโครเพลท (Thermo), เครื่องหมุนเหวี่ยงแช่เย็น (sigma 3K 15), ตู้อบ CO2 (บริษัท SH ELDO NA)

1.2 วิธี

1.2.1 การเตรียมเซรั่มที่มียาแผนโบราณของจีน

ใช้ผงยาจีนดิบ 150 กรัมเพิ่มเอทานอล 70% 10 เท่าความร้อนเพื่อไหลย้อนสองครั้ง 1 ชั่วโมงในแต่ละครั้งกรองรวมตัวกรองเข้มข้นกรองภายใต้ความดันลดลงถึง 300 มล. เย็นที่อุณหภูมิห้องและเก็บในตู้เย็นที่ 4 °Cเพื่อใช้ในภายหลัง เจือจางของเหลวยาแผนจีนเป็น 0.3 กรัมยาดิบ / มล. และ gavage, 1 มล. ในแต่ละครั้งวันละสองครั้งหลังจากการบริหารอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 4 วันเลือดจะถูกรวบรวมจากหลอดเลือดแดงใหญ่ในช่องท้องหลังจากการตกตะกอนในชั่วข้ามคืนหมุนเหวี่ยงที่ 2500r เป็นเวลา 20 นาทีรวบรวม supernatant และเข็มฆ่าเชื้อผ่านตัวกรองและเก็บที่อุณหภูมิ -20 ° C

1.2.2 การแยกและวัฒนธรรมของ MSC

หลังจากหนู SD ถูกดมยาสลบผ่านช่องท้องกระดูกต้นขาและกระดูกหน้าแข้งของแขนขาส่วนล่างทั้งสองถูกนําออกมาภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและทําความสะอาดเนื้อเยื่ออ่อนปลายกระดูกถูกตัดแต่งด้วย rongeurs โพรงไขกระดูกถูกสัมผัสและเข็มฉีดยาขนาด 10 มล. ถูกใช้เพื่อดูด L-DM EM ที่มีเซรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10% ล้างโพรงไขกระดูกด้วยตัวกลางซ้ํา ๆ จนกว่ากระดูกจะปรากฏเป็นสีขาวและการส่งผ่านแสงจะเพิ่มขึ้น รวบรวมน้ํายาล้างโพรงไขกระดูกในขวดเพาะเลี้ยงขนาด 75 ซม. 2 แล้ววางไว้ในตู้อบ CO 2 ขนาด 37 °C, 5% CO 2 เปลี่ยนของเหลวทุก 2 ถึง 3 วัน

1.2.3 การส่งผ่านของ MSC

เมื่อเซลล์เต็มไปด้วยก้นขวด 90% เซลล์จะถูกย่อยด้วยทริปซิน 0.25% จากนั้นปิเปตลงในเซลล์แขวนลอยและผ่านในอัตราส่วน 1:3

1.2.4 MSC ทําให้เกิดความแตกต่าง

เมื่อเซลล์ P4 รกเกินไป 90% เซลล์เหล่านั้นจะถูกย่อยด้วยทริปซิน 0.25% เพื่อเตรียมการระงับเซลล์ เซลล์ถูกเพาะในแผ่น 6 หลุม 2 แผ่นที่มีความหนาแน่นของเซลล์ 5×106 ต่อหลุมโดยมี 6 หลุมต่อแผ่น แบ่งออกเป็นกลุ่มว่างกลุ่ม Morinda officinalis, กลุ่ม Psoralen, กลุ่ม Eucommia ulmoides, กลุ่ม Cistanche cistanche, กลุ่ม epimedium เมื่อเซลล์เต็ม 80% ของก้นขวดสื่อก็เปลี่ยนไป สื่อดั้งเดิมของกลุ่มเปล่ายังคงได้รับการเพาะเลี้ยงและกลุ่มการแพทย์แผนจีนถูกเพิ่มเข้ามาด้วยสื่อ L-DM EM ที่มีส่วนผสมของยาจีน 10%

1.2.5 การย้อมสีอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส

ในวันที่ 10 ของวัฒนธรรมการเหนี่ยวนําแผ่น 6 หลุมถูกนําออกและย้อมสีตามวิธีการของชุดย้อมสีอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส สังเกตผลลัพธ์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์

1.2.6 การย้อมสีแดงของอลิซาริน

ในวันที่ 20 ของวัฒนธรรมการเหนี่ยวนําให้นําแผ่น 6 หลุมออกดูดสารละลายเหนี่ยวนํา osteoblast ล้าง 3 ครั้งด้วย P BS แก้ไขด้วยแอลกอฮอล์ 95% เป็นเวลา 10 นาทีเพิ่ม Alizarin Red-Tr is-HCl 0.1% (pH 8.3), อ่างน้ํา 37 °C เป็นเวลา 30 นาทีสังเกตผลลัพธ์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์

