การออกแบบ การสังเคราะห์ และผลกระทบของแอนไทม์แลนเจนิคของอนุพันธ์เมทานอล (2-ฟีนิลที่ถูกแทนที่-1,3-ไดไทโอแลน-4-อิล)เมทานอล

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

โดฮยอนคิม1ซูจองคิม1สุลต่านอุลลาห์1ฮวียองยุน1ปูซูนชุน2ฮยองรยองมูน1

เชิงนามธรรม:ผู้เขียนออกแบบและสังเคราะห์อนุพันธ์ 17 (2-substitutiond phenyl-1,3-dithiolan-4-yl) methanol (PDTM) เพื่อหาโครงสร้างทางเคมีใหม่ ซึ่งแสดงได้ดีไทโรซิเนส-ยับยั้งกิจกรรม. กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของพวกมันถูกประเมินเทียบกับไทโรซิเนสของเห็ดที่ 50 ไมโครโมลาร์ และพบว่าอนุพันธ์ของ PDTM 5 ชนิด (PDTM3, PDTM7–PDTM9 และ PDTM13) นั้นสามารถยับยั้งเห็ดได้ไทโรซิเนสมากกว่ากรดโคจิกหรืออาร์บูติน สารควบคุมเชิงบวก จาก PDTM สิบเจ็ดตัว PDTM3 (ความเข้มข้นสูงสุดในการยับยั้งที่ 13.94±1.76 ไมโครโมลาร์) ที่มีมอยอิตีไดไฮดรอกซีฟีนิล 2,4-มอยอิตี แสดงผลการยับยั้งที่ยิ่งใหญ่ที่สุด (ความเข้มข้นของการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่งของกรดโคจิก 1886± 2.14 ไมโครโมลาร์) สิ่งที่น่าสนใจก็คือ สารประกอบ PDTM ที่ไม่มีหมู่ไฮดรอกซิล PDTM7–PDTM9 ก็มีฤทธิ์ในการยับยั้งที่แรงกว่ากรดโคจิกเช่นกัน ในการศึกษาซิลิโกของปฏิกิริยาระหว่างไทโรซิเนสและ PDTM ห้าตัว บ่งชี้ว่าสัมพรรคภาพในการจับของพวกมันสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของพวกมัน การทดลองโดยใช้เซลล์ที่ดำเนินการโดยใช้เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู B16F10 พบว่า PDTM3 ยับยั้งได้อย่างมีประสิทธิภาพการสร้างเม็ดสีและเซลล์ไทโรซิเนสกิจกรรม. การศึกษาความมีชีวิตของเซลล์ที่ดำเนินการโดยใช้เซลล์ B16F10 ระบุว่าผลของแอนไทม์แลนเจนิกของ PDTM3 ไม่ได้มาจากความเป็นพิษต่อเซลล์ของมัน การศึกษาทางจลนศาสตร์แสดงให้เห็นว่า PDTM3 สามารถยับยั้งไทโรซิเนสที่สามารถแข่งขันได้ ซึ่งบ่งชี้ถึงการจับกับไซต์ที่ออกฤทธิ์ของไทโรซิเนส เราพบว่า PDTM3 ที่มีโครงสร้างทางเคมีใหม่อาจเป็นตัวเลือกที่มีแนวโน้มสำหรับสารฟอกสีผิว และแหวนไดไทโอเลน 1,3-วงแหวนสามารถใช้เป็นโครงทางเคมีสำหรับการยับยั้งไทโรซิเนสที่มีศักยภาพคำสำคัญ:ตัวยับยั้งไทโรซิเนส, เมลาโนเจเนซิส, 1,3-ไดไทโอเลน, PDTM

Cistanche เป็นตัวยับยั้งไทโรซิเนส

บทนำ

ในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่ผ่านมาสารยับยั้งไทโรซิเนสได้รับความสนใจอย่างมาก เนื่องจากไทโรซิเนสมีบทบาทสำคัญในการสร้างเม็ดสี. เมลานินผลิตขึ้นโดยใช้ปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์และปฏิกิริยาเคมีร่วมกัน เส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพที่รับผิดชอบในการผลิตเมลานินได้รับการอธิบายในขั้นต้นโดย Raper1 และ Mason2 และเพิ่งแก้ไขโดย Cooksey et al3 และ Schallreuter et al.4 การสร้างเมลานินเริ่มต้นโดยเอนไซม์ไทโรซิเนสซึ่งกระตุ้นสองขั้นตอนแรกออกซิเดชันในเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของเมลานิน: การเกิดออกซิเดชัน ของ l-tyrosine เป็น l-dopa ตามด้วย l-dopa เป็น l-dopaquinone (รูปที่ 1) สองขั้นตอนนี้ยังเป็นขั้นตอนกำหนดอัตราในการสังเคราะห์ทางเมลานินเนื่องจากค่า pH ทางสรีรวิทยาสามารถดำเนินต่อไปได้เองตามขั้นตอนที่ตามมา5 โดปาควิโนนที่ผลิตในขั้นตอนที่สองจะถูกแปลงเป็นซิสเทนิลโดปาโดยกลูตาไธโอนหรือซิสเทอีน และสุดท้ายเป็นฟีโอเมลานินซึ่งมีหน้าที่ทำให้เกิดสีเหลืองเป็น สีแดงของผิวหนังของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือเป็นโดพาโครมโดยการออกซิเดชั่นอัตโนมัติและสุดท้ายคือยูเมลานินซึ่งเป็นสาเหตุของสีน้ำตาล/ดำของผิวหนังของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (รูปที่ 1) เมลานินช่วยปกป้องผิวหนังมนุษย์จากรังสีอัลตราไวโอเลตที่เป็นอันตรายและยังกำหนดลักษณะฟีโนไทป์ ในทางกลับกัน การสะสมเมลานินที่มากเกินไปในผิวหนังอาจทำให้เกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับรอยดำและปัญหาเครื่องสำอาง เช่น กระ ฝ้า และถั่วเลนติจีนในวัยชรา

