ผลของ Tanshinone IIA ต่อการตอบสนองการอักเสบที่เกิดจาก LPS ในลักษณะที่ขึ้นกับ ROS-NLRP3 Inflammasome ในเซลล์ RAW264.7
Mar 10, 2022
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:emily.li@wecistanche.com
ไฮไลท์
Tan IIA สามารถยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบและการแสดงออกของ NLRP3 ที่กระตุ้นโดย LPS หรือ LPS บวก ATP Acetylcysteine (N-acetyl-l-cysteine, NAC) ซึ่งเป็นสารยับยั้ง ROS สามารถยับยั้ง LPS บวกกับการเพิ่มขึ้นของระดับ NLRP3 ที่เกิดจาก ATP กลไกที่เป็นสาเหตุของผลกระทบของ Tan IIA อาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมเส้นทาง ROS-NF-κB/ P38-NLRP3 การศึกษานี้แสดงลักษณะกลไกระดับโมเลกุลของ Tan IIA เพิ่มเติมและให้แนวคิดใหม่แก่การรักษาทางคลินิก
เชิงนามธรรม
หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นว่า Tanshinone IIA (Tan IIA) ป้องกันการบาดเจ็บของ cardiomyocytes, ไฟโบรบลาสต์ของหัวใจและหลอดเลือด อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังผลกระทบของ Tan lA นั้นยังไม่ชัดเจน เพื่อตรวจสอบบทบาทของ Tan ll A ในการตอบสนองต่อการอักเสบในลักษณะที่ขึ้นกับ ROS-NLRP3 inflammasome เซลล์ RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS ถูกคัดเลือกเพื่อผลิตแบบจำลองเซลล์ของการตอบสนองต่อการอักเสบ ผลลัพธ์ของเราระบุว่าการผลิต NO เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากถูกกระตุ้นโดย LPS และTan IIA ที่บำบัดลดระดับ NO อย่างมีนัยสำคัญ การแสดงออกของ mRNA ของ NLRP3 IL-1B และ TNF-a ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดย Tan LLA เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย LPS การแสดงออกของโปรตีน NLRP3 IKBa, pp65/p65 และ pp38/p38 ถูกลงนามโดย Tan IIA ที่ลดลงอย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อเปรียบเทียบกับ LPS หรือ LPS บวกกับกลุ่มที่กระตุ้นด้วย ATP ในขณะเดียวกัน. Tan IA ยับยั้งระดับของ ROS ที่เหนี่ยวนำโดย LPS บวก ATP อย่างมีนัยสำคัญ และ NAC ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง ROS ก็สามารถยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนของ NLRP3 ได้เช่นกัน จากการค้นพบนี้ เราสามารถคาดเดาได้ว่ากลไกที่เป็นสาเหตุของผลกระทบของ Tan IIA อาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมของวิถี ROS-NF-kB/ P38-NLRP3 การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงกลไกระดับโมเลกุลของ Tan IA และให้แนวคิดใหม่แก่การรักษาทางคลินิก
คำสำคัญ: ทันชิโนะเนะ ไอไอเอ,การอักเสบ, NLRP3 อินเฟลมมาโซม, ROS
ประโยชน์ของผลิตภัณฑ์ Cistanche
พื้นหลัง
แมคโครฟาจมีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลของหัวใจและประสานการซ่อมแซมเนื้อเยื่อตลอดจนการเปลี่ยนแปลงรูปแบบใหม่ ในหัวใจความล้มเหลวผู้ป่วย ไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบในซีรัมที่เพิ่มขึ้นควรเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่คาดการณ์ถึงผลลัพธ์ทางคลินิกที่แย่ลง และการอักเสบอาจนำไปสู่ความก้าวหน้าของภาวะหัวใจล้มเหลว [1] แม้ว่าการอักเสบได้กลายเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคหัวใจและหลอดเลือด อย่างไรก็ตาม ดูเหมือนว่าการกดภูมิคุ้มกันในวงกว้างล้มเหลวในการปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกทั้งหลังกล้ามเนื้อหัวใจตาย (MI) หรือภาวะหัวใจล้มเหลว [2,3]
การศึกษาทางคลินิกหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง anอักเสบทางเดิน เช่นอักเสบcytokine, IL-1 , สามารถลดการเกิดซ้ำของโรคหัวใจและหลอดเลือดได้อย่างมีประสิทธิภาพ [4, 5] สามารถสันนิษฐานได้ว่าการปรับภูมิคุ้มกันของการตอบสนองต่อการอักเสบมีความสำคัญในการวินิจฉัยและการรักษาที่สำคัญในกระบวนการของโรคหัวใจและหลอดเลือด
NLRP3 inflammasome เป็นการศึกษาที่ครอบคลุมมากที่สุดของ inflammasomes ทุกชนิด มีการบันทึกไว้ว่า NLRP3 inflammasome มีบทบาทสำคัญในหลายโรค เช่น โรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง (MS) โรคอัลไซเมอร์ (AD) หลอดเลือด โรคอ้วน และโรคเบาหวานประเภท 2 [6] และมีหลักฐานมากขึ้นเรื่อยๆ ที่บ่งชี้ว่า NLRP3 inflammasome ยังเกี่ยวข้องกับกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือด / การบาดเจ็บซ้ำ (MI/RI) [7,8] กลไกของการกระตุ้น NLRP3 อาจรวมถึงการสร้างชนิดของออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) โพแทสเซียมที่ไหลออก และการปล่อยของ cathepsins เข้าไปใน cytosol หลังจากการทำให้ lysosomal ไม่เสถียร เมื่อเซลล์ถูกกระตุ้นโดยเชื้อโรคหรือสัญญาณอันตราย NLRP3 ถูกกระตุ้นและคัดเลือกโปรแคสเปส-1 ผ่านทางอะแด็ปเตอร์โปรตีน ASC เอ็นแอลอาร์พี3 ASC และโปรแคสเปส-1 madeNLRP3 ประกอบซับซ้อน inflammasome ภายใต้การกระทำของ NLRP3 inflammasome โปร-caspase-1 ถูกกระตุ้นเป็น caspase-1 ในที่สุดก็นำไปสู่การหลั่งของ IL-1 และ IL-18 และทำให้เกิด ชุดของปฏิกิริยาการอักเสบ [9,10]
