ผลของไดออสมินแบบปรับสองทางต่อกระบวนการสร้างนิ่วในไตแคลเซียมออกซาเลต: การตกผลึก, การเจริญเติบโต, การรวมกลุ่ม, การยึดเกาะของเซลล์คริสตัล, การทำให้อยู่ภายในเซลล์ท่อไต และการบุกรุกผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์
Mar 16, 2022
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com
ศุภภรณ์ คำชุนa,b,c,1, สุนิสา อยู่ดีa,1, วิสิษฐ์ ทองบุญเกิดa,*
aหน่วยโปรตีโอมิกส์ทางการแพทย์ สำนักวิจัยและพัฒนา คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพฯ 10700 ประเทศไทย
bภาควิชาเทคนิคการแพทย์ School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
cหน่วยความเป็นเลิศทางชีวการแพทย์เชิงบูรณาการระดับโมเลกุล คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยพะเยา พะเยา 56000 ประเทศไทย
คำสำคัญ: สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ฟลาโวนอยด์ สารยับยั้ง โมดูเลเตอร์ ไตอักเสบ โปรโมเตอร์ Urolithiasis
บทคัดย่อ
ไดออสมินเป็นฟลาโวนไกลโคไซด์ตามธรรมชาติ (ไบโอฟลาโวนอยด์) ที่พบในผลไม้และพืชที่มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาหลายอย่าง มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะอาหารเสริมหรือยารักษาโรคในโรค/ความผิดปกติต่างๆ แม้ว่าจะแนะนำ หลักฐานของกลไกการป้องกันต่อต้านไตโรคนิ่ว (ไตอักเสบ/ urolithiasis) โดยเฉพาะแคลเซียมออกซาเลต (CaOx) โมโนไฮเดรต (COM) ที่เป็นชนิดที่พบบ่อยที่สุด ยังคงไม่ชัดเจน ในการศึกษานี้ เราจึงประเมินผลของ .อย่างเป็นระบบไดออสมิน(ที่ 2.5–160 นาโนโมลาร์) ในระยะต่างๆ ของไตกระบวนการสร้างหิน รวมถึงการตกผลึก COM การเติบโตของผลึก การรวมกลุ่ม การยึดเกาะของเซลล์คริสตัล การฝังตัวเข้าไปในเซลล์ท่อไต และการบุกรุกผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) ผลปรากฏว่าไดออสมินมีผลต่อการปรับค่าที่ขึ้นกับปริมาณยาต่อกระบวนการนิ่วในไต COM ที่กล่าวถึงทั้งหมดไดออสมินเพิ่มจำนวนและมวลของผลึก COM อย่างมีนัยสำคัญในระหว่างการตกผลึก แต่ขนาดและการเติบโตของคริสตัลลดลง ในขณะที่ไดออสมินส่งเสริมการรวมตัวของผลึก ยับยั้งการยึดเกาะของเซลล์คริสตัลและการทำให้อยู่ภายในเซลล์ท่อไต ในที่สุด diosmin ได้ส่งเสริมการบุกรุกของคริสตัลผ่าน ECM ข้อมูลของเรามีหลักฐานที่แสดงให้เห็นทั้งการยับยั้งและส่งเสริมผลกระทบของไดออสมินต่อCOMไตกระบวนการสร้างหิน จากกิจกรรมการปรับสองทางของไดโอสมิน บทบาทในการต่อต้านโรคนิ่วในท่อไตเป็นที่น่าสงสัยและควรให้ความระมัดระวังในการใช้งานไตโรคหิน
1. บทนำ
ไดออสมิน(3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone-7-rhamnoglucoside) เป็นไบโอฟลาโวนอยด์ตามธรรมชาติที่พบได้ทั่วไปในพืชและผลไม้หลายชนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Citrus spp. [1,2]. มันสามารถสังเคราะห์หรือได้มาจากฟลาโวนอยด์อื่น ๆ เฮสเพอริดิน [1,2] Diosmin เพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับ hesperidin ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นยา phlebotropic สำหรับการรักษาความผิดปกติของหลอดเลือดดำและน้ำเหลืองเช่นความไม่เพียงพอของหลอดเลือดดำเรื้อรังและโรคริดสีดวงทวาร [3,4] นอกจากนี้ ไดออสมินยังจัดแสดงกิจกรรมทางชีวภาพและทางเภสัชวิทยาอื่นๆ อีกหลายอย่าง รวมทั้งฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ [5,6] คุณสมบัติต้านการกลายพันธุ์และต้านเนื้องอก [7,8] ฤทธิ์ต้านปฏิชีวนะ [9] คุณสมบัติต้านน้ำตาลในเลือดสูง [ 10] และผลการป้องกันความเสียหายต่ออวัยวะหลายส่วน กล่าวคือ
หลอดเลือดหัวใจ [11], จอประสาทตา [12],ไต, ตับและสมองบาดเจ็บ [13].