ไทโรซิเนสมีการแพร่กระจายอย่างกว้างขวางในแบคทีเรีย เชื้อรา แมลง พืช และสัตว์ รวมทั้งมนุษย์ และมีหน้าที่รับผิดชอบต่อสีผิวและเส้นผมของมนุษย์ และการเกิดสีน้ำตาลที่ไม่พึงประสงค์ของผลไม้และผัก6 การเกิดสีน้ำตาลจากเอนไซม์ที่ไม่พึงประสงค์และโรคที่เกี่ยวข้องกับรอยดำบนผิวหนัง ได้สนับสนุนให้นักวิทยาศาสตร์ค้นหาสารยับยั้งไทโรซิเนสชนิดใหม่เพื่อใช้เป็นสารฟอกสีผิวและสารต่อต้านการเกิดสีน้ำตาล มากมายสารยับยั้งไทโรซิเนสถูกค้นพบจนถึงปัจจุบัน 7-9 แต่ค่อนข้างน้อยที่ได้รับการอนุมัติให้เป็นวัสดุฟอกสีผิวเนื่องจากความกังวลด้านความปลอดภัยหรือผลไวท์เทนนิ่งที่อ่อนแอ

ในการศึกษาก่อนหน้านี้ บนพื้นฐานของโครงสร้างของแอล-ไทโรซีนและแอล-โดปา ซึ่งเป็นสารตั้งต้นตามธรรมชาติของไทโรซิเนส เราออกแบบสารยับยั้งไทโรซิเนสที่มีศักยภาพสองตัวด้วยวงแหวนไทอาโซลิดีน (MHY384 และ MHY794; รูปที่ 1) และสังเคราะห์พวกมันโดยการควบแน่นของสารที่เหมาะสม benzaldehyde และ l-cysteine ​​หรือ cysteamine ไฮโดรคลอไรด์ สารประกอบทั้งสองนี้ถูกระบุว่ามีศักยภาพในการแข่งขันสารยับยั้งไทโรซิเนสและเพื่อลดการสร้างเม็ดสีในหนูที่ไม่มีขน HRM2 อย่างมีประสิทธิภาพ10,11 นอกจากการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสโดยตรงแล้ว MHY384 ยังยับยั้งการแสดงออกของไทโรซิเนสโดยการยับยั้งไซคลิกอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต–PKA10 และวิถีทางที่ไม่ใช่ไซคลิกกัวโนซีนโมโนฟอสเฟต–PKG12,13 และ MHY794 ยังถูกยับยั้งไทโรซิเนสการแสดงออกที่เกิดจาก NO-mediatedการสร้างเม็ดสีการส่งสัญญาณ 11 ผลลัพธ์เชิงบวกเหล่านี้และข้อเท็จจริงที่ว่าไดวาเลนต์ –S– เป็นไอโซสเตอรีคลาสสิกของไดวาเลนต์ –NH– สนับสนุนให้เราสังเคราะห์อนุพันธ์ด้วยวงแหวนไดไทโอเลนเป็นตัวแทนสำหรับวงแหวนไทอะโซลิดีนที่มักมีอยู่ใน MHY384 และ MHY794 เพื่อค้นหานวนิยาย สารยับยั้งไทโรซิเนส

ในการศึกษานี้ ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของความพยายามอย่างต่อเนื่องของเราในการหาโครงสร้างทางเคมีใหม่ที่แข็งแกร่งสำหรับการยับยั้งไทโรซิเนสและพัฒนาใหม่สารยับยั้งไทโรซิเนสเราสังเคราะห์คลาสของอนุพันธ์เชิงโครงสร้าง (2-ฟีนิลทดแทน-1,3-ไดไทโอแลน-4-อิล)เมทานอล (PDTM) (รูปที่ 1) และตรวจสอบผลกระทบของแอนติเมลาเจนโดยใช้ ไทโรซิเนสเห็ดและการทดสอบตามเซลล์ ในการศึกษานี้ กรดโคจิกและอาร์บูตินถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกสำหรับกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนส เนื่องจากกรดโคจิกเป็นหนึ่งในกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ใช้บ่อยที่สุดในการประเมินการยับยั้งไทโรซิเนส และอาร์บูตินถูกใช้ในทางการแพทย์เพื่อเป็นสารฟอกสีฟัน

