ส่วนผสมที่มีประสิทธิภาพของ Cistanche: การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ Phenylethanoid Glycosides

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com

การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ Phenylethanoid Glycosides จาก Cistanche Deserticola โดยโครมาโตกราฟีแบบกระแสตรงความเร็วสูง

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a,

J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

a Department of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun 130032, China

b Guelph Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 93 Stone Road West, Guelph, Ontario, แคนาดา N1G 5C9

รับวันที่ 31 พฤษภาคม 2550; ได้รับในแบบฟอร์มแก้ไข 16 ตุลาคม 2550; รับ 29 ตุลาคม 2550

เชิงนามธรรม:

ห้าฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์(PhG)เอ็กไคนาโคไซด์, ซิสตาโนไซด์ A, แอกทีโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์ และ 20-อะซีติแลคติโอไซด์ ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์จากCistanche deserticolaเป็นครั้งแรกโดยโครมาโตกราฟีแบบกระแสตรงความเร็วสูง (HSCCC) โดยใช้ระบบไบเฟสิกสองระบบ ระบบหนึ่งประกอบด้วยเอทิลอะซิเตต–เอธานอล-วอเตอร์ (5:0.5:4.5, v/v/v) และอีกระบบหนึ่ง ของเอทิล อะซีเตต–n-บิวทานอล–เอทานอล-วอเตอร์ ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v) อิไคนาโคไซด์รวม 28.5 มก., 18.4 มก. ของซิสตาโนไซด์ A, 14.6 มก. ของแอคทีโอไซด์, isoacteoside 30.1 มก. และ 20-acetylacteoside 25.2 มก. ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก 1412 มก. ของสารสกัด n-butanol ของCistanche deserticola, แต่ละตัวมีความบริสุทธิ์มากกว่า 92.5% ตามที่กำหนดโดย HPLC โครงสร้างถูกระบุโดยเวลาการคงอยู่ของพวกมัน, UV, LC–ESI-MS ในโหมดไอออนลบ และยืนยันโดยการทดลอง NMR มีการกล่าวถึงรูปแบบการกระจายตัวของ LC–ESI-MSn ที่เป็นลักษณะเฉพาะของสารประกอบทั้งห้า และพบว่าเป็นเครื่องมือเฉพาะเจาะจงและมีประโยชน์มากสำหรับการระบุโครงสร้างของ PhGs จากพืชสมุนไพรที่สำคัญนี้

Crown ลิขสิทธิ์ © 2007 เผยแพร่โดย Elsevier Ltd. สงวนลิขสิทธิ์

คำสำคัญ:Cistanche deserticola; ฟีนิลทานอยด์;เอ็กไคนาโคไซด์; ซิสตาโนไซด์ เอ;แอคทีโอไซด์; ไอโซแอคทีโอไซด์; 20-อะเซทิแลคทีโอไซด์; HSCCC; LC–ESI-MS; NMR

1. บทนำ

Cistanche deserticolaYC Ma เป็นยาสมุนไพรจีนที่มีชื่อเสียงและมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการเตรียมอาหารแบบดั้งเดิมที่คล้ายกับส่วนผสมในอาหารหรืออาหารเสริมที่ใช้งานได้ในปัจจุบัน (Wong, Li, Cheng, & Chen, 2006) องค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญใน C. deserticola คือphenylethanoidไกลโคไซด์ (PhGs) รวมทั้งเอ็กไคนาโคไซด์, แอคทีโอไซด์, ไอโซแอคทีโอไซด์, 20-อะซิติแลคติโอไซด์ และซิสตาโนไซด์ A(โคบายาชิ, คาราซาว่า, & มิยาเสะ, 1984; Kobayashi et al., 1987) PhGs มีการกระจายอย่างกว้างขวางในอาณาจักรพืช และได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางเกี่ยวกับหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ ของ PhG เช่น hepatoprotective (Xiong et al., 1998), anti-inflammatory, antinociceptive activity (Schapoval et al., 1998) และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Cheng , Wei, Guo, Ni, & Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li, & But, 2000; Li, Wang, & Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu, & Jia, 1993; Wang, Jiang , Wu, & Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani, & Namba, 1996), ปรับปรุงสมรรถภาพทางเพศ (Xie & Wu, 1993; Zong, He, Wu, & Chen, 1996) และยากล่อมประสาท effect (Lu, 1998) .

