GRP78 การแสดงออกมากเกินไปทำให้เกิดสีชมพู1-ไมโทฟาจี้ป้องกันระบบประสาทที่ใช้ IP3R ตอนที่ 2

2.5. เวสเทิร์นบล็อท

เราทำการวางยาสลบหนูอย่างล้ำลึกด้วย Dolethal (n=4) ที่ 7 dpi เพื่อรับส่วนไขสันหลัง L4–L5 (ความยาว 5- มม.) สำหรับการวิเคราะห์แบบ Western blot เราแช่แข็งตัวอย่างด้วยไนโตรเจนเหลว

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่ามีความสัมพันธ์ใกล้ชิดระหว่างการซับโปรตีนและความทรงจำ การซับโปรตีนเป็นเทคนิคการวิเคราะห์เพื่อตรวจหาการแสดงออกของโปรตีน ซึ่งมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยด้านประสาทวิทยาศาสตร์

การเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ประสาทมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการจัดเก็บหน่วยความจำ การซับโปรตีนสามารถตรวจจับสถานะการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ประสาทและการแสดงออกของโปรตีนก่อนและหลังซินแนปติก ซึ่งเผยให้เห็นถึงบทบาทที่สำคัญของโปรตีนในการสร้างและการเก็บรักษาหน่วยความจำ

การศึกษาพบว่าการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ประสาทพรีไซแนปติกมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการก่อตัวและการเก็บรักษาหน่วยความจำ ตัวอย่างเช่น ในระหว่างกระบวนการเรียนรู้และความจำ เซลล์ประสาทเปลี่ยนการแสดงออกของโปรตีนพรีไซแนปติก และการเปลี่ยนแปลงนี้เกี่ยวข้องกับการสร้างและการจัดเก็บความทรงจำใหม่ นอกจากนี้ การศึกษาบางชิ้นยังพบว่าการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของโปรตีนบางชนิดเกี่ยวข้องกับโรคทางระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์

ดังนั้นการซับโปรตีนสามารถให้ความเข้าใจเชิงลึกเกี่ยวกับสถานะการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ประสาทและการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้อง ซึ่งเผยให้เห็นกลไกระดับโมเลกุลของเซลล์ประสาท นี่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการศึกษากลไกการสร้างความจำและโรคทางระบบประสาท

กล่าวโดยสรุป ความสัมพันธ์ระหว่างการซับโปรตีนและความทรงจำแสดงให้เห็นบทบาทของโปรตีนในการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ประสาทและการจัดเก็บหน่วยความจำ นี่เป็นแนวคิดและแนวทางใหม่ในการศึกษากลไกการสร้างความจำและโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท ให้เราส่งเสริมการวิจัยด้านประสาทวิทยาศาสตร์อย่างแข็งขันและมีส่วนร่วมในสุขภาพและอายุยืนยาว! จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมีนัยสำคัญเนื่องจากมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต่อต้านวัย ซึ่งสามารถช่วยลดการตอบสนองของออกซิเดชันและการอักเสบในสมอง จึงช่วยปกป้องสุขภาพของประสาท ระบบ. นอกจากนี้ Cistanche ยังสามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตและการซ่อมแซมเซลล์ประสาท ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเชื่อมต่อและการทำงานของโครงข่ายประสาทเทียม ผลกระทบเหล่านี้สามารถช่วยปรับปรุงความจำ ความสามารถในการเรียนรู้ และความเร็วในการคิด และยังสามารถป้องกันการเกิดความผิดปกติทางสติปัญญาและโรคเกี่ยวกับระบบประสาทได้อีกด้วย

คลิกรู้วิธีปรับปรุงการทำงานของสมอง

ตัวอย่างถูกจัดเก็บหรือประมวลผลเพิ่มเติมโดยการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์สลาย (20 มิลลิโมลาร์ HEPES, pH 7.7, ซูโครส 251 มิลลิโมลาร์, EDTA 1 มิลลิโมลาร์, EGTA 1 มิลลิโมลาร์ และค็อกเทลของโปรตีเอส (Sigma-Aldrich) และสารยับยั้งฟอสฟาเตส (โรช, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) ) ด้วยเครื่องพอตเตอร์โฮโมจีไนเซอร์บนน้ำแข็ง

หลังจากการปั่นแยกไลซีนที่ 800× กรัม เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4°C เรารวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนเป็นเศษส่วนหลังนิวเคลียร์ และหาปริมาณโปรตีนโดย BCAassay (Pierce Chemical Co.)