ไตโรคนิ่ว (หรือโรคไตอักเสบ/โรคนิ่วในไต) เกิดจากก้อนนิ่วที่พัฒนาและสะสมในไต และส่งผลกระทบต่อมนุษย์ในทุกพื้นที่ของโลกด้วยอัตราการกลับเป็นซ้ำสูง [14–17] ในบรรดาผลึกที่ก่อให้เกิดโรคต่างๆ ทั้งหมด แคลเซียมออกซาเลต (CaOx) โดยเฉพาะอย่างยิ่งรูปแบบโมโนไฮเดรต (COM) เป็นส่วนประกอบผลึกที่ทำให้เกิดโรคมากที่สุดและพบได้บ่อยที่สุดในตัวสร้างนิ่ว (ผู้ป่วยนิ่วในไต) [18] ในทางกลไก ผลึก COM มีความสามารถในการยึดติดที่มีศักยภาพมากที่สุดและมีผลเป็นพิษต่อเซลล์ส่วนใหญ่ต่อเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต [19,20] ระหว่างการเกิดโรคของหิน แบบจำลองแผ่นโลหะของ Randall และสมมติฐานในท่อมีลักษณะทั่วไปของกระบวนการสร้างหิน COM รวมถึงการตกผลึก COM การเจริญเติบโต การรวมตัว การคงไว้โดยพื้นผิวยึดเกาะบนเซลล์ท่อไตหรือกระดูกเชิงกรานของไต คั่นระหว่างไตผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) [21,22]
เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการศึกษาจำนวนมากที่เน้นไปที่การค้นพบยาโดยใช้พืช/ผลไม้เป็นยาและสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่มีจุดมุ่งหมายเพื่อป้องกันการก่อตัวของนิ่วใหม่และ/หรือการเกิดซ้ำ รายงานก่อนหน้านี้จำนวนหนึ่งแสดงให้เห็นว่าสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพบางชนิด โดยเฉพาะสารประกอบฟีนอล (โพลีฟีนอล ฟลาโวนอยด์ ฟลาโวนไกลโคไซด์ ฯลฯ) ที่สกัดจากพืช/ผลไม้สมุนไพรหลายชนิด มีผลในการป้องกันกลไกการก่อโรคของไตโรคนิ่วทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย [23-25] ในบรรดาสารที่เป็นประโยชน์เหล่านี้ มีรายงานบางฉบับแนะนำว่าไดออสมินอาจป้องกันการสะสมของผลึก CaOx ภายในเนื้อเยื่อไตในแบบจำลองสัตว์ [26,27] อย่างไรก็ตาม ยังไม่ได้ตรวจสอบบทบาทการปรับที่แม่นยำ (การยับยั้งหรือการส่งเสริม) และกลไก (ขั้นตอนหรือกระบวนการสร้างหิน) ในการเกิดนิ่วในไต COM การศึกษาในปัจจุบันจึงประเมินผลของ .อย่างเป็นระบบไดออสมิน(ที่ 2.5–160 นาโนโมลาร์) ในระยะต่างๆ ของไตกระบวนการสร้างหิน รวมถึงการตกผลึก การเจริญเติบโตของผลึก การรวมตัว การยึดเกาะของเซลล์คริสตัล การฝังตัวในเซลล์ท่อไต และการบุกรุกผ่าน ECM
คลิกเพื่อปริมาณ Cistanche tubulosa สำหรับการทำงานของไต
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. การเตรียมไดออสมิน
ไดออสมิน(อุตสาหกรรมเคมีของโตเกียว; โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ถูกละลายด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) 100 เปอร์เซ็นต์ (ซิกมา-อัลดริช; เซนต์หลุยส์, มิสซูรี) และส่วนย่อยที่ใช้งานได้ถูกสร้างขึ้นที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 และ 160 นาโนโมลาร์สำหรับการตรวจสอบผลกระทบต่อผลึก COM นอกจากนี้ DMSO 100 เปอร์เซ็นต์ยังถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบในการทดลองทั้งหมด
2.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์
