ผลของการบำบัดด้วยโปรตอนต่อการฆ่าเซลล์เนื้องอกและสภาวะแวดล้อมจุลภาคของภูมิคุ้มกันสำหรับมะเร็งเซลล์ตับ

เชิงนามธรรม: การรักษาด้วยรังสีด้วยการรักษาด้วยโปรตอน (PT) มีข้อดีด้านปริมาณรังสีมากกว่าการรักษาด้วยโฟตอน ซึ่งช่วยเพิ่มขอบเขตการรักษาของรังสีรักษาสำหรับมะเร็งเซลล์ตับ (HCC) เราประเมินการตอบสนองของ HCC ต่อ PT และตรวจสอบกลไกพื้นฐาน เซลล์มะเร็งตับของมนุษย์ HepG2 และ HuH7 และเซลล์มะเร็งตับของ murine Hepa1–6 ได้รับการคัดเลือกสำหรับการทดลองในเซลล์และสัตว์เพื่อตรวจสอบการตอบสนองที่เกิดจากการฉายรังสี PT ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันหลังจากการฉายรังสี PT การทดลองในหลอดทดลองไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการอยู่รอดของเซลล์หลัง PT เมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วยรังสีโฟตอน ในแบบจำลองเนื้องอกของหนู เนื้องอกมีขนาดเล็กลง 12 วันหลังจากการฉายรังสี PT การเปลี่ยนแปลงพื้นฐานรวมถึงความเสียหายของ DNA ที่เพิ่มขึ้น ระดับ IL-6 ที่ได้รับการควบคุม และสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกภูมิคุ้มกันที่ได้รับการควบคุม การวิเคราะห์โปรตีน ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย แสดงให้เห็นว่า PT เพิ่มระดับของลิแกนด์การตายของเซลล์ที่ถูกโปรแกรมไว้ 1 (PD-L1) ที่แสดงออกในเซลล์เนื้องอกและคัดเลือกเซลล์กดรับที่ได้มาจากไมอีลอยด์ (MDSC) การเพิ่มขึ้นของ PD-L1 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับปริมาณรังสี ในโมเดลเมาส์ syngeneic Hepa1–6 การรวมกันของ PT กับ anti-PD-L1 ช่วยเพิ่มความล่าช้าในการเติบโตของเนื้องอกเมื่อเปรียบเทียบกับ PT เพียงอย่างเดียว ซึ่งสัมพันธ์กับ T เซลล์ที่แทรกซึมของเนื้องอกที่เพิ่มขึ้นและลดทอนการรับสมัคร MDSC ในสภาพแวดล้อมจุลภาค นอกจากนี้ เมื่อ PT ถูกนำไปใช้กับเนื้องอก HCC หลัก หนูที่ได้รับการรักษาด้วยแอนติ-PD-L1 แอนติบอดีแสดงเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีแบบซิงโครนัสที่มีขนาดเล็กกว่า โดยสรุป การตอบสนองของ HCC ต่อ PT ถูกกำหนดโดยการฆ่าเซลล์เนื้องอก และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก การใช้ร่วมกับแอนติบอดีต้าน PD-L1 เพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกมีหน้าที่ในการทำงานร่วมกันในการรักษาสำหรับ HCC ที่รักษาด้วย PT จากผลลัพธ์ของเรา เราแนะนำว่า PT ร่วมกับ anti-PD-L1 อาจเป็นนโยบายการรักษาที่น่าหวังสำหรับ HCC

ประโยชน์ของ cistanche tubulosa-Antitumor

คำสำคัญ: จุดตรวจสุขภาพ; การบำบัดด้วยโปรตอน PD-L1; มีภูมิคุ้มกัน

1. บทนำ

มะเร็งเซลล์ตับ (HCC) เป็นมะเร็งที่เกิดขึ้นทั่วโลกและมีอุบัติการณ์ค่อนข้างสูงในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ [1] ผู้ป่วยส่วนใหญ่มีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีเนื่องจากเนื้องอกลุกลามและ/หรือการทำงานของตับไม่ดี ตามเนื้อผ้า การรักษาด้วยรังสี (RT) ด้วยขนาดยาที่แน่นอนสำหรับการรักษามะเร็งตับมีความสัมพันธ์กับความเสี่ยงสูงต่อโรคตับอักเสบจากรังสี การปรับปรุงเทคนิคการนำส่งรังสีรักษาได้ช่วยเพิ่มช่วงการรักษา RT สำหรับ HCC การพัฒนา RT ด้วยการบำบัดด้วยโปรตอน (PT) ทำให้การใช้ RT สำหรับ HCC กลายเป็นจุดสนใจ [2,3] PT มีข้อได้เปรียบด้านการวัดปริมาณรังสีเหนือการบำบัดด้วยโฟตอนแบบทั่วไปสำหรับการรักษาโรคมะเร็ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ HCC มะเร็งศีรษะและคอ และมะเร็งเต้านม การศึกษาล่าสุดชี้ให้เห็นว่าอาจมีความแตกต่างในการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพที่เกิดจาก RT รวมถึงการเหนี่ยวนำความเสียหายของ DNA ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่น และการควบคุมเซลล์ภูมิคุ้มกัน ระหว่าง PT และโฟตอนในปริมาณที่มีประสิทธิผลทางชีวภาพที่เทียบเท่ากัน [4–7] การตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลกระทบทางรังสีวิทยาของ PT จะเอื้อต่อโอกาสในการพัฒนากลยุทธ์ PT ที่มีแนวโน้มในการรักษาโรคมะเร็ง การรวมกันของ RT และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันในสถานพยาบาลมีแนวโน้มว่าจะมีข้อบ่งชี้หลายประการ [8,9] เนื่องจากการอักเสบเรื้อรังส่งผลให้เกิดการพัฒนาของ HCC HCC จึงเป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน [10] RT มีทั้งฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันและกดภูมิคุ้มกันต่อสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก [9] แม้ว่า RT แสดงให้เห็นว่ากระตุ้นการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันและเพิ่มการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก [11,12] การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่า RT สามารถกระตุ้นไซโตไคน์และเซลล์ควบคุมภูมิคุ้มกัน ส่งผลให้สภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกมีภูมิคุ้มกันมากขึ้น การรวมกันของการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันและ RT แสดงให้เห็นว่าช่วยเพิ่มการตอบสนองของเนื้องอกเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการอย่างใดอย่างหนึ่งเพียงอย่างเดียว และเพื่อยกเลิกผลกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RT [13,14] การศึกษาทางคลินิกและพรีคลินิกหลายครั้งแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยโฟตอน RT และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันมีผลเชิงบวกต่อการควบคุมเนื้องอกใน HCC [15,16] ตามความรู้ของเรา รายงานเกือบทั้งหมดเกี่ยวกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากคลื่นวิทยุได้มาจากการฉายรังสีโดยใช้โฟตอน ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับกลไกที่รับผิดชอบในการตอบสนองต่อ PT อาจนำไปสู่แนวทางการรักษาที่มีศักยภาพมากขึ้นสำหรับ HCC ผลกระทบทางชีวภาพของ PT ที่รับผิดชอบในการควบคุมเนื้องอกและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันจำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม ดังนั้นเราจึงมุ่งเป้าที่จะประเมินผลของรังสีด้วย PT และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก นอกจากนี้เรายังตรวจสอบว่าการรวมกันของ PT และการปิดล้อมของ PD-L1 มีผลเสริมฤทธิ์กันในการควบคุมเนื้องอก HCC หรือไม่

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การเพาะเลี้ยงเซลล์ 

เซลล์มะเร็งตับของมนุษย์ HepG2 และเซลล์มะเร็งตับของหนู Hepa1–6 ได้มาจากศูนย์รวบรวมและวิจัยทรัพยากรชีวภาพ นอกจากนี้ เซลล์ HuH7 ซึ่งเป็นเซลล์ตับของมนุษย์ ได้รับการกรุณาจาก Dr. Yen-Hao, Chen (โรงพยาบาล Kaohsiung Chang Gung Memorial ประเทศไต้หวัน) การใช้สายเซลล์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยสถาบันของเรา (หมายเลข 00464-2021120952922) เพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's (DMEM) ดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) 10% นอกจากนี้ เซลล์ THP มอนอไซติกของมนุษย์ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 โมโนไซต์ THP-1 สามารถแยกความแตกต่างเป็นมาโครฟาจ M1 หรือ M2 เมื่อบ่มในตัวกลางที่มีการปรับสภาพ [17,18] เพื่อกำหนดหาผลของ PT ต่อความสามารถของเซลล์มะเร็งในการกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนสภาพของมาโครฟาจ M2 เซลล์ HuH7 ที่มีหรือไม่มีการฉายรังสี PT ถูกเพาะในเพลตหลุม 6- 24 ชั่วโมงก่อนสิ้นสุดโพลาไรเซชันของมาโครฟาจ M2 หลังจากการเพาะเลี้ยงร่วม 24 ชั่วโมง การแสดงออกของ CD163 ซึ่งเป็นเครื่องหมายมาโครฟาจ M2 ถูกวิเคราะห์ด้วยมาโครฟาจ การวิเคราะห์เซลล์ที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนต์หลากสี (FACS) ดำเนินการโดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ FACS (BD Biosciences) บนสารแขวนลอยเซลล์เดี่ยวที่เตรียมจากมาโครฟาจที่แตกต่าง และการทำภูมิคุ้มกันสำหรับ CD163 ดำเนินการโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีฉลากเรืองแสง การทดลองในหลอดทดลองดำเนินการในห้องปฏิบัติการ Conjoint ของโรงพยาบาล Chang Gung Memorial ซึ่งมีแพลตฟอร์มบริการต่างๆ ซึ่งรวมถึงเครื่องคัดแยกเซลล์ เครื่องวิเคราะห์เซลล์หลากสี และกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล

ประโยชน์ของ cistanche tubulosa-Antitumor

2.2. การฉายรังสี

ประสิทธิผลทางชีวภาพสัมพัทธ์ของโปรตอนตั้งไว้ที่ 1.1 และปริมาณประสิทธิผลทางชีวภาพสัมพัทธ์ (RBE) คำนวณโดยการคูณปริมาณโปรตอนด้วยค่านี้ [19] ในการศึกษาปัจจุบัน เราใช้ขนาดยา RBE เพื่อประเมินผลที่เกิดจาก RT ปริมาณรังสีรักษาด้วยโปรตอนกำหนดเป็น Gy (RBE) โดยการเพิ่มขนาดยาทางกายภาพขึ้น 10% กล่าวคือ ปริมาณโปรตอน RBE=ปริมาณโปรตอนทางกายภาพ × 1.1 เซลล์และหนูได้รับ RT ในพื้นที่โดยการฉายรังสีโฟตอนหรือการฉายรังสี PT ด้วยขนาด RBE การฉายรังสีโฟตอนดำเนินการโดยใช้การวางแผนการรักษา Varian 21EX และ Eclipse ในหลอดทดลอง เซลล์ที่กำลังเติบโตแบบทวีคูณได้รับการฉายรังสีด้วยปริมาณ 0, 3, 6 และ 9 Gy เพียงครั้งเดียวโดยใช้ลำแสง 6 MV สำหรับการวิเคราะห์รังสีโฟตอน สำหรับ PT การฉายรังสีโดยการสแกนลำแสงดินสอ (PBS) ดำเนินการในปริมาณโปรตอนที่แตกต่างกัน (0, 3, 6, 9 และ 12 Gy (RBE)) โดยมีพลังงานที่สอดคล้องกับ 93.6–109.2 MeV และ 72–143.2 MeV สำหรับเซลล์ และหนูตามลำดับ การฉายรังสีของเซลล์และเมาส์ดำเนินการโดยการวางเซลล์ไว้ตรงกลางของจุดสูงสุดของ Bragg (SOBP; ความกว้าง 1 ซม. สำหรับเซลล์ PT, ความกว้าง 6 ซม. สำหรับการฉายรังสี PT ของเมาส์) เพื่อจำลองสภาวะทางคลินิก (รูปที่ 1a, b) การฉายรังสีโปรตอนถูกส่งโดยไซโคลตรอนที่ใช้ในโรงพยาบาลของเรา (Sumitomo Heavy Industries, Ltd., โตเกียว, ญี่ปุ่น) ซึ่งสร้างลำแสงโปรตอนที่มีความเข้มสูงอย่างต่อเนื่อง ขนาดฟิลด์ RT คือ 20 × 10 cm2 เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ abscopal, 20 × 15 cm2 เพื่อตรวจสอบผลการฆ่าเนื้องอกของ PT ในร่างกาย หรือ 20 × 20 cm2 เพื่อตรวจสอบผลของ PT ในหลอดทดลอง Ray Station คือระบบการวางแผนการรักษาที่ใช้ในการคำนวณปริมาณ RT (เวอร์ชัน 8.1, Ray Search Laboratories, สตอกโฮล์ม, สวีเดน)

รูปที่ 1 แบบจำลองพรีคลินิกสำหรับ PT การออกแบบลำแสงโปรตอนทดลองสำหรับแบบจำลองเนื้องอกในหลอดทดลอง (a) และสัตว์ (สนาม RT สำหรับการฉายรังสีเนื้องอกในตับ, เส้นสีน้ำเงิน; สนาม RT เพื่อตรวจสอบผลของแอบสโคปัล, เส้นสีแดง) (b)

2.3. การสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนทีเซลล์

เพื่อตรวจสอบว่า PT สามารถควบคุมผลของเซลล์มะเร็งและเซลล์ต้าน (MDSC) ที่ได้มาจากไมอีลอยด์ต่อการแพร่กระจายของทีเซลล์ CD8+ หรือไม่ เราได้วัดการแพร่กระจายของทีเซลล์ CD8+ หลังการกระตุ้น ทีเซลล์ CD8+ ที่ถูกแยกเดี่ยวโดยใช้ไมโครบีดต้าน CD8 ถูกติดฉลากด้วยคาร์บอกซีฟลูออเรสซีน ซัคซินิมิดิล เอสเทอร์ (CFSE) และเพาะในเพลตหลุม 96- ที่มีเซลล์ CD11b+ ในการมีอยู่หรือไม่มีเซลล์มะเร็ง 48 ชั่วโมงหลังจาก PT การแพร่กระจายของทีเซลล์ CD8+ ถูกกระตุ้นโดยเม็ดบีดต้าน CD3/CD28 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) การย้อมสีฟลูออเรสเซนต์ CFSE ถูกวิเคราะห์โดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี 3 วันหลังการกระตุ้น

2.4. การเหนี่ยวนำ CD14+HLA-DR-จากเซลล์โมโนนิวเคลียร์ของเลือดส่วนปลาย (PBMC)

ชุดย่อยใหม่ของ MDSC ถูกระบุตามการมีอยู่ของการแสดงออกของ CD14 แต่ไม่มีการแสดงออกของแอนติเจนของเม็ดเลือดขาวของมนุษย์ (HLA)- DR (CD14+HLA-DR−) ในเลือดส่วนปลายของผู้ป่วยโรคมะเร็ง มีรายงานว่าการสะสมของเซลล์ CD14+HLA-DR− ที่ผิดปกติใน PBMC มีส่วนช่วยในการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกันของเนื้องอก และสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรคมะเร็ง [20–22] เพื่อประเมินบทบาทของการฉายรังสี PT ในการเหนี่ยวนำ MDSCs เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD14+HLA-DR−myeloid ได้รับการประเมินจาก PBMCs ที่บ่มด้วยเซลล์มะเร็งที่ถูกฉายรังสี PT เป็นเวลา 24 ชั่วโมง วิเคราะห์สัดส่วนของเซลล์ CD 14+HLA-DR− ไมอีลอยด์ และระดับการแสดงออกของ PD-L1 โดยใช้ FACS (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)

2.5. การทดสอบโคลนเจนิก

การตรวจ Clonogenic ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบผลของ RT (PT เทียบกับโฟตอน RT) ต่อการสูญเสียการอยู่รอดของเซลล์สืบพันธุ์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกฉายรังสีแล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C เพื่อสร้างโคโลนี หลังจากผ่านไป 10 วัน โคโลนีได้รับการแก้ไขและย้อมด้วยคริสตัลไวโอเล็ตเพื่อการนับโคโลนี โคโลนีถูกให้คะแนนเพื่อกำหนดหาประสิทธิภาพการชุบและเศษส่วนที่เหลืออยู่ที่ขนาดยา RBE ที่กำหนดให้ ส่วนรอดคือจำนวนโคโลนีหลังจากได้รับ RT โดยมีการแก้ไขประสิทธิภาพการชุบ

2.6. แบบจำลองเนื้องอกแบบซินจีนิก (นอกมดลูกและออร์โธโทปิก)

การศึกษาในสัตว์ทดลองทั้งหมดเป็นไปตามกฎระเบียบด้านจริยธรรมที่เกี่ยวข้องทั้งหมดสำหรับการวิจัยในสัตว์ และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการสัตว์ทดลองของโรงพยาบาลของเรา การทดลองกับสัตว์ดำเนินการในศูนย์สัตว์ทดลองของโรงพยาบาลชางกุงเมมโมเรียล ซึ่งได้รับการรับรองเต็มรูปแบบจากสมาคมเพื่อการประเมินและรับรองระบบการดูแลสัตว์ทดลองนานาชาติ (AAALAC) เราใช้หนู C57BL/6J เป็นแบบจำลองการปลูกถ่ายเนื้องอกในตับ ในแบบจำลองเนื้องอกนอกมดลูกและออร์โธโทปิก เซลล์เนื้องอก (เซลล์ Hepa 1–6 1 × 106) ถูกปลูกฝังใต้ผิวหนังในบริเวณต้นขาขวาและ/หรือปลูกฝังระหว่างการผ่าตัดในบริเวณโดมตับ เพื่อตรวจสอบการตอบสนองของเนื้องอกในตับต่อ PT ในร่างกาย การฉายรังสี PT ในพื้นที่สำหรับ 12 Gy (RBE) ให้กับเนื้องอก 14 วันหลังจากการฝังด้วยเซลล์มะเร็ง Hepa1–6 (รูปที่ 1b) หนูควบคุมถูกฉายรังสีหลอก เพื่อจัดการกับผลกระทบของ PT ต่อโฮสต์ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องที่มีเนื้องอก เราได้ปลูกฝังเซลล์มะเร็ง Hepa1–6 พร้อมกันที่ต้นขาขวา (เนื้องอกหลัก) และหลังส่วนบน (เนื้องอกซิงโครนัสทุติยภูมิ) สิบสี่วันหลังจากการปลูกถ่ายเนื้องอก PT ที่มี 12 Gy (RBE) ได้ถูกบริหารให้กับเนื้องอกหลัก แต่ไม่ใช่กับเนื้องอกซิงโครนัสทุติยภูมิ จากนั้นเราสังเกตการเติบโตของเนื้องอก (รวมถึงเนื้องอกที่ไม่มีการฉายรังสีปฐมภูมิและซิงโครนัสที่ไม่ได้รับการฉายรังสี) ณ จุดเวลาที่ระบุ เพื่อตรวจสอบผลของแอนติ-PD-L1 ต่อการควบคุมเนื้องอกเฉพาะที่ที่มี PT เป็นสื่อกลางและผลของแอบโคพอล หนูที่มีเนื้องอกได้รับขนาดยาในช่องท้องของแอนติบอดี PD-L1 250 ไมโครกรัมทันทีหลังจากการฉายรังสี PT และทุก 2 วันจนกระทั่งสิ้นสุด การทดลอง แอนติบอดีต่อต้านเมาส์ PD-L1 (B7-H1, 10F.9G2) ได้มาจาก Bio X Cell (เลบานอน, NH, สหรัฐอเมริกา)

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. MDSC Flow Cytometric วิเคราะห์ใน Vivo

MDSC แสดงคุณลักษณะโดยการแสดงออกร่วมของแอนติเจนที่สร้างความแตกต่างในสายเลือดไมอีลอยด์ Gr1 และ CD11b ดังนั้นเราจึงใช้แอนติบอดีต้าน Gr1 ที่จำเพาะ ซึ่งทำปฏิกิริยากับอีพิโทปทั่วไปบน Ly-6G และ Ly-6C และแอนติบอดีจำเพาะสำหรับ CD11b (BD Pharmingen) เพื่อกำหนด MDSC ของเมาส์เป็น CD11b + กลุ่ม1+ [23] นอกจากนี้ แอนติเจนสำหรับการเปลี่ยนสภาพแบบไมอีลอยด์ Gr-1 ประกอบด้วยเอพิโทปสองตัวที่จดจำได้โดยแอนติบอดีต่อต้าน-Ly-6G และแอนติบอดีต่อต้าน-Ly6C ประชากรของ CD11b+Gr-1+ MDSC ประกอบด้วยชุดย่อยหลักสองชุด: เซลล์ที่มีฟีโนไทป์ของแกรนูโลไซต์ที่แสดงออก Ly-6G และเซลล์ที่มีฟีโนไทป์มอนอไซต์ที่แสดงออก Ly6C ชุดย่อยใหม่ของ MDSC ถูกระบุเป็น MDSC มอนอไซติก ที่กำหนดเป็น CD11b+Ly6G- ในหนูเมาส์ เราทำการวิเคราะห์ FACS และอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์เพื่อตรวจสอบผลของการฉายรังสีต่อการรับสมัคร MDSC หลังจากที่หนูได้รับการฉายรังสี FACS ถูกดำเนินการกับสารแขวนลอยเซลล์เดียวที่เตรียมจากเนื้องอกทั้งหมดและม้ามหลังจากการย่อยอาหารและการสร้างภูมิคุ้มกันสำหรับ CD11b, Gr1 และ LY6G ด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ติดฉลากเรืองแสง (BD PharMingen) เปอร์เซ็นต์ของ MDSC ถูกวัดผ่านทางมัลติคัลเลอร์โฟลว์ไซโตเมทรีด้วยมอนอโคลนอล แอนติบอดีที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น แอนติบอดีที่จำเพาะต่อไอโซไทป์ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบใน FACS