สำหรับการซับแบบตะวันตก เราโหลดเศษส่วนหลังนิวเคลียร์ของส่วน L4 – L5 จำนวน 30 µg จากสัตว์แต่ละตัวลงบนเจล SDS-polyacrylamide 12% เพื่อทำการแยกโปรตีนด้วยไฟฟ้า - trophoretic ตามด้วยการถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ในระบบ BioRadcuvette ใน 25 mM ทริส, pH 8.4, ไกลซีน 192 มิลลิโมลาร์, 20% (ปริมาตร/ปริมาตร) เมทานอล

เราปิดกั้นธีมเมมเบรนที่มี 5% BSA ใน PBS บวก 0.1% Tween-20 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นบ่มที่ 4 ◦C ข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ: ต่อต้าน- -แอคตินของเมาส์ ( 1:10000; SigmaAldrich), ต่อต้าน GRP78 ของเมาส์ (1:500, Sigma-Aldrich), ต่อต้าน CV ของเมาส์ (1:1000, Invitrogen), ต่อต้าน HSP60 ของกระต่าย (1:500, แอนติบอดีออนไลน์), ต่อต้าน - NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), ต่อต้าน OPA1 ของเมาส์ (1:1000, BD Biosciences), ต่อต้าน Parkin ของกระต่าย (1:500, Abcam, Cambridge, UK), ต่อต้าน PINK1 ของเมาส์ (1:500, Abcam), กระต่ายต้าน NRF2 (1:500, Abcam), ต้าน MNF2 (1:500, Abcam), กระต่ายต้าน GRP75 (1:500, Abcam)

หลังจากการล้างหลายครั้ง เมมเบรนถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่เหมาะสมที่คอนจูเกตกับฮอร์ราดิชเพอรอกซิเดส (1:5000, เวกเตอร์) มองเห็นเมมเบรนโดยใช้ส่วนผสมทางเคมีของแสง 1:1 (ลูมินอล 0.5 โมลาร์, กรด p-คูมาริก 79.2 มิลลิโมลาร์, ทริส-HCl 1 โมลาร์, pH 8.5) และ (8.8 โมลาร์ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์, 1 โมลาร์ ทริส-HCl; pH 8.5) และ ถ่ายภาพด้วยเครื่องมือ Gene Genome และวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ Gene Snap และ Gene Tools (Syngene)

2.6. ในหลอดทดลองรุ่น

เพาะเลี้ยงเซลล์ NSC34 ในกลูโคสสูงปานกลางของ Eagle ดัดแปลง (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) เสริมด้วยซีรั่มของวัวในครรภ์ 1 0% (Sigma-Aldrich), 100 ยูนิต/มล.เพนิซิลลิน และสารละลายเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 0.5 X (Sigma-Aldrich) และดูแลรักษาในตู้อบที่มีความชื้นที่อุณหภูมิ 37 ◦C ต่ำกว่า 5% CO2 ตามหลักตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26]

หลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นเวลา 4 วันโดยไม่เปลี่ยนตัวกลาง เซลล์ NSC34 จะมีฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกันซึ่งมีลักษณะพิเศษคือการมีนิวไรต์ยาว ในวันที่ 4 ยาถูกเติมเข้าไปในเซลล์ สารละลาย Tun (ซิกมา-อัลดริช, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) และ EFV (บริสตอล-ไมเยอร์ส สควิบบ์, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) ถูกเตรียมที่ความเข้มข้น 10 เท่าและละลายใน DMEM

หลังจาก 24 ชั่วโมง ประเมินความมีชีวิตของเซลล์โดยการฟักเซลล์ด้วยสารละลาย MTT 4 มก./มล. เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ผลึกฟอร์มาซานสีน้ำเงินที่เกิดขึ้นถูกละลายใน DMSO และวัดการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA)

2.7. นิวคลีโอเฟชั่น

เราแปลงเซลล์หนึ่งล้านเซลล์ด้วยพลาสมิด 2 ไมโครกรัมสำหรับการแสดงออกของ GFP, GRP78, HAPARK, เมาส์ sh-eGFP, เมาส์ sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), เมาส์ sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) และ /หรือเมาส์ sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) โดยใช้ Amaxa Nucleofector II TM (ลอนซา, บาเซิล, สวิตเซอร์แลนด์) และชุด Nucleofactor V (Lonza) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

สำหรับการวิเคราะห์ไซโตเมทริกแบบคงที่ เราได้เพาะเซลล์ใน {{0}} ที่เคลือบอย่างดีด้วยคอลลาเจน 10% หลังจากการเพาะเลี้ยง เราตรึงเซลล์ด้วย PFA 4% ล้างสองครั้งด้วย PBS และจัดเก็บหรือเพิ่มบัฟเฟอร์การขัดขวางในภายหลังที่มี PBS 0.3% (v/v)Triton X-100 และ 10% ของซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ หลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นเวลา 3 วัน ยาที่ละลายใน DMEM ถูกเติมเข้าไป

