รูปแบบการแสดงออกของ -Tubulin, Inversin และเป้าหมายที่ไม่เรียบร้อย-1 และสัณฐานวิทยาของตาชั้นแรกในพัฒนาการของไตและโรคปกติของมนุษย์
Mar 10, 2022
เชิงนามธรรม:การแสดงออกเชิงพื้นที่ของโปรตีน -tubulin, inversion และที่ไม่เรียบร้อย-1 (DVL-1) ที่เกี่ยวข้องกับวิถีการส่งสัญญาณ Wnt และสัณฐานวิทยาของตาปฐมภูมิถูกวิเคราะห์ในการพัฒนาไต(สัปดาห์พัฒนาการ 14–38) หลังคลอดที่มีสุขภาพดี (1.5- และ 7-ปี) และมนุษย์ที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาไตรวมถึง dysplastic หลายใบไต(MCDK), glomerulosclerosis เฉพาะส่วนโฟกัส (FSGS) และโรคไตในประเภทฟินแลนด์ (CNF) การวิเคราะห์ดำเนินการโดยวิธีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์สองครั้ง กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน วิธีกึ่งปริมาณและสถิติ การแสดงออกร่วมของไซโตพลาสซึมของ -ทูบูลิน, การผกผันและ DVL-1 ถูกสังเกตพบในทูบูลที่บิดเบี้ยวส่วนต้น (pct), ท่อที่บิดเบี้ยวส่วนปลาย (dct) และโกลเมอรูไล (g) ของเนื้อเยื่อที่วิเคราะห์ ในระหว่างไตพัฒนาการ การแสดงออกโดยรวมของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1ลดลง ในขณะที่ในระยะหลังคลอดเพิ่มขึ้นเล็กน้อย การแสดงออกสูงสุดของ -tubulin และการผกผันแสดงลักษณะเฉพาะ dct และ g ในขณะที่ DVL สูง-1 แสดงคุณลักษณะ pct -tubulin, inversion และ DVL-1 รูปแบบการแสดงออกใน MCDK, FSGS และ CNFไตแตกต่างอย่างมากจากการควบคุมสุขภาพ เมื่อเทียบกับสุขภาพไต, การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาไตมีตาชั้นแรกผิดปกติ ไดนามิกนิพจน์ที่แตกต่างกันของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 ระหว่างไตการพัฒนาอาจบ่งชี้ว่าการสลับไปมาระหว่างสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติและแบบไม่เป็นมาตรฐานเป็นสิ่งสำคัญสำหรับภาวะปกติไตสัณฐานวิทยา ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกของพวกเขาถูกรบกวนในทางพยาธิวิทยาไตอาจสัมพันธ์กับซีเลียปฐมภูมิผิดปกติ นำไปสู่โรคเรื้อรังโรคไต
คำสำคัญ:การพัฒนาไตของมนุษย์ -ทูบูลิน; อินเวอร์ซิน; DVL-1; เอ็มซีดีเค; เอฟเอสจีเอ; ซีเอ็นเอฟ; ไต ไต
CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต
บทนำ
การพัฒนาของ definitive หรือ metanephricไตเริ่มต้นในช่วงสัปดาห์ตั้งครรภ์ที่ห้า (GW) ซึ่งจะสร้างความแตกต่างอย่างต่อเนื่องเพื่อสร้างไตถาวร [1,2] การส่งสัญญาณระหว่าง mesenchyme metanephric และ ureteric bud ช่วยให้มั่นใจได้อย่างเหมาะสมไตการพัฒนาในระหว่างการสร้างไต โดยสังเขป ตาของท่อไตทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ mesenchymal-to-epithelial (MET) ใน metanephric mesenchyme ซึ่งควบแน่นและก่อตัวไตถุงน้ำ ตามด้วยวัตถุรูปลูกน้ำและรูปตัว S และในที่สุดก็นำไปสู่การก่อตัวของโกลเมอรูไล [3] ในทางกลับกัน mesenchyme จะกระตุ้นให้เกิดการแตกแขนงของไตมากขึ้น ไต metanephric กลายเป็นหน่วยขับถ่ายที่ใช้งานได้ในสัปดาห์ที่ 11 ของการพัฒนามนุษย์ อย่างไรก็ตาม กระบวนการสร้างไตจะเสร็จสิ้นภายในสัปดาห์ที่ 34 ถึง 36 ของการพัฒนาของทารกในครรภ์ เมื่อเหตุการณ์การแตกแขนงหลายครั้งเสร็จสิ้นลง แต่กระบวนการสร้างความแตกต่างของไตจะดำเนินต่อไปจนถึงช่วงหลังคลอด [4,5] การหยุดชะงักของปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนเหล่านี้ส่งผลให้เกิดความผิดปกติ แต่กำเนิดต่างๆ ของไตและทางเดินปัสสาวะ (CAKUT) รวมถึง dysplasia โรคไต polycystic dysplastic multicysticโรคไต(MCDK) ส่งผลให้เกิดโรคเรื้อรังโรคไต(โรคไต) [6].
ในการศึกษานี้ เรามุ่งเน้นไปที่ลักษณะที่ปรากฏของ cilia ขั้นต้นและเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt ซึ่งมีบทบาทสำคัญในระหว่างการสร้างไตตามปกติและในไตกระบวนการซ่อมแซมภายหลังเฉียบพลันหรือเรื้อรังโรคไต[7]. การดำรงอยู่ของขนตาหลักในระหว่างการสร้างไตและการพัฒนาจำนวนมากไตข้อบกพร่องที่เกิดขึ้นในผู้ป่วยโรคเลนส์ปรับเลนส์บ่งชี้ว่าการทำงานของเลนส์ตาปฐมภูมิที่แท้จริงมีความจำเป็นต่อภาวะปกติไตอวัยวะ [8,9]. ซีลีเนียมปฐมภูมิเป็นออร์แกเนลล์ที่มีไมโครทูบูลเป็นส่วนประกอบสำคัญสำหรับสภาวะสมดุลของเนื้อเยื่อ โดยที่ -ทูบูลินเป็นองค์ประกอบพื้นฐาน [10] การสูญเสีย -tubulin acetylation ในเซลล์อมตะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิวเป็น mesenchymal (EMT) ซึ่งหมายความว่า acetylated -tubulin มีความสำคัญในการรักษาเสถียรภาพของ microtubules [11] ในระหว่างการพัฒนาของมนุษย์ วิถี Wnt ที่มี cilia-mediated หลักช่วยให้เซลล์มีการเพิ่มจำนวน การแยกความแตกต่าง และการสร้างรูปร่างของเนื้อเยื่อ [12] เด็กจำนวนมากที่มีความบกพร่องในการทำงานของ cilia หลักและขัดขวางเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt พัฒนา CKD โดยกำเนิดไตความผิดปกติมีส่วนรับผิดชอบต่อเกือบครึ่งหนึ่งของกรณี [13] โรคซิสติกที่มีมา แต่กำเนิดที่พบบ่อยที่สุดในเด็กคือโรคถุงน้ำคร่ำหลายใบโรคไต(MCDK) [14]. ซีสต์หลายตัวไม่สื่อสาร [15] และขาดความปกติไตparenchyma เป็นการค้นพบด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีลักษณะเฉพาะสำหรับ MCDK Focal Segmental glomerulosclerosis (FSGS) เป็นหนึ่งในโรคไตที่พบบ่อยที่สุดที่นำไปสู่ระยะสุดท้ายโรคไต[16]. ในตอนแรก FSGS เป็นลักษณะเฉพาะของการโฟกัส ซึ่งเกี่ยวข้องกับโกลเมอรูไลส่วนน้อยและปล้องปล้องเท่านั้น ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงเพียงส่วนหนึ่งของวงกลมไต [17] กลุ่มอาการของโรคไต แต่กำเนิดของประเภทฟินแลนด์ (CNF) เป็นกรรมพันธุ์ autosomal ที่หายากโรคไตแสดงโดยการระบาดก่อนคลอดของการสูญเสียโปรตีนอย่างกว้างขวาง [18] ที่เกี่ยวข้องกับการเกิด cystogenesis ของท่อใกล้เคียง [19] โรคไตปฐมภูมิหลายรูปแบบพัฒนาโปรตีนในปัสสาวะอันเป็นผลมาจากสิ่งกีดขวางการกรองไตที่เสียหาย [20] การศึกษาจำนวนมากบ่งบอกว่าการบาดเจ็บและความผิดปกติของ podocytes มีบทบาทที่แท้จริงในการเกิดโรคของโปรตีนในปัสสาวะ CKD [21] การศึกษาโดย Vukojevic และคณะ แสดงจำนวนที่เพิ่มขึ้นของ podocytes ciliated และแตกต่างต่ำใน CNF [22] การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่าเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt/ -catenin มีบทบาทสำคัญในการกลั่นกรองความผิดปกติของ podocyte ด้วยโปรตีนในปัสสาวะ [23] มีสองเส้นทางหลักในการส่งสัญญาณ Wnt วิธีหนึ่งเรียกว่า Canonical -catenin-dependent และ noncanonical อื่น ๆ -catenin อิสระ ระหว่างเมาส์ไตพัฒนาการ การส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัตินั้นทำงานบนปลายตาของไตและในร่างกายรูปตัว S [24] นอกจากนี้ Wnt ผ่านการส่งสัญญาณตามบัญญัติมีความเกี่ยวข้องในการรักษา MET ในระหว่างการสร้างไต [25] กล่าวคือ การผูกมัดของโปรตีนเชิงซ้อนที่มี Dvl กับตัวรับเมมเบรนเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการกระตุ้นเส้นทาง Wnt ในขณะที่การปิดใช้งานองค์ประกอบหลักของวิถีนี้ส่งผลให้เกิดการตายปริกำเนิดในระยะแรกเนื่องจากไม่มีโซนไตในไต[25].