2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบของนักเรียน ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าคลาดเคลื่อนเฉลี่ย ± มาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SD) การทดลองระดับเซลล์ทั้งหมดประกอบด้วยการจำลองทางชีวภาพสามครั้งต่อสภาวะ [24] และดำเนินการอย่างน้อยสามครั้งอย่างอิสระ สำหรับการทดลอง ภายในร่างกาย มีการใช้สัตว์หกตัวต่อกลุ่ม และทำการทดลองอิสระอย่างน้อยสองครั้ง ใช้ระดับความน่าจะเป็นที่ p < 0.05 เพื่อระบุนัยสำคัญทางสถิติ เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น

3. ผลลัพธ์:

3.1. การตอบสนองของ HCC ถึง PT การตอบสนองของ HCC

เซลล์มะเร็งของมนุษย์และหนูได้รับสัมผัสกับขนาดยา PT เดียวที่ 0, 3, 6 หรือ 9 Gy (RBE) และการตายของเซลล์ที่ 48 ชั่วโมงและสัดส่วนการรอดชีวิตของเซลล์ที่สร้างโคโลนีได้รับการตรวจสอบและเปรียบเทียบ ด้วยโฟตอน-RT ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการอยู่รอดของเซลล์ที่ RBE ที่เทียบเท่าระหว่าง PT และ photon-RT (รูปที่ 2a, b) การก่อตัวของ p-H2AX คือการตอบสนองของเซลล์ต่อการแตกตัวของ DNA double-strand และการปรากฏตัวของการได้รับ calreticulin และกลุ่มที่มีความคล่องตัวสูง Box 1 (HMGB1) ทำหน้าที่เป็นจุดเด่นของการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RT [25–27] ดังที่แสดงในรูปที่ 2c PT ปรับปรุง calreticulin และการแสดงออกของ HMGB1 ที่เกี่ยวข้องกับความเสียหายของ DNA ที่เพิ่มขึ้น 24 ชั่วโมงหลังจาก RT การศึกษาก่อนหน้านี้ [28] รายงานว่าโฟตอน-RT ควบคุม IL-6 ซึ่งเกี่ยวข้องกับการต้านทานของ HCC ต่อ RT ข้อมูล (รูปที่ 2c, d) เปิดเผยว่า PT ควบคุมระดับ IL -6 ในเซลล์มะเร็งตับที่วิเคราะห์โดยใช้ IF และ RT PCR แบบเรียลไทม์ที่ 24 และ 48 ชั่วโมงหลังจาก PT เพื่ออธิบายลักษณะเพิ่มเติมว่าการเพิ่มขึ้นของ IL-6 โดย PT นั้นเชื่อมโยงกับกิจกรรมโปรโมเตอร์ของ IL6 หรือไม่ เราได้ทำการตรวจวิเคราะห์กิจกรรมของลูซิเฟอเรสโดยใช้เซลล์ HepG2 และ HuH7 ที่ถูกแปลงสภาพอย่างเสถียรด้วยเวกเตอร์ที่แสดงโครงสร้างโปรโมเตอร์ของ IL-6 (รูปที่ 2e) . ข้อมูลเชิงปริมาณแนะนำว่า PT เพิ่มกิจกรรมโปรโมเตอร์ IL -6 ที่ 48 ชั่วโมงหลังจาก 6 Gy (RBE) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม

3.2. การตอบสนองต่อการรักษา PT ในโฮสต์ที่ไม่มีความสามารถ

ในร่างกาย แบบจำลองเนื้องอกในสัตว์เป็นเครื่องมือสำคัญในการทำนายประสิทธิภาพของกลยุทธ์ต้านมะเร็งแบบใหม่ เราใช้แบบจำลองเนื้องอกของเมาส์ซินจีนิกเพื่อตรวจสอบผลกระทบของ PT ต่อการควบคุมเนื้องอก HCC จากการสังเกตกิจกรรมของเนื้องอกโดยการตรวจเอกซเรย์โมเลกุลเรืองแสง (FMT) ในแหล่งกำเนิด และการวัดขนาดเนื้องอก เราพบว่ามีกิจกรรมการดูดซึมกลูโคสของเนื้องอกลดลงอย่างมีนัยสำคัญและเนื้องอกขนาดเล็กลง 12 วันหลังจาก PT เมื่อเทียบกับ sham-RT (รูปที่ 3a, ข) เพื่อตรวจสอบกลไกที่รับผิดชอบในการตอบสนองต่อ PT เพิ่มเติม เราทำการวิเคราะห์ FACS และอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้เนื้องอก 3 วันหลังจากการฉายรังสี PT หรือการหลอกลวง มีรายงานว่าการได้รับ calreticulin เป็นตัวบ่งชี้ภูมิคุ้มกันของการตายของเซลล์ที่เกิดจาก RT ในขนาดต่ำ และ HMGB1 เชื่อมโยงกับการตายของเซลล์ที่เกิดจาก RT ในขนาดที่สูงขึ้น [29] นอกจากนี้ IL-6 ยังได้รับการรายงานว่ามีบทบาทในการปรับภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RT [30] ก่อนหน้านี้เรารายงานว่าการแสดงออกของ IL-6 ได้รับการควบคุมโดยโฟตอน RT และการเพิ่มขึ้นของ IL6 มีความสัมพันธ์กับการตอบสนองของการแผ่รังสีของเนื้องอกในตับ [28] ดังที่แสดงในรูปที่ 3c, d, PT เพิ่มการตายของเซลล์เนื้องอกที่เกี่ยวข้องกับความเสียหายของ DNA ที่เพิ่มขึ้น และการแสดงออกของ IL6 และ HMGB1 เมื่อเปรียบเทียบกับการฉายรังสีเสแสร้ง

3.3. ผลกระทบของภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก PT

การเหนี่ยวนำของโพลาไรเซชันขนาดมหึมา M2 ได้รับการรายงานว่าเป็นองค์ประกอบสำคัญในการกดภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี [17,18] เพื่อทดสอบว่า PT ปรับปรุงการสร้างความแตกต่างของโมโนไซต์ในเซลล์ M2 หรือไม่ เราได้ฟักโมโนไซต์ THP-1 ที่ระยะพัก (M0) ในตัวกลางที่มีการปรับสภาพเป็นเวลา 72 ชั่วโมงสำหรับโพลาไรเซชัน M2 จากนั้นเราวิเคราะห์ระดับของเครื่องหมาย M2 ในมาโครฟาจจากโมโนไซต์โดยการเพาะเลี้ยงร่วมกันในส่วนเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงโดยมีหรือไม่มีเซลล์ HuH7 ที่ได้รับการฉายรังสี PT 24 ชั่วโมงก่อนสิ้นสุดโพลาไรเซชันของมาโครฟาจ M2 ดังที่แสดงในรูปที่ 4a การเพิ่มเซลล์มะเร็งที่ได้รับการฉายรังสี PT ในการเพาะเลี้ยงมาโครฟาจเพิ่มการแสดงออกของ M2 marker CD163 ในมาโครฟาจ ในหลอดทดลอง เราทำการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทของ PT ในความสามารถของเซลล์มะเร็งในการกระตุ้น MDSC จากโมโนไซต์ในเลือดของผู้บริจาคโดยการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์มะเร็งโดยมีหรือไม่มี PT เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ชุดย่อยใหม่ของ MDSC ถูกระบุโดยเซลล์ CD14+HLA-DR− ใน PBMC รูปที่ 4b เผยให้เห็นว่าการฉายรังสี PT มีความสัมพันธ์กับความถี่ที่สูงกว่าของเซลล์ HLA-DR-ไมอีลอยด์ CD14+ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม นอกจากนี้ยังมีการแสดงออกที่สูงขึ้นของ iNOS ซึ่งเป็นเครื่องหมายการทำงานของการกดภูมิคุ้มกันโดยใช้ MDSC ในชุดย่อยของเซลล์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยงด้วยเซลล์มะเร็งที่ได้รับการฉายรังสี PT (รูปที่ 4c) นอกจากนี้ CD163 ยังได้รับการยืนยันว่าเป็นเครื่องหมายฟีโนไทป์ของมาโครฟาจ M2 ที่สามารถใช้เพื่อแยกแยะความแตกต่างระหว่างมาโครฟาจ M2 และ M1 ดังที่แสดงในรูปที่ 4d,e, PT นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของเซลล์ CD163+ ในเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี PT ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำของ monocytic MDSCs ในหนูที่มีเนื้องอก มีรายงานว่า RT กระตุ้นให้เซลล์ภูมิคุ้มกันตายและเพิ่มการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน เพื่อทดสอบบทบาทของ PT เพิ่มเติมในผลที่ตามมาจากการทำงานของเซลล์มะเร็งต่อการปราบปรามของ T-cell ที่ใช้ MDSC การแพร่กระจายของ T เซลล์ CD8+ ที่เรียงลำดับได้รับการประเมินต่อหน้าเซลล์เนื้องอกที่มีหรือไม่มี 6 Gy (RBE ) การฉายรังสี PT ข้อมูลเผยให้เห็นว่าเซลล์ MDSC-CD11b+ ลดการเพิ่มจำนวนทีเซลล์ และการฟักตัวด้วยเซลล์เนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี PT กลับการเพิ่มจำนวน CD8+ ทีเซลล์หลังการกระตุ้น (รูปที่ 4f)