สำหรับการทดลองเหล่านี้ เราใช้ 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) หรือ 10 µM BAPTA-AM (Sigma -อัลดริช) หลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมงหลังการรักษา เราได้ตรึงเซลล์สำหรับอิมมูโนไซโตเคมีด้วย PFA 4% หรือทำให้เซลล์เหล่านั้นเป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ RIPA ที่ดัดแปลง (50 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl, pH 7.5,150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 1 มิลลิโมลาร์ EGTA , 1% NP-40, โซเดียมดีออกซีโคเลต 0.5%, SDS 0.1%, โปรตีเอสและค็อกเทลฟอสฟาเตส) สำหรับการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน อิมมูโนฮิสโตเคมีถูกดำเนินการโดยการล้างตัวอย่างสองครั้งด้วย PBS และการบ่มด้วยบัฟเฟอร์ขัดขวางที่มี PBSplus 0.3% (ปริมาตร/ปริมาตร) ไทรทัน X{-100 และซีรั่มของวัวของทารกในครรภ์ 10%

เราบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต่อไปนี้: rabbit anti-IP3R (1:200, Abcam), mouse anti-HA (1:2000, Abcam), mouse anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) และ rabbit anti-HSP60 (1:500, แอนติบอดีออนไลน์) เพื่อประเมินความมีชีวิตโดย MTT ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เราออกจากการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

2.8. การวัดการผลิตไมโตคอนเดรียซูเปอร์ออกไซด์และ ∆ψM

เซลล์ถูกบ่มด้วย MitoSOX 2.5 µM สำหรับการวิเคราะห์ซูเปอร์ออกไซด์ หรือด้วย 2.5 µMTMRM สำหรับการวิเคราะห์ ∆ψM ทั้งจาก Molecular Probes และ Invitrogen ในช่วง 30 นาทีสุดท้ายของการบำบัด ตรวจพบการเรืองแสงด้วยกล้องจุลทรรศน์ Olympus IX81 และตรวจวัดปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์สแตติกไซโตเมทรี

2.9. การวัดทางเคมีไฟฟ้าของการใช้ออกซิเจน

เซลล์ (1 × 106 ต่อ 1 มล. ใน HBSS) ถูกปั่นป่วนในห้องกันแก๊สที่อุณหภูมิ 37 °C การวัดดำเนินการด้วยอิเล็กโทรด O2 ชนิดคลาร์ก (Rank Brothers, Cambridge, UK) และบันทึกด้วยข้อมูล Dup.18 อุปกรณ์รับข้อมูล (WPI) ทันทีหลังจาก 5-ทำการรักษาด้วยยานพาหนะหรือ Tun

2.10. การแบ่งแยกไมโตคอนเดรียและไซโตโซลิก

เซลล์ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์สลาย (10 มิลลิโมลาร์ HEPES, pH 7.4, EGTA 1 มิลลิโมลาร์, ซูโครส 250 มิลลิโมลาร์ และค็อกเทลของโปรตีเอส (Sigma-Aldrich) และสารยับยั้งฟอสฟาเตส (โรช)) ด้วยเครื่องพอตเตอร์โฮโมจีไนเซอร์บนน้ำแข็ง

หลังจากการปั่นแยกไลซีนที่ 2000× g เป็นเวลา 5 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกปั่นแยกที่ 10,000× g เป็นเวลา 12 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถือเป็นเศษส่วนที่ละลายน้ำได้ (S2) และมีโปรตีนไซโตซิลิกและไมโครโซม

เม็ด (P2) คือเศษส่วนของไมโตคอนเดรียที่ทำให้อุดม ซึ่งถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ RIPA ที่ถูกดัดแปลง (50 มิลลิโมลาร์ ทริส-HCl, pH 7.5, 150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 1 มิลลิโมลาร์ EGTA, 1% NP{{8 }}, 0.5% โซเดียมดีออกซีโคเลต, 0.1% SDS, โปรตีเอสและฟอสฟาเตสค็อกเทล) และความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ BCA จากนั้นตัวอย่างจะถูกประมวลผลสำหรับ Western Blot

2.11. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน

เราจุ่มไขสันหลัง L{{0}} ส่วน L5 (1- ชิ้น) ในสารละลายตรึง PFA 2% (w/v) และกลูตาราลดีไฮด์ 2.5% (v/v) (เกรด EM) ใน 0.1 M PBS, pH 7.4 และวางไว้บนแท่นโยกเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นตรึงไว้ใน 1% (w/v) PFA และต่อมาแก้ไขภายหลังด้วย 1% (w/v) ออสเมียม เทตรอกไซด์ (TAAB Lab ) ที่มีโพแทสเซียมเฮกซะไซยาโนเฟอร์เรต 0.08% (w/v) (Sigma-Aldrich) ใน PBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมง

เราทำการล้างสี่ครั้งด้วยน้ำปราศจากไอออนและการคายน้ำตามลำดับในอะซิโตน ขั้นตอนทั้งหมดดำเนินการที่อุณหภูมิ 4 ◦C ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [33] เราฝังตัวอย่างในเรซิน EPON และเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์ที่ 60 ◦C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง

ตัวอย่างได้รับการประมวลผลเพื่อให้ได้ส่วนกึ่งบาง (1 µm) ด้วยไมโครโทม Leicaultracut UCT ย้อมด้วยสารละลายโทลูอิดีนบลูที่เป็นน้ำ 1% (w/v) และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อระบุบริเวณฮอร์นหน้าท้องที่เต็มไปด้วย MN

ส่วนที่บางเฉียบ (70 นาโนเมตร) ถูกตัดด้วยมีดเพชร วางบนตะแกรงเคลือบ และตัดกันกับยูรานิลอะซิเตตทั่วไปและสารละลายเลดซิเตรตของ Reynolds

สุดท้าย เราสังเกตส่วนต่างๆ ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (จอล 1400) ที่ติดตั้งกล้อง GatanUltrascan ES1000CCD เราเลือกสามชิ้นต่อเงื่อนไข วิเคราะห์สาม MN ต่อส่วน และวัดพื้นที่นิวเคลียสเปรียบเทียบกับพื้นที่ทั้งหมดของ MN โดยใช้เครื่องมือ ImageJ

2.12. ชีวสารสนเทศศาสตร์และสถิติ

เราใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) เพื่อเปรียบเทียบค่าระหว่างกลุ่มทดลองต่างๆ สำหรับข้อมูลที่ตรงตามสมมติฐานปกติ ความแตกต่างระหว่างกลุ่มถูกวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ตามด้วยการทดสอบแบบหลายช่วงหลังของ Tukey หรือใช้การทดสอบแบบทีของนักเรียน การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดเสร็จสิ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 สำหรับนัยสำคัญ)

3. ผลลัพธ์

3.1. ข้อความ

3.1.1. การวิเคราะห์โปรตีโอมิกของการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 เผยให้เห็นไมโตคอนเดรียเป็นเป้าหมายหลัก

เพื่อระบุกลไกระดับโมเลกุลที่นำไปสู่การปกป้องระบบประสาทโดยการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 เราทำการวิเคราะห์โปรตีโอมิกแบบไม่มีฉลากเปรียบเทียบ เพื่อระบุความแตกต่างทั้งเชิงปริมาณและคุณภาพระหว่างสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ที่ติดเชื้อด้วย adenoviruses สำหรับการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 (Ad-GRP78) ซึ่งก่อนหน้านี้พบว่ามีการป้องกันระบบประสาท ของ MN หรือเบตา-กาแลคโตซิเดส (แอด-ß-กัล) เป็นตัวควบคุม [20]

เจ็ดวันหลังการบาดเจ็บ (dpi) เป็นจุดเวลาที่เลือกสำหรับการวิเคราะห์ตามการศึกษาก่อนหน้าที่ดำเนินการในห้องปฏิบัติการของเรา [20,25] ในการเปรียบเทียบก่อนหน้านี้ระหว่างแบบจำลองของการฟื้นฟูหลัง axotomy ส่วนปลายและการเย็บเส้นประสาท sciatic กับแบบจำลอง RA ความเสื่อมของเรา เราสังเกตว่าเหตุการณ์การส่งสัญญาณมีความคล้ายคลึงกันจนถึง 7 dpi เมื่อเหตุการณ์ Divergentpro-degenerative เกิดขึ้นหลังจาก RA [20,25]

การวิเคราะห์แบบไม่มีฉลาก LC-MS/MS ของเศษส่วนหลังนิวเคลียร์จากส่วนไขสันหลัง L4- L5 ส่งผลให้สามารถระบุโปรตีนได้ 1,420 ชนิด โดยมีเปปไทด์อย่างน้อยสองตัวต่อโปรตีนตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้สำหรับตัวอย่างและการศึกษาอื่นๆ [25] .

โปรตีนหรือเปปไทด์ทั้งหมด 566 และ 732 รายการมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเนื่องจาก Ad-GRP78 หรือ Ad-ß-Gal แสดงออกมากเกินไปตามลำดับในสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ในส่วนที่เกี่ยวกับสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ที่ไม่ติดไวรัส (p < 0 .05) (ตาราง S1 และ S2)

เราเปรียบเทียบทั้งสองรายการและพบว่า 220 มีการเปลี่ยนแปลงที่ไม่ซ้ำกันเนื่องจาก Ad-GRP78 มีการแสดงออกมากเกินไป (ตาราง S3) คำอธิบายประกอบเชิงฟังก์ชันของโปรตีนเหล่านี้โดยใช้เครื่องมือฐานข้อมูลสำหรับคำอธิบายประกอบ การแสดงภาพ และการค้นพบแบบรวม (DAVID) ช่วยให้เราสามารถระบุได้ ฟังก์ชันทางชีวภาพที่สำคัญที่สุดในชุดข้อมูล (FDR < 0.05) [34,35]

การแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 ส่งผลให้เกิดความแตกต่างในระดับของโปรตีนที่เกี่ยวข้องในกระบวนการไมโตคอนเดรีย การทำงาน และส่วนประกอบ (ตาราง S4A – C, รูปที่ S1A – C) คำศัพท์ของ Gene Ontology (GO) และการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG ของข้อมูลเหล่านี้เผยให้เห็นว่าในสัตว์ที่ติดเชื้อ Ad-GRP78 มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับของโปรตีนหลายชนิดที่มีการทำงานของไมโตคอนเดรีย ซึ่งรวมถึงโปรตีนจากใบหน้าไมโตคอนเดรียด้านนอกและด้านใน โปรตีนของระบบทางเดินหายใจที่ซับซ้อน และเมทริกซ์โปรตีน

เรายืนยันความแตกต่างในระดับโปรตีนที่เปิดเผยในรายการโปรตีโอมิก เช่น GRP75 ซึ่งได้รับการควบคุม (p < 0.05) และหน่วยย่อยของคอมเพล็กซ์ V (CV ) ที่ถูกควบคุม (p=0.03) ในกลุ่ม GRP78 ตามที่คาดไว้ (รูปที่ 1A)

จากรายการทั้งหมด สิ่งที่มีการควบคุมลดลงมากที่สุดคือ 2-ออกโซกลูตาเรต/มาเลตแคริเออร์โปรตีน OGC (SCL25A11), MT-ND3 (ตัวยับยั้งเนื้องอกที่มีส่วนร่วมในกระสวยเทมาเลต-แอสพาเทต และสร้างกลุ่ม NADH ขึ้นมาใหม่ในเมทริกซ์ไมโตคอนเดรียเพื่อให้เกิดสารเชิงซ้อน ฉันทำหน้าที่), หน่วยย่อย NADH ดีไฮโดรจีเนส 3 ของคอมเพล็กซ์ I, กรดแกมมาอะมิโนบิวทีริกอะมิโนทรานสเฟอเรส ABAT และหน่วยย่อยยูบิควินอล-ไซโตโครม C รีดักเตสของคอมเพล็กซ์ III ในทางตรงกันข้าม มีโปรตีนน้อยมากที่ได้รับการควบคุม (รูปที่ 1B)

โปรตีนที่ควบคุมหนึ่งตัวคือ GRP78 ตามที่คาดไว้ และโปรตีนที่ได้รับการควบคุมอื่น ๆ คือ theamino acid Transporter EAAT2 ซึ่งส่วนใหญ่ตั้งอยู่ในพลาสมาเมมเบรนและบางครั้งในไมโตคอนเดรียที่ไซแนปส์แบบกระตุ้น และ hydroxyacyl-CoA dehydrogenase HADHA ซึ่งเร่งปฏิกิริยาสามขั้นตอนสุดท้ายของไมโตคอนเดรียเบต้า -ออกซิเดชันของกรดไขมันสายยาว

เราขยายการวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบว่าโปรตีนอื่น ๆ ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของไมโตคอนเดรียหรือไมโตคอนเดรียได้รับการแก้ไขจากรายการโปรตีโอมิกหรือไม่เพื่อยืนยันผลกระทบของไมโตคอนเดรียจากการทำงาน (รูปที่ 1C)

เราสังเกตว่าไมโตคอนเดรียอนุรักษ์ไดนามินที่เกี่ยวข้องกับ GTPase ออปติกฝ่อ 1 (OPA1) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการฟิวชั่น [36] ถูกลดระดับลง (p < 0.1); LONP1 ซึ่งเป็นโปรตีเอสที่ขึ้นกับ ATP ที่เป็นสื่อกลางในการสลายตัวแบบเลือกสรรของโพลีเปปไทด์ที่พับผิด มีแนวโน้มที่จะเพิ่มขึ้น แต่ไม่พบความแตกต่างในระดับของ ubiquinone NDUFA9 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัส NRF2 ซึ่งควบคุมยีนที่มีองค์ประกอบการตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ หรือไดนามินอื่นๆ -GTPase ที่เกี่ยวข้องกับการให้ยา เช่น mitofusin 2 (MFN2) [36]