เนื่องจากฤทธิ์ทางชีวภาพที่มีนัยสำคัญข้างต้น สารประกอบบริสุทธิ์จำนวนมากจึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วนเพื่อเป็นมาตรฐานอ้างอิง และสำหรับการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกายต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการใช้ยาแผนจีน วิธีการที่มีประสิทธิภาพสำหรับการแยก การทำให้บริสุทธิ์ และการกำหนดลักษณะโครงสร้างของ PhGs จึงมีความจำเป็น อย่างไรก็ตาม งานดังกล่าวมักต้องใช้ขั้นตอนโครมาโตกราฟีหลายขั้นตอนในการทำความสะอาดและแยกตัวอย่าง (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten, & Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin, & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987) ซึ่งมักส่งผลให้อัตราการฟื้นตัวต่ำเนื่องจากการดูดซับ PhGs ที่ไม่สามารถย้อนกลับได้บนการสนับสนุนที่มั่นคงระหว่างการแยก (Lei et al., 2001) ในทางตรงกันข้าม high-speed counter-current chromatography (HSCCC) ได้กลายเป็นทางเลือกที่มีประสิทธิภาพสำหรับเทคนิคโครมาโตกราฟีแบบเดิมสำหรับการแยก PhGs บางส่วนออกจากสารสกัดจากพืช (Lei et al., 2001; Li et al., 2005) ลี และคณะ แยกได้สำเร็จแอคทีโอไซด์และ 20-acetylacteoside จาก Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck โดยใช้ HSCCC (Lei et al., 2001) ผู้เขียนบทความนี้ได้รายงานการแยกตัวของแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์จาก Plantago psyllium L. โดย HSCCC (Li et al., 2005) อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการเผยแพร่รายงานเกี่ยวกับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ PhGs หลายตัวจากCistanche deserticolaโดยใช้ HSCCC เนื่องจากขาดมาตรฐาน วิธีการ LC-MS จึงได้รับการพัฒนาและใช้เป็นเครื่องมือวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพสำหรับการกำหนดลักษณะเฉพาะและการระบุอย่างรวดเร็วของ PhGs บางชนิดในสารสกัดจากพืช (Li et al., 2005; Wang et al., 2000)

ในบทความนี้ เรารายงานวิธี HSCCC ที่พัฒนาขึ้นสำหรับการเตรียมอิชินาโคไซด์ซิสตาโนไซด์ A, acteoside, isoacteoside และ 20-acetylacteoside fromCistanche deserticola. การหาลักษณะเฉพาะและการวิเคราะห์ของ PhG ห้าตัวที่แยกจากกันทำได้สำเร็จโดยการใช้ LC ควบคู่ไปกับ in-line ESI mass spectrometry และการทดลอง NMR เวลาการกักเก็บ น้ำหนักโมเลกุล และชิ้นส่วนอิออนที่เป็นลักษณะเฉพาะของ PhG ทั้งห้าถูกนำเสนอและอภิปรายในบทความนี้ โครงสร้างของ PhGs ทั้งห้าที่ระบุในการศึกษานี้แสดงไว้ในรูปที่ 1

เอ็กไคนาโคไซด์ใน cistanche

2. ทดลอง

2.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

แอคทีโอไซด์ถูกซื้อจาก Sigma–Aldrich (Oak- Ville, ON), echinacoside ถูกซื้อจาก ChromaDex (Santa Ana, CA) ไอโซแอคทีโอไซด์ถูกแยกได้จาก P. psyllium L. (Li et al., 2005)Cistanche deserticolaถูกซื้อจาก Beijing TongRenTang Medicinal Store (ประเทศจีน) ตัวทำละลายทั้งหมดเป็นเกรด HPLC และซื้อจาก Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON)

2.2. การเตรียมตัวอย่าง

Cistanche deserticola(20 กรัม) ถูกสกัดห้าครั้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 12 ชั่วโมงต่อครั้งด้วยเอทานอลที่มีน้ำ 80 เปอร์เซ็นต์ 100 มล. ทุกครั้งที่กรองส่วนผสมในการสกัดผ่านกระดาษกรอง Whatman No.1 (Whatman International Ltd., Maidstone, England) ฟิลเตรตที่รวมกันถูกทำให้เข้มข้นถึง 100 มล. ในสุญญากาศที่ <40 องศา="" สารละลายในน้ำที่เป็นผลลัพธ์ถูกไล่ไขมันสองครั้ง="" โดยแต่ละตัวมีเฮกเซน="" 100="" มิลลิลิตร="" จากนั้นสกัดอย่างต่อเนื่องเป็นเวลาห้าครั้ง="" โดยแต่ละตัวมีเอ็น-บิวทานอล="" 100="" มิลลิลิตร="" ชั้นเอ็น-บิวทานอลถูกผสมและทำให้เข้มข้นจนแห้งในสุญญากาศที่="">< 40="" องศา="" ซึ่งให้สารสกัดเอ็น-บิวทานอล="" 2.2="" กรัม="" สารสกัดถูกเก็บไว้ที่="" -20="" องศาก่อนการแยก="">

2.3. ขั้นตอนการแยก HSCCC

การเตรียม HSCCC ดำเนินการใน Model CCC{0}} high-speed counter-current chromatography (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland USA) เครื่องมือนี้มีขดลวดเตรียมการสามชุด เชื่อมต่อแบบอนุกรม (ปริมาตรรวม 325 มล.) สามารถปรับความเร็วรอบของเครื่องได้ระหว่าง 0 ถึง 2000 รอบต่อนาที ระบบ HSCCC ได้รับการติดตั้งปั๊ม HPLC (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, USA), เครื่องตรวจจับ UV รุ่น 450 (Alltech, USA), เครื่องบันทึกแบบเตียงรุ่น L 120 E (Linseis Inc., Princeton Jct, สหรัฐอเมริกา) ตัวเก็บเศษส่วน (Advantec MFS Inc., USA) และวาล์วฉีดตัวอย่างที่มีลูปตัวอย่าง 10-มล.