รูปที่ 2 การตอบสนองของ HCC ต่อ PT ในหลอดทดลอง ผลของการรักษา PT ต่อการตายของเซลล์ของเซลล์ HuH7 ( a ) การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนต์ด้วย propidium iodide และการย้อมสี Annexin V 48 ชั่วโมงหลังจาก PT สำหรับขนาดยาที่ระบุ (RBE) และ ( b ) เศษส่วนการอยู่รอดของเซลล์โดยการตรวจวิเคราะห์ clonogenic ที่นำเสนอด้วยอัตราส่วนที่ทำให้เป็นมาตรฐานโดยเศษส่วนการรอดชีวิตภายใต้เงื่อนไขการควบคุม จำนวนเซลล์ชุบสำหรับ 0, 3, 6 และ 9 Gy (RBE) คือ 500, 1000, 1500 และ 3000 ต่อหลุม ตามลำดับ ( c ) อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สำหรับความเสียหายของ DNA ที่เกิดจาก PT และเครื่องหมายสำหรับการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันแสดงโดยสไลด์ตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณ (DAPI, สีน้ำเงิน; pH 2AX และ calreticulin, สีเขียว; HMGB1 และ IL6, สีแดง) แกน y แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงการพับสัมพัทธ์ในการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมาย (d) ระดับของ IL -6 ถูกตรวจสอบผ่าน RT–PCR แบบเรียลไทม์ 48 ชั่วโมงหลังจาก PT (e) การถ่ายเซลล์ HepG2 และ HuH7 ที่เสถียรด้วยพลาสมิดที่มีโครงสร้างโปรโมเตอร์และนักข่าวของ IL {22}} ค่าจะแสดงเป็นการกระตุ้นแบบพับของกิจกรรมลูซิเฟอเรสของรีพอร์ตเตอร์พลาสมิดในสภาวะที่ระบุ ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย * พี < 0.05

รูปที่ 3 การตอบสนองต่อการรักษา PT ในหนูที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง รูปภาพที่เป็นตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ FMT ของการดูดซึมกลูโคสที่ 0, 3 หรือ 12 วัน โดยมีหรือไม่มีการฉายรังสี PT (a) แกน y แสดงถึงอัตราส่วนที่ทำให้เป็นมาตรฐานด้วยค่าของเนื้องอกที่ 0 วันด้วยการฉายรังสีหลอก รูปภาพตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณของรูปภาพเนื้องอก ( b ) จากหนูที่มีเนื้องอก sc 12 วันหลังจากแสดง 12 Gy (RBE) PT หรือการฉายรังสีเสแสร้ง แกน y แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงของขนาดเนื้องอกตามเวลาที่ระบุหลัง PT ความเสียหายของ DNA โดย IF (c) และการตายของเซลล์โดย FACS (d) ได้รับการประเมินที่ 3 วันหลังจาก PT แกน y คือการเปลี่ยนแปลงการพับสัมพัทธ์ในการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายและอัตราการตายของเซลล์ที่ 3 วันหลังจาก PT ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย * พี < 0.05

3.4. บทบาทของ PT ในการแสดงออกของลิแกนด์การตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ 1 (PD-L1)

PD-L1 เป็นตัวกำหนดที่สำคัญของความสมดุลในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกภูมิคุ้มกัน [31] PT เพิ่มการแสดงออกของ PD-L1 ในเซลล์เนื้องอกตับ และระดับการแสดงออกมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับปริมาณ RBE ของ PT ในหลอดทดลอง (รูปที่ 5a, b) เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ PT ต่อ PD-L1 ในร่างกาย เพิ่มเติม เราได้ตรวจสอบระดับการแสดงออกของ PD-L1 ในเนื้องอก HCC ของ murine โดยใช้ IF และ FACS ข้อมูลในรูปที่ 5c,d แสดงการแสดงออกของ PD-L1 ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้องอก 3 วันหลังจาก PT นอกจากนี้เรายังตรวจสอบว่า PT ควบคุมการแสดงออกของ PD-L1 ใน MDSC โดยใช้เซลล์ CD11b + myeloid ที่เรียงลำดับจากเนื้องอกหรือไม่ ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า PT เพิ่มการแสดงออกของ PD-L1 ในเซลล์ CD11b+ ที่เรียงลำดับแล้ว (รูปที่ 5e,f)

3.5. ผลของ PD-L1 ต่อการตอบสนองของ HCC ต่อ PT ใน Vivo

เพื่อตรวจสอบว่า PD-L1 มีบทบาทในความไวต่อรังสีของเนื้องอกในตับต่อ PT ในโฮสต์ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องหรือไม่ ให้ฉีด RT ในพื้นที่ที่มี PT 12 Gy (RBE) เพื่อปลูกฝังเนื้องอกใต้ผิวหนังในหนูที่มีหรือไม่มีการรักษาด้วย anti – PD-L1 ดังที่แสดงในรูปที่ 6a – c anti – PD-L1 เพิ่มผลการยับยั้งเนื้องอกที่เกิดจาก PT ที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ลดลงและการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นหลังจากการฉายรังสี นอกจากนี้ เพื่อตรวจสอบผลด้านกฎระเบียบของ anti-PD-L1 ต่อสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกภูมิคุ้มกันตาม PT เราได้ตรวจสอบการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยใช้แบบจำลองเนื้องอกออร์โธโทปิกของ Murine HCC ข้อมูลแสดงให้เห็นว่า anti-PD-L1 ลดทอนการคัดเลือก MDSC และเพิ่ม CD3+ TIL ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกขนาดเล็กเมื่อเปรียบเทียบกับ PT เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 6d–f)

3.6. การปิดล้อมของ PD-L1 ช่วยเพิ่มผล Abscopal ต่อมะเร็งตับตาม PT

มีรายงานการฉายรังสีเพื่อกระตุ้นให้เกิดผลข้างเคียงในบริเวณมะเร็งที่อยู่ห่างไกลและไม่ได้รับการรักษา ซึ่งขยายวงกว้างขึ้นโดยการใช้ยากระตุ้นภูมิคุ้มกัน [32–34] ดังนั้นเราจึงตรวจสอบเพิ่มเติมถึงผลของการละเว้นที่เกิดจาก PT ต่อเนื้องอกในตับและผลกระทบของการรักษาร่วมกับแอนติบอดีต่อต้าน PD-L1 ดังที่แสดงในรูปที่ 7a, b และรูปที่ S1 เพิ่มเติม การใช้ PT ในพื้นที่กับเนื้องอกเพียงอย่างเดียวทำให้เกิดเนื้องอกขนาดเล็กที่มีการเผาผลาญกลูโคสลดลงในเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสีเหนือต้นขาขวา แต่ไม่พบการยับยั้งเนื้องอกที่มีนัยสำคัญในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีทุติยภูมิที่หลังส่วนบน เมื่อเทียบกับกลุ่ม sham-RT การบำบัดแบบผสมผสานกับแอนติบอดี anti-PD-L1 ทันทีหลังจาก PT เพิ่มผลการฆ่าเชื้อเนื้องอกในเขตข้อมูลที่ได้รับรังสี PT และส่งผลให้เกิดการถดถอยของเนื้องอกทุติยภูมิที่อยู่นอกเขตข้อมูลที่ได้รับรังสี การวิเคราะห์เซลล์ภูมิคุ้มกันที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกแสดงให้เห็นว่าสารต้าน PD-L1 ลดทอนการคัดเลือก MDSC, เพิ่ม TIL ของ CD3+ และลดการเพิ่มจำนวนเซลล์ในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสี (รูปที่ 7c,d) ของหนูที่ได้รับ PT เฉพาะที่ไปยังเนื้องอกปฐมภูมิ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า anti-PD-L1 ช่วยเพิ่มการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก และเพิ่มผลของ abscopal ในโฮสต์ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องหลังจากการฉายรังสี PT ในพื้นที่

รูปที่ 4 การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับ PT การแสดงออกของเครื่องหมาย CD163 ในเซลล์ที่ส่วนท้ายของโพลาไรซ์มาโครฟาจ M2 ถูกวิเคราะห์ผ่านทาง FACS (a) (I: การควบคุม; II: + ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์มะเร็ง; III: + เซลล์มะเร็ง; IV: +6 Gy (RBE) ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์มะเร็งที่ถูกฉายรังสี PT; V: +6 เซลล์มะเร็งที่ถูกฉายรังสี PT Gy (RBE) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD 14+ HLA-DR− จาก PBMC ที่ถูกบ่มโดยมีหรือไม่มีเซลล์ HuH7 ที่ได้รับการฉายรังสีด้วย 0, 3 หรือ 6 Gy (RBE) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงได้รับการวิเคราะห์ ( b ) และการแสดงออก ของ iNOS ในเซลล์ CD 14+HLA-DR− ที่เรียงลำดับถูกวิเคราะห์ผ่าน IF (DAPI, สีน้ำเงิน; iNOS, สีแดง) (c) ขอบเขตของเซลล์ CD 163+ ในเนื้องอกฉายรังสี 12 วันหลังจากตรวจ PT ผ่าน IF (DAPI, สีน้ำเงิน; CD163, สีแดง) (d) และผลของการฉายรังสี PT ต่อการรับสมัคร monocytic-MDSC ได้รับการประเมินผ่าน FACS ( จ) นอกจากนี้ อัตราการแพร่กระจายของทีเซลล์ถูกตรวจสอบผ่านทาง FACS โดยมีหรือไม่มีการฟักตัวด้วยเซลล์มะเร็งที่ถูกฉายรังสี PT แสดงรูปภาพตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณ (f) การบำบัดระบุทีเซลล์ CD8+ ด้วยเม็ดบีดกระตุ้นต้าน CD3/CD28 ในการมีอยู่ของ MDSC รวมกับเซลล์มะเร็งที่มีหรือไม่มีการฉายรังสี PT ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย * พี < 0.05.