โปรตีนที่มีความสำคัญในฐานะการสลับระดับโมเลกุลระหว่างวิถีการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติและแบบไม่เป็นมาตรฐานนั้นพบว่ามีการผกผัน [26] แม้ว่าจะตรวจพบปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนต่างๆ กับการผกผัน แต่ฟังก์ชันที่แน่นอนยังไม่ได้รับการชี้แจงอย่างสมบูรณ์ ในไตเซลล์เยื่อบุผิวผกผันอยู่ใน cilia ปฐมภูมิซึ่งทำหน้าที่เป็นโปรตีนปรับเลนส์ [27] นอกจากนี้การผกผันยังก่อให้เกิดความซับซ้อนคงที่กับทูบูลินในวัฒนธรรมของไตเซลล์และพวกมัน colocalize ในร่างกาย [27,28]. การผกผันดูเหมือนจะมีบทบาทสำคัญในการสร้างมอร์ฟเจเนซิสในช่วงต้นของระบบโปรเนฟริกและการกำหนดสมมาตรซ้าย-ขวาระหว่างการพัฒนา [29,30] เหตุการณ์สำคัญสำหรับทั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติและแบบไม่เป็นมาตรฐานในการรับสมัคร Dvl ของไซโตพลาสซึมไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ เนื่องจากผลการวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการผกผันและ Dvl จัดกลุ่มในเซลล์เยื่อบุผิวของไต จึงสามารถคาดการณ์ได้ว่าการผกผันอาจมีบทบาทในการส่งสัญญาณแบบ noncanonical การไม่เป็นระเบียบของการส่งสัญญาณ Wnt ที่เป็นสื่อกลางโดยการผกผันทำให้เกิดการงอกขยายอย่างผิดปกติในท่อ [31] การทดสอบทางพันธุกรรมเผยให้เห็นการกลายพันธุ์ของ DVL-1 ในผู้ป่วยโรค Robinow syndrome ที่โดดเด่นด้วย autosomal ซึ่งนำเสนอความผิดปกติที่แตกต่างกันในผู้ป่วยบางรายที่เกี่ยวข้องกับระบบทางเดินปัสสาวะและไตความผิดปกติ [32].
CISTANCHE จะปรับปรุงการฟอกไต/ไต
รูปแบบการแสดงออกของพัฒนาการของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 ได้รับการตรวจสอบในแบบจำลองสัตว์ต่างๆ ดังนั้นการแสดงออกของพวกมันในโปรเนฟรอสของ Xenopus laevis จึงได้รับการยืนยันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ในช่องปาก [31] ในขณะที่พบพวกมันในเซลล์ที่ได้มาจากเซลล์ท่อใกล้เคียงของหนูโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและแมสสเปกโตรเมทรี [33] นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์แบบคู่พบว่ามีอยู่ในส่วนต่างๆ ของหนูไต[34]. การศึกษาเกี่ยวกับหนูที่น่าพิศวงผกผันรายงานว่าซีสต์ขยายตัวและกระจายในไตไขกระดูกและเยื่อหุ้มสมองที่เกี่ยวข้องกับการผกผันของอวัยวะภายใน [35] ในมนุษย์ การกลายพันธุ์ของการผกผันถูกนำเสนอด้วยโรคไตอักเสบในวัยแรกเกิดซึ่งนำไปสู่การยุติการตั้งครรภ์ [36] แม้จะมีการศึกษามากมายเกี่ยวกับไตรูปแบบการแสดงออกของทูบูลิน การผกผัน และ DVL-1 รูปแบบการแสดงออกและหน้าที่ เท่าที่ทราบ รูปแบบการแสดงออกของโปรตีนเหล่านี้ในเนื้อเยื่อของมนุษย์ในครรภ์และหลังคลอดของมนุษย์ยังไม่ได้รับการตรวจสอบและทำให้เกิดความสัมพันธ์ นอกจากนี้ ยังไม่มีรายงานหลักฐานที่พิจารณาการแสดงออกของการผกผันและ DVL-1 ในการพัฒนามนุษย์ในระยะแรก ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกเชิงพื้นที่และเวลาของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 ระหว่างระยะของทารกในครรภ์และหลังคลอดของมนุษย์ที่มีสุขภาพดีไต, เช่นเดียวกับในไตเนื้อเยื่อของ MCDK, FSGS และ CNFไตเพื่อสร้างความเชื่อมโยงที่เป็นไปได้ที่ขาดหายไประหว่างหน่วยงานเหล่านี้ กล่าวคือ เราเสนอว่ารูปแบบการแสดงออกที่รบกวนของโปรตีน -tubulin, inversion และ DVL-1 อาจเป็นกระบวนการสร้างซิสโตเจเนซิสที่แฝงอยู่และการทำงานที่ผิดปกติของซีเลียปฐมภูมิที่นำไปสู่โรคเรื้อรังโรคไต
ผลลัพธ์
การวิเคราะห์พัฒนาการและหลังคลอดไตเนื้อเยื่อถูกดำเนินการบนโครงสร้างที่แตกต่างอย่างชัดเจนของไต:หลอดที่บิดเบี้ยวใกล้เคียง (pct), หลอดที่บิดเบี้ยวส่วนปลาย (dct) และโกลเมอรูไล (g) ระหว่างช่วงพัฒนาการวิเคราะห์และหลังคลอดไตเนื้อเยื่อ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 แสดงรูปแบบการแสดงออกในเชิงบวก แต่มีความแตกต่างในด้านความเข้ม การกระจาย และปริมาณ การวิเคราะห์ทางพยาธิวิทยาเนื้อเยื่อไตของ MCDK, FSGS และ CNF ดำเนินการในการนับจำนวนภาพที่สมบูรณ์ของเซลล์ที่เป็นบวกเมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเนื้อเยื่อไตที่มีสุขภาพดี
2.1. กล้องจุลทรรศน์แสง กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน และอิมมูโนฮิสโตเคมี ( -Tubulin) ของเนื้อเยื่อไตของมนุษย์หลังคลอดที่มีสุขภาพดีและเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา
2.1.1. แสงไตหลังคลอดเพื่อสุขภาพ
กล้องจุลทรรศน์หลังคลอดไตเนื้อเยื่อแสดงให้เห็นชัดเจนไตโครงสร้างที่มีความแตกต่างอย่างชัดเจนระหว่างไขกระดูกและเยื่อหุ้มสมองกับการก่อตัวของ pct, dct และ g ในบริเวณเปลือกนอก การย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีของ -tubulin เผยให้เห็นการมีอยู่ของซีลีเนียมปฐมภูมิหนึ่งซีเลียมที่กึ่งกลางของผิวเซลล์ปลายสุดของเซลล์รูปท่อแต่ละเซลล์และใน 0018 เปอร์เซ็นต์ ± 0.00014 เปอร์เซ็นต์ SD บนพื้นผิวของเซลล์ไต กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแสดงการมีอยู่ของซีเลียมปฐมภูมิเพียงตัวเดียวที่เกิดจากตัวฐานที่ผิวเซลล์ปลายสุดของท่อ (รูปที่ 1a)
2.1.2. CNF
g ที่วิเคราะห์ส่วนใหญ่มีขนาดเล็กกว่าและเป็นก้อน (80 เปอร์เซ็นต์ ) ในขณะที่ส่วนน้อยมีขนาดปกติหรือ hypertrophic (20 เปอร์เซ็นต์ , n=100) พบเส้นโลหิตตีบตามเซ็กเมนต์หรือทั่วโลกของ g ในขณะที่ pct และ dct ถูกขยายบางส่วนและเคลือบด้วยเยื่อบุผิวแกร็น Ultrastructural สูญเสีย microvilli และความสูงของเซลล์ลดลงด้วยนิวเคลียสหลายส่วน ใน podocytes กระบวนการของเท้าจะหายไปอย่างกระจัดกระจาย cilia ปฐมภูมิของท่อไม่เป็นระเบียบ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในซีสต์ส่วนต้นของ tubules ซึ่งแสดงการเปลี่ยนแปลงในความยาวและตำแหน่งของไซโตพลาสซึม (รูปที่ 1b)
2.1.3. MCDK
ในเนื้อเยื่อไตจะพบ g ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะและ g ที่โตเต็มที่ไตเนื้อเยื่อเต็มไปด้วยซีสต์รูปไข่จำนวนมาก เซลล์เยื่อบุผิวแบบเสาปกคลุมซีสต์และล้อมรอบด้วยเนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่หลวม การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีกับ -tubulin แสดงซิเลียปฐมภูมิที่ยาวและไม่เป็นระเบียบจำนวนมากบนพื้นผิวของเซลล์เยื่อบุผิว (รูปที่ 1c)
2.1.4. FSGS