Tan IIA เป็นองค์ประกอบที่ละลายในไขมันของ Danshen (Sahia miltiorrhiza Bge) ซึ่งมีคุณสมบัติทางชีวภาพที่หลากหลายและมีส่วนร่วมในชุดของปฏิกิริยาทางชีวเคมี Tan IA มีต่อต้าน-อักเสบ, สารต้านอนุมูลอิสระและส่งเสริมผลการสร้างเส้นเลือดใหม่ และยังได้รับการเผยแพร่อย่างกว้างขวางสำหรับการรักษาโรคระบบหัวใจและหลอดเลือด [1, 12] หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นว่า Tan IIA ป้องกันการบาดเจ็บของ cardiomyocytes, ไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ, หลอดเลือดและการอักเสบของระบบประสาท[13-16]. อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังผลกระทบของ Tan IIA นั้นยังไม่ชัดเจน
ระหว่างภาวะขาดเลือดขาดเลือด/การบาดเจ็บซ้ำ โมโนไซต์/มาโครฟาจ นิวโทรฟิล และเซลล์บุผนังหลอดเลือดจะเริ่มต้นอักเสบตอบสนองกระตุ้นการเปิดตัวของหลากหลายอักเสบไซโตไคน์และส่งผลให้การซึมผ่านของหลอดเลือดเพิ่มขึ้น เนื้อเยื่อบวมน้ำ และความเสียหาย มาโครฟาจเป็นเซลล์ควบคุมการอักเสบที่สำคัญในบรรดาอักเสบชนิดของเซลล์และมีบทบาทสำคัญในกระบวนการของกล้ามเนื้อหัวใจตาย [17] Monocyte/macrophage ที่ได้รับคัดเลือกไปยังกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เสียหายสามารถปลดปล่อย ROS สารสื่อกลางการอักเสบ และโปรตีเอส ซึ่งทำให้อาการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจรุนแรงขึ้น [18]
ด้วยเหตุผลที่ว่ามาโครฟาจมีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลของหัวใจและประสานการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ เราคัดเลือกเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS เพื่อสร้างแบบจำลองเซลล์ของการตอบสนองต่อการอักเสบ การศึกษาปัจจุบันได้ตรวจสอบว่า Tan IIA มีผลต่อมาโครฟาจที่กระตุ้นด้วย LPS หรือไม่ และกลไกที่เป็นสาเหตุของผลกระทบของ Tan ⅡA ต่อมาโครฟาจในลักษณะที่ขึ้นกับ ROS-NLRP3 ที่ขึ้นอยู่กับการอักเสบ
วัสดุและวิธีการ
การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา
เซลล์ RAW264.7 ซื้อมาจาก Cell Culture Center ของ Chinese Academy of Medical Sciences (ปักกิ่ง ประเทศจีน) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง DMEM (กลูโคสสูง), เพิ่ม 10 เปอร์เซ็นต์ของตัวอ่อนวัวในซีรัม (FBS), 100 U/mL เพนิซิลลินและ100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของสเตรปโตมัยซิน เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นเต็มที่ด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ สำหรับการทดลองทั้งหมด เซลล์ถูกบำบัดที่ 80-90 เปอร์เซ็นต์ของการบรรจบกันของเซลล์ เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกันของ Tan IIA (ที่ 10,1 และ 0.1 ไมโครโมลาร์) สำหรับเวลาที่ต่างกัน โดยมีหรือไม่มี LPS 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในขณะเดียวกัน เซลล์ในกลุ่มควบคุมได้รับการบำบัดด้วย DMSO ปริมาตรที่เท่ากัน 0.1 เปอร์เซ็นต์
การวัดปริมาณการผลิต NO
NO Assay Kit (Beyotime, China) ถูกนำมาใช้เพื่อวัดการผลิต NO ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยย่อ มาตรฐานถูกเจือจางด้วย DMEM บวก 10 เปอร์เซ็นต์ FBS และมาตรฐาน 50μL หรือส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกเติมลงในแต่ละหลุมของเพลต 96-หลุม จากนั้นทำการปิเปต Griess Reagent I และ II จำนวน 50uL ในแต่ละหลุมของเพลต และตรวจพบความหนาแน่นของแสง (OD) โดยเครื่องอ่านไมโครเพลทแบบมัลติโหมด Varioskan LUX ที่ 540 นาโนเมตร
การแยกอาร์เอ็นเอ
เซลล์ RAW264.7 ถูกชุบที่ความหนาแน่น 1×106 เซลล์/หลุมด้วย FBS DMEM 10 เปอร์เซ็นต์ในเพลตหกหลุม 24 ชั่วโมงต่อมา สื่อถูกนำออกและเติมด้วยสื่อ DMEM ที่ปราศจากเซรั่มและปราศจากยาปฏิชีวนะแทน เซลล์ RAW264.7 ถูกบำบัดด้วย DMSO (กลุ่มควบคุม),LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ LPS บวก Tan IIA (10,1,และ0.1uM เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นจึงสกัด RNA ทั้งหมดเพื่อตรวจหาระดับ mRNA ของ NLRP3, IL{ {18}} และ TNF- RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Ambion) RNA ถูกวัดโดยความเข้มข้น Va กับสเปกโตรโฟโตมิเตอร์อัลตราไมโครฟลูออเรสเซนต์ (DeNovix) HiFiScript cDNA synthesis kit (cwbiotech) ถูกใช้สำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับตาม คำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่าง RNA 1 ไมโครกรัมถูกคัดลอกย้อนกลับ และขั้นตอนปฏิกิริยามีดังนี้:42 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 50 นาที 85 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที แล้วคงไว้ที่ 4 องศา