รูปที่ 5 ผลของ PT ต่อการแสดงออกของ PD-L1 ระดับของ PD-L1 ได้รับการประเมินโดยใช้ (a) IF (DAPI, สีน้ำเงิน; PD-L1, สีเขียว), (b) การย้อมสี FACS สำหรับเซลล์มะเร็งตับของมนุษย์และ murine ที่ 48 ชั่วโมงหลังจาก PT ในหลอดทดลอง และ (c) FACS และ (d) IF สำหรับเนื้องอกในตับของ murine ตามเวลาที่ระบุหลังจาก PT สำหรับ 12 Gy (RBE) ในร่างกาย แกน y คือการเปลี่ยนแปลงการพับสัมพัทธ์ในนิพจน์ PD-L1 ที่เงื่อนไขที่ระบุหลังจาก PT ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย * พี < 0.05. นอกจากนี้ การแสดงออกของ PD-L1 ในเซลล์ CD11b+ ของหนูหลังจากการฉายรังสี PT ได้รับการประเมินผ่านทาง (e) IF และ (f) การวิเคราะห์ FACS (เซลล์ CD11b+ จุดสีน้ำเงิน)

รูปที่ 6 ผลของ PD-L1 ต่อการตอบสนองของ HCC ต่อ PT ในร่างกาย (a) ผลของการรักษาด้วยยาต้าน PD-L1 ต่อการชะลอการเติบโตของเนื้องอก แกน y คือการเปลี่ยนแปลงรอยพับสัมพัทธ์ในขนาดเนื้องอกใต้ผิวหนังที่ถูกเหนี่ยวนำโดยแอนติ-PD-L1 หลังจาก PT ข้อมูลแสดงถึงวิธีการทดลอง * p < {{10}}.05. (b) ผล ในร่างกาย ของการตายของเซลล์ที่เกิดจากการรักษาตามที่ประเมินโดยใช้ FACS กับการย้อมสี Annexin V-PI แกน y คือการเปลี่ยนแปลงการพับสัมพัทธ์ในอัตราการตายของเซลล์หลังจาก PT ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย * พี < 0.05 (c) อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับความเสียหายของ DNA ที่เกิดจาก RT และ Ki -67 ในเนื้องอกในเวลาที่ระบุหลัง PT เป็นเวลา 12 Gy (RBE) (d) ผลของการบำบัดด้วย anti-PD-L1 ต่อการยับยั้งเนื้องอกได้รับการประเมินในแบบจำลองเนื้องอกออร์โธโทปิก รูปภาพตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณจะแสดง 12 วันหลังจากการฉายรังสี PT ในพื้นที่หรือการฉายรังสีหลอก แกน y คือการเปลี่ยนแปลงรอยพับสัมพัทธ์ของขนาดเนื้องอกในตับ ข้อมูลแสดงถึงวิธีการทดลอง * p < 0.05 (e) ขอบเขตของเซลล์ ki67+, CD3+TIL และ CD11b+ ในเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี 12 วันหลังจากตรวจ PT โดยใช้ IF (DAPI, สีน้ำเงิน; ki-67 และ CD3, สีเขียว ; CD11b, สีแดง) (f) ผลของแอนติ-PD-L1 รวมกับการฉายรังสี PT ต่อการสรรหา MDSC ได้รับการประเมินโดยใช้ FACS

รูปที่ 7 ผลของ abscopal ต่อมะเร็งตับหลัง PT การเจริญเติบโตของเนื้องอกที่ไม่มีการฉายรังสีบริเวณหลังส่วนบนถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ FMT ของการดูดซึมกลูโคส (a) และรูปภาพเนื้องอก (b) ตามเวลาที่ระบุจากหนูที่ได้รับ PT เป็นเวลา 12 Gy (RBE) ไปยังเนื้องอกหลักที่ต้นขาขวาเท่านั้น ( PT (+): หนูได้รับ 12 Gy (RBE) ไปยังเนื้องอกหลักที่ต้นขาขวา แต่ไม่ได้รับเนื้องอกรองที่หลังส่วนบน) รูปภาพที่เป็นตัวแทนและข้อมูลเชิงปริมาณของเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีถูกแสดงที่ 0, 3 และ 12 วันหลังจากการฉายรังสี PT โดยมีหรือไม่มีการรักษาด้วยยาต้าน PD-L1 แกน y แสดงถึงการเปลี่ยนแปลงพับสัมพัทธ์ในค่า FMT และขนาดเนื้องอกในเวลาที่ระบุหลัง PT นอกจากนี้ รูปภาพที่เป็นตัวแทนของระดับ ki-67 และการแทรกซึมของเซลล์ CD11b+ และเซลล์ CD3+ ในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีทุติยภูมิ 12 วันหลังจาก PT เฉพาะที่โดยใช้ IF แสดงขึ้น (DAPI, สีน้ำเงิน; ki{{16 }} และ CD3 สีเขียว CD11b สีแดง) (c) การสะสมของ MDSCs (d) ในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีทุติยภูมิถูกวิเคราะห์โดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี แกน y คือการเปลี่ยนแปลงการพับสัมพัทธ์ ข้อมูลแสดงถึงวิธีการทดลอง * p < 0.05

4. การอภิปราย

ผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าการสูญเสียเซลล์ที่สร้างโคโลนีที่เกิดจาก PT นั้นขึ้นอยู่กับขนาดยาและคล้ายกับการสูญเสียที่เกิดจากการฉายรังสีโฟตอน ระดับความเสียหายของ DNA ที่ไม่ได้รับการซ่อมแซมซึ่งเกิดจากการแผ่รังสีเป็นตัวกำหนดหลักของการตอบสนองของรังสีที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อ ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าการตายของเซลล์ที่เกิดจาก PT มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของระดับเครื่องหมายความเสียหายของ DNA มีรายงานว่าไซโตไคน์ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกหลายชนิดถูกควบคุมโดยการฉายรังสี และสามารถรับและแบ่งขั้วภูมิคุ้มกันย่อยในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกได้ [35,36] ก่อนหน้านี้เรารายงานว่าการแสดงออกของ IL -6 ได้รับการควบคุมโดยโฟตอน RT และการเพิ่มขึ้นของ IL6 มีความสัมพันธ์กับการตอบสนองของการแผ่รังสีของเนื้องอกในตับ [28] การศึกษาพรีคลินิกแสดงให้เห็นว่ามีการควบคุมปัจจัยการอักเสบที่แตกต่างกันหลัง PT เทียบกับการแผ่รังสีโฟตอน รวมถึง IL-6 [6,7,37] เราแสดงให้เห็นโดยใช้การทดลองระดับเซลล์ว่าการฉายรังสี PT ยังเพิ่มระดับการแสดงออกของ IL-6 ในลักษณะที่ขึ้นกับปริมาณรังสี การตอบสนองต่อการรักษาของเนื้องอกได้รับอิทธิพลจากการเพิ่มจำนวนเซลล์เนื้องอกและสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก การใช้แบบจำลองเมาส์เป็นกลยุทธ์ที่ดีที่สุดในการประเมินการตอบสนองต่อการรักษา ตามความรู้ของเรา มีซีรีส์พรีคลินิกเพียงไม่กี่ชุดที่นำเสนอการตอบสนองของเนื้องอกในตับต่อ PT จนถึงปัจจุบัน ข้อมูล ในร่างกาย ของการตายของเซลล์เนื้องอกและความล่าช้าในการเติบโตของเนื้องอกที่เกิดจาก PT ในหนูที่มีเนื้องอกในตับได้แสดงให้เห็นในการศึกษาครั้งนี้ นอกเหนือจากความไวแสงจากรังสีของเซลล์ภายในแล้ว การเจริญเติบโตของเนื้องอกหลังการรักษาด้วยรังสี ในร่างกาย อาจได้รับผลกระทบอย่างมากจากปัจจัยการอักเสบและสโตรมัลหลายประการ [38,39] RT กระตุ้นผลกระทบปลายน้ำที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่หลากหลาย รวมถึงผลกระทบจากการกระตุ้นภูมิคุ้มกันและกดภูมิคุ้มกัน RT กระตุ้นภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งผ่านการเหนี่ยวนำการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกัน โดยปล่อยแอนติเจนใหม่ไปยังส่วนประกอบของระบบภูมิคุ้มกัน ต่อมานำไปสู่การปรับปรุงการเตรียมและกระตุ้นการทำงานของเอฟเฟคเตอร์ทีเซลล์ ในทางกลับกัน RT ทำให้เกิดผลกดภูมิคุ้มกัน เช่น การสรรหา MDSCs ในสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคที่ได้รับการฉายรังสี [39,40] การสรรหา MDSC เป็นตัวกำหนดสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่กดภูมิคุ้มกันตาม RT MDSC ได้กลายเป็นตัวควบคุมหลักในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในมะเร็งและสภาวะทางพยาธิวิทยาอื่นๆ หลักฐานสนับสนุนการมีส่วนร่วมที่สำคัญของ MDSC ต่อการลุกลามของเนื้องอก ก่อนหน้านี้เรารายงานว่า MDSC ที่เพิ่มขึ้นสามารถถูกกระตุ้นโดย RT และการเพิ่มขึ้นนั้นสัมพันธ์กับการต้านทาน RT ในแบบจำลองสัตว์ HCC [28] การศึกษาที่นำเสนอแสดงให้เห็นว่า PT นำไปสู่การกระตุ้นการสรรหา MDSC ที่เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำของ monocytic MDSCs ในหนูที่มีเนื้องอก ชุดย่อยใหม่ของ MDSC ที่ระบุว่าเป็น MDSC แบบมอนอไซติกถูกกำหนดให้เป็นโมโนไซต์ CD14+HLA-DR− จากเลือดของผู้ป่วยและ CD11b+Ly6G- ในหนูเมาส์ [20,23,41] การแสดงออกของ iNOS ในฐานะเครื่องหมายการทำงานของการยับยั้ง T-cell ถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการประเมินฟังก์ชัน MDSC [42] การทดลองโดยใช้การฟักตัวของ PBMC กับเซลล์มะเร็งแสดงให้เห็นว่า PT เพิ่มความสามารถของเซลล์มะเร็งในการชักนำ MDSC ในโมโนไซต์ และเพิ่มการแสดงออกของ iNOS ในส่วนย่อยของเซลล์ นอกจากนี้ ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ CD11b+ ลดการแพร่กระจายของ T-cell และมะเร็งที่ได้รับรังสี PT ได้ลดทอนความสามารถในการยับยั้งของเซลล์ CD11b+ บนการเพิ่มจำนวน T-cell ในการทดลองการเพาะเลี้ยงร่วมกัน

มีรายงานว่าเชื้อสายของเซลล์ไมอีลอยด์ประกอบด้วยเครือข่ายของเซลล์ปราบปรามภูมิคุ้มกันที่มีอยู่ในผู้ป่วยมะเร็งส่วนใหญ่ และยับยั้งการสร้างภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งได้อย่างลึกซึ้ง Macrophages ซึ่งเป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันที่มีอยู่มากมายในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก เป็นตัวควบคุมสำคัญของการอักเสบเรื้อรัง มีการเสนอแนะว่ามาโครฟาจสามารถโพลาไรซ์ไปทางฟีโนไทป์ M2 ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดสภาพแวดล้อมจุลภาคที่กดภูมิคุ้มกันได้ [43] เซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเนื้องอกน่าจะมีอยู่ในระยะการแยกความแตกต่างที่หลากหลายตั้งแต่มอนอไซต์/มอนอไซติก-MDSC ไปจนถึงมาโครฟาจ M2 ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เครือข่ายระหว่าง MDSC และมาโครฟาจ M2 ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกเผยให้เห็นว่า M2 สามารถแยกแยะได้จาก MDSC โมโนไซติก หลักฐานแสดงให้เห็นว่า RT มีบทบาทในการกำกับดูแลในแมคโครฟาจที่มีโพลาไรเซชัน M1/M2 เพื่อปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน [44,45] เราแสดงให้เห็นว่าการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ที่ได้รับการฉายรังสี PT ส่งผลให้การแสดงออกของเครื่องหมาย M2 ในหลอดทดลอง เพิ่มขึ้น และเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี PT ในร่างกาย การกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งมีความสำคัญต่อประสิทธิผลของ RT