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น รีเอเจนต์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดทั้งหมด – l-tyrosine (รหัส T3754), l-dopa (รหัส PHR1271), กรดโคจิก (รหัส K3125), MTT (3-(4,5-dimethyl{{ 8}}ไทอะโซลิล)-2,5-ไดฟีนิล-2H-เตตราโซลิเนียมโบรไมด์) (รหัส M2128), PMSF (ฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์) (รหัส P7626), ไทรทัน X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenylpolyethylene glycol) (รหัส T8787), โพแทสเซียม ไฮโดรเจน ฟอสเฟต (รหัส P9666), โพแทสเซียม ไดไฮโดรเจน ฟอสเฟต (รหัส PHR1330), 2,3- dimercapto-1-propanol (code 64046), 1,4-dioxane (code 296309), sulfuric acid (code 339741) และ benzaldehydes – ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) เซรั่มโคของทารกในครรภ์ Dulbecco's Modified Eagle น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เพนิซิลลินสเตรปโตมัยซินและทริปซินซื้อจาก Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) เห็ดไทโรซิเนส(รหัส T3824) และฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH; รหัส M4135) ก็ซื้อจากซิกมา-อัลดริชเช่นกัน สเปกตรัมนิวเคลียร์แม่เหล็กเรโซแนนซ์ (NMR) 1H และ 13C ถูกบันทึกบนเครื่องมือ Varian Unity Inova 400 และ Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) มวลสารความละเอียดต่ำ (MS) และข้อมูล MS ที่มีความละเอียดสูงได้รับจาก Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) และ 6530 Accurate Mass quadrupole time-of-flight liquid-chromatography mass spectrometer (Agilent) ตามลำดับ . การสังเคราะห์ PDTM1–PDTM17 ทำได้สำเร็จในห้องปฏิบัติการของเรา

สารสกัดจากซิสแทนเช่

ขั้นตอนทั่วไปสำหรับการสังเคราะห์ PDTM1–PDTM17

ไปยังสารละลายที่ถูกกวนของ 2,3-ไดเมอร์แคปโต-1-โพรพานอล (100 มก., 0.80 มิลลิโมล) ใน 1,4-ไดออกเซน (1 มล.) คือ เติมสารละลายของกรดซัลฟิวริก (ความสมมูล 0.1) ใน 1,4-ไดออกเซน (1 มล.) และเบนซาลดีไฮด์ที่เหมาะสม (การสมมูล 1.1) ในภายหลัง หลังจากถูกกวนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที, ของผสมปฏิกิริยาถูกกวนผสมที่ 70 องศาเป็นเวลา 40 นาที ถึง 1 ชั่วโมง จากนั้น ของผสมถูกแบ่งส่วนระหว่างเอทิล อะซีเตตกับน้ำ และชั้นอินทรีย์ถูกทำให้ปราศจากน้ำเหนือ MgSO4 ที่ปราศจากน้ำ, กรองและระเหย เรซิดิวที่ได้รับถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ซิลิกา-เจลคอลัมน์โครมาโตกราฟีเพื่อให้ผลิตภัณฑ์ PDTM บริสุทธิ์: PDTM1–PDTM17.14 การแสดงคุณลักษณะโครงสร้าง (1H และ 13C NMR และข้อมูลมวลของ PDTM ทั้งหมดและ 1-D และ 2-D NMR สเปกตรัมของ PDTM บางตัว) ของสารประกอบสังเคราะห์ถูกจัดให้มีไว้ในวัสดุเสริม

การยับยั้งเห็ดไทโรซิเนสโดย PDTM1–PDTM17

ผลการยับยั้งของแอนะล็อก PDTM ต่อไทโรซิเนสของเห็ดถูกสำรวจด้วยการดัดแปลงเล็กน้อยตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในงานของเรา15 สารประกอบแต่ละชนิด (10 ไมโครลิตร, ความเข้มข้นสุดท้าย 50 ไมโครโมลาร์) ถูกผสมกับสารละลายซับสเตรต (170 ไมโครลิตร) ซึ่งเตรียมจากโพแทสเซียม ฟอสเฟต 14.7 มิลลิโมลาร์ สารละลายบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และสารละลายแอล-ไทโรซีน 293 ไมโครโมลาร์ (1:1, v/v) ในแต่ละหลุมของเพลต 96-หลุม ในแต่ละหลุม สารละลายเห็ดไทโรซิเนส (20 ไมโครลิตร, 1,000 ยู/มล.) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 องศา เนื้อหาของโดปาโครมที่เกิดขึ้นในหลุมถูกกำหนดโดยการวัดความหนาแน่นของแสงที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท VersaMax (อุปกรณ์ระดับโมเลกุล Sunnyvale, CA, USA) ใช้กรดโคจิกและอาร์บูตินเป็นตัวควบคุมเชิงบวก การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า อัตราการยับยั้งของไทโรซิเนสถูกคำนวณดังนี้:

การยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)

โดยที่ A ระบุความหนาแน่นเชิงแสงของสารประกอบทดสอบ และ B แสดงถึงความหนาแน่นเชิงแสงของตัวควบคุม

ความเข้มข้นในการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่ง (IC50) คือความเข้มข้นของสารประกอบที่ยับยั้งการตอบสนองมาตรฐาน 50 เปอร์เซ็นต์ IC50 ได้มาจากแกน x บนกราฟความเข้มข้นของสารยับยั้งเทียบกับกราฟการก่อรูปผลิตภัณฑ์ และถูกกำหนดหาจากการจัดแนวของเส้นโค้งตอบสนองปริมาณการใช้บนแกน y ที่ขึ้นต่อกัน ในการศึกษานี้ การทดลองการยับยั้งที่ขึ้นกับขนาดยาถูกดำเนินการเป็นสามเท่าเพื่อกำหนดหา IC50 ของสารประกอบ ตามเปอร์เซ็นต์การยับยั้งของปริมาณห้าขนาด (ความเข้มข้นสุดท้าย 10, 20, 30, 40 และ 50 ไมโครโมลาร์) ในการทดลองแต่ละครั้ง กราฟเชิงเส้นตรงและสมการถูกกำหนดหา จากนั้นจึงคำนวณค่า IC50 แต่ละรายการเป็นความเข้มข้นเมื่อแกน y เท่ากับการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ ผลลัพธ์จากการทดลองทั้งสามจะแสดงขึ้น

การวิเคราะห์ธรรมชาติของการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

เพื่อชี้แจงลักษณะของผลการยับยั้งของ PDTM3 ต่อไทโรซิเนสของเห็ด ได้ทำการศึกษาจลนศาสตร์ PDTM3 (10 ไมโครลิตร [0, 5, 10 หรือ 25 ไมโครโมลาร์สุดท้ายความเข้มข้น]) ถูกเติมลงในสารละลายแอล-ไทโรซีน 170 ไมโครลิตร (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5, 1, 2 หรือ 4 มิลลิโมลาร์) และ แล้วคลุกกับเห็ดไทโรซิเนสสารละลาย (20 ไมโครลิตร, 1,000 ยู/มล.) ในแต่ละหลุมของเพลต96-หลุม หลังจากที่ของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 องศา เนื้อหาของโดปาโครมที่ผลิตในหลุมถูกกำหนดหาโดยการวัดความหนาแน่นเชิงแสงที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า สำหรับการกำหนดลักษณะการยับยั้ง ได้ใช้โครงเรื่อง Lineweaver–Burk

สารสกัดจากซิสแทนเช่ ประโยชน์

การจำลองการเทียบเคียงของ PDTM3 หรือกรดโคจิกด้วยไทโรซิเนส

การจำลองการเทียบท่าในซิลิโกของโปรตีน-ลิแกนด์ได้ดำเนินการด้วย AutoDock Vina โดยใช้เทคนิคการค้นหาอย่างเป็นระบบและโครงสร้าง 3-D ของ Agaricus bisporusไทโรซิเนส(โปรตีน Data Bank ID 2Y9X).16,17 ในโครงสร้างผลึกของไทโรซิเนส ตำแหน่งการจับของแอล-ไทโรซีนถูกใช้เป็นกระเป๋าเชื่อมต่อ ผลลัพธ์การจำลองได้มาจากการเทียบท่าระหว่างไทโรซิเนสและสารประกอบสังเคราะห์ (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 และ PDTM13) หรือกรดโคจิก ก่อนทำการจำลองการเทียบท่ากับสารประกอบ โครงสร้าง 2-D ของสารประกอบถูกแปลงสภาพเป็นโครงสร้าง 3-D กำหนดหาประจุของสารประกอบ และอะตอมไฮโดรเจนถูกแทรกโดยใช้ ChemOffice LigandScout 3.1.2 ใช้สำหรับทำนายปฏิกิริยาที่เป็นไปได้ระหว่างลิแกนด์กับไทโรซิเนสและการระบุเภสัชภัณฑ์ ภาพจำลองการเทียบท่าของ 17 PDTM มีให้ในเอกสารประกอบ

การหาระดับเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ B16F10

การสอบวิเคราะห์ปริมาณเมลานินที่มีการดัดแปลงเล็กน้อยถูกใช้ในเซลล์ B16F10 สำหรับผลการยับยั้งของ PDTM3 บนการสร้างเม็ดสี.19 เซลล์ที่เพาะที่ความหนาแน่น 5×104 เซลล์/หลุมในจานหลุม24-หลุมได้รับอนุญาตให้เกาะติดที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในชั่วข้ามคืน วันต่อมา เซลล์ถูกเผยสัมผัสกับ -MSH (1 ไมโครโมลาร์) และ PDTM3 (0, 5, 10 หรือ 25 ไมโครโมลาร์) หรือกรดโคจิก (25 ไมโครโมลาร์) และเพลตถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงภายใต้สภาวะเดียวกัน หลังจากถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกแยกออกโดยการบ่มที่ 60 องศาใน 200 ไมโครลิตรของ 1 N NaOH เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ไลเซตถูกย้ายไปยังเพลต 96-หลุม และความหนาแน่นเชิงแสงถูกวัดที่ 405 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านการสอบวิเคราะห์อิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์สำหรับการคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเฉลี่ยของกรดโคจิกและ PDTM3 การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า

การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ B16F10

โดยการประมาณอัตราการออกซิเดชันของแอล-โดปาไทโรซิเนสกิจกรรมถูกประเมินด้วยการดัดแปลงเล็กน้อย ตามที่อธิบายไว้ในงานก่อนหน้านี้20 เซลล์ที่เพาะที่ความหนาแน่น 5×104 เซลล์/หลุมในจาน24-หลุมได้รับอนุญาตให้ ยึดที่อุณหภูมิ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกเผยสัมผัสกับ -MSH (1 ไมโครโมลาร์) และ PDTM3 (0, 5, 10 หรือ 25 ไมโครโมลาร์) หรือกรดโคจิก (25 ไมโครโมลาร์) และเพลตถูกบ่มภายใต้สภาวะเดียวกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากล้างด้วย PBS สองครั้ง เซลล์ถูกสลายด้วย 100 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์ lysis ที่มี 0.1 มิลลิโมลาร์ PMSF (5 ไมโครลิตร), 50 มิลลิโมลาร์ PBS (90 ไมโครลิตร, pH 6.8) และ 1 เปอร์เซ็นต์ไทรทัน X-100 (5 ไมโครลิตร) และแช่แข็งที่ -80 องศาเป็นเวลา 30 นาที ไลเซตถูกละลายและหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศาและส่วนลอยเหนือตะกอน (80 ไมโครลิตร) ถูกรวมกับ 10 มิลลิโมลาร์ l-โดปา (20 ไมโครลิตร) ในจานหลุม 96-หลุม ซึ่งจากนั้น ฟักเป็นเวลา 30 นาที ที่ 37 องศา ความหนาแน่นของแสงคำนวณที่ 500 นาโนเมตรและกิจกรรมการยับยั้งของไทโรซิเนสถูกกำหนดดังนี้:

การยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ )=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)

โดยที่ B และ A คือความหนาแน่นเชิงแสงของช่องว่างก่อนและหลังการฟักไข่ ตามลำดับ และ D และ C คือความหนาแน่นเชิงแสงของสารประกอบทดสอบก่อนและหลังการฟักไข่ ตามลำดับ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบของ Dunnett ใช้เพื่อพิจารณาว่าค่าเฉลี่ยกลุ่มแตกต่างจากกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ การทดสอบแบบ unpaired ของ Welch ถูกใช้เพื่อตรวจสอบว่าผลของ PDTM3 และกรดโคจิกมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติหรือไม่ การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ GraphPad (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ผลลัพธ์ทั้งหมดถูกระบุเป็นค่าเฉลี่ย ± ความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของการทดลองอิสระสามครั้ง ค่า P สองด้านของ 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