ใน 90 เปอร์เซ็นต์ของ g พบว่ามีเส้นโลหิตตีบปล้องที่กว้างขวาง (n=100) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าและสัญญาณของความเสียหายของท่อ การลดลงของความสูงของเซลล์เยื่อบุผิวที่มีการสูญเสีย microvilli นั้นพบได้ในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในขณะที่เซลล์บุผนังหลอดเลือดและบริเวณ mesangial มีโครงสร้างพื้นฐานปกติ ในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน พบซีเลียมที่ยาวและคลาดเคลื่อน (กระจายอำนาจ) บนพื้นผิวของเซลล์ท่อส่วนปลาย (รูปที่ 1e) Podocytes แสดงการสูญเสียกระบวนการของเท้าแบบกระจายด้วยเนื้อเยื่อ microvillus ที่กว้างขวาง การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีคอลไปยังเอ-ทูบูลินแสดงซีเลียปฐมภูมิที่ยาวและไม่เป็นระเบียบหลายจุดบนผิวเซลล์เยื่อบุผิว (รูปที่ 1c)
2.2. การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับ 心Tubulin, Inversion และ DVL-1- และการวิเคราะห์ทางสถิติของพัฒนาการและไตของมนุษย์หลังคลอดที่มีสุขภาพดี
ในสัปดาห์ที่ 14, 15 และ 16 ของการตั้งครรภ์ไตเนื้อเยื่อจะถูกนำเสนอด้วยขั้นตอนการพัฒนาที่แตกต่างกันของการก่อตัวของเนฟรอน: จากถ้วยเมตาเนฟริกไตvesicles ทำหน้าที่ควบคุม nephrons รูปตัว S ทำให้เกิดโซน nephrogenic ในเยื่อหุ้มสมองชั้นนอก (รูปที่ 2) ความแตกต่างของ pct, dct และ g สามารถสังเกตได้ในบริเวณเปลือกนอกใกล้กับไตไขกระดูก ในช่วง GW ที่ 22 ส่วนของไขกระดูกและเยื่อหุ้มสมองมีความโดดเด่นอย่างชัดเจน ในขณะที่ GW ที่ 38ไตโครงสร้างมีลักษณะแตกต่างกันอย่างมาก ประกอบด้วย pct, dct และ g
2.2.1. เอ-ทูบูลิน
ในระหว่างการพัฒนา a-tubulin แสดงออกอย่างมากในการพัฒนาทั้งหมดไตโครงสร้างซึ่งส่วนใหญ่แสดงภาพรูปแบบของ cilia ปฐมภูมิบนพื้นผิวของเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อมของแคปซูลของ Bowman, g, pct และ dct ภายในไตเนื้อเยื่อ 82-97 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ pct แสดง a-tubulin ในขณะที่การแสดงออก dct ลดลงจาก 99 เปอร์เซ็นต์เป็น 72 เปอร์เซ็นต์ใน GW ที่ 38 (ดูรูปที่ 3 ตารางที่ 1) ในบรรดาขั้นตอนการพัฒนาที่แตกต่างกันการแสดงออกของ a-tubulin ที่แข็งแกร่งที่สุดนั้นพบได้ใน g ของ GW ที่ 16ไตซึ่งประกอบด้วยเซลล์บวกร้อยละ 93 lithe 14, 15 และ 22 GW (ดูรูปที่ 3a,b, ตารางที่ 1), ประมาณ 70 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ g แสดง a-tubulin ในขณะที่การแสดงออกน้อยที่สุดถูกสังเกตใน 38th GW (p < 0.01)="" ด้วย="" 34="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวก="" (รูปที่="" 3c)="">ไตเนื้อเยื่อ (1.5-ปีและ 7-ปีไต) การกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่แรงที่สุดต่อ a-tubulin จะสังเกตได้บนพื้นผิวเซลล์ปลายของ pct และ dct (รูปที่ 3d-f) การแสดงออกของ a-tubulin ยังมีอยู่ในไซโตพลาสซึมรอบนิวเคลียสของ dct และเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อมของแคปซูลของโบว์แมน a-tubulin คราบทั้งหมดไตโครงสร้างที่มีค่าเฉลี่ย 50 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวกในเปอร์เซ็นต์, 94 เปอร์เซ็นต์ใน dct และ 85 เปอร์เซ็นต์ใน g (รูปที่ 3f) คราบ Dct แตกต่างจาก pct อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.0001)="" โครงสร้างที่ตรวจสอบทั้งหมดมีผลบวกต่อ="" a-tubulin="" โดย="" 77%="" ของเซลล์บวกในเปอร์เซ็นต์="" 72="" เปอร์เซ็นต์ใน="" dct="" และ="" 58="" เปอร์เซ็นต์ใน="" g="">
รูปที่ 3 การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของ -tubulin และ DAPI ในเนื้อเยื่อไตของมนุษย์ที่กำลังพัฒนาและหลังคลอด (a–e) ไตของ 14, 15/16, 38 GW (a–c);ไตจาก 1.5- และ 7-เด็กอายุ (d,e) การย้อมสีที่เป็นบวกของ -tubulin (ลูกศร) จะแสดงในแต่ละโครงสร้างในเยื่อหุ้มสมองผ่านระยะพัฒนาการและระยะหลังคลอด (a–e), ท่อที่ซับซ้อนใกล้เคียง (pct), ท่อปลายโค้งส่วนปลาย (dct) และโกลเมอรูลี (g) รายละเอียดของ cilia หลักใน pct (d) และ dct (a–c,e) จะแสดงเป็นภาพขยายที่สูงขึ้น (กล่องสีขาว) กำลังขยาย ×40 แถบมาตราส่วน 100 µm การกระจายของเซลล์บวก -Tubulin ต่อโครงสร้างตลอดระยะต่างๆ ของการพัฒนาและในระยะหลังคลอดแสดงไว้ในกราฟ (f) กราฟ (g) (จำนวนเซลล์บวกโปรตีนโดยรวมในโครงสร้างที่สังเกตได้) แสดงการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเวลาการพัฒนา (การถดถอยเชิงเส้น) และความสัมพันธ์ระหว่าง -Tubulin กับ DVL-1 ผ่านการพัฒนาและการเจริญเต็มที่ (Two-Way ANOVA ตามด้วย การทดสอบหลังการทำของ SIDAK) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD
การกระจายตัวของ -tubulin-positive cells ต่อโครงสร้างตลอดระยะต่างๆ ของการพัฒนาและในระยะหลังคลอดแสดงไว้ในกราฟ (f) กราฟ (g) (จำนวนเซลล์บวกโปรตีนโดยรวมในโครงสร้างที่สังเกตได้) แสดงการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเวลาการพัฒนา (การถดถอยเชิงเส้น) และความสัมพันธ์ระหว่าง -tubulin กับ DVL-1 ผ่านการพัฒนาและการเจริญเต็มที่ (ANOVA แบบสองทางตามด้วย การทดสอบเฉพาะกิจของ Sidak) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD
2.2.2. Double Immunoflfluorescence Staining to Inversion and DVL-1 และ DAPI Nuclear Stain ในการพัฒนาและการแสดงออกของการผกผันของไตหลังคลอดที่ดีต่อสุขภาพในการพัฒนาและเนื้อเยื่อไตหลังคลอด
ในวันที่ 14, 15 และ 16 GW การผกผันแสดงการแสดงออกของเม็ดละเอียดที่แข็งแกร่งใน g และการแสดงออกของเม็ดละเอียดที่ไม่รุนแรงในไซโตพลาสซึมของ pct และ dct (รูปที่ 4a,b) ในขณะที่ใน GW 22 และ 38 (ดูรูปที่ 4c) อย่างแรง การแสดงออกในเชิงบวกถูกสังเกตใน g (ตารางที่ 1) ระหว่าง 14 และ 22 GW ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์แสดงเวอร์ชัน ใน GW ที่ 16 เซลล์ pct แสดงการผกผันใน 73 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ ในขณะที่ลดลงเหลือ 29 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ (p < 0.05)="" ใน="" gw="" ที่="" 38="" (ดูรูปที่="" 4f)="" การแสดงออกในเชิงบวกของการผกผันพบได้ในประมาณ="" 80–90="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์="" dct="" และ="" g="">ไตเนื้อเยื่อของ GW ที่ 14 และ 16 โดยมีการแสดงออกต่ำสุดใน dct ที่ 38th GW (p < 0.05,="" p="">< 0.0001="" ตามลำดับ)="" โดยที่="" 66="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์เป็นค่าบวก="">ไต, pct คราบอย่างแรงที่เยื่อหุ้มเซลล์ปลายสุด