MDCK renal tubular epithelial cell line ได้มาจากส่วนปลายของท่อไต (ATCC; Manassas, VA) แพร่กระจายในสื่อจำเป็นขั้นต่ำของ Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ fetal bovine serum (FBS) 60 U/ml เพนิซิลลิน G (Sigma-Aldrich) และ 60 ug/ml streptomycin (Sigma-Aldrich) เซลล์ถูกคงรักษาไว้ในตู้ฟักที่มีความชื้นด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 ◦C
2.3. การทดสอบการตกผลึก COM
การตกผลึก COM ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [28,29] โดยย่อ 500 ul ของ 10 mM CaCl2⋅2H2O ในบัฟเฟอร์การตกผลึก (ที่มี 10 mM Tris-HCl และ 90 mM NaCl) (pH 7.4) ถูกเติมในแต่ละหลุมของจานหลุม 24-หลุม (Corning Inc.; Corning, นิวยอร์ก) ปริมาตรที่เท่ากัน (4 ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (ตัวควบคุมว่าง), DMSO (ตัวควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 หรือ 160 นาโนโมลาร์) ถูกผสมกับ CaCl2 ในที่สุด 500 ul ของ 1.0 mM Na2C2O4 ในบัฟเฟอร์การตกผลึกถูกเติมเพื่อทำให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ CaCl2 และ Na2C2O4 เป็น 5 mM และ 0.5 mM ตามลำดับ ของผสมถูกบ่มที่ 25 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และจากนั้นตรวจสอบ ภาพคริสตัลถูกจับแบบสุ่มจากทุ่งพลังงานสูง (HPF) อย่างน้อย 15 แห่งภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสงคอนทราสต์แบบกลับด้านของ Nikon Eclipse Ti-S (นิคอน โตเกียว ญี่ปุ่น) ขนาดและจำนวนคริสตัลถูกวัดจากอย่างน้อย 15 HPF สำหรับแต่ละตัวอย่างโดยใช้ซอฟต์แวร์ NIS Element D เวอร์ชัน 4.11 (Nikon) มวลคริสตัลคำนวณจากอย่างน้อย 100 คริสตัลใน 15 HPFs โดยใช้สูตรต่อไปนี้: มวลคริสตัล (µm2/HPF)=ขนาดคริสตัลเฉลี่ยในแต่ละฟิลด์ (µm2) × จำนวนคริสตัลในแต่ละฟิลด์ (/HPF) ( 1)
2.4. COM การทดสอบการเจริญเติบโตของผลึก
การทดสอบการเจริญเติบโตของผลึกได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [30,31]
โดยสังเขป ปริมาตรที่เท่ากัน (500 ul) ของ 10 mM CaCl2⋅2H2O และ 1.0 mM Na2C2O4 ในบัฟเฟอร์การตกผลึกถูกผสม (1:1) (v/v) ในแต่ละหลุมของ { {12}}จานหลุม ของผสมถูกบ่มที่ 25 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้เกิดการตกผลึกอย่างสมบูรณ์ ณ จุดนี้ (T0) ปริมาตรที่เท่ากัน (4 ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (ตัวควบคุมว่าง), DMSO (ตัวควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 หรือ 160 นาโนโมลาร์) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและของผสมถูกบ่มเพิ่มเติมเป็นเวลา 60 นาที (T60) ที่ T0 และ T60 ภาพคริสตัลถูกจับแบบสุ่มจาก HPF อย่างน้อย 15 ตัวภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสงคอนทราสต์แบบกลับด้านของ Nikon Eclipse Ti-S ขนาดคริสตัลที่ T0 และ T60 ถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ NIS Element D เวอร์ชัน 4.11 (Nikon) ในขณะที่การเติบโตของคริสตัล (แสดงโดย Δ ขนาดคริสตัล) คำนวณจากอย่างน้อย 100 คริสตัลใน 15 HPF โดยใช้สูตรต่อไปนี้: Δ ขนาดคริสตัล (µm2)=ขนาดคริสตัลที่ T60 - ขนาดคริสตัลที่ T0 (2)
2.5. การทดสอบการรวมคริสตัล COM