RT-PCR
การทดสอบ PCR (OPCR) ที่ควบคุมไม่ได้ดำเนินการด้วยเครื่องมือ O-PCR (Lightcycler 96, Roche) โดยใช้ส่วนผสม UltraSYBR (cwbiotech) โปรโตคอล PCR คือ 95 องศาเป็นเวลา 10 นาที ตามด้วย 40 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 10 วินาที 56 สำหรับ 30 วินาที และ 72 ครั้งสำหรับ 32 วินาที ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ qRT-PCR มีดังต่อไปนี้: GADPH-Forward: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3';GADPH-Reverse:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3',NLRP3-Forward: 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'NLRP3-Reverse:5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3';IL-1 -Forward:5'-GCCCATCCTCTGTGACTCAT-3';IL{ {32}}ย้อนกลับ:5'-AGGCCACAGGTATTTTGTCG-3':TNF- -ไปข้างหน้า:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3'TNF-a-Reverse:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3 ! ระดับการแสดงออกของยีนคำนวณโดยใช้วิธี 2-AACt
ซับตะวันตก
Western blotting ดำเนินการดังต่อไปนี้แอนติบอดี: แอนติบอดีต้าน NLRP3 (CST), แอนติบอดีต้าน pp38 (CST), แอนติบอดีต้าน p38 (CST), แอนติบอดีต้าน pp65 (CST), แอนติบอดีต้าน GADPH (เทคโนโลยีโปรตีน), แอนติบอดีต้าน- -ทูบูลิน (เทคโนโลยีโปรตีน), แอนติบอดีต่อต้าน HMGB1 (เทคโนโลยีโปรตีน), แอนติบอดีต่อต้าน p65 (เทคโนโลยีโปรตีน), แอนติบอดีต่อต้าน IKB- (เทคโนโลยีโปรตีน) แยกส่วนของโปรตีนออกจากไลเสตของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง และใช้ Enhanced BCA Protein Assay Kit (บีโยไทม์ ประเทศจีน) เพื่อวัดความเข้มข้นของโปรตีน โปรตีนถูกทำให้เสียสภาพและถูกแก้ไขบน SDS-PAGE จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF หลังจากบล็อกด้วย QuickBlockTMBlocking Buffer (Beyotime, China) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นเยื่อหุ้ม PVDF จะถูกฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา จากนั้นล้างเยื่อเมมเบรนด้วย Western Wash Buffer (Beyotime, China) สามครั้ง และบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ HRP conjugated เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง มีการใช้ชุด BeyoECL Plus (Beyotime, China) เพื่อตรวจหาโปรตีนตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีการใช้ C-DiGit 3600 (Li-Cor, USA) เพื่อสร้างภาพและวงดนตรีถูกวัดปริมาณโดย Image J Software
การวัดการสะสม ROS
ชุดทดสอบ Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, China) ของโพรบ DCFH-DA ใช้เพื่อวัดระดับ ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ RAW264.7 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยย่อ DCFH-DA ถูกเจือจางด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ที่ปราศจากซีรัมและความเข้มข้นสุดท้ายถูกปรับเป็น 10 ไมโครโมลาร์/ลิตร หลังจากการบ่มด้วยสีย้อม DCFH-DA 10 μM เป็นเวลา 30 นาที ที่ 37 องศาเซลเซียส เซลล์ RAW264.7 ถูกล้างสามครั้งด้วยตัวกลาง DMEM ที่ปราศจากซีรัม เพื่อขจัด DCFH-DA ส่วนเกินออก สำหรับกลุ่มควบคุมเชิงบวก แอลไมโครลิตรของโรซัปถูกเติมลงในเซลล์ การเรืองแสงถูกวัดปริมาณโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวของ Nikon IX73 ภาพของเซลล์ถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image J
การวิเคราะห์ทางสถิติ
การทดลองทั้งหมดทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง ซอฟต์แวร์ SPSS ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทั้งหมด และใช้ GraphPad Prism 5 สำหรับการวาดกราฟิก ผลลัพธ์ทั้งหมดถูกกำหนดเป็นค่ากลาง ± SD การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลระหว่างกลุ่มและการเปรียบเทียบที่จับคู่โดยใช้การทดสอบ SNK-q ค่า P< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">
รูปที่ 1 Tan IIA มีผลบังคับต่อการผลิต NO, NLRP3, IL-1 , TNF- mRNA