ของผสมของเอทิล อะซีเตต–เอทานอล-น้ำ (5:0.5:4.5, v/v/v) ถูกเขย่าอย่างแรงในกรวยแยกและปล่อยให้ยืนและแยกออกจากกันที่อุณหภูมิห้อง สองขั้นตอนถูกใช้ใน HSCCC หลังจากที่พวกเขาไปถึงสมดุล คอลัมน์ขดทั้งหมดถูกเติมด้วยชั้นบนเป็นครั้งแรกซึ่งทำหน้าที่เป็นระยะนิ่ง จากนั้นชั้นล่าง (เฟสเคลื่อนที่) ถูกปั๊มเข้าไปในส่วนหัวของคอลัมน์ที่อัตราการไหลของน้ำที่ 1.5 มล./นาที ความเร็วในการหมุนถูกกำหนดไว้ที่ 1050 รอบต่อนาที ตัวอย่าง (ประมาณ 230 มก. ต่อครั้ง) ที่ละลายในส่วนผสมของเอทิล อะซิเตต–เอธานอล-น้ำ (5:0.5:4.5, v/v/v) จำนวน 8 มล. ถูกบรรจุลงในวาล์วหัวฉีดหลังจากที่ระบบไปถึงอุทกพลศาสตร์ สมดุล. ระบบตัวทำละลายแบบไบเฟสนี้ถูกเลือกโดยพิจารณาจากค่า coefficient ของพาร์ติชั่น (K) ซึ่งเท่ากับ 0.87, 1.11 และ 1.32 สำหรับแอคทีโอไซด์, isoacteoside และ 20 acetylacteoside ตามลำดับ ค่า K คืออัตราส่วนของความเข้มข้นในชั้นบนสุดและชั้นล่างของสารประกอบเดียวกันตามที่กำหนดหาโดย HPLC (รูปที่ 2) effluent จากทางออกของคอลัมน์ถูกเฝ้าติดตามอย่างต่อเนื่องโดยเครื่องตรวจจับ UV ที่ 254 นาโนเมตร และรวบรวมลงในหลอดทดลองโดยตั้งค่าตัวเก็บเศษส่วนไว้ที่ 4 นาทีสำหรับแต่ละหลอด

2.4. เงื่อนไข LC

เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติแบบคงที่และเครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอด (DAD) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ PhGs ในสารสกัด n-butanol ของCistanche deserticolaและเศษส่วนที่เก็บจากการแยก HSCCC การแยกได้ดำเนินการในคอลัมน์ Phenomenex ODS-C18 (250 × 4.6 มม., 5 lm) พร้อมเสาป้องกัน C18 เฟสเคลื่อนที่แบบไบนารีประกอบด้วยอะซิโตไนไทรล์ (ตัวทำละลาย A) และน้ำที่มีกรดอะซิติก 2 เปอร์เซ็นต์ (ตัวทำละลาย B) ตัวทำละลายทั้งหมดถูกกรองผ่าน a

{{0}}.45 lm filter ก่อนใช้งาน อัตรา flow ถูกคงไว้ที่ 1.0 มล./นาที เป็นเวลาการทำงานทั้งหมด 25 นาที ระบบทำงานด้วยโปรแกรมไล่ระดับ: 0–20 นาที: 90 เปอร์เซ็นต์ B ถึง 60 เปอร์เซ็นต์ B; 20–22 นาที: 60 เปอร์เซ็นต์ B ถึง 0 เปอร์เซ็นต์ B; และ 22-25 นาที, 0 เปอร์เซ็นต์ B ถึง 90 เปอร์เซ็นต์ B. ปริมาตรของการฉีดตัวอย่างคือ 10 lL พีคที่น่าสนใจถูกเฝ้าติดตามที่ 320 นาโนเมตรโดยตัวตรวจวัด DAD

2.5. การทดลอง LC–ESI-MS

การทดลอง LC-MS ดำเนินการโดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ Finnigan LCQ DECA ion trap (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดอิออไนเซชันอิเล็กโตรสเปรย์ (ESI) ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ในสภาพโครมาโตกราฟีเดียวกัน แบบจำลองเชิงลบถูกใช้สำหรับการรวบรวมข้อมูล แก๊สฝักและอัตรา flow เสริมถูกตั้งไว้ที่ 96 และ 7 (หน่วยโดยพลการ) ตามลำดับ แรงดันไฟของเส้นเลือดฝอยตั้งไว้ที่ 29 V และควบคุมอุณหภูมิไว้ที่ 350 องศา แรงดันไฟฟ้าของเลนส์ทางเข้าถูกกำหนดไว้ที่ 40 V และแอมพลิจูด RF แบบหลายขั้วถูกตั้งไว้ที่ 540 V แรงดันไฟฟ้าของเข็ม ESI ถูกควบคุมที่ 4.5 kV ชุดเลนส์หลอดคือ 16 V เลนส์มัลติโพล 1 offset คือ 8.20 V และชุดเลนส์มัลติโพล 2 offset คือ 10.5 V แรงดันไฟฟ้าตัวคูณอิเล็กตรอนตั้งไว้ที่ 980 V สำหรับการตรวจจับไอออน

2.6. NMR สำหรับการระบุตัวตน

สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกบนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance-600 (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canada) เฉพาะสารประกอบ 2 และ 5 เท่านั้น (ไม่มีมาตรฐาน) ที่อยู่ภายใต้การทดลอง NMR ตัวอย่างถูกละลายใน CD3OD