การสอบวิเคราะห์การรวมตัวของคริสตัลถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [32,33] ผลึก COM ถูกสร้างขึ้นตามที่กล่าวไว้ข้างต้นในการสอบวิเคราะห์การเจริญของผลึก แต่ด้วยปริมาตรที่ใหญ่กว่าในหลอดรูปกรวยขนาด 50-มล. (Corning Inc.) จากนั้นจึงเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2,000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้ง ในขณะที่ผลึก COM ถูกล้างด้วยเมทานอลสามครั้ง หลังจากการปั่นเหวี่ยงอีกครั้งที่ 2000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที เมทานอลถูกทิ้งและผลึกถูกทำให้แห้งด้วยอากาศข้ามคืนที่ 25 ◦C ผลึก COM (น้ำหนักแห้ง 1,000 ไมโครกรัม) ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การตกผลึก 1 มิลลิลิตรในแต่ละหลุมของจานหลุม 6-หลุม (Corning Inc.) ปริมาตรที่เท่ากัน (4 ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (ตัวควบคุมว่าง), DMSO (ตัวควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 หรือ 160 นาโนโมลาร์) ถูกเติมลงในสารแขวนลอยคริสตัล COM ในแต่ละหลุม จานถูกเขย่าอย่างต่อเนื่องในตู้ฟักไข่แบบเขย่า (Zhicheng; Shanghai, China) ที่ 150 รอบต่อนาที และ 25 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงทำการตรวจสอบและถ่ายภาพการก่อตัวของผลึก COM ที่รวมเข้าด้วยกัน (หมายถึง "การประกอบของผลึก COM เดี่ยวตั้งแต่สามชิ้นขึ้นไปที่เชื่อมติดกันอย่างแน่นหนา" [32]) ถูกตรวจสอบและถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้เฟสคอนทราสต์แบบกลับด้านของ Nikon Eclipse Ti-S จำนวนของการรวมผลึก COM ถูกนับจาก HPF แบบสุ่มอย่างน้อย 15 ตัวต่อหลุม
2.6. COM การทดสอบการยึดเกาะเซลล์คริสตัล
การสอบวิเคราะห์การยึดเกาะของเซลล์คริสตัลได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [34,35] โดยสังเขป ผลึก COM ถูกสร้างขึ้นตามที่กล่าวไว้ข้างต้นในหลอดรูปกรวยขนาด 50-มล. และจากนั้นเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 กรัม เป็นเวลา 5 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้ง ในขณะที่ผลึก COM ถูกล้างด้วยเมทานอลสามครั้ง หลังจากการปั่นเหวี่ยงอีกครั้งที่ 2000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที เมทานอลถูกทิ้งและผลึกถูกทำให้แห้งด้วยอากาศข้ามคืนที่ 25 ◦C คริสตัลถูกกำจัดการปนเปื้อนด้วยรังสีอัลตราไวโอเลตเป็นเวลา 30 นาทีก่อนการแทรกแซงกับเซลล์
เซลล์ MDCK (ที่ความหนาแน่น 2 × 105 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะและเติบโตในแต่ละหลุมของเพลต 6-หลุม (Corning Inc.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อให้ได้โมโนเลเยอร์ที่ไหลมารวมกัน จากนั้นจึงรีเฟรชอาหารเลี้ยงเชื้อก่อนที่จะเติมผลึก COM (ผลึกน้ำหนักแห้ง 100 ไมโครกรัมต่ออาหารเลี้ยงเชื้อมิลลิลิตร) ปริมาตรที่เท่ากัน (4 ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (ตัวควบคุมว่าง), DMSO (ตัวควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 หรือ 160 นาโนโมลาร์) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม เซลล์ถูกบ่มเพิ่มเติมในตู้อบที่มีความชื้นด้วย 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างอย่างแรงด้วย PBS ห้าครั้ง และถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้เฟสคอนทราสต์แบบกลับด้านของ Nikon Eclipse Ti-S จำนวนผลึก COM ที่เหลืออยู่ที่เกาะบนพื้นผิวเซลล์ท่อไตถูกนับจากฟิลด์สุ่มอย่างน้อย 15 ฟิลด์ต่อหลุม