ในขณะที่ dct คราบส่วนใหญ่ที่เยื่อหุ้มเซลล์ฐานและในไซโตพลาสซึมรอบนิวเคลียส (รูปที่ 4d,e) ในขั้นตอนนั้น เราพบการแสดงออกของการผกผันในทุกการตรวจสอบไตโครงสร้าง ซึ่งรวมถึง pct, dct และ g โดยมีค่าเฉลี่ยของเซลล์บวกที่ 92 เปอร์เซ็นต์สำหรับ pct, 88 เปอร์เซ็นต์สำหรับ dct และ 90 เปอร์เซ็นต์สำหรับ g (รูปที่ 4f) เราไม่ได้สังเกตความแตกต่างของความแรงของสัญญาณของการแสดงออกการผกผันระหว่างโครงสร้าง การแสดงออกสูงสุดของการผกผันพบใน g โดยมีค่าเฉลี่ย 94 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวก (รูปที่ 4f) พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบการย้อมของ g (โดยที่ 94 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ย้อมในเชิงบวก) กับ pct โดยที่ 58 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่ย้อมสีในเชิงบวก (p < 0.01)="" และกับ="" dct="" โดยที่="" 49="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์อยู่="" บวก="" (p="">< 0.0001,="" รูปที่="">
DVL-1 การแสดงออกในการพัฒนาและเนื้อเยื่อไตหลังคลอด
การแสดงออกของ DVL ในระดับเล็กน้อยถึงรุนแรง{{0}} พบได้ในไซโตพลาสซึมของ pct, dct และ g ในช่วงของทารกในครรภ์ (ดูรูปที่ 4a–c, ตารางที่ 1) ในเปอร์เซ็นต์ 76–86 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์แสดง DVL-1 ใน GW ที่ 14–22 ในขณะที่ใน GW ที่ 38 มีเซลล์บวก 57 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 4g) ใน dct ที่ 14 และ 15 GW ร้อยละ 68–70 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์แสดง DVL-1 ใน GW ที่ 16 และ 22 จำนวนเซลล์บวกจะลดลงเหลือ 42–5{{41} } เปอร์เซ็นต์ ขณะที่อยู่ในนิพจน์ GW ที่ 38 (p < 0.001)="" พบได้ใน="" 19="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์="" dct="" การแสดงออกของ="" dvl-1="" จะเพิ่มขึ้นเป็น="" g="" ตลอดระยะของทารกในครรภ์:="" ใน="" gw="" ที่="" 14="" เท่ากับ="" 6="" เปอร์เซ็นต์="" ในขณะที่ในวันที่="" 15,="" 16="" และ="" 22="" gw="" จะเพิ่มขึ้นเป็น="" 10="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.01)="" ใน="" 38="" gw="" 14="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์="" g="" แสดง="" dvl-1="" (รูปที่="" 4="" ก.)="" ในช่วงหลังคลอด="" dvl-1="" immunoreactivity="" จะกระจัดกระจายในไซโตพลาสซึม="" (ตารางที่="" 1)="" ของทั้ง="" pct="" และ="" dct="" (รูปที่="" 4d,e)="" สัญญาณนี้พบได้ในโครงสร้างที่ตรวจสอบทั้งหมด="" แต่ส่วนใหญ่อยู่ในไซโตพลาสซึมรอบนิวเคลียส="" ความเข้มของการแสดงออกของ="" dvl-1="" สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ="" dct="" และ="" g="" (p="">< 0.01)="" 39–45="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ใน="" pct="" และ="" dct="" express="" dvl-1="" ในขณะที่ใน="" g="" 21="" เปอร์เซ็นต์ของเซลล์เป็นค่าบวก="" (รูปที่="" 4="" ก.)="">ไตโครงสร้าง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ภูมิคุ้มกัน DVL-1 คือ 34 เปอร์เซ็นต์ในเปอร์เซ็นต์ 36 เปอร์เซ็นต์ใน dct และ 27 เปอร์เซ็นต์ใน g ตามลำดับ (รูปที่ 4g)
รูปที่ 4 การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์สองเท่าของการผกผัน (สีเขียว), DVL-1 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในเนื้อเยื่อไตที่กำลังพัฒนาและหลังคลอด (14–38 GW, 1.5- และ {{6 }}เนื้อเยื่อไตอายุหนึ่งปี). การย้อมสีที่เป็นบวก (ลูกศร) จะแสดงในแต่ละโครงสร้างตลอดทุกขั้นตอนของการพัฒนา (a–c) และระยะหลังคลอด (d,e) ไมโครโฟนที่ผสานเข้ากับโครงสร้างที่น่าสนใจในคอร์เทกซ์: ท่อโพรซิมอลที่ซับซ้อน (pct), ท่อส่วนปลาย (dct) และโกลเมอรูไล (g) Colocalization of inversion/DVL-1 (หัวลูกศร) แสดงในไมโครโฟโตกราฟที่ผสาน การย้อมสีควบคุมเชิงลบจะแสดงเป็นส่วนแทรกในการผกผันและ DVL-1 (a) เซลล์เม็ดเลือดแดงสามารถเห็นได้ว่าเป็นเซลล์ที่ย้อมสีแรงใกล้ dct รายละเอียดจะแสดงเป็นส่วนเสริมที่มีกำลังขยายสูงขึ้น กำลังขยาย ×40 แถบมาตราส่วน 100 µm การกระจายเซลล์เชิงบวกแบบไดนามิกของการผกผันและ DVL-1 ในโครงสร้างไต (pct, dct, g) ตลอดระยะการพัฒนาและหลังคลอดจะแสดงเป็นกราฟ (f,g) กราฟ (h) แสดงการแสดงออกของโปรตีน (จำนวนเซลล์บวกโดยรวมในโครงสร้าง) ที่เกี่ยวข้องกับเวลาการพัฒนา (การถดถอยเชิงเส้น) และความสัมพันธ์ของการผกผันกับ DVL-1 ผ่านการพัฒนาและการเจริญเต็มที่ (ANOVA สองทางตามด้วยการทดสอบหลังเฉพาะกิจของ Sidak ). ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD
การแสดงออกร่วมของการผกผันและ DVL-1 สังเกตพบได้ในไซโตพลาสซึมของไต g, dct และ pct ในระหว่างการพัฒนา (ดูรูปที่ 4a–c, การรวมกัน) ในช่วงหลังคลอด การแสดงออกร่วมของการผกผันและ DVL-1 จะแสดงลักษณะการแบ่งเซลล์ต่างๆ ของเซลล์รูปท่อในหน่วยเปอร์เซ็นต์และ dct ในขณะที่การแสดงออกร่วมในหน่วย g จะแสดงลักษณะโดยความชุกของการแสดงออกการผกผันอย่างมาก (ดูรูปที่ 4d การผสาน ). ใน 7-ปี ไตหลังคลอด การแสดงออกร่วมของการผกผันและ DVL-1 จะเห็นได้ในเซลล์ท่อของ dct และ pct และใน g ที่การแสดงออกของการผกผันมีผลเหนือกว่า DVL เล็กน้อยเมื่อเปรียบเทียบกับ DVL-1 (รูปที่ 4e รวม)
2.2.3. ความแตกต่างในการแสดงออกของ -Tubulin การผกผัน และ DVL-1 ระหว่างระยะพัฒนาการของไตและไตหลังคลอด
จำนวนเซลล์ -tubulin-positive ในสัดส่วนของเนื้อเยื่อไตของทารกในครรภ์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อไตของเด็ก 7- ปี (13 (p < 00{="" {11}}1),="" 15="" (p="">< 0.0001)="" และ="" 16="" (p="">< 0.00001)="" gw)="" dct="" ของระยะเริ่มต้นของทารกในครรภ์="" (13,="" 15,="" 16="" และ="" 22="" gw)="" มีเซลล์ที่เป็นบวกมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อไตของเด็กที่="" 38="" และ="" 1="" 5-="" ปี="" (p="">< 0.0001="" ตามลำดับ="" รูปที่="" 3f)="" เมื่อเปรียบเทียบระยะการพัฒนาที่แตกต่างกัน="" เราพบว่าการแสดงออกผกผันในระดับที่ต่ำกว่าในสัดส่วนของวันที่="" 13="" (p="">< 0.0001),="" 15="" (p="">< 0.00001),="" 22="" (p="">< 0.001)="" และ="" 38="" (p="">< 0.0001)="" gw="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">ไตเนื้อเยื่อจากเด็กอายุ 1.5-ปี ใน dct พบการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติของการผกผันที่เปรียบเทียบ 16 GW กับ 38 GW เนื้อเยื่อไต (p < 0.0001)="" นอกจากนี้="" การแสดงออกที่ลดลงของการผกผันใน="" dct="" ยังพบในเนื้อเยื่อไตเด็กอายุ="" 7-="" ปี;="" เปรียบเทียบวันที่="" 13,="" 15="" (p="">< 0.001="" ทั้งคู่),="" 16="" และ="" 1="" 5-เนื้อเยื่อไตอายุเท่ากับ="" dct="" ของเนื้อเยื่อไตอายุ="" 7-="" ปี="" (p="">< 0.00001="" ตามลำดับ="" รูปที่="" 4f)="" สัญญาณที่สังเกตได้ของการแสดงออกของ="" dvl-1="" ผ่านขั้นตอนต่างๆ="" เปิดเผยว่าร้อยละของวันที่="" 13="" (p="">< 0.01),="" 15,="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. ความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ -Tubulin และการผกผันกับ DVL-1 ในการพัฒนาและเนื้อเยื่อไตหลังคลอด