ซิสตันเช่เอจินาโคไซด์สามารถต้านทานการตายของเซลล์และส่งเสริมกระดูกพัฒนาการ

2 ผลลัพธ์

2.1 การสังเกตทางสัณฐานวิทยาของเซลล์

MSC เป็นเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายไฟโบรบลาสต์ซึ่งก่อตัวเป็นฟูซิฟอร์มหลังจากยึดติดกับผนัง (ดูรูปที่ 1) หลังจากเพิ่มสารละลายเหนี่ยวนําเซลล์ในกลุ่มว่างไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสําคัญ ตั้งแต่วันที่ 3 เป็นต้นไปเซลล์ในกลุ่ม Morinda officinalis กลุ่ม Eucommia ulmoides กลุ่ม Cistanche deserticola และกลุ่ม Epimedium แสดงการเจริญเติบโตของเซลล์รวมและปริมาณเซลล์ที่เพิ่มขึ้นเล็กน้อย (ดูรูปที่ 2) 14 วันต่อมาการก่อตัวของก้อนกลมที่ชัดเจนถูกมองเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ด้านหลัง (ดูรูปที่ 3) ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนในเซลล์ของกลุ่ม psoralen

2.2 การย้อมสีอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส

ในวันที่ 10 กลุ่มโมรินดาออฟฟิซินาลิสกลุ่มยูคอมเมียอัลมอยด์กลุ่ม Cistanche cistanche และกลุ่ม Epimedium ถูกย้อมด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส พบว่าพื้นที่รวมตัวของเซลล์กลายเป็นสีม่วงและสีดํา (ดูรูปที่ 4) และการกระจายตัวของเซลล์เป็นสีน้ําเงิน (ดูรูปที่ 5) ). กลุ่ม psoralen และกลุ่มที่ว่างเปล่าเป็นลบ

2.3 การย้อมสีแดงของอลิซาริน

ในวันที่ 21 กลุ่ม Morinda officinalis, กลุ่ม Eucommia ulmoides, กลุ่ม Cistanche, กลุ่ม Epimedium Alizarin Red ย้อมสีขาวเม็ดเล็ก ๆ ที่ด้านล่างของแผ่น 6 หลุมและสีแดงเข้มหลังจากการย้อมสี กลุ่ม Jitian, กลุ่ม psoralen, กลุ่ม eucommia, กลุ่ม cistanche, กลุ่ม epimedium ภายใต้กล้องจุลทรรศน์มีอนุภาคสีแดงในพื้นที่รวมตัวของเซลล์ซึ่งเป็นก้อนแคลเซียม (รูปที่ 6) กลุ่ม psoralen และกลุ่มที่ว่างเปล่าเป็นลบ

3 การสนทนา

3.1 การเตรียมเซรั่มที่มียาแผนโบราณของจีน

องค์ประกอบของการแพทย์แผนจีนมีความซับซ้อนและเป็นการยากที่จะศึกษาแต่ละองค์ประกอบ เภสัชวิทยาเซรั่มสามารถเอาชนะการรบกวนของปัจจัยที่ไม่แน่นอนเช่นคุณสมบัติทางกายภาพและทางเคมีของการเตรียมยาแผนจีนในผลการทดลองและค่อนข้างใกล้เคียงกับการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพที่แท้จริงของยาในร่างกาย

กระบวนการจริง กล่าวคือมันมีข้อดีที่สําคัญสองประการ: (1)มันสะท้อนให้เห็นถึงผลการเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีของสารประกอบในร่างกาย

(2)เอาชนะการรบกวนโดยตรงของคุณสมบัติทางกายภาพและทางเคมีของยาในการทดลอง [1]

ทั้งการเตรียมซีรั่มและที่ได้จาก M SC เป็นหนู SD และที่มีความคล้ายคลึงกันถูกนํามาใช้ในการเตรียมซีรั่มซึ่งสามารถลดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากความแตกต่างของสายพันธุ์และปรับปรุงความน่าเชื่อถือของผลการทดลอง [2] โดยคํานึงถึงการเผาผลาญของ ที่แตกต่างกัน, ใช้น้ําหนัก, วิธีการแปลงพื้นที่ผิวของร่างกายในการจัดการ. บางคนคิดว่ามีเอนไซม์จํานวนมาก, ต่อต้านร่างกาย, เสริม, ไซโตไคน์, และสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพอื่น ๆ, ซึ่งอาจมีผลกระทบโดยตรงต่อเซลล์, ไวรัส, เชื้อโรค, และเนื้อเยื่อและอวัยวะที่ใช้สําหรับการทดลองในหลอดทดลอง, ซึ่งอาจรบกวนผลการทดลองและมีผลต่อการประเมินวัตถุประสงค์ของประสิทธิภาพของยา. การแทรกแซงทางเภสัชวิทยาหลังจากการปิดใช้งานซีรั่ม [3] อย่างไรก็ตามส่วนประกอบของการแพทย์แผนจีนมีความซับซ้อนและผลกระทบทางเภสัชวิทยาในร่างกายมีความซับซ้อน เซรั่มที่ไม่ใช้งานสามารถสะท้อนถึงผลกระทบของยาในร่างกายได้ดีขึ้นและไม่เห็นผลพิษต่อเซลล์ในระหว่างการทดลอง