Cistanche สำหรับการทำงานของไต
2.7. การทดสอบการทำให้เป็นผลึกภายในของ COM
ผลึก COM ที่ติดฉลากเรืองแสงถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [36,37] องค์ประกอบ/ความเข้มข้นของสารเคมีที่ใช้สำหรับการตกผลึกเหมือนกันกับที่กล่าวไว้ข้างต้นสำหรับผลึกธรรมดา (ที่ไม่ได้ติดฉลาก) แต่ 0.1 ไมโครกรัม/มล. ฟลูออเรสซีน ไอโซไทโอไซยาเนต (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) คือ เติมลงในสารละลาย CaCl2⋅2H2O ก่อนผสมกับ Na2C2O4 ขั้นตอนที่ตามมา (การตกผลึกและการเก็บเกี่ยว) ได้ดำเนินการตามที่กล่าวไว้ข้างต้น แต่ในที่มืด
ในการประเมินการฝังภายในของผลึกเข้าไปในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต เซลล์ MDCK (ที่ความหนาแน่น 2 ×105 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะและเติบโตในแต่ละหลุมของ6-แผ่นหลุม (Corning Inc.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อให้ได้มา โมโนเลเยอร์มาบรรจบกัน โมโนเลเยอร์ของเซลล์ถูกบ่มด้วยผลึก COM ที่ติดฉลาก FITC (ตัวกลางแบบคริสตัล/มล. 1000 ไมโครกรัม) ในตู้อบที่มีความชื้น 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 ◦ซ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และบ่มด้วยสารละลายทริปซิน-EDTA เพื่อกำจัดผลึกที่ไม่อยู่ภายใน (ทั้งแบบเกาะติดและไม่เกาะติดกัน) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีผลึกภายในถูกหาปริมาณจากเหตุการณ์ที่ได้มาทั้งหมด 10,000 เหตุการณ์โดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA) เซลล์ที่ฟักตัวด้วยคริสตัล COM ธรรมดา (ที่ไม่มีป้ายกำกับ) ถูกใช้เพื่อตั้งค่าสัญญาณรบกวนและขีดจำกัดล่วงหน้าสำหรับสัญญาณเรืองแสงที่เป็นบวก จากนั้นจึงนับเซลล์ที่มีสัญญาณเรืองแสงเป็นบวกและใช้สำหรับการคำนวณเปอร์เซ็นต์ดังกล่าว
2.8. COM คริสตัลบุกผ่าน ECM assay
ผลึก COM ถูกเตรียมตามที่บรรยายไว้ข้างต้นสำหรับการสอบวิเคราะห์การรวมตัวของผลึกและการยึดติดของเซลล์คริสตัล การทดสอบการบุกรุกของคริสตัลได้ดำเนินการตามโปรโตคอลที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ [38,39] โดยสังเขป ผลึก COM ทั้งหมด 20 µg เคลือบด้วยบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ), อัลบูมิน (Sigma-Aldrich) (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) หรือไดออสมิน(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 หรือ 160 นาโนโมลาร์) ถูกเติมเข้าไปใน 200 ul MEM ต่อมา Lys-plasminogen 200 ul ของ 0.3 pM (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) ใน PBS ถูกผสมและบ่มด้วยสารเชิงซ้อนของผลึก-โปรตีนที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง พลาสมิโนเจนที่ไม่ถูกจับถูกทิ้งโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 กรัม เป็นเวลา 5 นาที และล้างเม็ดด้วย PBS หนึ่งครั้ง หลังจากนั้น 100 ul ของ 0.15 pM urokinase plasminogen activator (uPA) (Fitzgerald Industries International) ใน PBS ถูกผสมกับคริสตัล-โปรตีน-พลาสมิโนเจน/พลาสมินคอมเพล็กซ์ จากนั้นจึงเติมของผสมที่ด้านบนของเมทริกซ์เจลภายในห้องการย้ายถิ่น ECM และบ่มที่ 37 ◦C หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24-ชม. สารละลายยังคงอยู่ที่ส่วนบนของห้องอพยพโดยการใช้ผ้าก๊อซหรือกระดาษทิชชู่ จากนั้นจึงถ่ายภาพผลึก COM ที่บุกรุกภายในเมทริกซ์เจลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่มีโหมดดิฟเฟอเรนเชียลรบกวนคอนทราสต์ (DIC) (Nikon H600L) ระยะการบุกรุกของผลึกถูกวัดและหาค่าเฉลี่ยจากสนามพลังงานต่ำ (LPF) อย่างน้อย 15 แห่งภายในห้องเดียวกันโดยใช้ซอฟต์แวร์ NIS Element D เวอร์ชัน 4.11 (Nikon)
2.9. การวิเคราะห์ทางสถิติ
การทดลองทั้งหมดข้างต้นทำขึ้นเป็นสามเท่า (การทดลองอิสระสามครั้ง) และข้อมูลเชิงปริมาณถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย± SEM การเปรียบเทียบหลายรายการดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) กับการทดสอบหลังเฉพาะกิจของทูคีย์ ทำการทดสอบสหสัมพันธ์เพียร์สันเพื่อกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างตัวแปร การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 18) (IBM SPSS; Armonk, NY) ค่า P ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
3. ผลลัพธ์
3.1. ผลของไดออสมินต่อการตกผลึก COM
การตกผลึกเป็นหนึ่งในขั้นตอนแรกที่สำคัญของไตกระบวนการสร้างหินทุกประเภท หลังการตกผลึก 1-ชม. โดยมีหรือไม่มีไดออสมินที่ความเข้มข้นต่างๆ (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 หรือ 160 nM) ขนาดและจำนวนคริสตัล COM ถูกวัดและคำนวณมวลคริสตัล บัฟเฟอร์การตกผลึกและ DMSO ที่เจือจางทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมว่างและค่าลบ ตามลำดับ ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าขนาดยาทั้งหมด (2.5–160 nM) ของ disomin ลดขนาดคริสตัลลงอย่างมีนัยสำคัญ แต่เพิ่มจำนวนคริสตัลในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมว่างและกลุ่มควบคุมเชิงลบ (รูปที่ 1A–1C) สอดคล้องกับจำนวนผลึก มวลผลึกเพิ่มขึ้นตามขนาดยา (รูปที่ 1D) โดยรวม ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าไดออสมินส่งเสริมการตกผลึก COM (นีโอคริสตัล)
3.2. ผลของไดออสมินต่อการเติบโตของผลึก COM
ผลมอดูเลตของไดออสมินการเจริญเติบโตของผลึก COM ได้รับการประเมินโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงในขนาดคริสตัล (ขนาดคริสตัล Δ) หลังจากการบ่มเพิ่มเติมอีก 60- นาทีหลังจากเสร็จสิ้นขั้นตอนการตกผลึกเริ่มต้น เมื่อไม่มีผลึกนีโอคริสตัล ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าขนาดยาทั้งหมด (2.5–160 นาโนโมลาร์) ของไดโซมินลดขนาดคริสตัล Δ อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่าและค่าลบ (รูปที่ 2) การค้นพบนี้บ่งชี้ว่าไดออสมินยับยั้งการเจริญเติบโตของผลึก COM
3.3. ผลของไดออสมินต่อการรวมตัวของผลึก COM