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

กลไกภูมิคุ้มกันหลายอย่างมีความสำคัญในการพัฒนาและการลุกลามของ HCC และสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรค สารยับยั้งเช็คพอยต์ที่มุ่งเป้าไปที่ PD1 และ PDL1 มีฤทธิ์ ทนทานได้ และมีประโยชน์ทางคลินิกต่อ HCC ขั้นสูง [46] PD-L1 ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของเซลล์ที่สำคัญ มีบทบาทในการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกัน ซึ่งรวมถึงการยับยั้งการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกันที่ใช้สื่อกลางของ T-cell และการควบคุมโพลาไรเซชันของ Macrophage M2 [13,31,47] การควบคุมแกน PD-1/PD-L1 ถูกสังเกตเพื่อยับยั้งการกระทำที่เป็นพิษต่อเซลล์ของทีเซลล์ ซึ่งอาจเป็นสาเหตุของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ที่หลบเลี่ยงเนื้องอก และการฆ่าเซลล์เนื้องอกที่ไม่สมบูรณ์หลังจากการฉายรังสี PD-L1 ตั้งอยู่อย่างแพร่หลายในเซลล์เม็ดเลือด ซึ่งรวมถึงทีเซลล์ มาโครฟาจ และเซลล์เนื้องอก PD-1/PD-L1 เป็นจุดตรวจภูมิคุ้มกันที่โดดเด่นซึ่งนำไปสู่ภาวะทีเซลล์ แอนติบอดีต่อ PD-L1 ซึ่งเป็นการปิดกั้นจุดตรวจภูมิคุ้มกัน ได้รับการอนุมัติสำหรับการบำบัดแบบเสริมของมะเร็งบางชนิด และเป็นการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันที่มีแนวโน้มสำหรับผู้ป่วย HCC ขั้นสูง [48,49] สารยับยั้ง PDL1 เป็นหนึ่งในแกนหลักของการรักษาแบบเป็นระบบในการปฏิบัติงานทางคลินิกหรืออยู่ระหว่างการพัฒนาสำหรับ HCC นอกจากนี้ ผลกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RT ยังเผยให้เห็นถึงศักยภาพในการรวมรังสีเข้ากับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันรูปแบบต่างๆ ได้สำเร็จ เพื่อยกเลิกผลกดภูมิคุ้มกันเหล่านี้ MDSC สามารถมีส่วนทำให้ผู้ป่วยมีความต้านทานต่อการยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน เราแสดงให้เห็นว่า PT ควบคุมการแสดงออกของ PD-L1 ในเนื้องอกและ MDSC ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ผลกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RT เผยให้เห็นถึงศักยภาพในการรวมรังสีเข้ากับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันรูปแบบต่างๆ ได้สำเร็จ เพื่อยกเลิกผลกดภูมิคุ้มกันเหล่านี้ การวิจัยพรีคลินิกแสดงให้เห็นว่าการรวมกันของโฟตอน RT และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันแสดงให้เห็นการทำงานร่วมกันในการรักษาเพื่อปรับปรุงการควบคุมเนื้องอก [15] ดังที่เราทราบ การผสมผสานระหว่าง RT และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันยังอยู่ในขั้นตอนเบื้องต้น และไม่มีข้อกำหนดที่เหมาะสมที่สุดของขนาดยา RT, ประเภท RT หรือลำดับสำหรับ RT และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน เพื่อชี้แจงปัญหาของการฉายรังสี PT ร่วมกับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน เราได้รวมการรักษาด้วย anti-PD-L1 กับการฉายรังสี PT ของเนื้องอกในตับในแบบจำลองเนื้องอกแบบซินจีนิก เราพบว่าการผสมผสานกับแอนติบอดีต่อต้าน PD-L1 ทำให้มะเร็งตับไวต่อการฉายรังสี PT ดังที่แสดงโดยเนื้องอกขนาดเล็กที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์เนื้องอกที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ การบำบัดด้วยแอนติ-PD-L1 ยังยับยั้งการจัดหา MDSC และเพิ่มการกรองทีเซลล์ CD3+ ในเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี PT

RT ถือเป็นการบำบัดเฉพาะที่ โดยจะฆ่าเซลล์เนื้องอกด้วยความเสียหายของ DNA ภายในสนามรังสี นอกจากนี้ การตอบสนองต่อรังสีโดยไม่เห็นเป็นปรากฏการณ์ที่เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไป โดยที่เนื้องอกที่อยู่นอกสนามรังสีก็ตอบสนองต่อการรักษาเช่นกัน ผลของแอบสโคพัลนั้นคิดว่าเป็นสื่อกลางทางภูมิคุ้มกัน เซลล์มะเร็งส่วนหนึ่งภายในเนื้องอกจะตายโดยการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกัน เมื่อใช้รังสีในปริมาณที่ใช้ในการรักษา การตายของเซลล์เนื้องอกที่เกิดจาก RT สัมพันธ์กับการสร้างสัญญาณโมเลกุลจำเพาะและมีแอนติเจนปรากฏต่อส่วนประกอบของระบบภูมิคุ้มกันมากขึ้น มีรายงานว่า RT อาจกระตุ้นให้เกิดผลของการละเว้นที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน ซึ่งหมายความว่า RT ไม่เพียงแต่มีฤทธิ์ฆ่าเชื้อเนื้องอกในเนื้องอกเป้าหมายเท่านั้น แต่ยังมีผลต้านมะเร็งในบริเวณที่ห่างไกลและไม่ได้รับการรักษาอีกด้วย [32,50,51] ในบรรดาปัจจัยที่เกิดจาก RT ความสามารถของรังสีในการส่งเสริมการรับรู้ของเซลล์มะเร็งโดยทีเซลล์นั้นน่าจะมีความสำคัญเป็นพิเศษสำหรับผลกระทบของแอบสโคปัล ผลกระทบนี้เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์เนื้องอกเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันต้านมะเร็ง ซึ่งสามารถขยายได้โดยใช้สารกระตุ้นภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ pembrolizumab ยังให้อัตราการบรรเทาอาการตามวัตถุประสงค์ 15-20% ซึ่งสัมพันธ์กับการอยู่รอดที่ยืดเยื้อใน HCC [46] จุดสำคัญประการหนึ่งเกี่ยวกับสารยับยั้งจุดตรวจสอบคือประสิทธิภาพและความปลอดภัย เป็นที่ชัดเจนว่าการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันไม่ได้ให้ประโยชน์กับผู้ป่วยทุกราย วิธีเอาชนะการดื้อต่อเนื้องอกต่อการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันถือเป็นประเด็นสำคัญ สาเหตุที่เป็นไปได้ของการดื้อยาของเนื้องอก ได้แก่ การดื้อยาจากภายในและการพัฒนาแอนติบอดีต่อต้านยาที่ทำให้กิจกรรมของการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันเป็นกลาง เพื่อให้ได้การกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่ง การรักษาเฉพาะที่ต่างๆ สามารถผสมผสานตามลำดับหรือพร้อมกันกับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันแบบเป็นระบบได้ การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันมีแนวโน้มที่จะประสานกับการแทรกแซงในท้องถิ่นใน HCC HCC มักจะมีหลายจุดโดยมีพื้นที่มะเร็งที่อาจพัฒนาเป็นแบบ metachronous ตลอด ที่นี่เราตรวจสอบเพิ่มเติมว่าการรวมกันของ PT กับ anti-PD-L1 ช่วยเพิ่มผลของ abscopal ของ PT เพื่อเพิ่มการควบคุมเนื้องอกในตับแบบ metachronous หรือไม่ ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าการรวมกันของ PT กับ anti-PD-L1 ทำให้เกิดขนาดเนื้องอกที่เล็กลงในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีทุติยภูมิเมื่อเปรียบเทียบกับที่เกิดจาก PT หรือ anti-PD-L1 เพียงอย่างเดียว ข้อมูลของเรายังแสดงให้เห็นว่าการรวมกันของ anti-PD-L1 นั้นสัมพันธ์กับ TIL ที่เสริมและการสรรหา MDSC ที่ลดทอนในเนื้องอกที่ไม่ได้รับการฉายรังสีระยะไกลของหนูที่ได้รับ PT ในพื้นที่ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า anti-PD-L1 เพิ่มภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก ซึ่งเป็นสื่อกลางในกิจกรรมการฆ่าเนื้องอกขั้นต้นที่เพิ่มขึ้น และผลของการสลายเนื้องอกในหนูที่มีเนื้องอกซึ่งได้รับการฉายรังสี PT ในพื้นที่

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

5. สรุปผลการวิจัย

เหตุผลในการรวมการรักษาด้วยรังสีและการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันก็คือ การฉายรังสีสามารถสร้างภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งที่เสริมฤทธิ์กัน และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันจะเอาชนะการตอบสนองการปราบปรามของระบบภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่ได้รับการฉายรังสี โดยสรุป เราแนะนำว่านอกเหนือจากผลทางชีวภาพต่อเซลล์มะเร็งแล้ว PT ยังมีผลการปรับภูมิคุ้มกันต่อสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกด้วย ข้อมูลของเราเปิดเผยว่า anti-PD-L1 กระตุ้นภูมิคุ้มกันต้านมะเร็ง และต่อมาเพิ่มการตอบสนองของเนื้องอกปฐมภูมิและระยะไกลต่อการฉายรังสี PT การใช้ anti-PD-L1 ร่วมกับ PT อาจเป็นกลยุทธ์ที่มีความหวังสำหรับการรักษา HCC

อ้างอิง

1. เบรย์ ฟ.; เฟอร์เลย์ เจ.; เซอร์โจมาตาราม ไอ.; ซีเกล, ร.-ล.; ตอร์เร แอล.-เอ.; Jemal, A. สถิติมะเร็งทั่วโลกปี 2018: GLOBOCAN ประมาณการอุบัติการณ์และการเสียชีวิตทั่วโลกสำหรับมะเร็ง 36 รายใน 185 ประเทศ CA Cancer เจ. คลินิก 2018, 68, 394–424. [ครอสอ้างอิง]

2. ม.ชวง; ไกเซอร์, อ.; โมลิตอริส, เจ.; เม็นเดส โรเมโร, อ.; อภิสารธนารักษ์, ส. การรักษาด้วยลำแสงโปรตอนสำหรับมะเร็งตับ. เจ. ระบบทางเดินอาหาร. อองคอล. 2020, 11, 157–165. [ครอสอ้างอิง]

3. ยู ก.-ส.; ยู เจ.-ไอ.; ปาร์ค, เอช.-ซี. การบำบัดด้วยโปรตอนสำหรับมะเร็งตับ: ความรู้ในปัจจุบันและมุมมองในอนาคต โลกเจ. Gastroenterol. 2018, 24, 3090–3100. [ครอสอ้างอิง]