บทสรุปที่ครอบคลุมของการเปลี่ยนแปลงที่พบในไมโตคอนเดรียแสดงไว้ในแผนภาพในรูปที่ 1ง พลศาสตร์ของไมโตคอนเดรียมีความสำคัญต่อการตอบสนองต่อความเครียด เนื่องจากไมโตคอนเดรียที่เสียหายจะหลอมรวมเพื่อแลกเปลี่ยนวัสดุ และการแยกตัวของไมโตคอนเดรียทำให้สามารถแยกไมโตคอนเดรียที่เสียหายและไมโทฟาจีที่ตามมาได้ [37]

เมื่อพิจารณาว่าจำนวนโปรตีนที่ลดลงส่วนใหญ่จำกัดอยู่ที่ไมโตคอนเดรียและไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนเกี่ยวกับกิจกรรมการหลอมรวมของไมโตคอนเดรียโดยการวิเคราะห์ MFN2 และอัตราส่วนของรูปแบบ L / S OPA1 (รูปที่ 1C) เราตรวจสอบเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับไมโทฟาจี

โดยทั่วไปแล้ว การย่อยสลายไมโตคอนเดรียที่ขึ้นกับการกินอัตโนมัติเกิดขึ้นหลังจากการดีโพลาไรเซชัน และมักถูกกระตุ้นโดยการสะสมที่เพิ่มขึ้นของฟอสฟาเตสและเทนซินโฮโมลอก (PTEN) - ไคเนสสมมุติ 1 (PINK1) ที่เกิดขึ้นเต็มความยาวเต็มที่ที่เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นนอก

ต่อจากนั้น E3 ubiquitin-protein ligase Parkin ที่อยู่ระหว่างวงแหวนถูกคัดเลือกเพื่อทำเครื่องหมายโปรตีนเมมเบรนชั้นนอกของไมโตคอนเดรียของไมโตคอนเดรียแบบดีโพลาไรซ์โดยการแพร่หลาย [38–41] ด้านบนของรูปที่ 2A ไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงในระดับพาร์กิน แต่การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ PINK1 แบบเต็มความยาวที่เกิดจากการบาดเจ็บของ RA ในส่วนของเส้นประสาทไขสันหลัง L4-L5spinal L4- ด้าน ipsilateral เทียบกับการควบคุมที่ 7 dpi ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP78 ลด Parkin แต่เพิ่มระดับ PINK1 เป็นสองเท่าหลังจาก RA เมื่อเปรียบเทียบกับการแสดงออกของการควบคุมของโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้อง -Gal (รูปที่ 2A ด้านล่าง)

การควบคุม PINK1 แบบเต็มความยาวนั้นสอดคล้องกับการเหนี่ยวนำของไมโทฟาจี [42] และการลดพาร์กินอาจเกี่ยวข้องกับสถานะการแยกส่วนออร์แกเนลล์ขั้นสูงตามที่สังเกตโดยโปรตีนไมโตคอนเดรียที่เหลือ

เรายังตรวจสอบการแปลร่วมของไมโตคอนเดรียและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูล 1A/1B light chain 3 (LC3) -positive puncta ซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญของเครื่องจักรหลักในแมคโครออโตพากีและจำเป็นสำหรับกระบวนการไมโทแฟจี [43]

เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการแปลร่วมของไมโตคอนเดรียซึ่งมีป้ายกำกับโดยใช้ anti-COX IV โดยมี LC 3- puncta เชิงบวกหลังจาก RA เฉพาะใน MN ที่เสียหายซึ่งแสดงออกมากเกินไป GRP78 ที่ 7 dpi (รูปที่ 2B)

เรายืนยันการมีอยู่ของไมโทฟาจีใน MN ที่ถูกขับออกมาเฉพาะเมื่อมีการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 โดยการวิเคราะห์ตัวอย่างโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กทรอนิกส์แบบส่องผ่าน

เราสังเกตแวคิวโอลจำนวนมากที่มีไมโตคอนเดรียแบบกลืนกัน ซึ่งเป็นจุดเด่นของไมโทฟาจี [37] คล้ายกับไมโทฟาโกโซม และ ERcisternae หลายตัวที่เชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับไมโตคอนเดรียภายใน MN จากสัตว์ Ad-GRP78 แต่เราไม่ได้ตรวจพบพวกมันใน Ad- -Gal RA ที่ได้รับบาดเจ็บ ตัวอย่างหนูที่ 5 dpi (รูปที่ 2C)

รูปที่ 1 การแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 ในสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA มีเป้าหมายไปที่โปรตีนไมโตคอนเดรีย (A) Immunoblot และกราฟแท่งแสดงการเปลี่ยนแปลงพับเฉลี่ย (± SEM) ของระดับโปรตีน GRP78, GRP75 และ CV ใน L 4- ส่วนไขสันหลัง L5 ใน GRP78 เทียบกับ