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

3.1. การแยก HSCCC

สารสกัดจากเอ็น-บิวทานอลของCistanche deserticolaและเศษส่วนที่สอดคล้องกับแต่ละพีคที่แยกได้จาก HSCCC ถูกวิเคราะห์โดย HPLC และให้ผลลัพธ์ในรูปที่ 2 สารประกอบหลักห้าชนิด (พีค 1-5) ถูกแยกและตรวจพบด้วยเวลาการกักเก็บที่ 9.2 นาที, 10.7 นาที, 12.3 นาที ,

13.3 นาที และ 16.2 นาที ตามลำดับ

การแยกสาร HSCCC ที่ประสบความสำเร็จส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับระบบตัวทำละลายสองเฟสที่เหมาะสมซึ่งให้ค่าสัมประสิทธิ์การแบ่งชั้นในอุดมคติ (K) ประมาณ 1 สำหรับสารประกอบที่ต้องการ ระบบ biphasic ดังกล่าวควรให้เวลาสั้นพอสมควร (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka, Oka, & Ito, 1991) ในการทดลองของเรา เราเลือกระบบตัวทำละลายสี่ชุดตามความสามารถในการละลายของสารประกอบเป้าหมายในCistanche deserticola. HPLC ถูกใช้เพื่อวัดความเข้มข้นในแต่ละเฟส จากที่ซึ่งค่า K ของสารประกอบเป้าหมายถูกคำนวณ สองระบบ, เอทิลอะซิเตท– เอ็น-บิวทานอล–เอธานอล-วอเตอร์ (4:0.6:0.6:5, v/v/v/v) และเอทิล อะซีเตต–วอเตอร์ (1: 1, v/v) ก่อนหน้านี้เคยใช้ใน HSCCC เพื่อแยกแอคทีโอไซด์และ 20-acetylacteoside fromC. ซัลซ่า,แอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์จาก P. Psyllium ตามลำดับ (Lei et al., 2001; Li et al., 2005) แม้ว่าระบบแรกจะมีระยะเวลาในการตกตะกอนค่อนข้างสั้น แต่ก็มีประสิทธิภาพในการแยก PhGs ของCistanche deserticolaเนื่องจากมีค่า K ต่ำสำหรับสารประกอบ 1 และ 2 และค่า K สูงสำหรับสารประกอบ 3-5 ค่า K ต่ำมากสำหรับสารประกอบ 1-4 ในระบบที่สอง แต่สูงมากสำหรับสารประกอบ 5 (ตารางที่ 1) ระบบดัดแปลงที่มีเอทิล อะซีเตต–เอทานอล-น้ำ (5:{{10}}.5:4.5, v/v/v) ให้ค่า K ในอุดมคติสำหรับสารประกอบ 3–5 ที่ 0.87, 1.11, และ 1.32 ตามลำดับ และทำให้เกิดการแยกที่ดีของสารประกอบทั้งสามนี้ (รูปที่ 3A และ B) อย่างไรก็ตาม ระบบนี้ผลิตขึ้น

ค่า K น้อยเกินไปสำหรับสารประกอบ 1 และ 2 ทำให้สารประกอบทั้งสองละลายร่วมกันใกล้กับด้านหน้าของตัวทำละลาย (เศษส่วนที่ 1 ในรูปที่ 3A) การปรับเปลี่ยนระบบเพิ่มเติม (เอทิลอะซิเตท–n-บิวทานอล–เอทานอล-วอเตอร์ (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) เพิ่มค่า K สำหรับสารประกอบ 1 และ 2 เป็น 0.52 และ 0.92 ตามลำดับ และนำไปสู่การแยกที่สมบูรณ์ (รูปที่ 3C) รูปที่ 3A แสดงการแยก HSCCC ของ ตัวอย่างที่ประกอบด้วยสารสกัดเอ็น-บิวทานอลของ . 230 มกCistanche deserticolaโดยใช้เอทิล อะซีเตต–เอทานอล-น้ำ (5:0.5:4.5, v/v/v) เศษส่วนที่ถูกยืนยันโดย HPLC ว่าประกอบด้วยสารประกอบ 3, 4 หรือ 5 เท่านั้นที่ถูกรวมกันอย่างแยกจากกัน, และพวกที่มีสารประกอบ 3 และ 4 ถูกรวมเข้าด้วยกัน, ทำแห้งเยือกแข็ง, และนำส่ง HSCCC อีกครั้งสำหรับการแยกเพิ่มเติม (รูปที่ 3B) การแยกสาร HSCCC แบบสองขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้นให้ผลรวมเป็น 14.6 มก., 30.1 มก. และ 25.2 มก. ของสารประกอบ 3–5 จากสารสกัดเอ็น-บิวทานอล 1412 มก. รูปที่ 3C แสดงการแยก HSCCC ของตัวอย่างที่มีสารประกอบ 1 และ 2 (ส่วนที่ 1 ในการแยกครั้งแรก) โดยใช้ ethyl acetate–n-butanol–ethanol-water (0.5:0.5 :0.1:1, วี/วี/ วี/วี). ได้รับสารประกอบ 1 และ 2 ทั้งหมด 28.5 และ 18.4 มก. ความบริสุทธิ์ของโครมาโตกราฟีของสารประกอบแห้งเยือกแข็ง 1-5 มากกว่า 92.5 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งถูกใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์ LC–ESI-MS และ NMR