-การแสดงออกของทูบูลินและการผกผันถูกเปรียบเทียบกับการแสดงออกของ DVL-1 ตลอดระยะพัฒนาการและในเนื้อเยื่อไตหลังคลอด -ทูบูลินมีการแสดงออกที่สูงขึ้นทางสถิติในระยะที่สังเกตพบทั้งหมด เมื่อเทียบกับการแสดงออกของ DVL-1 (p < 0.001,="" รูปที่="" 3g)="" ตลอดระยะที่สังเกตได้="" การผกผันมีการแสดงออกที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ="" dvl-1="" (p="">< 0.0001,="" รูปที่="" 4="">
2.2.5. การเปรียบเทียบการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีกับ -Tubulin รุ่นและ DVL-1- และการวิเคราะห์ทางสถิติของเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin ความแตกต่างของการย้อมสี -tubulin ใน MCDK, FSGS และ CNF มีนัยสำคัญทางสถิติในการเปรียบเทียบ ต่อเนื้อเยื่อไตหลังคลอดที่มีสุขภาพดีเป็นกลุ่มควบคุม (p < 0.0001="" ตามลำดับ)="" เนื้อเยื่อไตที่ผิดปกติมีการแสดงออกที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม="" ในขณะที่="" fsgs="" และ="" cnf="" มีการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญของ="" -tubulin="" เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี="" (รูปที่="">
ผกผัน
การผกผันถูกแสดงออกในไซโตพลาสซึมของเซลล์เยื่อบุผิวที่ไม่เป็นระเบียบและท่อของ MCDK (รูปที่ 5a) ใน CNF นิพจน์ผกผันแสดงลักษณะเฉพาะของ g และ dct ในขณะที่แสดงความเข้มข้นน้อยกว่าใน pct cysts (รูปที่ 5b) ใน FSGS การผกผันจะแสดงอย่างรุนแรงใน g และ dct แต่เข้มข้นน้อยกว่าใน pct cysts (รูปที่ 5c) การแสดงออกเชิงพื้นที่ของการผกผันแสดงอัตราการย้อมสีที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในเนื้อเยื่อไตที่มีสุขภาพดี (รูปที่ 5g) เมื่อเปรียบเทียบกับ MCDK, FSGS และ CNF (p < 0.0001="">
รูปที่ 5. การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์สองเท่าของการผกผัน (สีเขียว), DVL-1 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในเนื้อเยื่อไตทางพยาธิวิทยาใน MCDK (a), CNF (b) และ FSGS (c): tubules (t) , glomeruli (g), pct cyst (c), ความสูงของเซลล์เยื่อบุผิว pct (*). โครงสร้างและการแปลตำแหน่งเซลล์ร่วมกันของการผกผันและ DVL-1 (หัวลูกศร) จะแสดงในส่วนที่ผสานพร้อมรายละเอียดในส่วนแทรกที่มีกำลังขยายที่สูงขึ้น การย้อมสีควบคุมเชิงลบจะแสดงเป็นส่วนแทรกในการผกผันและ DVL-1 (a) กำลังขยาย ×40 แถบมาตราส่วน 10{{0}} µm ความสัมพันธ์ของ -tubulin (d) และการผกผัน (e) กับการแสดงออกของ DVL-1 ใน MCDK, FSGS และ CNF (ANOVA แบบสองทางตามด้วยการทดสอบ post hoc ของ SIDAK) ความแตกต่างของความสูงของเซลล์เยื่อบุผิว (f) ของ FSGS, CNF และ MCDK pct เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี (ANOVA ทางเดียวตามด้วยการทดสอบ post hoc ของ Tukey, n=50) ความแตกต่างของเปอร์เซ็นต์เซลล์บวกโดยรวมของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 ใน MCDK, CNF และ FSGS เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี (g–i) การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวแบบทางเดียวตามด้วยการทดสอบหลังเฉพาะกิจของ Tukey) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญแสดงด้วยค่า p (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ****="" p="">< 0.0001)="" dvl-1="" dvl-1="" แสดงออกอย่างอ่อนโยนมากในท่อที่ไม่เป็นระเบียบของ="" mcdk="" เท่านั้น="" ในขณะที่ใน="" cnf="" การแสดงออกจะแสดงคุณลักษณะของ="" dct="" และ="" g="" (รูปที่="" 5a,b)="" ใน="" fsgs="" dvl-1="" สังเกตได้ว่าเป็นปฏิกิริยาที่ไม่รุนแรงใน="" g,="" dct="" และ="" pct="" (รูปที่="" 5c)="" เนื้อเยื่อไตที่มีสุขภาพดีที่ย้อมเป็น="" dvl-1="" แสดงอัตราการย้อมสีที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ="" (รูปที่="" 5="" ชั่วโมง)="" ที่ตรงกันข้ามกับ="" mcdk="" และกับ="" fsgs="" (p="">< 0.0001="" ทั้งคู่)="" ในขณะที่ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญสำหรับ="">
2.2.6. ความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ -Tubulin และการผกผันกับ DVL-1 ในเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (MCDK, CNF, FSGS)ใน MCDK, FSGS และ CNF -tubulin มีการย้อมสีสูงกว่า DVL-1 อย่างมีนัยสำคัญ (p < 00001="" ตามลำดับ="" รูปที่="" 5d)="" การผกผันสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ="" dvl-1="" ใน="" mdck="" (p="">< 0.0001)="" และใน="" fsgs="" (p="">< 0.01,="" รูปที่="">
2.2.7. ความแตกต่างในความสูงของเซลล์เยื่อบุผิวของท่อที่ซับซ้อนใกล้เคียงระหว่างการควบคุมสุขภาพและเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (MCDK, CNF, FSGS)ความสูงของเซลล์เยื่อบุผิว pct (n {{0}} ต่อกลุ่ม) ถูกเปรียบเทียบระหว่างเซลล์ทูบูลในเนื้อเยื่อไตที่แข็งแรงและเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (รูปที่ 5b,c,f) ความสูงของเซลล์เยื่อบุผิวเฉลี่ยใน HC คือ 12.91 µm ± 1.847 µm และสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ CNF และ FSGS (p < 0.0001="" ตามลำดับ)="" ความสูงของเซลล์เฉลี่ยใน="" cnf="" pct="" คือ="" 9.011="" µm="" ±="" 1.453="" µm="" ในขณะที่ใน="" fsgs="" คือ="" 8.114="" µm="" ±="" 0.9248="" µm="" เซลล์เยื่อบุผิว="" pct="" ของ="" mcdk="" ไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในความสูง="" (12.17="" µm="" ±="" 1.476="" µm)="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">
