การแสดงออกของไนตริกออกไซด์ซินเทสและเรนินในเส้นประสาทในไตผิดปกติของสุนัขอายุน้อย

เชิงนามธรรม.

เรนินและการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ของเซลล์ประสาทในไตจะควบคุมเรนิน-แองจิโอเทนซินและระบบตอบรับ tubuloglomerular- การศึกษาครั้งนี้ศึกษาการแสดงออกของเรนินและเส้นประสาทไนตริกออกไซด์สังเคราะห์ในไตผิดปกติของสุนัขหนุ่มสามตัว การทำงานของระบบภูมิคุ้มกันต่อไตซึ่งเกิดขึ้นในเซลล์ juxtaglomerular และ tubular ของไตที่ผิดปกติไม่แตกต่างจากไตปกติของสุนัขอายุน้อย เซลล์ที่มีจุดมาคูลาหนาแน่นในไตปกติแสดงการสังเคราะห์ปฏิกิริยาสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ของเซลล์ประสาท แต่เซลล์ที่อยู่ในไตผิดปกตินั้นไม่มีสัญญาณที่ชัดเจน การสังเกตนี้อาจสัมพันธ์กับกลไกทางพยาธิวิทยาของภาวะไตวายในสุนัขอายุน้อย

คำสำคัญ: โรคไตเรื้อรัง, ไตผิดปกติ, อิมมูโนฮิสโตเคมี, การสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ของเซลล์ประสาท, เรนิน

ภาวะไตวายมักเกิดกับสุนัขอายุน้อย ในกรณีเช่นนี้ การตรวจเนื้อเยื่อมักแสดงให้เห็นรอยโรคของไตที่ผิดปกติ อย่างไรก็ตาม กลไกทางพยาธิสรีรวิทยาที่เกิดขึ้นในไตผิดปกติของสุนัขยังไม่ชัดเจน เมื่อเร็วๆ นี้ เราได้สาธิตการลดทอนของไซโคลออกซีเจเนส (COX)-2 ในโรคไตเรื้อรังในสุนัขอายุน้อยที่มีไตผิดปกติโดยใช้การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมี [19]

การสนับสนุนอาหารเสริม Cistancheอาหารเสริมการทำงานของไต

COX-2 เป็นเอนไซม์อักเสบที่เหนี่ยวนำได้ซึ่งมีความจำเป็นต่อการพัฒนาของไตตามปกติในระยะทารกในครรภ์และทารกแรกเกิด [12, 15] หลังคลอด COX-2 จะถูกแสดงออกในไตและกระจุกตัวอยู่ในบริเวณจำกัดของจุดมาคูลาเดนซา (MD) ของแขนขาที่หนาขึ้น [1, 4, 22] MD เป็นบริเวณเฉพาะที่อยู่ติดกับขั้วหลอดเลือดของโกลเมอรูลัส ควบคุมการหลั่งของเรนินและระบบป้อนกลับของไต (TGF) COX-2 ที่แสดงออกในเซลล์ MD ควบคุมกลไกเหล่านี้ [6, 8] นอกจาก COX-2 แล้ว นิวรอนไนตริกออกไซด์ซินเทส (nNOS) ซึ่งแสดงออกในเซลล์ MD ยังเป็นที่รู้กันว่าเป็นตัวควบคุมหลักของระบบ TGF [3, 18] โมเลกุลทั้งสองนี้ซึ่งแสดงออกร่วมกันใน MD เป็นที่รู้กันว่ามีปฏิสัมพันธ์ซึ่งกันและกัน [2, 5, 9] ในการศึกษานี้ เราได้ตรวจสอบการแสดงออกของเรนินและ nNOS ในไตผิดปกติโดยวิธีอิมมูโนฮิสโตเคมีเพื่อตรวจสอบว่าการลดทอนของ COX-2 ในไตผิดปกติทำให้เกิดการหยุดชะงักของระบบเรนิน-แองจิโอเทนซินและระบบ TGF ในสุนัขอายุน้อยหรือไม่