3.2. การระบุโครงสร้างโดย LC–ESI-MS และ NMR

การระบุเบื้องต้นของสารประกอบ 1, 3 และ 4 ทำได้โดยเวลาการกักเก็บที่สอดคล้องกันและข้อมูลสเปกตรัมยูวีกับอิชินาโคไซด์แท้จริงแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์ (รูปที่ 2) สารประกอบ 2 และ 5 ไม่เป็นที่รู้จัก อย่างไรก็ตาม สเปกตรัมยูวีของสารประกอบทั้งห้ามีความคล้ายคลึงกันอย่างมาก ซึ่งบ่งชี้ลักษณะโครงสร้างที่คล้ายคลึงกัน

เพื่อตรวจสอบโครงสร้างของสารประกอบทั้งห้าเหล่านี้เพิ่มเติม การทดลอง LC–ESI-MSn ถูกทดลองและผลลัพธ์ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 4 และตารางที่ 2 สารประกอบที่เกี่ยวข้องกับพีค (1-5) ในรูปที่ 2 แสดงไอออนโมเลกุลที่ลดโปรตอนอย่างเข้มข้น [MH]— ที่ m/z 785, 799, 623, 623 และ 665 ตามลำดับในโหมดลบ Dimeric [2M H]— ยังสังเกตพบไอออนสำหรับพีค 1-4 ในรูปที่ 2 สิ่งเหล่านี้ยืนยันน้ำหนักโมเลกุลของพีค 1-5 เป็น 786, 800, 624, 624 และ 666 ตามลำดับ ข้อมูล LC–MSN (ตารางที่ 2) ให้ข้อมูลโครงสร้างที่มีประโยชน์อย่างมากสำหรับ PhG ทั้งห้า เช่น การสูญเสียที่เป็นกลางของ

ขั้นตอนการทดลอง: ชั่งน้ำหนักตัวอย่างแต่ละตัวอย่างประมาณ 1 มก. ในหลอดทดสอบ 10 มล. โดยเติม 1 มล. ของแต่ละเฟสของระบบตัวทำละลายสองเฟสที่ปรับสมดุลไว้ล่วงหน้า หลอดทดลองถูกปิดฝาและเขย่าอย่างแรงเป็นเวลา 1 นาที และปล่อยให้ยืนจนแยกออกจากกันอย่างสมบูรณ์ นำส่วนหาร 100 ลิตรของแต่ละชั้นออกและระเหยแยกกันจนแห้งในสุญญากาศที่<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

คาเฟอีนมอยอิตี (162) กลูโคสมอยอิตี (162) มอยอิตี rhamnose (146) อนุมูล CH2 (14) และกลุ่ม COCH2 (42)

LC–ESI-MS ของพีค 1 แสดงไว้ในรูปที่ 4A โมเลกุลไอออนที่ลดโปรตอน [MH]— ที่ m/z 785 ที่มีความอุดมสมบูรณ์สูงและโมเลกุลที่มีโปรตอนไดเมอร์

ไอออน [2M H]— ที่ m/z 1571 ถูกสังเกตในโหมดลบ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 786 ซึ่งเท่ากับของอิชินาโคไซด์ การตรวจสอบเพิ่มเติมในการทดลอง LC–MS2 ของ m/z 785 ไอออนให้ไอออนลูกสาวหลักหนึ่งตัวที่ m/z 623 (รูปที่ 4B) ที่ผลิตโดยตรงจาก m/z 785 โดยการสูญเสีย caffeoyl moiety หรือ hexose moiety เป็น [M 162 H]—. สเปกตรัม LC–MS3 ของ m/z 623 แสดงไอออนหลักสองตัวที่ m/z 477 และ 461 และไอออนรองสองตัวที่ m/z 315 และ 179 (รูปที่ 3C ตารางที่ 2) ความแตกต่างของมวลระหว่าง m/z 623 และแฟรกเมนต์ไอออน m/z 477 และ 461 เท่ากับ 146 และ 162 ตามลำดับ ซึ่งสอดคล้องกับการสูญเสียหน่วย rhamnose และกลูโคสมอยอิตีหรือมอยอิตีความรู้สึกคาเฟ่ [M 162 H]— m/z 623 ion ยังสูญเสีย caffeoyl moiety และ rhamnose moiety เพื่อผลิต m/z 315 ion ไอออนที่ m/z 179 ถูกผลิตขึ้นจากความแตกแยกของคาffอออิลมอยอิตี โดยมีประจุลบเหลืออยู่ในส่วนของคาffอออิลมอยอิตี การทดลอง LC–ESI-MSN บนเอไคนาโคไซด์แท้พบรูปแบบการกระจายตัวแบบเดียวกัน พีค 1 จึงได้รับการยืนยันว่าเป็นอิชินาโคไซด์

สำหรับพีค 2 LC–ESI-MS แสดง m/z 799 เป็นโมเลกุลไอออนที่ลดโปรตอน [MH]— และ m/z 1599 เป็นไอออนแบบไดเมอร์ บ่งบอกถึงมวลโมเลกุล 800 ในระหว่างการทดลอง MS2 ค่า m/z 799 ไอออนก่อตัวเป็นลูกสาวสามคน