2.2.8. ความแตกต่างในความยาวของตาชั้นประถมศึกษาระหว่างการควบคุมสุขภาพและเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (MCDK, CNF, FSGS)
ความยาวของซีเลียมปฐมภูมิ (n= 50 ต่อกลุ่ม) ถูกเปรียบเทียบระหว่าง HC และเนื้อเยื่อไตที่เปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา (รูปที่ 6c) เนื้อเยื่อไตที่แข็งแรงและ MCDK ถูกย้อมด้วย -tubulin เพื่อสร้างความมั่นใจในความจำเพาะของการย้อมสี -tubulin cilium (รูปที่ 6a,b) ในเนื้อเยื่อไตที่มีสุขภาพดี ซีเลียมปฐมภูมิมีความยาว 5.065 µm ± 1.229 µm ในขณะที่ใน MCDK, CNF และ FSGS นั้นยาวกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
การอภิปราย
จุดมุ่งหมายของการศึกษาของเราคือเพื่อตรวจสอบการแสดงออกทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของอะทูบูลิน การผกผัน และ DVL-1 ในทารกในครรภ์ไตเนื้อเยื่อและเนื้อเยื่อไตหลังคลอด นอกจากนี้ เราต้องการสำรวจว่ารูปแบบการแสดงออกและการย้อมสีของ a-tubulin การผกผัน และ DVL-1 ถูกรบกวนในโรคไตต่างๆ หรือไม่เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี กล่าวคือ แม้จะมีความสนใจอย่างกว้างขวางจากนักวิจัยคนอื่นๆ เกี่ยวกับบทบาทของ a-tubulin, inversion และ DVL-1 ในระหว่างการพัฒนาของไต การศึกษาก่อนหน้านี้ส่วนใหญ่ได้ใช้สัตว์หรือแบบจำลองการทดลองในหลอดทดลอง เท่าที่เราทราบ นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่แสดงการแสดงออกและการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ a-tubulin พร้อมกับการผกผันและ DVL-1 ในไตของทารกในครรภ์และหลังคลอด และที่ได้สำรวจการแสดงออกของโปรตีนดังกล่าวในไต โรคต่างๆ เช่น MCDK, FSGS และ CNF นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงในความยาวและลักษณะของ cilia โดยกล้องจุลทรรศน์แสงและอิเล็กตรอน เนื่องจากการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราได้ระบุแล้วว่าการรบกวนของเลนส์ตาอาจเกี่ยวข้องกับการสร้างถุงน้ำดีใน FSGF และ CNF [19]
ในวิถีการส่งสัญญาณ Wnt ที่เป็นที่ยอมรับ การผูกของ Wnt ลิแกนด์กับตัวรับจะชักชวน Dvl [37] กระบวนการของ MET และทางเดินขั้วเซลล์ระนาบระหว่างระยะแรกของการสร้างรูปร่างของไตจะถูกควบคุมโดยการส่งสัญญาณ Wnt โดยการเป็นสื่อกลางในวิถี Wnt ตาหลักจะควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ การสร้างความแตกต่างและการสร้างรูปร่างของเนื้อเยื่อ [12] ผ่านการจัดระเบียบโครงร่างโครงร่างของเซลล์และการวางแนวของเซลล์ตลอดจนการยืดตัวของโครงสร้างท่อ [2,38] ในการศึกษาของเรา -tubulin, inversion และ DVL-1 ล้วนมีอยู่ในโครงสร้างของไต และทั้งหมดมี colocalized ไม่เพียงแต่ในระหว่างการพัฒนาของไตของทารกในครรภ์เท่านั้น แต่ยังอยู่ในเนื้อเยื่อไตจาก 1.5- และ {{9 }}เด็กปี. การค้นพบนี้สอดคล้องกับการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเกิดขึ้นแล้วระหว่างการสร้างท่อใหม่ [39] นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเราได้เปิดเผยว่าการแสดงออกของ -tubulin และการผกผันสัมพันธ์กันกับ DVL-1 และแสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างรูปแบบการแสดงออกของพวกมัน ซึ่งสัมพันธ์กับแบบจำลองการทดลอง เนื่องจากการกลายพันธุ์ของตระกูลโปรตีน Dvl เต็มรูปแบบในหนูทดลองส่งผลให้ขาดกระบวนการย่อยอาหาร ในขณะที่การกลายพันธุ์ที่ไม่รวมถึงกลุ่มโปรตีนทั้งหมดแสดงข้อบกพร่องในการจัดวางตาที่ปมประสาทพร้อมกับความบกพร่องของอวัยวะ [40] . การค้นพบก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าการผกผันมีบทบาทในการย้ายเซลล์ใน Xenopus pronephros เนื่องจากส่วนนั้นสัมพันธ์กับลูปของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของ Henle และท่อส่วนปลาย นี่อาจบ่งบอกถึงความสำคัญของการผกผันระหว่างการพัฒนาไตในมนุษย์เช่นกัน [41] ตามข้อสันนิษฐานนั้น การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่าการกลายพันธุ์ของยีนผกผันอาจส่งผลให้เกิดภาวะไตวายในไตชนิดที่ 2 ซึ่งเป็นสื่อกลางโดยการแสดงออกของ DVL-1 ที่ผิดปกติ [42] แม้ว่าบทบาทของซีลีเนียมปฐมภูมิจะเป็นที่ถกเถียงกันในการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt แต่เราพบว่า -tubulin ถูกรวมกลุ่มด้วยการผกผันและ DVL-1 ในตัวอย่างไตที่วิเคราะห์ นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าซีลีเนียมปฐมภูมิพร้อมกับการผกผันควบคุมการเสื่อมสลายของ Dvl โดยมีอิทธิพลต่อเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt [43] ในโรคไตของมนุษย์ที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของซีสต์ พบว่ามีการจำกัดตำแหน่งและการทำงานของตาผิดปกติ [19] ในทำนองเดียวกัน การศึกษาในปัจจุบันยังยืนยันการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของการสร้างตาชั้นปฐมภูมิในสภาวะทางพยาธิวิทยา เช่น CNF, FSGS และ MCDK ผลการวิจัยก่อนหน้านี้ยอมรับว่าการกระตุ้นมากเกินไปของวิถี Wnt ที่เป็นที่ยอมรับหลังจากความเสียหายของไตนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของเนื้อเยื่อไตที่ไม่สามารถย้อนกลับได้ [44] ในทางตรงกันข้าม ซีลีเนียมปฐมภูมิได้รับบทบาทในการเปลี่ยนจากวิถี Canonical เป็น noncanonical Wnt ในการช่วยเหลือไตซ่อมแซม. นอกจากนี้ พบว่าการกระตุ้นมากเกินไปของวิถี Wnt ที่เป็นที่ยอมรับในเนื้อเยื่อไตที่ปลูกถ่ายพบว่ามีค่าพยากรณ์ที่เป็นบวกต่อการเกิดพังผืดในไต [45] หากวิถีทาง Wnt ที่เป็นที่ยอมรับโดยไม่ได้มาตรฐาน ก็จะสนับสนุนทฤษฎีการเกิดพังผืดในไตเป็นผล การค้นพบของเราในการลด -tubulin และการแสดงออกการผกผันใน CNF และ FSGS บ่งบอกถึงการไม่มีการใช้งานของเส้นทาง Wnt ที่ไม่ใช่แบบบัญญัติ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อทั้งสองเงื่อนไขมีแนวโน้มที่จะนำไปสู่ระยะสุดท้ายโรคไตกล่าวคือ เป็นที่เชื่อกันว่าการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นและหน้าที่ของซีลีเนียมปฐมภูมิอาจเป็นปัจจัยในการรักษาเส้นทาง Wnt ปกติ ดังนั้นจึงเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นสำหรับการพัฒนาตามปกติ ในทางตรงกันข้าม หากวิถี Wnt ได้รับการปรับปรุง อาจส่งผลให้เกิดการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ผิดปกติและการสร้างความแตกต่างที่นำไปสู่การก่อมะเร็ง [46] ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ทางเดิน Wnt ที่เป็นที่ยอมรับเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเริ่มต้นของ MET และการก่อตัวของ nephron ในขณะที่การรบกวนอาจนำไปสู่ไตhypoplasia [47]. ผลลัพธ์ของเราสนับสนุนแนวคิดนี้โดยการเปิดเผยการแสดงออกที่ต่ำที่สุดของ DVL-1 ด้วยการแสดงออกของ -tubulin ใน MCDK สูงสุดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี ผลลัพธ์เหล่านี้อาจบอกเป็นนัยถึงการเปิดใช้งานเส้นทาง Wnt แบบบัญญัติที่ต่ำที่สุด ซึ่งอาจเป็นสาเหตุพื้นฐานสำหรับการไม่มีการก่อตัวของเนฟรอน ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกของทูบูลินสูงสุดที่มีการแสดงออกของ DVL-1 ต่ำสุดอาจอธิบายการค้นพบของซีสต์หลายตัว เนื่องจากไม่มีการยืดตัวที่เป็นระเบียบและโพลาไรเซชันของเซลล์ตามแนวทาง Wnt ที่ไม่ใช่แบบบัญญัติ การศึกษาก่อนหน้านี้ยังแสดงให้เห็นว่าการผกผันยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติโดยการกำหนดเป้าหมาย Dvl สำหรับการย่อยสลาย [26] พบว่าขั้นตอนนี้ในการปฏิสัมพันธ์ของพวกเขามีความจำเป็นในการยับยั้งการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติในการรักษาการยืดตัวและการวางตำแหน่งท่อตามปกติ การกลายพันธุ์แบบผกผันส่งผลให้เกิดการปรับขึ้นของสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติซึ่งต่อมากระตุ้นการเพิ่มจำนวนผิดปกติในเซลล์ท่อ ขั้นตอนนี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีความสำคัญในการเกิด cystogenesis [42] ในขณะที่การผกผันของหนูทดลองทำให้เกิดโรคไต polycystic [48] ตามทฤษฎีของไตcystogenesis การผกผันถือเป็น "mycoprotein" เนื่องจากมีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นใน ciliaไตเซลล์ท่อ ในการศึกษาของเรา พบว่ามีขนปฐมภูมิอยู่ที่ผิวปลายเซลล์รูปท่อในทุกขั้นตอนที่วิเคราะห์ ในขณะที่ในระยะของทารกในครรภ์ การแสดงออกของ -tubulin จะแข็งแกร่งกว่าในช่วงหลังคลอด
CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต
การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการทำงานของ cilia ขั้นต้นอาจได้รับผลกระทบจากการควบคุม -tubulin ผิดปกติในระหว่างการพัฒนา ซึ่งอาจนำไปสู่การสร้างถุงน้ำดี การพัฒนาไตผิดปกติ และโรคไตเรื้อรังที่เป็นไปได้ในวัยเด็ก [31,49] สิ่งนี้สอดคล้องกับการค้นพบของเราเกี่ยวกับตาที่สั้นและผิดปกติที่พบใน MCDK หรือมีตาที่ยาวมากหรือคลาดเคลื่อนมากที่พบในท่อขยายของ CNF และ FSGS เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี เพื่อสนับสนุนความจริงที่ว่าเส้นทางการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติและที่ไม่ใช่แบบบัญญัติซึ่งควบคุมโดยตาชั้นแรกนั้นถือเป็นข้อบังคับสำหรับการพัฒนาไตตามปกติ เราพบว่าการย้อมสีการผกผันและ DVL-1 ที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญใน MCDK เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ [31,49]. รูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างกันของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 ตลอดระยะการพัฒนาไตที่แตกต่างกันอาจบ่งชี้ถึงการสลับไปมาระหว่างวิถีการส่งสัญญาณ Wnt แบบบัญญัติและไม่ใช่แบบบัญญัติระหว่างการสร้างรูปร่างของไตตามปกติ เราแนะนำว่าการแลกเปลี่ยนกันเป็นตัวกำหนดการถอดรหัสในวิถีทางบัญญัติหรือลำดับการย้ายเซลล์และโพลาไรเซชันระหว่างการพัฒนาไตในวิถีการส่งสัญญาณที่ไม่เป็นไปตามรูปแบบบัญญัติ ความสมดุลและการแสดงออกในโครงสร้างไตที่ตรวจสอบทั้งหมดบ่งบอกถึงบทบาทสำคัญในการพัฒนาไตตามปกติ ในระหว่างการพัฒนาไตตามปกติ (ตั้งแต่ 13 GW ถึง 38 GW) การแสดงออกโดยรวมของ -tubulin การผกผัน และ DVL-1 จะลดลงเมื่อเนื้อเยื่อไตได้รับลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่โตเต็มที่ ในเนื้อเยื่อไตอายุ 1.5- และ 7-ปี -tubulin และการผกผันมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นเล็กน้อย ซึ่งสนับสนุนความจริงที่ว่าเส้นทาง Wnt ที่ไม่ใช่แบบบัญญัติยังคงทำงานอยู่หลังคลอด ในทางตรงกันข้าม DVL-1 ยังคงมีรูปแบบการแสดงออกที่ลดลงซึ่งอาจเพิ่มข้อสรุปว่าวิถีทาง Wnt ที่เป็นที่ยอมรับนั้นถูกระงับในเนื้อเยื่อไตที่แข็งแรง อันเป็นผลมาจากพยาธิสภาพของไต เซลล์เยื่อบุผิวของไตอาจทำปฏิกิริยากับการกลับมาของ EMT และพังผืด [50] ที่เกี่ยวข้องกับการเปิดใช้งานวิถี Wnt ที่เป็นที่ยอมรับอีกครั้ง [44] ดังนั้นการรบกวนของ -tubulin การผกผันและ DVL-1 ที่พบในไตที่เป็นโรคอาจเป็นกลไกทางพยาธิวิทยาที่แฝงอยู่และเป็นผลมาจากการเปลี่ยนจากวิถี noncanonical ไปเป็น canonical Wnt ในไตที่กำลังพัฒนาซึ่งพาดพิงถึงการสลับไปมาระหว่างไตที่กลับไม่ได้ ความเสียหาย. นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงในช่วงก่อนคลอดและหลังคลอดไตรูปแบบการแสดงออกอาจสัมพันธ์กับการทำงานของไตบกพร่องในวัยผู้ใหญ่ นำไปสู่โรคประจำตัวและไตวายเรื้อรัง
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. ตัวอย่างมนุษย์
เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อไตของทารกในครรภ์หลังจากสูญเสียการตั้งครรภ์ที่ 14, 15, 16, 22 และ 38 GW ที่ภาควิชานรีเวชวิทยาและสูติศาสตร์ของ University Hospital Center Split วัสดุของทารกในครรภ์ที่ได้มาทั้งหมดได้รับการตรวจสอบโดยนักพยาธิวิทยา และใช้เฉพาะเนื้อเยื่อที่ไม่มีสัญญาณของความผิดปกติ รอยย่น หรือการเสียชีวิตของมดลูก และด้วย karyogram ปกติเท่านั้นที่ใช้สำหรับการศึกษา เวชระเบียนของมารดาได้รับการตรวจสอบก่อนการเก็บตัวอย่าง และในกรณีที่มีปัญหาด้านสุขภาพที่อาจส่งผลต่อผลการตั้งครรภ์ เนื้อเยื่อไตจะไม่รวมอยู่ในการศึกษา ความสมบูรณ์ถูกกำหนดโดยเส้นรอบวงศีรษะ รอบท้อง และความยาวโคนขา [51] ซึ่งสัมพันธ์กับปฏิทินประจำเดือนของผู้ป่วย เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อไต 1.5- และ 7-ปีหลังจากการเสียชีวิตโดยไม่ได้ตั้งใจ เก็บตัวอย่างได้ที่ภาควิชาพยาธิวิทยาของ University Hospital Center Split ตัวอย่างของเนื้อเยื่อไต dysplastic หลายชิ้น (MCDK) ได้มาหลังจากการสูญเสียการตั้งครรภ์ glomerulosclerosis เฉพาะส่วนโฟกัส (FSGS) และโรคไตในประเภทฟินแลนด์ (CNF) ได้มาเนื่องจากการตัดไต วัสดุที่ได้มาทั้งหมดได้รับการตรวจสอบและประเมินโดยนักพยาธิวิทยาซึ่งจัดประเภทการวินิจฉัย โปรโตคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยสปลิต (20 พฤษภาคม 2016) ตามปฏิญญาเฮลซิงกิและการปรับปรุง (การจัดหมวดหมู่: 003-08/16-03/0001, ทะเบียนเลขที่: 2181-198-03-04-16-0024, 20 พฤษภาคม 2559) [52].