การแสดงออก
A. RAW264.7 Cells ไม่มีการผลิตของกลุ่มต่างๆ เซลล์ถูกปรับสภาพก่อนด้วย Tan IIA 10µM, 1µM และ
{{0}}.1µM เป็นเวลา 30 นาที และกระตุ้นด้วย LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง * P < 0.05="" เทียบกับ="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" lps="" bd.="">
มีผลบังคับต่อการแสดงออกของ mRNA ของ TNF- NLRP3 และ IL-1 เซลล์ถูกปรับสภาพด้วย Tan IIA
ผลลัพธ์
ผลกระทบต่อเซลล์ RAW264.7 ไม่มีการผลิต Tan IIA Treatment
NO ซึ่งเป็นโมเลกุลผู้ส่งสารตัวที่สองทำหน้าที่ต่างๆ ในกระบวนการทางสรีรวิทยาและทางพยาธิวิทยาของเซลล์ ไม่มีการหลั่งโดยแมคโครฟาจมีบทบาทสำคัญในปฏิกิริยาการอักเสบ ภูมิคุ้มกัน และต้านไวรัส [19, 20] ด้วยเหตุนี้จึงไม่สามารถใช้ NO เพื่อประเมินผลกระทบของ LPS ต่อการตอบสนองต่อภูมิคุ้มกันและการอักเสบ เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกันของ Tan IIA (ที่ 10, 1 และ 0.1 ไมโครโมลาร์) โดยมีหรือไม่มี LPS 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และเซลล์ในกลุ่มควบคุมถูกบำบัดด้วยปริมาตรที่เท่ากันของ DMSO 0.1 เปอร์เซ็นต์ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 1A เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในกลุ่มแบบจำลองที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การผลิตของ NO เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (P<0.05); and="" various="" concentrations="" of="" taniia="" treatment="" (at="" 10,="" 1,="" and="" 0.1="" μm)="" significantly="" decreased="" the="" no="" production=""><0.05) of="" the="" cells="" stimulated="" with="">
ผลต่อการแสดงออกของ NLRP3, IL-1 และ TNF-mRNA ของการรักษา Tan IIA
เซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS สามารถกระตุ้นการกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบ และอาจแก้ไขได้ด้วย Tan IIA ซึ่งรวมถึงการแสดงออกของ mRNA ของ NLRP3, IL-1 และ TNF- ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 1B-D เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในกลุ่มแบบจำลองที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS การแสดงออกของ mRNA ของ NLRP3, IL-1 และ TNF- เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (P < {{1{{14})="" }}}.05);="" และความเข้มข้นต่างๆ="" ของการบำบัดด้วย="" tan="" iia="" (ที่="" 10,="" 1="" และ="" 0.1="" ไมโครโมลาร์)="" ลดการแสดงออกของ="" mrna="" ของ="" nlrp3,="" il-1="" และ="" tnf-="" (p="">< 0.05)="" อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย="">
ผลต่อการแสดงออกของโปรตีน NLRP3 ของการรักษา Tan IIA
ATP ซึ่งเป็นโมเลกุลสัญญาณที่สอง เป็นตัวกระตุ้นที่จำเป็นสำหรับการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 ดังนั้น ATP จึงถูกใช้เพื่อกระตุ้นการเปิดใช้งาน NLRP3 [21, 22] ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า LPS บวกกับ ATP กระตุ้นการกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีน NLRP3 และสามารถแก้ไขได้ด้วย Tan IIA ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในกลุ่มแบบจำลองที่ชักนำโดย LPS บวก ATP ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ NLRP3 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (P < 0.05);="" และการบำบัดด้วย="" taniia="" (ที่="" 10μm)="" ลดการแสดงออกของโปรตีนของ="" nlrp3="" (p="">< 0.05)="" ในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย="" lps="" บวก="" atp="">
การกระตุ้นด้วย LPS ของเส้นทาง NF-κB และ p38 สามารถยับยั้งได้โดย Tan IIA
ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS หรือ LPS บวก ATP การแสดงออกของโปรตีนของ IKB , pp65/p65 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (P < 0.05);="" และการรักษาด้วย="" tan="" iia="" (ที่10μm)="" ลดการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ="" ระดับโปรตีนของ="" pp38/p38="" ถูกปรับเพิ่มขึ้นในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย="" lps="" บวก="" atp="" และการปรับเพิ่มถูกยับยั้งโดย="" tan="" iia="" (10μm)="" (รูปที่="" 2)="" อย่างไรก็ตาม="" ระดับโปรตีนของ="" pp38/p38="" ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย="" lps="" นอกจากนี้="" การแสดงออกของโปรตีนของ="" hmgb1="" ยังเพิ่มขึ้นในเซลล์ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย="" lps="" หรือ="" lps="" บวก="" atp="" แต่ไม่แสดงความแตกต่างทางสถิติ="" ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า="" lps="" หรือ="" lps="" บวกกับการกระตุ้น="" atp="" ของเส้นทาง="" nf-κb="" และ="" p38="" สามารถยับยั้งโดย="" tan="">