ไอออนที่ m/z 637, 623 และ 475 (ตารางที่ 1) ไอออนที่ m/z 637 ถูกผลิตขึ้นโดยตรงจากไอออนต้นกำเนิดของ m/z 799 อีกครั้งเนื่องจากการสูญเสียที่เป็นกลางของcaffeoyl [M—162—H]— หรือมอยอิตีของกลูโคส [M—162—H]— ไอออนที่ m/z 623 เป็นผลมาจากการสูญเสียอนุมูล CH2 ไอออนที่ m/z 475 เกิดขึ้นจากการสูญเสียที่เป็นกลางของทั้ง Caffeoyl moiety [M 162 H]— และกลูโคสมอยอิตีจากไอออนต้นกำเนิด การทดลอง MS3 บน m/z 637 ทำให้เกิดไอออนสามตัวที่ m/z 619, 491 และ 475 ซึ่งสอดคล้องกับการสูญเสียน้ำหนึ่งหน่วย หน่วย rhamnose และมอยอิตีของกลูโคสตามลำดับ ไอออนลูกสาว m/z 623 ผลิต m/z 461 และ 315 ในการศึกษา MS3 ซึ่งเป็นไปตามวิถีการแตกแฟรกเมนต์เดียวกันกับเอไคนาโคไซด์ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น ข้อมูล LC– ESI-MSN รองรับการระบุเบื้องต้นสำหรับ peak 2 asซิสตาโนไซด์ A.

LC–ESI-MS ยังดำเนินการทดลองสำหรับพีค

3 และ 4 (tR 12.49 และ 13.46 นาทีในรูปที่ 2) พีคทั้งสองมีค่าเท่ากัน [MH] — ไอออนที่ m/z 623 และ dimer ที่ m/z 1247 ในโหมดลบ (ตารางที่ 1) ซึ่งบ่งชี้ว่าพวกมันอาจเป็นไอโซเมอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากันของ

624 เช่นเดียวกับแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์ สเปกตรัม MS2 ของ [MH] — ไอออนยังแสดงไอออนลูกเดียวกันหนึ่งตัวของ m/z 461 ซึ่งบ่งชี้การสูญเสียของคาffอออิลมอยอิตีจากไอออนต้นกำเนิด m/z 623 (ตารางที่ 1) ได้สเปกตรัม MS3 ที่คล้ายกันสำหรับสารประกอบทั้งสอง สำหรับพีค 3 สเปกตรัม MS3 ของไอออนที่ m/z 461 ก่อตัวสามไอออนที่ m/z 315, 161 และ 135 m/z 315 เกิดขึ้นหลังจากสูญเสีย rhamnose ตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ ไอออน m/z 161 ถูกผลิตขึ้นจากการตัดแยกของคาเฟอีนมอยอิตี ตามด้วยการสูญเสียน้ำหนึ่งไปอีก; ประจุยังคงอยู่ในส่วนของcaffeoyl moiety ไอออนที่ m/z 135 [agly- cone 18 H]— เกิดขึ้นจากความแตกแยกของพันธะไกลโคซิดิกที่ตำแหน่ง C1 ด้วยการสูญเสียน้ำเพิ่มเติมหนึ่งรายการ โดยปล่อยให้ประจุอยู่ในส่วนของอะไกลโคนมอยอิตี สเปกตรัม MS3 ของพีค 4 เป็นไปตามเส้นทางการกระจายตัวแบบเดียวกันกับพีค 3 ยกเว้นไอออนที่หายไปที่ m/z 135 โมเลกุลไอออนและรูปแบบการแตกแฟรกเมนต์ของสารประกอบทั้งสองนี้สอดคล้องกับข้อมูลวรรณกรรมเกี่ยวกับแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์ (Wang et al., 2000) แม้ว่าจะพบไอออนเพิ่มเติม m/z 153 และ

มอบหมายให้เป็น [aglycone H]— โดย Wang et al. (วังและคณะ, 2000). ไอออนนี้อาจไม่เสถียรและสูญเสียน้ำเพื่อให้ m/z 135 ในการทดลองของเรา จากข้อมูล MS และเวลาเก็บรักษาที่สอดคล้องกันของจุดสูงสุด 3 และ 4 กับมาตรฐาน ดังนั้นจึงระบุได้ว่าแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์ตามลำดับ

