ผลของ Phenylethanol Glycosides ต่อปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง – P1/Smads Signaling Pathway ใน Human Hypertrophic Scar Fibroblasts

ผลของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ต่อปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง – p1/Smads ส่งสัญญาณเส้นทางในไฟโบรบลาสต์แผลเป็นที่มีไขมันในเลือดสูงของมนุษย์

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:Ali.ma@wecistanche.com

[เชิงนามธรรม]วัตถุประสงค์ ขึ้นอยู่กับปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง - pl (TGF - pl)/เส้นทางการส่งสัญญาณ Smads เพื่อตรวจสอบผลกระทบของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จากซิสทานเช ทูบูโลซา(CPhGs) กับไฟโบรบลาสต์แผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงของมนุษย์ (HSFbs) และกลไกที่เป็นไปได้ วิธีการ ตั้งแต่เดือนมีนาคมถึงมิถุนายน 2019 ผู้ป่วย 9 รายที่มีแผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงหลังจากก้นเข้ารับการรักษา แยกไฟโบรบลาสต์ออกจากแผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงและเพาะเลี้ยง รอยแผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงของมนุษย์ถูกลบออกและไฟโบรบลาสต์ถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง กลุ่มว่าง กลุ่มแบบจำลอง กลุ่มควบคุมเชิงบวก (TGF - pl บวก 5 - ฟลูออโรราซิล) และกลุ่มทดลอง (TGF - pl บวก CPhG) ถูกตั้งค่า ผลกระทบของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จากซิสทานเช ทูบูโลซาที่ความเข้มข้นต่างกันบนการเพิ่มจำนวนของ HSFbs ถูกตรวจพบโดยชุดตรวจนับเซลล์ {0}} (CCK - 8) การแสดงออกของ Smad2, Smad3, Smad7, คอลลาเจน I (COL -1) และคอลลาเจน HI (COL -3) mRNA ถูกตรวจพบโดยปฏิกิริยารีเวิร์สทรานสคริปเทสเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ - ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (RT - qPCR) ใน แต่ละกลุ่ม Western blotting ตรวจพบการแสดงออกของโปรตีน Smad2, Smad3, phosphorylated Smad2 (p - Smad2), phosphorylated Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 และ COL {{20}} ข้อมูลการวัดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (Mean ± SD) เปรียบเทียบหลายกลุ่มโดยใช้ ANOVA ทางเดียว ผลลัพธ์ อัตราการยับยั้งของไฟโบรบลาสต์หลังการรักษาด้วย CPhG ที่ 60 , 90 และ 120 มก./ลิตร เป็นเวลา 48 ชั่วโมง คือ (36.87 ±0.06) เปอร์เซ็นต์ เทียบกับ (43.52 ±0.04) เปอร์เซ็นต์ เทียบกับ (78.11 ±0.03) เปอร์เซ็นต์ , ค่า F =45.070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="" <="" 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

{{0}}.04 ± 0.04, ค่า F=14.780, P <{{21 }}.05)="" ;="" ผลการซับแบบตะวันตกพบว่าการแสดงออกของโปรตีนของ="" p-smad2="" และ="" p="" -smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3="" ในกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุมเชิงบวกมีค่าต่ำกว่าในกลุ่มแบบจำลองอย่างมีนัยสำคัญ="" และ="" การแสดงออกของโปรตีน="" smad7="" สูงกว่าในกลุ่มแบบจำลองอย่างมีนัยสำคัญ="" (0="" 16="" ±="" 0.03="" เทียบกับ="" 0.="" 11="" ±="" 0.02="" เทียบกับ="" 0.06="" ±="" 0{{="" 26}}),="" (0.="" 12="" ±="" 0.02="">

{{0}}.07 ± 0.{{10}}1 เทียบกับ 0.04 ±{ {18}}.{{20}}1, ค่า F =7.670, P < 0.05), (0.12 ±0.03 เทียบกับ 0.15 ±0.06 เทียบกับ 0.23 土 0.05, ค่า F { {24}}.936, ป<0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="" <="" 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[คำสำคัญ] ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จากซิสทานเช ทูบูโลซา; ไฟโบรบลาสต์แผลเป็น Hypertrophic; การเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเติบโต - เส้นทางการส่งสัญญาณ pl / Smads