Tan IIA มีผลบังคับต่อ ROS
เพื่อยืนยันว่า Tan IIA สามารถกำจัด ROS ภายในเซลล์ได้หรือไม่ การผลิต ROS ภายในเซลล์ได้รับการประเมินโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงโดยใช้ชุดทดสอบ Reactive Oxygen Species Assay เซลล์ RAW264.7 สัมผัสกับ LPS เป็นเวลา 6 ชั่วโมง และ ATP 1 มิลลิโมลาร์ถูกเติม 30 นาทีก่อนที่เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยว เซลล์ที่เป็นบวก ROS ถูกมองเห็นเป็นจุดสีเขียวสดใส และการบำบัดด้วย LPS บวกกับ ATP เพิ่มระดับของ ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3) ในขณะเดียวกัน การรักษาด้วย Tan IIA ยับยั้งการเพิ่มขึ้นของ LPS ร่วมกับ ATP ที่เพิ่มขึ้นใน ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Tan IIA มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ
รูปที่ 3 Tan IIA มีผลบังคับต่อการแสดงออกของ ROS (แถบมาตราส่วน50μm)
เซลล์ถูกบำบัดก่อน IIA 10µM เป็นเวลา 30 นาทีและกระตุ้นด้วย LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 5.5 ชั่วโมง ATP ถูกเติม 30 นาทีก่อนเซลล์จะถูกเก็บเกี่ยว A. ภาพเรืองแสงที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ ROS ของเซลล์ B. ข้อมูลเชิงปริมาณของค่าเฉลี่ยในการทดลองสามแบบแยกกัน * P < 0.05="" เทียบกับ="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" lps/lps="" บวก="">
รูปที่ 4 NAC มีผลควบคุมต่อการแสดงออกของโปรตีนของ NLRP3
เซลล์ถูกบำบัดก่อน IIA 10µM เป็นเวลา 30 นาทีและกระตุ้นด้วย LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) /LPS (1 ไมโครโมลาร์) บวก NAC (1 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 5.5 ชั่วโมง ATP ถูกเติม 30 นาทีก่อนเซลล์จะถูกเก็บเกี่ยว A. ตัวแทน Western blot ของ NLRP3 B. ข้อมูลเชิงปริมาณของค่าเฉลี่ยในการทดลองสามแบบแยกกัน * P < 0.05="" เทียบกับ="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" lps="" บวก="">
NAC มีผลบังคับต่อ NLRP3
Acetylcysteine (N-acetyl-l-cysteine,NAC) ซึ่งเป็นสัตว์กินของเน่าของ ROS สามารถยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนของ NLRP3 ตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ การแสดงออกของโปรตีนของ NLRP3 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากกระตุ้นด้วย LPS บวก ATP เป็นเวลา 6 ชั่วโมง และการรักษาด้วย Tan IIA ยับยั้งการเพิ่มขึ้นของระดับโปรตีน NLRP3 ที่เกิดจาก LPS ร่วมกับ ATP นอกจากนี้ การรักษาด้วย NAC ยังสามารถยับยั้งการเพิ่มขึ้นของระดับโปรตีน NLRP3 ที่เกิดจาก LPS ร่วมกับ ATP อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าผลกระทบด้านกฎระเบียบของ Tan IIA ต่อ NLRP3 อาจขึ้นอยู่กับเส้นทาง ROS-NLRP3
การอภิปราย
มาโครฟาจมีส่วนร่วมในกระบวนการตอบสนองต่อการอักเสบและมีบทบาทสำคัญในกระบวนการของกล้ามเนื้อหัวใจตาย โมโนไซต์/มาโครฟาจที่ได้รับคัดเลือกไปยังกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เสียหายสามารถปล่อย ROS สารไกล่เกลี่ยการอักเสบ และโปรตีเอส ซึ่งทำให้อาการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจรุนแรงขึ้น [23] เซลล์ RAW264.7 ได้รับการพิจารณาให้เป็นแบบจำลองมาโครฟาจทดลองที่มีอำนาจเหนือกว่า และมีบทบาทสำคัญในการวิจัยเส้นทางการส่งสัญญาณการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับมาโครฟาจ [24] มาโครฟาจมีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลของหัวใจและประสานการซ่อมแซมเนื้อเยื่อตลอดจนการเปลี่ยนแปลงรูปแบบใหม่ เซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS ถูกใช้อย่างกว้างขวางเพื่อศึกษายาที่มีคุณสมบัติต้านการอักเสบและกลไกพื้นฐาน [25,26]
อินฟลามาโซม NLRP3 เป็นตัวกลางสำคัญของการตอบสนองต่อการอักเสบ และมีหลักฐานเพิ่มขึ้นว่าอินฟลามาโซม NLRP3 มีบทบาทสำคัญในโรคหัวใจ ในหลอดเลือดแดงของมนุษย์ การแสดงออกที่สูงของ NLRP3 มีความสัมพันธ์กับปัจจัยเสี่ยงของโรคหลอดเลือดและความรุนแรงของโรคหลอดเลือดหัวใจ [27] และระดับของยีนที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบของ NLRP3 มีความสัมพันธ์กับคราบไขมันในหลอดเลือด [28] การกระตุ้น NLRP3 inflammasome ยังเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของหัวใจที่ไม่พึงประสงค์ NLRP3 ถูกกระตุ้นใน cardiomyocytes ในหนูทดลองที่ทำให้เกิดการหดตัวของหลอดเลือดตามขวาง (TAC) และการกระตุ้นของ NLRP3 inflammasome ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของโปรแคสเปส-1ไปเป็นรูปแบบที่ทำงานอยู่ [29] MCC950.a ตัวยับยั้ง inflammasome ของ NLRP3 สามารถยับยั้งผลกระทบของหลอดเลือดซึ่งอาจเป็นการยับยั้งการยึดเกาะของ monocytes และลดการสะสมของ macrophages intraplaque [30]