บล็อกพาราฟินที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินของไตผิดปกติจากสุนัขอายุน้อย (n=3) ไตปกติจากสุนัขอายุน้อย (n=3) และไตปกติจากสุนัขโตเต็มวัย (n=4) เช่นเดียวกับที่ใช้ในการศึกษาครั้งก่อนของเรา ซึ่งมีการอธิบายประวัติทางคลินิกและการเตรียมเนื้อเยื่อไว้ก่อนหน้านี้ [19] การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการทดลองสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยคาโกชิมะ ประเทศญี่ปุ่น (VM15020) ส่วนต่างๆ ได้รับการจัดเตรียมด้วยความหนา 3- µm และการวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับเรนินและ nNOS ได้ดำเนินการตามเกณฑ์วิธีต่อไปนี้: (1) การลดพาราฟิน; (2) การดึงแอนติเจนโดยการให้ความร้อนด้วยไมโครเวฟในบัฟเฟอร์ซิเตรต 10 mM (pH 6.0) สำหรับ nNOS; (3) การฟักตัวด้วย 3% H2O2 เป็นเวลา 30 นาที; (4) การปิดกั้นด้วย 3% bovine Serum albumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) สำหรับ renin หรือ 0.25% casein (Sigma-Aldrich) สำหรับ nNOS เจือจางในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเป็นเวลา 30 นาที; (5) การฟักตัวข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยอัตราส่วน 1:3,000 การเจือจางของแอนติซีรัมโพลีโคลนอลแอนติซีรั่มของกระต่ายที่ต่อต้านรีคอมบิแนนท์ (จัดหาโดยดร. มูราคามิ มหาวิทยาลัยสึกูบะ ประเทศญี่ปุ่น) หรือ 1:3,{{32 }} การเจือจางของ antiserum polyclonal antiserum ของกระต่ายต่อต้าน nNOS (เคย์แมนเคมี, แอนอาร์เบอร์, มิชิแกน, สหรัฐอเมริกา) ในสารละลายปิดกั้น; (6) การฟักตัวเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีสากลที่ผันด้วยเปอร์ออกซิเดส - โพลีเมอร์ - คอนจูเกต (อิมมูโนโกลบูลินต่อต้านเมาส์ (Ig) G และ IgG ต่อต้านกระต่าย; คราบธรรมดา MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ; และ (7) การตรวจหาสัญญาณภูมิคุ้มกันโดยใช้ระบบ 3,3ʹ-diaminobenzidine (แท็บเล็ตบัฟเฟอร์ 3,3ʹ-diaminobenzidine; Merck, Darmstadt, Germany) สำหรับส่วนควบคุมเชิงลบ จะใช้ IgG กระต่ายปกติ (Lab Vision, ฟรีมอนต์, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้แทนแอนติบอดีปฐมภูมิ

ภาพที่ 1 อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับเรนินในไตสุนัขที่ผิดปกติ ตอบ: พบสัญญาณเชิงบวกของ Renin ในเซลล์ juxtaglomerular ใกล้กับขั้วของหลอดเลือดและเซลล์ไตบางส่วน (ลูกศร) แท่ง: 50 µm. B: พื้นที่อื่นของส่วนจะแสดงในแผง A ท่อในส่วนไตรอนที่ไม่ปรากฏชื่อแสดงการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันของไต แท่ง: 50 µm.

การวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาแบบสุ่มสำหรับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของเรนินได้ดำเนินการตามวิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [20] โดยสรุป ดัชนีเรนินถูกกำหนดให้เป็นอัตราส่วนของจำนวนหลอดเลือดแดงที่เป็นบวกของเรนินทั้งหมดต่อจำนวนโกลเมอรูลีทั้งหมด และแสดงต่อ 100 โกลเมอรูลี วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยใช้วิธีเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Bonferroni กับ SPSS เวอร์ชัน 24 (สถิติ IBM SPSS, Armonk, NY, USA)

การวินิจฉัยทางจุลพยาธิวิทยาดำเนินการตามเกณฑ์กล้องจุลทรรศน์ของ dysplasia ของไตในสุนัขโดย Picut และ Lewis [14] ส่วนเนื้อเยื่อวิทยาของทั้งสามกรณีนำเสนอความแตกต่างแบบอะซิงโครนัส ซึ่งบ่งชี้ว่ามีรอยโรคในโกลเมอรูลีของทารกในครรภ์/ยังไม่เจริญเต็มที่ การเปลี่ยนแปลงทุติยภูมิของความรุนแรงของตัวแปร เช่น ความเสียหายของท่อ พังผืดคั่นระหว่างหน้า และโกลเมอรูลีที่เกิดจากเส้นโลหิตตีบถูกพบภายในเนื้อเยื่อไตที่โตเต็มที่