ผลลัพธ์และการอภิปราย

การเตรียม PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 ถูกสังเคราะห์ตามที่แสดงในแผนภาพที่ 1 การให้ความร้อน 2,3-ไดเมอร์แคปโต-1-โพรพานอลและเบนซาลดีไฮด์ที่ถูกแทนที่อย่างเหมาะสมจำนวนมาก (1–17) ใน 1,4-ไดออกเซนใน การมีอยู่ของกรดซัลฟิวริกทำให้ได้ผลิตภัณฑ์ PDTM ที่ต้องการในรูปของของแข็งหรือน้ำมันเหนียว โครงสร้างของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายได้รับการยืนยันโดย 1H และ 13C NMR, สหสัมพันธ์สเปกโทรสโกปี, สเปกโทรสโกปีสหสัมพันธ์ควอนตัมเดี่ยวของเฮเทอโรนิวเคลียร์, สเปกโทรสโกปีสหสัมพันธ์หลายพันธะเฮเทอโรนิวเคลียร์ และ MS ที่มีความละเอียดสูงและต่ำ การมีอยู่ของเสื้อกล้ามที่สอดคล้องกับโปรตอน –SCH(Ph)S– ที่ δ=6.09–5.56 ppm ในสเปกตรัม 1H NMR ยืนยันการก่อตัวของวงแหวนไดไทโอเลนระหว่างเบนซาลดีไฮด์กับ 23-เมอร์แคปโต -1-โพรพานอล ในข้อมูลสเปกโตรสโกปี 1H NMR ของ PDTMs พีคของ 2-H ปรากฏขึ้นที่ด้านล่างมากกว่าพีคของโปรตอนที่ติดอยู่กับอะตอมของคาร์บอน sp3 และค่าพีคของ 4-H exomethylene และ 5-H2 ถูกสังเกตได้มากกว่า upfield ตามลำดับชื่อ ในข้อมูลสเปกโตรสโกปี 13C NMR นอกเหนือจากพีคจากวงแหวนฟีนิล พีคคาร์บอนของเอ็กโซเมทิลีน (~64 ppm) เป็นจุดต่ำสุดมากที่สุด ตามด้วย 4-C (~58 ppm), 2-C (~55.3 ppm) และ 5-C (~41 ppm) สี่ผลิตภัณฑ์ – PDTM6, PDTM12, PDTM13 และ PDTM15 – แต่ละตัวได้รับมาในฐานะ racemate เดียว ในขณะที่ผลิตภัณฑ์อื่นๆ ได้มาจากส่วนผสมของ racemates สองตัว ([2R,4R]/[2S,4S] และ [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1.5) ซึ่งคำนวณอัตราส่วนโดยใช้ข้อมูลสเปกโทรสโกปี 1H NMR ปรากฏการณ์ในการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ไม่สามารถอธิบายได้ง่ายๆ ด้วยเอฟเฟกต์ steric, electronic และ/หรือ stereoelectronic ดิการยับยั้งไทโรซิเนสการทดสอบดำเนินการโดยไม่มีการแยกจากเพื่อนร่วมการแข่งขัน

ผลการยับยั้งของ PDTM1–PDTM17 ต่อไทโรซิเนสเห็ด

ตรวจสอบศักยภาพของผลิตภัณฑ์สังเคราะห์ 17 ชนิด คือ PDTM1–PDTM17 ในการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสของเห็ดโดยใช้กรดโคจิก 22 และอาร์บูติน23 เป็นสารควบคุมเชิงบวก การยับยั้งถูกกำหนดหาโดยใช้ 293 ไมโครโมลาร์ แอล-ไทโรซีนเป็นซับสเตรตและสารประกอบสังเคราะห์ที่ความเข้มข้น 50 ไมโครโมลาร์ไทโรซิเนสการยับยั้งโดยกรดโคจิกและอาร์บูตินถูกกำหนดหาที่ 50 และ 500 ไมโครโมลาร์ตามลำดับ

สารประกอบสามชนิด – PDTM11 (3,4,5-ไตรเมทอกซีฟีนิล), PDTM15 (4-ไฮดรอกซี-3-เมทิลฟีนิล) และ PDTM17 (3,5-ได-ที-บิวทิล{{ 12}}ไฮดรอกซีเมทิล) – ยับยั้งไทโรซิเนสในระดับเดียวกับกรดโคจิกและยับยั้งมันได้มากกว่าอาร์บูติน (ตารางที่ 1) อนุพันธ์ของ PDTM ห้าชนิด – PDTM3 (2,4-ไดไฮดรอกซีฟีนิล), PDTM7 (4-เมทอกซีฟีนิล), PDTM8 (3,4-ไดเมทอกซีฟีนิล), PDTM9 (2,4-ไดเมทอกซีฟีนิล), และ PDTM13 (3-โบรโม-4-ไฮดรอกซีฟีนิล) – ยับยั้งไทโรซิเนสได้ดีกว่ากรดโคจิก ค่า IC50 ของสารประกอบเหล่านี้ถูกตรวจสอบ: 13.94±1.76 µM (PDTM3), 16.47±2.36 µM (PDTM7), 16.97±2.99 µM (PDTM8), 27.85±1.47 µM (PDTM9) และ 15.57±3.31 µM (PDTM13) ค่า IC50 ต่ำของ PDTM3, PDTM7, PDTM8 และ PDTM13 บ่งชี้ว่าศักยภาพแข็งแกร่งกว่ากรดโคจิก (18.86±2.14 µM) และอาร์บูติน (381.26±3.22 µM) ซึ่งถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก . น่าสนใจ ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับการค้นพบครั้งก่อนของเราว่าแอนะล็อกจำนวนมากที่มีมอยอิตีไดไฮดรอกซีฟีนิล 2,4-มีค่าสูงกว่าไทโรซิเนส-ยับยั้งกิจกรรมมากกว่ากรดโคจิก10,13,24–32