-Gal แสดงหนูที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA มากเกินไป 7 dpi ระดับถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามค่าแอกติน (n=4; * p < 0.05 เทียบกับ Ad- -Gal, การทดสอบของนักเรียน) (B) ฮิสโตแกรมของการเปลี่ยนแปลงรอยพับของโปรตีนไมโตคอนเดรียที่ได้จากการวิเคราะห์โปรตีโอมิกของส่วนของไขสันหลัง L4- จากในสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ซึ่งแสดงออก GRP78 มากเกินไปเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม Ad- -Gal 7 dpi (C)อิมมูโนล็อตและกราฟแท่งแสดงการเปลี่ยนแปลงพับเฉลี่ย (± SEM) ของ NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 ที่ทำให้เป็นมาตรฐานไปจนถึงแอกติน (ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม การทดสอบของนักเรียน) (D) แผนผังไมโตคอนเดรียที่มีโปรตีนถูกเปลี่ยนแปลงโดยการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78 ในส่วนไขสันหลัง L4- L5 จากสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ที่ถูกเน้นด้วยสีเหลือง (ลดลง) หรือสีน้ำเงิน (เพิ่มขึ้น) ที่ 7dpi

รูปที่ 2 Mitophagy ถูกมอดูเลต ใน vivo หลังจาก RA ในหนูที่แสดงออกมากเกินไป GRP78 (A) Immunoblots และกราฟแท่งที่สอดคล้องกันสำหรับการวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงพับของ PINK1 และ PARK ของระดับโปรตีน (หมายถึง ± SEM) ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในระดับแอคติน ในส่วนไขสันหลัง L 4- L5 ของหนูที่ได้รับบาดเจ็บ RA เทียบกับ

ควบคุม (ด้านบน) หรือจากกลุ่ม Ad{{0}} Gal และ Ad-GRP78 (ด้านล่าง) 7 dpi (n=4; * p < 0.05, การทดสอบของนักเรียน) (B) ซ้าย ภาพไมโครโฟโต้ของตัวแทน MN ที่ไซต์ ipsilateral จากสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA ที่ได้รับการฉีดเข้าช่องไขสันหลังของกลุ่ม AAVrh10-GFP หรือ AAVrh10-GRP78 ที่ 7 dpi ตัวอย่างถูกย้อมด้วย COX IV (สีแดง) และ LC3 (สีเขียว) และย้อมด้วยฟลูออเรสเซนต์Nissl (สีน้ำเงิน)

สเกลบาร์=10 µm และการซูมแบบดิจิทัลในส่วนที่แทรก 10X

โปรดทราบว่าการแปลร่วมจะสังเกตได้ในกลุ่ม AAVrh10-GRP78 เท่านั้น ขวา กราฟแท่งแสดงการวิเคราะห์ % ของจุดการแปลร่วมของ COX IV และ LC3 ค่าเฉลี่ย ± SEM ของการแปลร่วม COX IV และ LC3 (n=4; ** p < 0.01, การทดสอบของนักเรียน) ( C ) ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านตัวแทนโดยที่ไมโตคอนเดรียมีความโดดเด่นภายใน MNs ของไขสันหลัง: a ภาพของไซโตพลาสซึมของ MN แสดงสัตว์ที่ควบคุมไมโตคอนเดรีย; b, รูปภาพของไซโตพลาสซึม MN จากหนูที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA จากกลุ่ม Ad- -gal c, รูปภาพของไซโตพลาสซึม MN จากหนูที่ได้รับบาดเจ็บจาก RA จากกลุ่ม Ad-GRP78 โดยมีไมโตคอนเดรียที่ถูกกลืนหายไปบางส่วนแสดงด้วยเครื่องหมายดอกจันสีแดง; d ภาพกำลังขยายที่สูงขึ้นจะแสดงใน (C) ซึ่งชี้ให้เห็นการสัมผัสของไมโตคอนเดรียและ ER ขนาดใหญ่ แถบมาตราส่วนระบุไว้ในภาพ

โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP78 อาจทำให้ไมโทฟาจิอินตัดการเชื่อมต่อ MN หลังจาก RA และอาจส่งเสริมการป้องกันระบบประสาท

3.1.2. GRP78 การแสดงออกมากเกินไปช่วยฟื้นฟูการทำงานของไมโตคอนเดรียที่เสียหาย

จากนั้นเราตรวจสอบเพิ่มเติมถึงผลกระทบของการแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP78 ต่อไมโตคอนเดรียโดยใช้แบบจำลองความเครียดของ ER ในหลอดทดลอง เนื่องจากการดูถูกนี้ปรากฏขึ้นในช่วงต้นหลังจากการบาดเจ็บของ RA ใน vivoas รายงานก่อนหน้านี้ [20,26] และเป็นวิธีที่เชื่อถือได้ในการคัดกรองสารป้องกันระบบประสาทชนิดใหม่ [2,44 ]