4. หยวน ต.-ซ.; จ้าน ซ.-เจ.; เฉียน ซี.-เอ็น. ขอบเขตใหม่ในการบำบัดด้วยโปรตอน: การประยุกต์ในมะเร็ง ชุมชนมะเร็ง 2019, 39, 61. [CrossRef] [PubMed]

5. เดย์มาร์ ส.; แฟคซิน อี.; คาซิโมวา ต.; น็อบเบล, ป.-ก.; เทลาโรวิช ไอ.; ชานซ ฟ.; วอลเลอร์, วี.; วิงค์เลอร์ อาร์.; ยง, ค.; Zingariello, D. ประสิทธิผลทางชีวภาพสัมพัทธ์ของการฉายรังสีโปรตอนโดยขึ้นอยู่กับการซ่อมแซมความเสียหายของ DNA บ. เจ. เรดิโอล. 2020, 93, 20190494. [CrossRef] [PubMed]

6. เลอร์ อ.; ฟอน นอยเบ็ค ซี.; กรอส ม.; Troost, EGC ประสิทธิผลทางชีวภาพสัมพัทธ์ในการบำบัดด้วยลำแสงโปรตอน - ความรู้ปัจจุบันและความท้าทายในอนาคต คลินิก. การแปล แผ่รังสี อองคอล. 2018, 9, 35–41. [ครอสอ้างอิง]

7. เกิร์ดานี ส.; แซคส์ ร.; Hlatky, L. ผลกระทบทางชีวภาพของรังสีโปรตอน: สิ่งที่เรารู้และไม่รู้ แผ่รังสี ความละเอียด 2013, 179, 257–272. [ครอสอ้างอิง]

8. ฟาน ลิมเบอร์เกน, อี.-เจ.; เดอ รุยส์เชอร์ ดี.-เค.; โอลิโว ปิเมนเทล, วี.; มาร์คัส ดี.; เบอร์บี ม.; โฮเบน, อ.; เรเกอร์ส น.; พวกเขาเจ.; ยาโรมินา, อ.; ดูบัวส์, แอล.-เจ.; และคณะ ผสมผสานรังสีรักษากับภูมิคุ้มกันบำบัด: อดีต ปัจจุบัน และอนาคต บ. เจ. เรดิโอล. 2017, 90, 20170157. [CrossRef]

9. ชาบาสัน เจ.-อี.; มินน์, เอ.-เจ. การปิดล้อมด่านตรวจรังสีและภูมิคุ้มกัน: จากม้านั่งไปจนถึงคลินิก เซมิน. แผ่รังสี อองคอล. 2017, 27, 289–298. [CrossRef] [PubMed]

10. ลู ค.; รอง ดี.; จาง บ.; เจิ้ง ว.; วังเอ็กซ์.; เฉิน ซ.; Tang, W. มุมมองปัจจุบันเกี่ยวกับสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่กดภูมิคุ้มกันในมะเร็งเซลล์ตับ: ความท้าทายและโอกาส โมล กรกฎ 2019, 18, 130. [CrossRef]

11. เบิร์ด เจ.-อาร์.; มอนจาเซ็บ, A.-M.; ชาห์ทุม; แมคกี้ เอช.; เมอร์ฟี่, ดับบลิว.-เจ.; คริตเทนเดน ม.-ร.; กอฟ, เอ็ม.-เจ. กระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเพื่อเพิ่มการควบคุมเนื้องอกที่เกิดจากการฉายรังสี นานาชาติ เจ. เรเดียท. อองคอล. ไบโอล ฟิสิกส์ 2017, 99, 362–373. [ครอสอ้างอิง]

12. เบิร์นสไตน์ ม.-บ.; กฤษณะ ส.; ฮอดจ์ เจ.-ว.; ช้าง เจ.-วาย. การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันและการฉายรังสีบำบัดแบบ Stereotactic (ISABR): แนวทางการรักษา? แนท. อาจารย์คลินิก. อองคอล. 2016, 13, 516–524. [CrossRef] [PubMed]

13. พิโลเนส, K.-A.; Vanpouille-Box, ค.; Demaria, S. การรวมกันของการรักษาด้วยรังสีและสารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน เซมิน. แผ่รังสี อองคอล. 2015, 25, 28–33. [CrossRef] [PubMed]

14. อิชิฮาระ ดี.; ป๊อป, แอล.; ทาเคชิมะ ต.; ไอเยนการ์ ป.; Hannan, R. เหตุผลและหลักฐานในการรวมการรักษาด้วยรังสีและการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันเพื่อรักษาโรคมะเร็ง มะเร็งอิมมูนอล ภูมิคุ้มกัน 2017, 66, 281–298. [ครอสอ้างอิง]

15. ลี ย.-ช.; ต่าย ด.; ยิป ค.; ชู ส.-ป.; Chew, V. การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันแบบผสมผสานสำหรับมะเร็งตับ: รังสีบำบัด, การปิดล้อมด่านตรวจภูมิคุ้มกันและอื่น ๆ ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2020, 11, 568759. [CrossRef] [PubMed]

16. ชอย ช.; ยู ก.-ส.; โช ว.-ก.; ปาร์ค, เอช.-ซี. การเพิ่มประสิทธิภาพการรักษาด้วยรังสีด้วยการปิดกั้นจุดตรวจภูมิคุ้มกันในมะเร็งตับ โลกเจ. Gastroenterol. 2019, 25, 2416–2429. [ครอสอ้างอิง]

17. เกอนิน ม.; ผ่อนผันเอฟ.; ฟัตแทคซิโอลี, อ.; เรซ ม.; Michiels, C. M1 และ M2 มาโครฟาจที่ได้มาจากเซลล์ THP-1 จะปรับเปลี่ยนการตอบสนองของเซลล์มะเร็งต่ออีโตโพไซด์อย่างแตกต่าง BMC มะเร็ง 2015, 15, 577 [CrossRef] [PubMed]

18. กัว ฟ.; เฟิง ย.-ค.; จ้าว ก.; จางร.; เฉิง Z.-Z.; ก้อง ว.-น.; วู, H.-L.; ซู บ.; เลเวล, X.; Ma, XM การแทรกซึมของมาโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก CD163(+) M2 มีการเชื่อมโยงอย่างสูงกับการแสดงออกของ PD-L1 ในมะเร็งปากมดลูก มะเร็งจัดการ ความละเอียด 2020, 12, 5831–5843. [ครอสอ้างอิง]

19. คาสเซตต้า แอล.; น้อย ร.; สเวียร์ชาค, อ.; ซูกาโนะ ก.; สมิธ เอช.; วีชมันน์, ล.; พอลลาร์ด, เจ.-ดับบลิว. การแยกเมาส์และมาโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกของมนุษย์ โฆษณา ประสบการณ์ ยา ไบโอล 2016, 899, 211–229.

20. ชิกามัตสึ เค.; ซาคาคุระ, เค.; โทโยดะ ม.; ทาคาฮาชิ, เค.; ยามาโมโตะ ต.; Masuyama, K. ฤทธิ์กดภูมิคุ้มกันของ CD14+ เซลล์ HLA-DR- ในมะเร็งเซลล์ squamous ของศีรษะและคอ วิทยามะเร็ง 2012, 103, 976–983. [ครอสอ้างอิง]

21. เฉิน ม.-ฟ.; ควน เอฟซี.; เยน ต.-ค.; ลู ม.-ส.; ลิน พ.-ย.; ชุง ย.-ช.; เฉิน W.-C.; ลี เค.-ดี. IL-6-กระตุ้น CD11b+ CD14+ HLA-DR- เซลล์กดรับที่ได้มาจากไมอีลอยด์มีความเกี่ยวข้องกับการลุกลามและการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีในมะเร็งเซลล์สความัสของหลอดอาหาร เป้าหมายเป้าหมาย 2014, 5, 8716–8728 [ครอสอ้างอิง]

22. Paganetti, H. ค่าประสิทธิผลทางชีวภาพสัมพัทธ์ (RBE) สำหรับการบำบัดด้วยลำแสงโปรตอน ความแปรผันตามฟังก์ชันของจุดสิ้นสุดทางชีวภาพ ปริมาณ และการถ่ายโอนพลังงานเชิงเส้น ฟิสิกส์ ยา ไบโอล 2014, 59, R419–R472. [CrossRef] [PubMed]

23. บรอนเต้, วี.; บรันเดา ส.; เฉิน S.-H.; โคลัมโบ, M.-P.; เฟรย์ ก.-บี.; เกรเทน ต.-ฟ.; มันดรุซซาโต ส.; เมอร์เรย์, P.-J.; โอโชอา, อ.; ออสตราน โรเซนเบิร์ก, ส.; และคณะ คำแนะนำสำหรับมาตรฐานการตั้งชื่อเซลล์ต้านและการกำหนดลักษณะเฉพาะของไมอีลอยด์ แนท. ชุมชน 2016, 7, 12150. [CrossRef]

24. เคอร์ติส ม.-เจ.; บอนด์ ร.-ก.; สปินา ด.; อาลูวาเลีย, อ.; อเล็กซานเดอร์ สปา; กีมบีซ, M.-A.; กิลคริสต์, อ.; ฮอยเออร์ ดี.; อินเซล, P.-A.; อิซโซ, เอ-เอ การออกแบบและการวิเคราะห์เชิงทดลองและการรายงาน: คำแนะนำใหม่สำหรับการตีพิมพ์ใน BJP บ. เจ. ฟาร์มาคอล. 2015, 172, 3461–3471. [ครอสอ้างอิง]

25. ไฮเคอร์วาล ส.-เจ.; ฮาเกะคิเรียโคว เจ.; แมคมานัส ม.; มาร์ติน โอ.-ก.; เฮย์เนส, N.-M. สร้างภูมิคุ้มกันมะเร็งด้วยการฉายรังสี มะเร็งเล็ตต์ 2015, 368, 198–208. [CrossRef] [PubMed]

26. หยวน ส.; หลิว ซ.; ซู่ซ.; หลิว เจ.; Zhang, J. กล่องกลุ่มความคล่องตัวสูง 1 (HMGB1): ตัวควบคุมสำคัญของมะเร็งเม็ดเลือด เจ. ฮีมาทอล. อองคอล. 2020, 13, 91. [CrossRef] [PubMed]

27. ซูซูกิ ย.; มิมูระ, เค.; โยชิโมโตะ ย.; วาตานาเบะ ม.; โอคุโบะ, ย.; อิซาวะ ส.; มูราตะ, เค.; ฟูจิอิ เอช.; นากาโนะ ต.; Kono, K. การตายของเซลล์เนื้องอกภูมิคุ้มกันที่เกิดจากเคมีบำบัดในผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งเซลล์ squamous หลอดอาหาร มะเร็ง. ความละเอียด 2012, 72, 3967–3976. [ครอสอ้างอิง]