ในไต dysplastic สังเกตสัญญาณ renin-immunoreactivity ในเซลล์ juxtaglomerular (JGCs) (รูปที่ 1A) และเซลล์ tubular ตั้งอยู่ใน nephrons ส่วนปลาย (รูปที่ 1B) ในโกลเมอรูลีบางเซลล์ มีเซลล์จำนวนหนึ่งแสดงสัญญาณเชิงบวกของเรนินใกล้กับขั้วของหลอดเลือด (รูปที่ 1A) ในไตกลุ่มควบคุมอายุน้อย ยังตรวจพบสัญญาณเรนินทั้งใน JGC และท่อส่วนปลาย ซึ่งรวมถึงเซลล์ MD ในไตควบคุมของผู้ใหญ่ สัญญาณเชิงบวกของเรนินถูกจำกัดไว้ที่ JGC ตามสถิติ จำนวนพื้นที่ที่เกิดผลบวกของเรนินในไตผิดปกติไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญจากบริเวณไตเด็กและไตผู้ใหญ่

เป็นที่รู้กันว่าการกระตุ้นการผลิตเรนนินมีบทบาทในการส่งสัญญาณ COX-2 และการศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมและความเข้มข้นของเรนินในพลาสมาลดลงหลังการให้สารยับยั้ง COX-2 หรือในการทำให้ COX ล้มลง -2 ยีน [10, 11] เนื่องจากไต dysplastic ที่ตรวจสอบในการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าไม่มีการแสดงออกของ COX ของไต -2 [19] การลดสัญญาณภูมิคุ้มกันของ renin ใน JGCs ในตอนแรกถูกสงสัยว่าเป็นความผิดปกติทางสรีรวิทยาที่เป็นไปได้ในไต dysplastic อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีในปัจจุบันไม่สามารถยืนยันสมมติฐานนี้ได้ และไม่มีการแนะนำให้ลดเรนินใน JGC อย่างชัดเจน แม้ว่าบทบาททางสรีรวิทยาของ tubular renin ยังไม่ได้รับการชี้แจงก่อนหน้านี้ การจัดการไตของโซเดียมอาจเป็นบทบาทที่เป็นไปได้ของ tubular renin เนื่องจากการเพิ่มประสิทธิภาพของการแสดงออกของ renin เกิดขึ้นใน nephron ส่วนปลาย หลังจากการให้อาหารที่มีเกลือต่ำในหนู [16] และไตที่ผิดปกติของสุนัขที่ตรวจในการศึกษาครั้งนี้อาจยังคงรักษาการทำงานของท่อนี้ได้

COX-2 ยังมีความสำคัญในการควบคุมระบบ TGF ซึ่งมีความสำคัญต่อการรักษาอัตราการกรองของไต การศึกษาในหนูแรทที่ใช้วิธีการเจาะด้วยไมโครแสดงให้เห็นการยับยั้งการตอบสนองของ TGF หลังการรักษาด้วยตัวยับยั้ง COX-2 [2] การตอบสนองของ TGF ในไตที่ผิดปกติอาจถูกลดทอนลงเนื่องจากขาดการแสดงออกของ COX{3}} ของไต อย่างไรก็ตาม ไม่มีการรายงานการค้นพบที่เกี่ยวข้องก่อนหน้านี้ ในไต nNOS จะแสดงออกมาในเซลล์ MD และช่วยควบคุมระบบ TGF [18]

ในการวิเคราะห์ nNOS ในปัจจุบัน ไม่พบสัญญาณที่ชัดเจนในภูมิภาค MD ของทุกกรณี (รูปที่ 2) การลดลงของ nNOS นี้ถือเป็นเหตุการณ์ที่เป็นสาเหตุทำให้เกิดโรคในไตที่ผิดปกติ แทนที่จะเป็นเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นหลังจากไตวายในกรณีต่างๆ การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราโดยใช้หนู OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) เป็นแบบจำลองของโรคเบาหวานประเภท 2 แสดงให้เห็นว่า nNOS มีการแสดงออกมากเกินไปใน MD และรอบเซลล์ tubular ในระยะหลังของโรคไตจากเบาหวาน [21] ในการควบคุมระบบ TGF ฟังก์ชันของ nNOS จะคล้ายกันและมีปฏิสัมพันธ์กับฟังก์ชันของ COX-2 การศึกษาบางชิ้นแนะนำว่า nNOS อยู่ในตำแหน่งต้นทางของเส้นทางการส่งสัญญาณและกระตุ้นการแสดงออกของ COX-2 [5, 9] ในทางกลับกัน การศึกษาอื่นๆ ได้เสนอแนะในทางตรงกันข้ามว่า COX-2 อยู่ในตำแหน่งต้นทางของ NOS [2, 13] โดยไม่คำนึงถึงความแตกต่างในเส้นทางการส่งสัญญาณ การขาด nNOS-immunosignals ในเซลล์ MD อาจกระตุ้นให้เกิดการลดลงของการแสดงออกของ COX-2 ของไตในไตที่ผิดปกติ