แบบจำลองนี้ใช้ทูนิคามัยซิน (Tun) ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นความเครียดของ ER ที่ทำให้เกิดการก่อตัวของตัวกลาง N-acetylglucosamine-lipid ดังนั้นจึงป้องกันไกลโคซิเลชันของโปรตีนที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่และนำไปสู่การพับโปรตีนผิด เราคิดว่าเนื่องจากมีรายงานว่าเส้นทางการหลั่งที่หยุดชะงักเป็นกุญแจสำคัญในกระบวนการทำงานของระบบประสาทหลังจาก RA [26]

ก่อนอื่นเราตรวจสอบว่านิวเคลียสของเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายโมโตนิวรอน NSC34 ด้วยเวกเตอร์ที่เหมาะสมส่งผลให้เกิดการผลิต GRP78 (รูปที่ 3A) ในเซลล์เหล่านี้การแสดงออกของ GRP78 ช่วยเพิ่มความอยู่รอดของตัวกลางที่มี Tun (รูปที่ 3B) อย่างมีนัยสำคัญ

แม้ว่าโดยทั่วไปการรักษาด้วย Tun จะชักนำ GRP78 เอง แต่การแสดงออกภายนอกที่มากเกินไปนี้ค่อนข้างช้า (ภายใน 24 ชั่วโมง) (รูปที่ S2) นอกจากนี้เรายังสงสัยด้วยว่าเราสามารถระบุได้ว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP78 มีผลกระทบต่อการป้องกันระบบประสาทในแบบจำลองหลอดทดลองอื่นที่เรารายงานก่อนหน้านี้เพื่อสร้างลักษณะหลายประการของการเสียชีวิตของ MN หลังจากได้รับบาดเจ็บจาก RA หรือไม่ [26]

แบบจำลองนี้อิงจากความเสียหายของโครงร่างเซลล์ที่เกิดจากโนโคดาโซล ซึ่งรบกวนการเกิดปฏิกิริยาพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูล การแสดงออกของ GRP78 เพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ที่เพาะเลี้ยงเมื่อมี nocodazole เช่นกัน (รูปที่ 3B)

จากนั้นเราประเมินการทำงานของไมโตคอนเดรียโดยการวัดการสร้างสายพันธุ์รีแอคทีฟออกซิเจน (ROS) ในไมโตคอนเดรียโดยใช้ MitoSOX ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (∆ψm) โดยใช้ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) และอัตราการบริโภค O2 ในเซลล์ NSC34 ของเราภายใต้ความเครียด ER มีหรือไม่มีการแสดงออกมากเกินไปของ GRP78

เนื่องจากการควบคุมเชิงบวก เราใช้ efavirenz (EFV) ซึ่งเป็นสารที่เป็นพิษต่อไมโตซึ่งเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์ทั้งสาม [45] เราสังเกตว่าระดับ MitoSOX เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องหลังจากการเติม Tun ซึ่งมีนัยสำคัญทางสถิติภายใน 24 ชั่วโมงและการสร้าง ROS เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่ได้รับ EFV จากการรักษาหลังการรักษาในชั่วโมงแรกที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมด้วยยานพาหนะ (รูปที่ S3A)

การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP78 ส่งผลให้ระดับไมโตคอนเดรีย ROSin ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเซลล์ที่แสดง GFP ที่ 24 ชั่วโมงหลังการรักษา Tun หรือ EFV (รูปที่ 3C) ∆ψm ถูกยุบหลังจาก 5 และ 24 ชั่วโมงของการรักษาด้วย Tun และหลังจาก 24 ชั่วโมงของการรักษาด้วย EFV (รูปที่ S3B) การกู้คืนพารามิเตอร์นี้ทำได้โดย GRP78 overexpressionin ในเซลล์ที่ได้รับ Tun- หรือ EFV (รูปที่ 3 มิติ)

อัตราการใช้ O2 ลดลงในระหว่างการวิเคราะห์ 80 นาทีหลังจากการเติม Tun ในเซลล์ที่แสดง GFP (ความชัน −0.063,R2=0.98) แต่ปริมาณการใช้ O2 อยู่ที่ เสถียรใน GRP 78- เซลล์ที่แสดงออกมากเกินไปแม้ว่าจะมี Tun ก็ตาม (ความชัน −0.221, R 2=0.99) (รูปที่ 3E ซ้าย)

หลังจากผ่านไป 5 ชั่วโมง การหายใจเป็นปกติในเซลล์ที่มีการแสดงออก GRP78- มากเกินไป และลดลงอย่างรุนแรงในเซลล์ที่แสดง GFP (รูปที่ 3E ขวา) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GRP78 ลดการทำงานของไมโตคอนเดรียที่เกิดจากความเครียดของ ER หรือความเป็นพิษต่อไมโต

For more information:1950477648nn@gmail.com