28. เฉิน ม.-F.; เซียห์ ซี.-ซี.; เฉิน W.-C.; ลาย, C.-H. บทบาทของอินเตอร์ลิวคิน-6 ต่อการตอบสนองทางรังสีของเนื้องอกในตับ นานาชาติ เจ. เรเดียท. อองคอล. ไบโอล ฟิสิกส์ 2012, 84, e621–e630 [CrossRef] [PubMed]

29. เหลียว ย.; หลิว ส.; ฟู ส.; Wu, J. HMGB1 ในรังสีบำบัด: สัญญาณสองหัวที่ควบคุมความไวของรังสีและภูมิคุ้มกันของเนื้องอก อองคอล. เป้าหมายเธอ 2020, 13, 6859–6871. [ครอสอ้างอิง]

30. กัว ย.; ซู ฟ.; ลู ต.; ด้วน ซ.; Zhang, Z. Interleukin-6 ส่งสัญญาณวิถีการรักษามะเร็งแบบกำหนดเป้าหมาย รักษามะเร็ง. ฉบับที่ 2012, 38, 904–910. [ครอสอ้างอิง]

31. อฟรีเรน ส.; Dermime, S. โมเลกุล B7-H1 ที่ยับยั้งภูมิคุ้มกันเป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้ในการเกิดมะเร็ง: ฆ่านกจำนวนมากด้วยหินนัดเดียว เฮมาทอล อองคอล. ก้าน. เซลล์ เธอ. 2014, 7, 1–17. [ครอสอ้างอิง]

32. ฟอร์เมนติ เอส.-ซี.; Demaria, S. การบำบัดด้วยการฉายรังสีเพื่อเปลี่ยนเนื้องอกให้เป็นวัคซีนในแหล่งกำเนิด นานาชาติ เจ. เรเดียท. อองคอล. ไบโอล ฟิสิกส์ 2012, 84, 879–880. [ครอสอ้างอิง]

33. โรดริเกซ-รุยซ์ ม.-E.; วิทาเล ฉัน.; แฮร์ริงตัน เค.-เจ.; เมเลโร ฉัน.; Galluzzi, L. ผลกระทบทางภูมิคุ้มกันของการส่งสัญญาณการตายของเซลล์ซึ่งขับเคลื่อนโดยการฉายรังสีต่อสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก แนท. อิมมูนอล. 2020, 21, 120–134. [ครอสอ้างอิง]

34. หลิว ย.; ดงย.; ก้อง ล.; ชิเอฟ.; จู้ เอช.; Yu, J. ผล Abscopal ของการรักษาด้วยรังสีรวมกับสารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน เจ. ฮีมาทอล. อองคอล. 2018, 11, 104. [CrossRef] [PubMed] 35. ฮิลล์ ร.-พี. กระบวนทัศน์ที่เปลี่ยนแปลงของการตอบสนองของเนื้องอกต่อการฉายรังสี บ. เจ. เรดิโอล. 2017, 90, 20160474. [CrossRef]

36. มูเคอร์จี ส.; Chakraborty, A. ปรากฏการณ์ผู้ยืนดูที่เกิดจากการแผ่รังสี: ข้อมูลเชิงลึกและผลกระทบในการรักษาด้วยรังสี นานาชาติ เจ. เรเดียท. ไบโอล 2019, 95, 243–263. [CrossRef] [PubMed]

37. กาเมโร เอส.-อาร์.; มาลามาส, A.-S.; เบิร์นสไตน์ ม.-บ.; Tsang, K.-ย.; อ.วสันตชาติ.; สฮู น.; ช่างตัดเสื้อ ร.; พิดิกิติ ร.; กูฮา ซี.-ป.; ฮาห์น ส.-ม.; และคณะ เซลล์เนื้องอกที่รอดชีวิตจากการสัมผัสรังสีโปรตอนหรือโฟตอนมีสัญญาณการปรับภูมิคุ้มกันโดยทั่วไป ทำให้เซลล์เหล่านี้มีความไวต่อการฆ่าโดยอาศัยทีเซลล์มากขึ้น นานาชาติ เจ. เรเดียท. อองคอล. ไบโอล ฟิสิกส์ 2016, 95, 120–130. [ครอสอ้างอิง]

38. ซัน ย.; เนลสัน ป.-ส. วิถีทางระดับโมเลกุล: เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเสียหายต่อสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคในการต้านทานการรักษามะเร็ง คลินิก. มะเร็ง Res 2012, 18, 4019–4025. [CrossRef] [PubMed]

39. โคซิน ส.-ว.; คามูน, W.-S.; หวาง ย.; ดอว์สัน ม.-ร.; เจน ร.-ก.; ดูดา, ดี.-จี. การรับสมัครเซลล์สารตั้งต้นของไมอีลอยด์ แต่ไม่ใช่เซลล์บุผนังหลอดเลือดช่วยให้เนื้องอกงอกใหม่หลังจากการฉายรังสีเฉพาะที่ มะเร็ง Res 2010, 70, 5679–5685. [CrossRef] [PubMed]

40. เก้า เจ.; โค อี.-ซี.; ไอเซนสไตน์ ส.; ซิโกรา, A.-G.; ฟู ส.; เฉิน เอส.-เอช. การกำหนดเป้าหมายเซลล์กดภูมิคุ้มกันที่ได้มาจากไมอีลอยด์ในด้านเนื้องอกวิทยา คริติคอล สาธุคุณองคล. เฮมาทอล 2011, 77, 12–19. [ครอสอ้างอิง]

41. เฮิคสท์ บ.; ออร์ม็องดี ลุยเซียนา; บอลไมเออร์ ม.; เลห์เนอร์ เอฟ.; ครูเกอร์ ซี.; แมนส์ ส.ส. ; เกรเทน, TF; Korangy, F. ประชากรใหม่ของเซลล์ต้านที่ได้มาจากไมอีลอยด์ในผู้ป่วยมะเร็งเซลล์ตับทำให้เกิดเซลล์ T CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) ระบบทางเดินอาหาร 2551, 135, 234–243 [CrossRef] [PubMed]

42. Hsu, C.-Y.; ลิน ย.-ค.; ช้าง ล.-ย.; หวง ส.-ก.; หวาง ช.-ช.; หยาง ซี.-เค.; หวาง, C.-T.; ลิน ซี.-วาย. บทบาทการรักษาของไนตริกออกไซด์ซินเทสที่เหนี่ยวนำไม่ได้ซึ่งแสดงออกถึงเซลล์ต้านที่ได้มาจากไมอีลอยด์ในความล้มเหลวของตับ Murine ที่เกิดจากอะเซตามิโนเฟน ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2020, 11, 574839. [CrossRef]

43. พอลลาร์ด เจ.-ดับเบิลยู. มาโครฟาจที่ได้รับการศึกษาเกี่ยวกับเนื้องอกส่งเสริมการลุกลามของเนื้องอกและการแพร่กระจาย แนท. รายได้มะเร็ง 2547, 4, 71–78 [CrossRef] [PubMed]

44. วัง ล.-X.; จาง ส.-X.; วู, เอช.-เจ.; รอง X.-L.; Guo, J. M2b โพลาไรซ์แมคโครฟาจและบทบาทของมันในโรค เจ. ลอยค. ไบโอล 2019, 106, 345–358. [CrossRef] [PubMed]

45. เชียง ช.-ส.; ฟู ส.-ย.; วัง เอส.-ซี.; ยู ช.-ฟ.; เฉิน F.-H.; ลิน ช.-ม.; ฮอง เจ.-เอช. การฉายรังสีส่งเสริมฟีโนไทป์ขนาดมหึมา m2 ในภาวะขาดออกซิเจนของเนื้องอก ด้านหน้า. อองคอล. 2012, 2, 89. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​สังโกร บ.; สโรเบ้ ป.; แอร์วาส-สตับส์, ส.; Melero, I. ความก้าวหน้าในการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันสำหรับมะเร็งตับ แนท. รายได้ Gastroenterol. เฮปาทอล 2021, 18, 525–543. [ครอสอ้างอิง]

47. หลู ด.; นี, ซ.; หลิวเอ็กซ์.; เฟิง ส.; ดงเอ็กซ์.; ชิ เอ็กซ์.; ไจ่ เจ.; เชียงใหม่ ส.; เจียง เจ.; วังซ.; และคณะ นอกเหนือจากทีเซลล์: การทำความเข้าใจบทบาทของ PD-1/PD-L1 ในมาโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เจ. อิมมูนอล. ความละเอียด 2019, 2019, 1919082. [CrossRef]

48. เฉิง อ.-ล.; ซู ค.; ชาน ส.-ล.; ชู ส.-ป.; Kudo, M. ความท้าทายของการบำบัดร่วมกับสารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกันสำหรับมะเร็งตับ เจ. เฮปาทอล. 2020, 72, 307–319. [ครอสอ้างอิง]

49. แฮ็ค ส.-ป.; สปาห์น เจ.; เฉิน ม.; เฉิง อ.-ล.; เกษบ, อ.; คุโด้ ม.; ลี HC; ยอป, อ.; เชาว์ ป.; Qin, S. IMbrave 050: การทดลองระยะที่ 3 ของ atezoli zumab ร่วมกับ bevacizumab ในมะเร็งเซลล์ตับที่มีความเสี่ยงสูงหลังการผ่าตัดรักษาหรือการระเหย อนาคตออนคอล 2020, 16, 975–989. [ครอสอ้างอิง]

50. ปาร์ค ส.-ส.; ดงฮ.; หลิวเอ็กซ์.; แฮร์ริงตัน, S.-M.; โครโค, ซี.-เจ.; กรัม, ม.-ป.; แมนส์ฟิลด์, A.-S.; ฟุรุทานิ ก.-ม.; โอลิเวียร์ เค.-อาร์.; ควอน อี.-ดี. PD-1 ยับยั้งผลของ Abscopal ที่ชักนำด้วยรังสีบำบัด มะเร็งอิมมูนอล ความละเอียด 2015, 3, 610–619. [ครอสอ้างอิง]

51. เดมาเรีย ส.; อึ้ง บ.; เดวิทท์ ม.-ล.; แบบบาบ เจ.-ส.; คาวาชิมะ น.; ลีเบส ล.; ฟอร์เมนติ, เอส.-ซี. การยับยั้งการแผ่รังสีแบบไอออไนซ์ของเนื้องอกที่ไม่ได้รับการรักษาที่อยู่ห่างไกล (ผลแอบสโคปัล) นั้นเป็นสื่อกลางทางภูมิคุ้มกัน นานาชาติ เจ. เรเดียท. อองคอล. ไบโอล ฟิสิกส์ 2547, 58, 862–870 [CrossRef] [PubMed]