คลิกที่ cistanche deserticola ma และ Cistanche products

Hypertrophic scarring (HS) เป็นโรคไฟโบรติกของผิวหนังที่มีลักษณะการแพร่กระจายที่มากเกินไปของไฟโบรบลาสต์ (FBS) เช่นเดียวกับการสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) ซึ่งเป็นเซลล์หลักที่ทำให้เกิดแผลเป็น สามารถหลั่งคอลลาเจนจำนวนมาก และ ปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง (TGF) - เส้นทางการส่งสัญญาณ P / Smads นั้นสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการก่อตัวของ HSCistancheเป็นยาชูกำลังแบบจีนโบราณ สารสกัดจากฟีนิลทานอยด์ อะซิติก แอซิด รวม (cphgs) เป็นหนึ่งในส่วนผสมหลักที่ออกฤทธิ์ทางยาและมีหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ เช่น ต่อต้านการอักเสบ ต้านเนื้องอก ต้านรังสี กำจัดอนุมูลอิสระ ฯลฯ จากการศึกษาพบว่า cphgs สามารถยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ตับ stellate และสามารถทำได้โดยการลดการแสดงออกของ Smad2, Smad3 การเพิ่มการแสดงออกของ Smad7 จึงปิดกั้น tgf-p / Smads การส่งสัญญาณเส้นทางการถ่ายทอดและทำให้การลุกลามล่าช้า ของการเกิดพังผืดของตับ จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือการสังเกตผลกระทบต่อการแสดงออกของยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไฟโบรบลาสต์แผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงของมนุษย์ (hsfbs) ตามวิถีการส่งสัญญาณ TGF PL / Smad

วัสดุและวิธีการ

1. วัสดุ:Cistanchecphgs ถูกซื้อจาก hechen Pharmaceutical biotech Co., Ltd., Hetian, China; ซื้อซีรั่มวัวในครรภ์จากคลาร์กไบโอไซแอนซ์ สหรัฐอเมริกา; ซื้อชุดตรวจนับเซลล์ TGF PL จาก pepro tech ประเทศสหรัฐอเมริกา ซื้อชุด PCR เชิงปริมาณเรืองแสงจาก Takara Corporation ประเทศญี่ปุ่น ชุดถอดความแบบย้อนกลับทั้งหมดซื้อมาจาก Thermo Fisher Scientific ประเทศสหรัฐอเมริกา ซื้อแอนติบอดี Smad2 / 3, p-Smad2 / 3 จากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์สหรัฐอเมริกา แอนติบอดีต่อ Smad7, COL-1, COL-3, glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (gap-dh) ถูกซื้อมาจาก abeam (UK); ซื้อเยื่อแผ่นโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) จากมิลลิพอร์ สหรัฐอเมริกา

2. กรณีทั้งหมดได้รับการคัดเลือกจากแผนกศัลยกรรมกระดูก โรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง และตัวอย่าง 3 ตัวอย่าง (ซึ่งทั้งหมดได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นแผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงโดยพยาธิวิทยา) ได้รับการสุ่มเลือกสำหรับการเพาะเลี้ยงเบื้องต้นของ FBS การทดลองนี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมทางการแพทย์ของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (หมายเลขการอนุมัติ 20170214-71) และได้รับความยินยอมจากผู้ป่วยและครอบครัวของพวกเขา

3. Cell grouping: randomly divided into blank group; Model group: 5 |ug / L TGF - & 1; Positive control: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Experimental group: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 มก. / ล.) cphgso.

4. การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกกำหนดโดยชุดตรวจนับเซลล์ (CCK-8): hsfbs ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึมถูกนำมาใช้ เซลล์จากแต่ละกลุ่มได้รับการปฏิบัติตามที่ออกแบบ และค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลุมของแต่ละกลุ่มถูกเฝ้าติดตามตามลำดับที่ ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทที่ 24, 48 และ 72 ชั่วโมง

5. การตรวจหาการแสดงออกของ mRNA โดย RT qPCR: hsfbs จากแต่ละกลุ่มหลังจาก 48 ชั่วโมงของการแทรกแซงถูกรวบรวม RNA ถูกสกัดและกำหนดปริมาณของการแสดงออกของ mRNA

6. การแสดงออกของโปรตีนถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ Western blot โปรตีนจากเซลล์ทั้งหมดถูกสกัด 48 ชั่วโมงหลังการบำบัดจากแต่ละกลุ่มเพื่อตรวจหาการแสดงออกของโปรตีนแต่ละชนิด

7. วิธีทางสถิติ: ซอฟต์แวร์ทางสถิติ SPSS 220 ใช้ในการวิเคราะห์ และข้อมูลการวัดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ค่าเฉลี่ย ± SD) และใช้การวิเคราะห์ทางเดียวของความแปรปรวนเพื่อเปรียบเทียบระหว่าง หลายกลุ่ม และ P < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

ผลลัพธ์

ผลการเพิ่มจำนวนเซลล์พบว่า 60, 9{{10}} และ 120 mg / L cphgs เป็นเวลา 48 ชั่วโมงบนไฟโบรบลาสต์ อัตราการยับยั้งคือ [(36.87 ±0.06) เปอร์เซ็นต์ : (43.52 ±0.04) เปอร์เซ็นต์ :(78.11 ±0.03) เปอร์เซ็นต์ ,F=45.073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