อนุพันธ์ของ PDTM ที่เหลือไม่มี (PDTM1 และ PDTM2) หรือผลการยับยั้งต่ำ (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 และ PDTM16) ที่เปรียบเทียบกับกรดโคจิก จากข้อมูลความสัมพันธ์เชิงโครงสร้างและกิจกรรมที่สะสมของเรา แอนะล็อกที่มีกลุ่มไฮดรอกซิลอย่างน้อยหนึ่งกลุ่มสามารถยับยั้งไทโรซิเนสได้มากกว่า ค่อนข้างน่าประหลาดใจ อนุพันธ์ของ PDTM สี่ชนิดที่ไม่มีกลุ่มไฮดรอกซิลยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสได้มากหรือมีประสิทธิภาพมากกว่ากรดโคจิก สิ่งเหล่านี้คือ PDTM7 (4-เมทอกซีฟีนิล), PDTM8 (3,4-ไดเมทอกซีฟีนิล), PDTM9 (2,4-ไดเมทอกซีฟีนิล) และ PDTM11 (3,4,5-ไตรเมทอกซีฟีนิล) . สารประกอบ (PDTM1-2, PDTM4-5 และ PDTM12) ที่มีเพียง 4-หมู่ไฮดรอกซิลบนวงแหวนฟีนิลหรือหมู่อัลคอกซีหรือไฮดรอกซิลที่ตำแหน่ง 3 ที่มี 4-ไฮดรอกซิล กลุ่มมีฤทธิ์ต่ำหรือไม่มีเลย ในขณะที่สารประกอบ (PDTM13–PDTM17) ที่มีหมู่อัลคิลหรือโบรโมที่ตำแหน่ง 3 ที่มีหมู่ 4-ไฮดรอกซิลแสดงฤทธิ์ในการยับยั้งไทโรซิเนสสูงปานกลางถึงสูง ผลลัพธ์ความสัมพันธ์เชิงโครงสร้างและกิจกรรมเหล่านี้สนับสนุนสมมติฐานที่ว่าตัวยับยั้งไทโรซิเนสการออกฤทธิ์ของสารประกอบที่มีหมู่4-ไฮดรอกซิลได้รับผลกระทบอย่างมากจากชนิดของ3-หมู่แทนที่

cistancheประโยชน์: ต่อต้านริ้วรอย

โหมดการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดโดย PDTM3

เนื่องจาก PDTM3 ยับยั้งเห็ดไทโรซิเนสส่วนใหญ่ พล็อต Lineweaver–Burk ถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะของผลการยับยั้ง ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2 ได้โครงแบบสองส่วนกลับ และเส้นทั้งหมดที่มีความชันต่างกันตัดกับแกน y ที่จุดเดียวกัน ดังนั้นค่า Km (ค่าคงที่ของไมเคิล) จึงค่อยๆ เพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นของ PDTM3 ค่าพารามิเตอร์จลนศาสตร์โดยละเอียดถูกแสดงในตารางที่ 2 ในทางกลับกัน ความเร็วปฏิกิริยาสูงสุด (Vmax) ไม่ได้รับผลกระทบจากความเข้มข้นของ PDTM3 การค้นพบนี้แสดงให้เห็นไทโรซิเนสที่ยับยั้งโดยขึ้นกับขนาดยาและแข่งขันได้

ในการจำลองการเทียบท่าซิลิโคของความสัมพันธ์ของไทโรซิเนสกับ PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 และกรดโคจิก

AutoDock Vina ถูกใช้เพื่อตรวจสอบว่าแอนะล็อก PDTM ที่สังเคราะห์แล้วยับยั้งไทโรซิเนสโดยตรงผ่านการจับกับไซต์ที่ทำงานอยู่หรือไม่ กรดโคจิกและสารอะนาล็อก PDTM ห้าชนิด (PDTM3, PDTM7–PDTM9 และ PDTM13) ซึ่งพบว่ามีเห็ดที่มีศักยภาพไทโรซิเนส-ยับยั้งกิจกรรมถูกใช้เป็นลิแกนด์สำหรับการจำลองการเทียบท่า แอนะล็อก PDTM แต่ละตัวเหล่านี้สามารถมีสเตอริโอไอโซเมอร์สี่ตัว และพลังงานการจับของสเตอริโอไอโซเมอร์ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 3A สารอะนาล็อก PDTM ทั้งห้าชนิดถูกพบว่ามีสัมพรรคภาพที่คล้ายกันหรือสูงกว่าสำหรับตำแหน่งแอคทีฟของไทโรซิเนสที่เปรียบเทียบกับกรดโคจิก (-5.4 กิโลแคลอรี/โมล) และ PDTM3 แสดงให้เห็นถึงสัมพรรคภาพมากที่สุด ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าผลการยับยั้งที่เข้มข้นของอนุพันธ์ของ PDTM ทั้งห้านี้มีสาเหตุมาจากสัมพรรคภาพในการจับของพวกมันกับไทโรซิเนส และแสดงความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดระหว่างสัมพรรคภาพในการจับ ตามที่กำหนดโดยการจำลองการเทียบท่าและการยับยั้งไทโรซิเนส