4.2. อิมมูโนฮิสโตเคมี
การตรึงตัวอย่างเนื้อเยื่อที่เก็บรวบรวมถูกประมวลผลด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 22 ◦C หลังจากการคายน้ำในเอทานอล 100 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างถูกฝังในพาราฟินตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [53] ตัวอย่างถูกหั่นเป็นชิ้นหนา 5 ไมโครเมตรโดยใช้ไมโครโทม และติดตั้งบนสไลด์ไมโครสโคปในเวลาต่อมา เพื่อตรวจสอบการรักษาเนื้อเยื่อ ทุกส่วนที่ 10 ถูกย้อมด้วย hematoxylin และ eosin [54] การแยกสตรีและอิมมูโนฮิสโตเคมีดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [2,55,56] หลังจากล้างใน PBS สไลด์กล้องจุลทรรศน์ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในห้องที่มีความชื้นที่ 22 ◦C (ระบบการย้อมสีแบบสไลด์ StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้คือแอนติบอดีโมโนโคลนัลแอนติ-อัลฟาทูบูลินของกระต่าย (เจือจาง 1:1000; ab179484, Abcam, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร), แอนติบอดีโพลีโคลนัลต้านการผกผันของกระต่าย (เจือจาง 1:100; ab65187, Abcam, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร), โมโนโคลนัลเมาส์ DVL -1 แอนติบอดี (1:150 การเจือจาง; sc-8025, เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ดัลลาส, รัฐเท็กซัส, สหรัฐอเมริกา) และแอนติบอดีต้านแกมมาทูบูลินกระต่ายโพลีโคลนัล (เพื่อตรวจสอบการย้อมสีเฉพาะตาด้วยอัลฟา- ทูบูลิน, เจือจาง 1:500; ab11321, Abcam, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว ให้แอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงตามที่ระบุไว้: IgG H&L ต้านกระต่ายลา, Alexa Fluor 488 (เจือจาง 1:400; ab150073, Abcam, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) และแพะต้านหนู IgG H&L, TRITC (เจือจาง) 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ถูกใช้สำหรับการย้อมสีนิวเคลียสและหลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 2- นาที สไลด์ ถูกล้างด้วย PBS และหุ้มด้วยวัสดุสำหรับติดตั้งและแผ่นปิด การย้อมสีแบบไม่จำเพาะได้รับการป้องกันโดยใช้โปรตีนบล็อก (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) ก่อนการใช้แอนติบอดีปฐมภูมิ ในกลุ่มควบคุมเชิงลบ ทำการทดสอบก่อนการดูดซับถูกดำเนินการ ในขณะที่ความจำเพาะของแอนติบอดีทุติยภูมิถูกตรวจสอบโดยการละเว้นแอนติบอดีปฐมภูมิออกจากขั้นตอนการย้อมสี
4.3. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
การตรึงของไตเนื้อเยื่อถูกดำเนินการในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตามด้วยหลังการตรึงใน 1 เปอร์เซ็นต์ osmium tetroxide เป็นเวลา 1 ชั่วโมง กระบวนการคายน้ำดำเนินการด้วยชุดเอทานอลและเสร็จสิ้นด้วยการฝังในเรซิน LX 112 [22] ส่วนที่บางขนาดหนึ่งไมโครเมตรถูกย้อมด้วยโทลูอิดีนบลู และศึกษาเพื่อเลือกส่วนที่บางเฉียบ ชิ้นงานบางเฉียบที่มีความหนา 0.05 ไมโครเมตร ถูกตรวจสอบหลังจากการย้อมด้วยยูแรนิลอะซิเตตและลีดซิเตรต ใช้กล้องจุลทรรศน์ JEOL 1200 EX เพื่อให้ได้ไมโครโฟโตกราฟี
4.4. การวิเคราะห์ทางพันธุกรรม
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [19] โดยใช้เม็ดเลือดขาวจากเลือดส่วนปลาย ดีเอ็นเอของจีโนมถูกสกัดออกมา พบการกลายพันธุ์ของโฮโมไซกัส missense ในยีน NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) สิ่งที่ยืนยันการวินิจฉัยโรคไตที่มีมา แต่กำเนิดของประเภทฟินแลนด์ (CNF) [57]
CISTANCHE จะปรับปรุงการติดเชื้อในไต/ไต
4.5. การวิเคราะห์ข้อมูล
การวิเคราะห์ส่วนถูกดำเนินการบนกล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนซ์ FL โดยใช้ 3 แชนเนลการเรืองแสง FL (Olympus BX51, โตเกียว, ญี่ปุ่น) รูปภาพถูกถ่ายด้วยกล้องดิจิตอล DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) ด้วยกำลังขยายกำลังสูง (×40) เพียงไตคอร์เทกซ์ที่มีทูบูลส่วนต้น (pct), ทูบูลที่ส่วนปลาย (dct) และโกลเมอรูไล (ก.) เป็นที่สนใจ จากนั้นภาพจะถูกประมวลผลโดยซอฟต์แวร์ ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (เข้าถึงเมื่อ 15 ตุลาคม 2018), 1997–2021 ) และ Adobe Photoshop (Adobe Inc., ซานโฮเซ่, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) สำหรับการประเมินเพิ่มเติม ก่อนการนับเซลล์ เครื่องมือ ImageJ แบบแยกช่องสัญญาณจะถูกนำมาใช้ หลังจากนั้น ภาพถ่ายจุลภาคด้วยกล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ดั้งเดิมถูกลบด้วยช่องสีแดงหรือสีเขียว (ขึ้นอยู่กับว่าช่องเดิมคืออะไร) โดยใช้เครื่องคำนวณภาพ ImageJ เพื่อป้องกันสัญญาณรั่ว ค่าที่ต่ำกว่าเกณฑ์ระดับ 50 ถือเป็นค่าลบ เรานับสัญญาณภูมิคุ้มกันในเซลล์อย่างน้อย 20 โครงสร้าง (pct, dct หรือ g) ต่อระยะหรือจำนวนเซลล์บวกโดยรวมต่อภาพถ่ายไมโครของ multicystic dysplasticไตเนื้อเยื่อ FSGS และ CNF เราจัดประเภทเซลล์เป็นค่าบวก หากสัญญาณอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์สะสมที่ระดับเมมเบรน ไซโตพลาสซึม หรือนิวเคลียสใดๆ ที่สูงกว่าค่า 50 ที่วัดบนซอฟต์แวร์ ImageJ โดยใช้คำสั่งธรณีประตู เซลล์เชิงลบถูกจัดประเภทเป็นเซลล์ที่ไม่มีปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันใดๆ ผู้ตรวจสอบอิสระสองคนวิเคราะห์ข้อมูล
4.6. การวิเคราะห์เชิงปริมาณ
ความเข้มของสัญญาณการย้อมสี -tubulin, inversion และ DVL-1 ได้รับการประเมินโดยนักวิจัยอิสระสองคนโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ วัดความเข้มของสัญญาณโดยรวมหลังจากตั้งค่าภาพเป็น 8-ประเภทบิต หลังจากนั้น ประเมินความเข้มของการย้อมสีด้วยเครื่องหมายเป็น 20 เปอร์เซ็นต์, dct และ g โดยการวัดพื้นที่โครงร่างของโครงสร้าง หากผลลัพธ์ระหว่างผู้ประเมินแตกต่างกัน นักวิจัยอิสระคนที่สามได้ชี้แจงข้อสงสัย ความเข้มของสัญญาณสูงสุดสำหรับ -tubulin คือ 84.125 ± 3.214 SD สำหรับการผกผันคือ 71.50 ± 2.715 SD และสำหรับ DVL-1 80.916 ± 1.875 SD ความอิ่มตัวของสีสัญญาณสูงสุดในภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ถูกทำเครื่องหมายเป็น 3 (66.66–99.99 เปอร์เซ็นต์ของความเข้มของภาพสัญญาณโดยรวม) ตามด้วย 2 (33.33–66.66 เปอร์เซ็นต์) สำหรับความเข้มของสัญญาณและ 1 (0.33 เปอร์เซ็นต์ –33.33 เปอร์เซ็นต์) สำหรับความเข้มของสัญญาณต่ำ (ตารางที่ 1)
4.7. การวิเคราะห์ทางสถิติ
สำหรับการกำหนดความแตกต่างระหว่างขั้นตอนและโครงสร้าง การทดสอบ Kruskal–Wallis เสร็จสิ้นแล้ว ตามด้วย post hoc ของ Dunn โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (เข้าถึงได้ในวันที่ 15 ตุลาคม) 2018.)) จำนวนเซลล์บวกถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์เป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ในขณะที่รับรู้นัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0.05="" จำนวนของโครงสร้างที่วิเคราะห์คือ="" 4200="" ใน="" 35="" ตัวอย่าง="" โดยนับจำนวนเซลล์ทั้งหมด="" 135,256="" เซลล์="" เราใช้="" 2-way="" anova="" กับ="" sidak's="" post="" hoc="" test="" เพื่อทดสอบความแตกต่างในการแสดงออกของ="" -tubulin="" การผกผัน="" และ="" dvl-1="" ในขั้นตอนการพัฒนาต่างๆ="" เพื่อศึกษาการแสดงออกของโปรตีนเกี่ยวกับเวลาของพัฒนาการ="" เราใช้การถดถอยเชิงเส้น="" การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบเฉพาะกิจของ="" tukey="" ใช้เพื่อสำรวจความแตกต่างในการแสดงออกของ="" -tubulin="" การผกผัน="" และ="" dvl-1="">ไตเนื้อเยื่อเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อของ MCDK, FSGS และ CNF ความแตกต่างในการแสดงออกของโปรตีนระหว่าง MCDK, FSGS และ CNF ถูกตรวจสอบด้วย 2-way ANOVA ตามด้วยการทดสอบ post hoc ของ Sidak การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบเฉพาะกิจของ Tukey ใช้ในการประเมินความแตกต่างของความยาว cilia และความสูงของเซลล์เยื่อบุผิวในสัดส่วนระหว่างกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีและพยาธิสภาพไตเนื้อเยื่อ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) โดยมีความแตกต่างทางสถิติที่ยอมรับที่ p <>