3.2 ผลการกระตุ้นให้เกิดยาจีนไตตันต่อความแตกต่างโดยตรงของ MSC

ไขกระดูก M SCs (BM SCs) เป็นส่วนประกอบของสโตรมาไขกระดูก หลังจากถูกแยกและเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองภายใต้เงื่อนไขการเหนี่ยวนําบางอย่างพวกเขามีความสามารถในการแยกความแตกต่างเป็น osteoblasts, chondrocytes, neurocytes, adipocytes, cardiomyocytes ฯลฯ ในหลาย ๆ ด้าน การศึกษาทดลองแสดงให้เห็นว่าทั้งหน่วยการแพทย์แผนจีน [4] และยาจีนผสมไตตัน [5] มีผลในการกระตุ้นให้ MSC แยกความแตกต่างเป็น osteoblasts ในการทดลองเซรั่มสมุนไพรจีนทั้งห้าที่เตรียมจากยาห้าชนิดที่มีผลในการ "ทําให้ไตตันและเสริมสร้างกระดูกและกล้ามเนื้อ" ยกเว้น psoralen สามารถกระตุ้นความแตกต่างของ M SCs ให้เป็นโรคกระดูกพรุน ได้ แต่กลไกเฉพาะยังคงต้องศึกษาเพิ่มเติม

3.3 ความสําคัญทางคลินิกของซีรั่มที่มีส่วนผสมของยาแผนจีนที่มีส่วนผสมของไตตันเพื่อกระตุ้นให้ MSC แยกความแตกต่างเป็นเซลล์ปลูกถ่ายเท

วิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกมีแนวโน้มกว้างสําหรับการใช้งานทางคลินิกและได้กลายเป็นจุดสนใจการวิจัยในศัลยกรรมกระดูกที่ทันสมัย. BM SCs เป็นเมล็ดพันธุ์ที่เหมาะสมที่สุดสําหรับวิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกในปัจจุบันสามารถกําจัดอิทธิพลของปัจจัยที่รบกวนเหล่านี้ต่อผลการทดลองและช่วยลดปริมาณซีรั่มที่ไม่ใช่เซลล์ งานหลักของการวิจัยเกี่ยวกับผลกระทบของมันคือวิธีการทําภายใต้เงื่อนไขที่ง่ายที่สุด แยกความแตกต่างโดยตรงเป็น osteoblasts แล้วเปลี่ยนเป็นเซลล์กระดูกที่โตเต็มที่ ในปัจจุบัน, เหนี่ยวนําที่ใช้กันทั่วไปสําหรับความแตกต่างของ M SCs เป็น osteoblasts เป็น dexamethasone, มันประกอบด้วยวิตามินซีและโซเดียม β-glycerophosphate. ทางคลินิก dexamethasone มีผลข้างเคียงเช่นการติดเชื้อโรคกระดูกพรุนและโรคกระดูกพรุนและมีผลยับยั้งอย่างมีนัยสําคัญต่อการแพร่กระจายของเซลล์ในหลอดทดลอง [6, 7] ซึ่งจะ จํากัด การใช้ MSC เป็นตัวเหนี่ยวนําในร่างกายหลังการปลูกถ่าย ยาจีนที่เป็นยาเม็ดไตมีผลในการกระตุ้นให้ MSC แยกความแตกต่างออกเป็นออสโตบลาสต์ ในการประยุกต์ใช้ทางคลินิกในระยะยาว, พิษและผลข้างเคียงของไตตันยาจีนยังไม่เคยเห็น. ดังนั้นการใช้เป็นตัวเหนี่ยวนําในร่างกายจึงมีโอกาสในการใช้งานทางคลินิกในวงกว้าง

ในระยะสั้นการวิจัยส่วนใหญ่ในปัจจุบันเกี่ยวกับ M SCs ในฐานะเซลล์เมล็ดสําหรับวิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกยังอยู่ในขั้นตอนการทดลอง วิธีรับ M SCs ให้เพียงพอในเวลาอันสั้นและกระตุ้นให้พวกเขาแยกความแตกต่างเป็น osteoblasts ด้วยวิธีการง่ายๆกําลังศึกษาอยู่ โฟกัส แม้ว่ายาแผนโบราณของจีนที่มีผลทําให้ไตชุ่มชื่นและเสริมสร้างกระดูกและกล้ามเนื้อสามารถกระตุ้นให้ M SCs แยกความแตกต่างออกเป็น osteoblasts แต่ก็มีอนาคตที่สดใสในฐานะตัวเหนี่ยวนําความแตกต่างของ M SCs สําหรับการรักษาสหภาพที่ล่าช้า nonunion และโรคกระดูกพรุนของการแตกหัก กลไกการออกฤทธิ์ยังคงต้องศึกษาต่อไป

Cistanche echinacosideสามารถต้านทานการตายของเซลล์และส่งเสริมการเจริญเติบโตของกระดูก