Tan IIA เป็นโมโนเมอร์หลักที่สกัดจาก Danshen ซึ่งมีคุณสมบัติทางชีวภาพที่หลากหลาย ตาล ⅡA มีต่อต้าน-อักเสบ, สารต้านอนุมูลอิสระและส่งเสริมผลการสร้างเส้นเลือดใหม่ และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการรักษาโรคของระบบหัวใจและหลอดเลือด [11] หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่แสดงให้เห็นว่า Tan A ป้องกันการบาดเจ็บของ cardiomyocytes, ไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ, หลอดเลือดและการอักเสบของระบบประสาท[13-16]. การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า Tan IIA มีฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4-MyD88-NF-KB และปรับการแสดงออกของ miRNA ที่เกี่ยวข้องในเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS . นอกจากนี้ Tan IIA สามารถส่งเสริมการโพลาไรซ์ของมาโครฟาจจากฟีโนไทป์ M1 ที่ทำให้เกิดการอักเสบไปสู่ฟีโนไทป์ของ M2 ที่ต้านการอักเสบ [32] อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังผลกระทบของ Tan IIA ก็ยังไม่ชัดเจน
ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการผลิต NO เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS และการบำบัดด้วย Tan IIA (ที่ 10,1 และ 0.1 uM) ลดการผลิต NO ของเซลล์ลงอย่างมีนัยสำคัญ เซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS สามารถกระตุ้นการกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบ และอาจแก้ไขได้ด้วย Tan IIA รวมถึงการแสดงออกของ mRNA ของ NLRP3, IL-1 และ TNF- .ATP เป็นโมเลกุลสัญญาณที่สองของ การเปิดใช้งาน NLRP3 ที่ทำให้เกิดการอักเสบ ในการศึกษานี้ ใช้ ATP เพื่อกระตุ้นการเปิดใช้งาน NLRP3 ผลการศึกษาพบว่า LPS บวกกับ ATP กระตุ้นการกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีน NLRP3 และสามารถแก้ไขได้ด้วย Tan IIA ในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS หรือ LPS บวกกับ ATP การแสดงออกของโปรตีนของ IKBa, pp65/p65 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด; และการรักษา Tan IA (ที่ 10μM) ลดการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ระดับโปรตีนของ pp38/p38 ถูกเพิ่มการควบคุมในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS บวก ATP และการปรับเพิ่มถูกยับยั้งโดย Tan IA(10uM) นอกจากนี้ การแสดงออกของโปรตีนของ HMGB1 ยังเพิ่มขึ้นในเซลล์ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย LPS หรือ LPS บวก ATP แต่ไม่แสดงความแตกต่างทางสถิติ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า LPS หรือ LPS บวกกับการกระตุ้นด้วย ATP ของวิถีทาง NF-kB และ p38 อาจถูกยับยั้งโดย Tan IIA
การบำบัดด้วย LPS ร่วมกับ ATP เพิ่มระดับของ ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ และ Tan IIA ยับยั้งการเพิ่มขึ้นที่เหนี่ยวนำโดย LPS ร่วมกับ ATP ใน ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ Acetylcysteine (N-acetyl-I-cysteine, NAC) เป็นตัวเก็บขยะของ ROS NAC สามารถยับยั้งการเพิ่มขึ้นของระดับโปรตีน NLRP3 ที่เกิดจาก IPS บวกกับ ATP ได้อย่างมีนัยสำคัญ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Tan IIA มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระและผลด้านกฎระเบียบของ Tan IIA ต่อ NLRP3 อาจขึ้นอยู่กับเส้นทาง ROS-NLRP3
สรุป. Tan IIA สามารถยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบและการแสดงออกของ NLRP3 ที่กระตุ้นโดย LPS หรือ LPS บวก ATP และ NAC สามารถยับยั้ง LPS บวกกับการเพิ่มขึ้นของระดับ NLRP3 ที่เกิดจาก ATP ด้วยเหตุนี้ จึงสันนิษฐานได้ว่ากลไกที่เป็นพื้นฐานของผลกระทบของ Tan IIA อาจเกี่ยวข้องกับกฎระเบียบของวิถี ROS-NF-kB/ P38-NLRP3 การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงกลไกระดับโมเลกุลของ Tan IA และให้แนวคิดใหม่แก่การรักษาทางคลินิก
อ้างอิง
1 M.DeBerge.SJ. Shah, L. Weilbacher, et al Macrophages ในภาวะหัวใจล้มเหลวด้วยเศษการดีดออกที่ลดลงเมื่อเทียบกับการรักษาไว้ เทรนด์โมล เม.ย. 2019, 25: 328-340.