LigandScout 3.1.2 ถูกใช้เพื่อระบุไทโรซิเนสเรซิดิวกรดอะมิโนที่ทำปฏิกิริยากับแอนะล็อก PDTM ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3B และ C กลุ่ม 4-กลุ่มไฮดรอกซิลบนวงแหวนฟีนิลของ PDTM3 ทำปฏิกิริยากับ His85 ของไทโรซิเนสผ่านพันธะไฮโดรเจน และวงแหวนฟีนิลมีปฏิสัมพันธ์กับ Val283 และ Ala286 ผ่านอันตรกิริยาที่ไม่ชอบน้ำและกับ His263 จนถึง π–π การโต้ตอบแบบซ้อน พันธะไฮโดรเจนระหว่างหมู่แอลกอฮอล์ไฮดรอกซิลและเรซิดิวกรดอะมิโนของไทโรซิเนสถูกตรวจพบสำหรับ PDTM7 และ PDTM8 เท่านั้น อย่างไรก็ตาม หมู่แอลกอฮอล์ไฮดรอกซิลของอะนาลอก PDTM ทั้งสองมีปฏิสัมพันธ์กับเรซิดิวกรดอะมิโนที่แตกต่างกัน เช่น PDTM7 มีปฏิสัมพันธ์กับ His244 และ Asn260 ในขณะที่ PDTM8 มีปฏิสัมพันธ์กับ Gly281 นอกจากนี้ Val283 ของไทโรซิเนสยังเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำกับแอนะล็อกทั้งห้า

การตรวจปริมาณเมลานิน

เซลล์ B16F10 ถูกใช้เพื่อประเมินการออกฤทธิ์ของการลดเม็ดสีของสารอะนาล็อก PDTM PDTM3 ได้รับเลือกสำหรับการทดลองโดยใช้เซลล์ เนื่องจากเห็ดมีศักยภาพไทโรซิเนส-ยับยั้งผลกระทบและการขาดความเป็นพิษต่อเซลล์ B16F10 PDTM3 ถูกประเมินผลสำหรับผลการยับยั้งต่อ -MSH-stimulatedการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 โดยกำหนดระดับเมลานินในเซลล์ ระดับเมลานินลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากเซลล์ถูกโคทรีตด้วย PDTM3 และ -MSH เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย -MSH เพียงอย่างเดียว ในช่วงความเข้มข้น 0–25 ไมโครโมลาร์ PDTM3 แสดงผลแอนติเมลาโนเจนที่มีนัยสำคัญและขึ้นกับขนาดยา นอกจากนี้ ที่ความเข้มข้นเพียง 10 ไมโครโมลาร์ PDTM3 แสดงให้เห็นศักยภาพในการยับยั้งที่สูงกว่ากรดโคจิกที่ 25 ไมโครโมลาร์ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าผลของแอนไทม์แลนเจนิกของ PDTM3 ในเซลล์ B16F10 ไม่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษต่อเซลล์

การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ B16F10

ผลการยับยั้งของ PDTM3 ต่อการทำงานของไทโรซิเนสของเซลล์ถูกตรวจสอบในเซลล์ B16F10 ที่กระตุ้นด้วย -MSH PDTM3 ถูกยับยั้งโดยขึ้นกับขนาดยาไทโรซิเนสกิจกรรมในช่วงความเข้มข้น 0–25 μM (รูปที่ 6) นอกจากนี้ ผลลัพธ์เหล่านี้ยังตรงกับผลลัพธ์ของเนื้อหาเมลานินอีกด้วย ซึ่งแนะนำว่าฤทธิ์ต้านการเกิดมะเร็งของ PDTM3 นั้นเกิดจากการยับยั้งไทโรซิเนส

บทสรุป

ในงานนี้ ได้มีการสังเคราะห์และประเมินผลแอนะล็อก PDTM ที่หลากหลายสำหรับผลกระทบต่อการสร้างเม็ดสีและกิจกรรมของไทโรซิเนสในเซลล์ B16F10 สารคล้ายคลึงแปดชนิดแสดงฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดได้มากหรือมากกว่ากรดโคจิก และ PDTM3 มีฤทธิ์ยับยั้งได้มากที่สุด ในเซลล์ B16F10 PDTM3 ยับยั้งการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเมลานินอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและไทโรซิเนสกิจกรรมในช่วงความเข้มข้น 0–25 μM โดยไม่มีผลต่อเซลล์ ที่ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ PDTM3 ลดการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเมลานินและการทำงานของไทโรซิเนสมากกว่ากรดโคจิกที่ 25 ไมโครโมลาร์อย่างมีนัยสำคัญ จากการสังเกตของเราว่าสารอะนาล็อกของ PDTM จำนวนมากแสดงให้เห็นกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสที่มีศักยภาพ เราขอแนะนำว่า 1,3-dithiolane ถือเป็นโครงที่เหมาะสมสำหรับไทโรซิเนส-ยับยั้งกิจกรรม. ตอนนี้ เรากำลังหาสภาวะการแยกตัวของส่วนผสม PDTM แต่ละรายการของเพื่อนร่วมการแข่งขันสองคน และสภาวะการแยกตัวและผลกระทบของแอนไทม์แลนเจนิกของ Racemate ทุกรายจะถูกรายงานในเวลาที่เหมาะสม

ซื้อผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร cistanche