ข้อมูล LC–ESI-MS ของพีค 5 แสดงไว้ในตารางที่ 2 โมเลกุลไอออนที่ลดโปรตอน [MH]— (m/z 665) เป็นไอออนเพียงตัวเดียวที่พบในโหมดลบ ซึ่งหมายถึงมวลโมเลกุลเท่ากับ 666 ไอออนลูกสาวสามตัว ถูกสังเกตที่ m/z 623, 503 และ 461 ในการทดลอง MS2 (ตารางที่ 2) ไอออนลูกที่ m/z 623 และ 503 ถูกก่อรูปโดยตรงจากไอออนต้นกำเนิดโดยการสูญเสียหมู่ COCH2 และมอยอิตีของ Caffeoyl ตามลำดับ ไอออนที่ m/z 461 มาจากการสูญเสียทั้ง Caffeoyl และมอยอิตี COCH2 [M 162 42 H]— จากไอออนต้นกำเนิด ในการทดลอง MS m/z 623 ผลิต m/z 461 และ m/z 503 ให้ผลสามไอออนที่ m/z 485, 461 และ 315 สเปกตรัม MS3 ของไอออนลูกสาว m/z 461 ให้สองไอออนที่ 443 และ 315 โดยการเปรียบเทียบรูปแบบการกระจายตัวของ LC– MSN ของพีค 5 กับสารประกอบอื่นๆ ที่รายงานในการศึกษานี้และกับรายงานอื่นๆ (Li et al., 2005; Wang et al., 2000) เราสรุปได้ว่า peak 5 มีความสัมพันธ์เชิงโครงสร้างสูง เพื่อแอคทีโอไซด์ที่มีความแตกต่างเพียงอย่างเดียวคือหน่วย COCH3 ที่ตำแหน่ง R3 ดังนั้น อัตลักษณ์เบื้องต้นจึงถูกกำหนดให้พีค 5 เป็น 20-acetylacteoside (รูปที่ 1)

โครงสร้างของสารประกอบที่ไม่แน่นอนทั้งสองชนิดซึ่งระบุได้แน่ชัด คือ พีค 2 (ในฐานะซิสตาโนไซด์ A) และพีค 5 (ในฐานะ 20-อะซีติลแอคทีโอไซด์) ได้รับการยืนยันจากโครงสร้างของพวกมันโดย 1H NMR การเปลี่ยนแปลงทางเคมีและค่าคงที่การมีเพศสัมพันธ์ของโปรตอนทั้งหมดในสารประกอบ 2 และ 5 ดังแสดงในตารางที่ 3 ซึ่งตรงกับข้อมูล NMR ที่รายงานสำหรับซิสตาโนไซด์ Aและ 20-acetylacteoside ตามลำดับ (Kobayashi et al., 1984, 1987) การทดลอง 2D NMR (ความสัมพันธ์ระยะยาวของ COSY, ROESY และ CH) ยังได้ดำเนินการในการศึกษานี้และได้ยืนยันการระบุเพิ่มเติม (ไม่แสดงข้อมูล)

phenylethanoidไกลโคไซด์ในซิสแทนเช่

4. บทสรุป

ในเอกสารฉบับปัจจุบัน HSCCC ประสบความสำเร็จในการใช้การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของอิชินาโคไซด์ซิสตาโนไซด์ A, acteoside, isoacteoside และ 20-acetylacteoside จากสารสกัด n-butanol ของ C. deserticola ดังนั้นจึงเป็นวิธีที่ได้รับการพิสูจน์แล้วสำหรับการแยกสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพแบบกึ่งเตรียมการ ในขณะเดียวกัน โครงสร้างของ PhGs ทั้งห้าใน Cistanche deserticola ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ LC–ESI-MSN; พบคุณลักษณะเฉพาะของ PhGs ซึ่งทำให้เราสามารถกำหนดกลุ่มฟังก์ชันในโครงสร้างได้ ดังนั้นวิธี LC–ESI-MSN จึงเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการระบุอย่างรวดเร็วของฟีนิลเลธานอยด์และไกลโคไซด์ในCistanche deserticolaสารสกัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีการพิสูจน์โดยข้อมูล NMR

การรับทราบ

ผู้เขียนขอขอบคุณ Jun Gu จาก Nuclear Magnetic Resonance Center, University of Guelph, Ontario, Canada สำหรับความช่วยเหลือของเธอในการทดลอง NMR โครงการนี้ได้รับการสนับสนุนบางส่วนจากการระดมทุนจากมณฑลจี๋หลิน ประเทศจีน (หมายเลข 20060904)

อ้างอิง

Chen, LJ, Games, DE, & Jones, J. (2003). การแยกและการระบุองค์ประกอบฟลาโวนอยด์สี่ชนิดจากเมล็ดของ Oroxylum Indicum โดยโครมาโตกราฟีแบบกระแสตรงความเร็วสูง วารสารโครมาโตกราฟี A, 988, 95–105

Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., Ni, W., & Liu, CZ (2005)Cistanche deserticolaการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย:ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์สังเคราะห์ทางชีวภาพและกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ กระบวนการทางชีวเคมี, 40, 3119– 3124.

Foucault, AP, & Chevolot, L. (1998). โครมาโตกราฟีแบบทวนกระแส: เครื่องมือวัด การเลือกตัวทำละลาย และการประยุกต์ใช้ล่าสุดในการทำให้ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์จากธรรมชาติ วารสารโครมาโตกราฟี A, 808, 3–22.

Gross, G.-A. , Lahloub, MF, Anklin, C. , Schulten, H.-R. , & Sticher, O. (1988) Teucrioside ซึ่งเป็นฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์จาก Teucrium Chamaedrys ไฟโตเคมี 27, 1459–1463

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000)

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของphenylethanoidไกลโคไซด์จากโอกาสแบรนดิเซีย วารสารชาติพันธุ์วิทยา, 71, 483–486.

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). การศึกษาองค์ประกอบของ Cistanchis Herba สาม. การแยกตัวและโครงสร้างของฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์ใหม่ซิสตาโนไซด์ Aและ B. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3009–3014.