2. จีเอช. Gislason, S. Jacobsen, JN Rasmussen, et al ความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตหรือการกลับเป็นโรคหัวใจวายที่เกี่ยวข้องกับการใช้ตัวยับยั้ง cyclooxygenase-2 ที่เลือกและยาต้านการอักเสบ nonsteroidal ที่ไม่เลือกหลังจากกล้ามเนื้อหัวใจตายเฉียบพลัน การไหลเวียน 2549, 113: 2906-2913
3. DM McNamara, R. Holubkov, RCStarling และอื่น ๆ การทดลองควบคุมของโกลบูลินภูมิคุ้มกันทางหลอดเลือดดำในโรคกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือดที่เพิ่งเริ่มมีอาการ หมุนเวียน 2001, 103:2254-2259.
4. PM Ridker, BMEverett, T.Thuren และอื่น ๆ การรักษาด้วยยาแก้อักเสบด้วย canakinumab สำหรับโรคหลอดเลือด N Engl J Med 2017,377:1119-1131. PMRidker, JG MacFadyen, T. Thuren, และคณะ
5. ผลของการยับยั้ง interleukin-1เบต้าด้วย canakinumab ต่อมะเร็งปอดที่เกิดขึ้นในผู้ป่วยที่เป็นโรคหลอดเลือด: ผลการสำรวจจากการทดลองแบบสุ่มแบบ double-blind และ placebo-controlled มีดหมอ 2017,390:1833-1842. เอช. กัว, เจบี คัลลาเวย์, เจพี ติง.
6. กลไกการออกฤทธิ์ บทบาทในโรค และการรักษา นัท เมด 2015,21:677-687.
7. L.Minutoli.D.Puzzolo, M.Rinaldi และอื่น ๆ ROS-mediated NLRP3 กระตุ้นการอักเสบในสมอง หัวใจ. ไตและอัณฑะขาดเลือด / การบาดเจ็บซ้ำ Oxid Med Cell Longley 2016.2016:2183026
8. M.KawaguchiM.TakahashiTHata และคณะ การกระตุ้นการอักเสบของไฟโบรบลาสต์ในหัวใจเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือด/การกลับเป็นซ้ำ หมุนเวียน 2011, 123:594-604. ก. เทรนเดเลนเบิร์ก. การควบคุมระดับโมเลกุลของชะตากรรมของเซลล์
9. ในสมองขาดเลือด: บทบาทของ inflammasome และเส้นทางที่เชื่อมต่อกัน J Cereb Blood Flow Metab 2014,34:1857-1867.
10.ซี. จิน, ราฟลาเวลล์. กลไกระดับโมเลกุลของการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 J Clin Immunol 2010,30:628-631
11.ย. ไค. W, Zhang, Z.Chen และคณะ ข้อมูลเชิงลึกล่าสุดเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีววิทยาและระบบการนำส่งยาของแทนชิโนน Int J Nanomedicine 2016,11:121-130.
12. M.Akaberi, M.Iranshahi, S. Mehri. เส้นทางการส่งสัญญาณระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังผลกระทบทางชีวภาพของซัลเวียสปีชีส์ไดเทอร์ปีนในเภสัชวิทยาและโรคหัวใจ Phytother Res2016.30:878-893.
13. D. Wang, Y.Liu, G.Zhong และคณะ ความเข้ากันได้ของ tanshinone IIA และ astragaloside IV ในการลดอาการบาดเจ็บของ cardiomyocytes ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน เอธโนฟาร์มาคอล 2017,204:67-76.
14. W. Chen, X.Li, S.Guo, et al.Tanshinone IIA ประสาน crosstalk ของ autophagy และโพลาไรเซชันในแมคโครฟาจผ่านเส้นทาง miR-375/KLF4 เพื่อลดทอนหลอดเลือด Int Immunopharmacol 2019,70:486-497.
15. YT Tsai, SHLoh, CY Lee และอื่น ๆ Tanshinone A ยับยั้งการสังเคราะห์คอลลาเจนที่เกิดจากกลูโคสในระดับสูงผ่านทางปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียสอีรีทรอยด์ 2-แฟคเตอร์ 2 ในไฟโบรบลาสต์ของหัวใจ เซลล์ Physiol Biochem 2018,51:2250 2261.