การเปรียบเทียบการแสดงออกของ CoL-I, COL-3, Smad2 และ Smad3 mRNA ในแต่ละกลุ่ม: เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง ทั้งกลุ่มควบคุมเชิงบวกและกลุ่มทดลองสามารถลดปัจจัยการเจริญเติบโตที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลง - CoL-I, COL{{ 6}}, การแสดงออกของ Smad2 และ Smad3 mRNA และส่งเสริมการแสดงออกของ Smad7 mRNA โดยมีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (1.56 ±0.01:0. 30 ± 0.25 : 0.21 ±0.04,F=39. 755, พี<0.01; 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01;="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ;2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ;0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

การเปรียบเทียบ p-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 ในแต่ละกลุ่ม: เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มว่าง การแสดงออกของโปรตีนของ p-Smad2, col-l ในกลุ่มแบบจำลองเพิ่มขึ้น ในขณะที่ Smad7 ลดลง; เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง กลุ่มควบคุมเชิงบวกสามารถลดการแสดงออกของโปรตีนของ p-smad3, COL-1, COL-3 และกลุ่มทดลองแสดงผลการยับยั้งต่อการแสดงออกของโปรตีนที่เพิ่มขึ้นของ p- Smad2, p-smad3, คอลัมน์ - 3 การแสดงออกของ COL-3 ถูกยับยั้งในระดับต่างๆ ในขณะที่การแสดงออกของ Smad7 ค่อนข้างเพิ่มขึ้นในทั้งสองกลุ่ม และค่าการแสดงออกของโปรตีนของ p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL{{27 }} ในกลุ่มว่าง กลุ่มควบคุมเชิงบวก และกลุ่มทดลองคือ (0.{{30}}9 ±0.04,{ {38}}.16 ±{{40}}.03,0.11 ± 0.{{50}}}2 ,0.06 ± 0.00),(0.07 ±0.03,0.12 ± 0.02,0.07 ± 0.01,0. 04 ±0. 01,F { {60}}. 670,ป<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05,="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01),(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02,="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

การอภิปราย

HS เป็นผลลัพธ์ที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ของการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ และกลไกการเกิดขึ้นของมันส่วนใหญ่มีการแพร่กระจายมากเกินไปของ FBS การเสื่อมสภาพไม่เพียงพอ และอื่นๆ นำไปสู่การก่อตัวและการพัฒนาของ HS Tgf-p1 มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างมากกับโรคที่เกิดจากการแพร่กระจายและการเปลี่ยนแปลงของเซลล์เนื้อเยื่อที่ผิดปกติและยังคงดำเนินต่อไปตลอดการรักษาบาดแผล มันออกแรงผลกระทบส่วนใหญ่ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ tgf-p / Smads ซึ่งฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีน Smad2 / 3 นำไปสู่การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนยีนไฟโบรภายในเซลล์และนอกเซลล์ส่งเสริมการผลิตคอลลาเจนและเร่งการลุกลามของพังผืด Smad7 ในฐานะตัวควบคุมเชิงลบอาจป้องกันเส้นทางนี้ผ่านการโต้ตอบกับตัวรับ tgf-p1 ที่เปิดใช้งานซึ่งจะช่วยลดการสังเคราะห์เส้นใยคอลลาเจน ดังนั้นการเพิ่มการแสดงออกของ Smad7 หรือการยับยั้งการแสดงออกของ Smad2 / 3 สามารถป้องกันการพัฒนาแผลเป็นจากภาวะ hypertrophic

การศึกษานี้ใช้ Cistanche cphgs กับ HS ซึ่งเป็นโรคไฟโบรติกที่ผิวหนัง และพบว่าการให้ cphgs ในปริมาณต่างๆ ยับยั้งการแพร่กระจายของ hsfbs ที่เกิดจาก tgf-p1; นอกจากนี้ 90m & / L cphgs ยับยั้งการส่งสัญญาณเส้นทางโดยส่งเสริมการแสดงออกของ Smad7 และลดการแสดงออกของ Smad2 / 3 ที่ระดับการแสดงออกของยีนและโปรตีน และลดการผลิต CoL-I, COL-3 ซึ่งจะยับยั้งการลุกลามของ HS ผลลัพธ์ของเรายืนยันว่า cphgs ยับยั้งการผลิตคอลลาเจนโดยแทรกแซงในการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ tgf-p / Smads ภายใต้การกระตุ้น tgf-p1 ผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า Cistanche cphgs ยับยั้งการแพร่กระจายและลดการหลั่งคอลลาเจนของไฟโบรบลาสต์ที่มีแผลเป็นจากไขมันในเลือดสูงได้อย่างมีประสิทธิภาพผ่านเส้นทางส่งสัญญาณ tgf-p / Smads