Kobayashi, H. , Oguchi, H. , Takizawa, N. , Miyase, T. , Ueno, A. , Usmanghani, K. , และคณะ (1987). ใหม่phenylethanoidไกลโคไซด์จากCistancheตะขอทูบูโลซ่า (Schrenk) FI Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 35, 3309–3314.

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ, & Ito, Y. (2001).

การเตรียมการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของแอคทีโอไซด์และ 2'-acetyl acteoside จาก Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck โดยโครมาโตกราฟีแบบกระแสตรง วารสารโครมาโตกราฟี A, 912, 181–185.

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, et al. (2005). การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของแอคทีโอไซด์และไอโซแอคทีโอไซด์จาก Plantago psyllium L. โดยโครมาโตกราฟีแบบกระแสตรงความเร็วสูง วารสารโครมาโตกราฟี A, 1063, 161–169.

Li, LL, Wang, XW, & Wang, XF (1997). Antilipid peroxidation และ antiradical action ของ glycosides ใน herba Cistanches China Journal of Chinese Materia Medica, 22, 364–367.

Li, J., Wang, PF, เจิ้ง, RL, Liu, ZM, & Jia, ZJ (1993) การปกป้องฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์จาก Pedicularis ต่อการเกิดภาวะเม็ดเลือดแดงแตกออกซิเดชันในหลอดทดลอง แพลนตา เมดิกา, 59, 315–317.

ลู เอ็มซี (1998). การศึกษาผลของยากล่อมประสาทของCistanche deserticola.Journal of Ethnopharmacology, 59, 161–165.

Nishimura, H. , Sasaki, H. , Inagaki, N. , Chin, M. , & Mitsuhashi, H. (1991). ฟีนิทิลแอลกอฮอล์ไกลโคไซด์เก้าชนิดจาก Stachys szeboldzz ไฟโตเคมี, 30, 965–969.

Oka, F., Oka, H., & Ito, Y. (1991). การค้นหาอย่างเป็นระบบสำหรับระบบตัวทำละลายสองเฟสที่เหมาะสมสำหรับโครมาโตกราฟีแบบทวนกระแสความเร็วสูง วารสารโครมาโตกราฟี, 538, 99–108.

Ravn, H. , Nishibe, S. , Sasahara, M. , & Li, X. (1990). สารประกอบฟีนอลิกจาก Plantago Asiatica ไฟโตเคมี, 29, 3627–3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998) ฤทธิ์ต้านฤทธิ์ต้านจุลชีพและฤทธิ์ต้านจุลชีพของสารสกัดและสารประกอบที่แยกได้จาก Stachytarpheta cayennensis วารสารชาติพันธุ์วิทยา, 60, 53–59. Shoyama, Y., มัตสึโมโตะ, M., & Nishioka, I. (1987) ฟีนอลิกไกลโคไซด์จากรากที่เป็นโรคของ Rehmannia glutinosa Var. เพอร์เพียว ไฟโตเคมี 26, 983–986

หวาง XW เจียง XY หวู่ LY และหวาง XF (2001) ประสิทธิภาพการขับไกลโคไซด์ของCistanche deserticolaเกี่ยวกับอนุมูลอิสระและการป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดจาก OH ในหลอดทดลอง วารสารเภสัชวิทยาจีน, 36, 29–31.

Wang, YM, Zhang, SJ, Luo, GA, Hu, YN, Hu, JP, Liu, L., Zhu,

วาย, & หวาง, เอช.เจ. (2000). การวิเคราะห์phenylethanoidไกลโคไซด์ในสารสกัดจากสมุนไพร Cistanchis โดย LC/ESI-MS/MS Acta Pharmaceutica Sinica, 35, 839–842.

Wong, C.-C. , Li, H.-B. , Cheng, K.-W. , & Chen, F. (2006). การสำรวจอย่างเป็นระบบเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของพืชสมุนไพรจีน 30 ชนิดโดยใช้การทดสอบกำลังรีดิวซ์สารต้านอนุมูลอิสระของเฟอริก เคมีอาหาร, 97, 705–711. Xie, JH, & Wu, CF (1993). Effect ของสารสกัดเอทานอลของCistanche deserticolaเกี่ยวกับเนื้อหาของสารสื่อประสาทโมโนเอมีนในหนู

สมอง. ยาจีนโบราณและยาสมุนไพร 24, 417–419.

Xiong, Q. , Hase, K. , Tezuka, Y. , Tani, T. , Namba, T. , & Kadota, S. (1998). กิจกรรมป้องกันตับของฟีนิลเลธานอยด์จากCistanche deserticola. แพลนตา เมดิกา, 64, 120–125.

Xiong, QB, Kadota, S., Tani, T., & Namba, T. (1996). ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของฟีนิลทานอยด์จากCistanche deserticola. แถลงการณ์ทางชีวภาพและเภสัชกรรม, 19, 1580–1585.

Zong, G., He, W., Wu, GL, & Chen, LH (1996). การเปรียบเทียบระหว่างCistanche deserticolaYC Ma และCistancheท่อ (Schenk) ไวท์ในกิจกรรมทางเภสัชวิทยาบางอย่าง วารสารการแพทย์แผนจีน, 21, 436–438.