16.น. Huang, Y.Li, Y. Zhou, และคณะ ผลทางระบบประสาทของเซลล์ mesenchymal ที่ฟักตัวด้วย tanshinone IA ทำให้เกิด Abeta25-35-กระตุ้น 5C ต่อการอักเสบของเส้นประสาท Behav Brain Res 2019,365:48-55
17.ท. ไฮด์ G Courtesies, P Dutta, et al. การมีส่วนร่วมที่แตกต่างกันของ monocytes ต่อ macrophages ของหัวใจในสภาวะคงตัวและหลังกล้ามเนื้อหัวใจตาย Circ Res 2014,115:284-295.
18. เอส. สเตฟเฟนส์, เอฟ. มอนเตกุกโก, เอฟ. มัค การตอบสนองต่อการอักเสบเป็นเป้าหมายในการลดภาวะกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือดและการบาดเจ็บซ้ำ Thromb Haemost 2019,102:240-247.
19.เจ. แมคมิคกิ้ง โอ๋ เซี่ย C. ฟังก์ชันนาธานไนตริกออกไซด์และมาโครฟาจ Annu Rev Immunol 1997,15: 323-350
20.ชชช. W, WU NO ที่ Work.Cell 1994.78: 919-925
21. L. Franchi, T. Eigenbrod, R. Munoz-Planllo, et al The inflammasome: แพลตฟอร์มการเปิดใช้งาน caspase-1- ที่ควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันและการเกิดโรค ณัฐ อิมมูนอล 2009,10:241-247.
22. X. Dong Z. Zheng, P. Lin, et al ACPAs ส่งเสริม IL-1การผลิตเบต้าในโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์โดยการกระตุ้น NLRP3 inflammasome เซลล์โมลอิมมูนอล 2019.
23. พี.เจ. เมอร์เรย์, TA Wynn. หน้าที่ป้องกันและทำให้เกิดโรคของชุดย่อยมาโครฟาจ แนท เรฟ อิมมูนอล 2011,11:723-737.
24 G Pascual, AL Fong, S.Ogawa, et al.A ทางเดินที่ขึ้นกับ SUMOylation ไกล่เกลี่ยการยับยั้งยีนตอบสนองต่อการอักเสบโดย PPAR-gamma ธรรมชาติ 2005,437:759-763
25.X. Zhang G.Wang, ECGurley และคณะ Flavonoid apigenin ยับยั้งการตอบสนองการอักเสบที่เกิดจาก lipo polysaccharide ผ่านกลไกหลายอย่างในแมคโครฟาจ โปรดหนึ่ง 2014,9:e107072.
26. Z. Yuan, MA Syed, D.Panchal และอื่น ๆ การปรับอีพิเจเนติกที่เป็นสื่อกลางของเคอร์คูมินยับยั้งการแสดงออกของ TREM-1 ในการตอบสนองต่อไลโปโพลีแซคคาไรด์ Int J Biochem เซลล์ Biol 2012,44:2032-2043
27.F.Zheng.S, ซิง Zhong, et al NLRP3 inflammasomes แสดงการแสดงออกสูงในหลอดเลือดแดงใหญ่ของผู้ป่วยที่เป็นโรคหลอดเลือด Heart Lung Circ 2013, 22:746-750.
28. G Paramel Varghese, L. Folkersen, RJ Strawbridge และอื่น ๆ NLRP3 การแสดงออกและการกระตุ้นการอักเสบในหลอดเลือดของมนุษย์ เจ แอม ฮาร์ท รศ. 2558,5.
29.ท. Suetomi, A. Willeford, CSBrand, er al Inflammation และการกระตุ้น NLRP3 inflammasome ที่เริ่มต้นในการตอบสนองต่อแรงดันเกินโดย Ca (2 บวก) / calmodulin-dependent โปรตีน kinase II delta การส่งสัญญาณใน cardiomyocytes เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเปลี่ยนแปลงของหัวใจที่ไม่พึงประสงค์ หมุนเวียน 2018, 138:2530-2544.
30. T. van der Heijden, E. Kritikou, W. Venema, และคณะ การยับยั้ง NLRP3 inflammasome โดย MCC950 ช่วยลดการพัฒนารอยโรคหลอดเลือดในรายงานโดยย่อของหนูที่มี apolipoprotein E-deficient หลอดเลือดแดงอุดตัน Vasc Biol 2017,37:1457-1461
31. จี แฟน เอ็กซ์ เจียง. X. Wu, e1 อัล ฤทธิ์ต้านการอักเสบของ tanshinone IIA ในมาโครฟาจ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS ผ่าน miRNAs และวิถีทาง NF-kappaB ของ TLR4- การอักเสบ 2016,39: 375-384.
32. S. Gao, Y. Wang, D. Li, และคณะ Tanshinone IIA บรรเทาการตอบสนองต่อการอักเสบและชี้นำการโพลาไรซ์ของมาโครฟาจในเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วยไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ การอักเสบ 2019, 42: 264-275.