นอกจากการเติบโตของคริสตัลแล้ว การรวมตัวของผลึกแต่ละชิ้นที่เกาะติดกันเป็นขั้นตอนที่สำคัญอีกขั้นหนึ่งในระหว่างไตการเกิดโรคของหิน การรวมตัวของผลึกในระดับสูงอาจนำไปสู่การขยายตัวของหินและการอุดตันของลูเมนของท่อไตขนาดเล็ก เปรียบเทียบกับการควบคุมที่ว่างเปล่าและเชิงลบไดออสมินที่ 10–160 นาโนโมลาร์เพิ่มจำนวนของผลึก COM ที่รวมเข้าด้วยกัน (รูปที่ 3) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า diosmin ส่งเสริมการรวมคริสตัล COM
Cistanche สำหรับการทำงานของไต
3.4. ผลของไดออสมินต่อการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล COM
การเก็บรักษาผลึกเชิงสาเหตุเป็นหนึ่งในขั้นตอนสำคัญสำหรับไตการก่อตัวของหินและสามารถเกิดขึ้นได้จากการยึดเกาะของเซลล์คริสตัลที่ป้องกันไม่ให้ผลึกหลุดออกพร้อมกับปัสสาวะไหลออก เราจึงประเมินกิจกรรมมอดูเลตของไดออสมินในการยึดเกาะเซลล์คริสตัล COM ข้อมูลเปิดเผยว่าไดออสมินที่ 5-160 นาโนโมลาร์ลดความสามารถในการยึดติดของผลึก COM บนเซลล์ท่อไตในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่าและเชิงลบ (รูปที่ 4) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าไดออสมินยับยั้งการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล COM
3.5. ผลของไดออสมินต่อการสร้างผลึกภายใน COM ต่อเซลล์ท่อไต
หลังจากการยึดเกาะ ผลึก COM บางส่วนสามารถถูกฝังเข้าไปในเซลล์ท่อไตและทำให้เกิดการตอบสนองของเซลล์ตามมาหลายครั้ง [37,40] การฝังภายในของคริสตัลถูกประเมินโดยใช้ผลึก COM ที่ติดฉลาก FITC และหาปริมาณโดยโฟลว์ไซโตเมทรี คริสตัล COM ธรรมดา (ไม่มีการติดฉลาก) ถูกใช้เพื่อลบสัญญาณรบกวนทางเทคนิค และเพื่อให้แน่ใจว่าความเข้มของการเรืองแสงมาจากสัญญาณ FITC เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมว่างและกลุ่มควบคุมเชิงลบ เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีผลึกภายในลดลงอย่างมีนัยสำคัญไดออสมินที่ 10–160 นาโนโมลาร์ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 5) ผลการวิจัยระบุว่า disomin ยับยั้ง COM crystal internalization ในเซลล์ท่อไต
3.6. ผลของไดออสมินต่อการบุกรุกของผลึก COM ผ่านECM
การบุกรุกของผลึกผ่าน ECM เป็นกระบวนการที่ทำให้เกิดโรค/ทำลายล้างในระหว่างไตการเกิดโรคของหินที่สามารถกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบและน้ำตกต่างๆ ซึ่งจะทำให้กลไกการเกิดโรคแย่ลง เราตรวจสอบปรากฏการณ์นี้โดยใช้โปรโตคอลที่กำหนดไว้ตามกิจกรรมของพลาสมิโนเจน-พลาสมินของคอมเพล็กซ์โปรตีนคริสตัล [38,39] ผลการวิจัยพบว่า disomin ทุกขนาด (2.5–160nM) ช่วยเพิ่มการบุกรุกของผลึก COM ผ่าน ECM ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6) ที่น่าสนใจคือไดออสมินที่ 160nM สามารถส่งเสริมการบุกรุกคริสตัล COM ได้เทียบเท่ากับอัลบูมินซึ่งเป็นโปรโมเตอร์ที่มีศักยภาพที่รู้จักสำหรับการบุกรุกคริสตัล COM [41] (รูปที่ 6) (รูปที่ 6) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า diosmin ส่งเสริมการบุกรุกคริสตัล COM ผ่าน ECM อย่างมาก
มะเดื่อ 1. ผลกระทบของไดออสมินเกี่ยวกับการตกผลึก COM การสอบวิเคราะห์การตกผลึกถูกดำเนินการด้วยปริมาตรที่เท่ากัน (4ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน (2.5–160 นาโนโมลาร์) (A): สัณฐานวิทยาของผลึกในแต่ละสภาวะหลังจากการตกผลึก 1-ชม. กำลังขยายเดิมคือ 400 เท่าสำหรับแผงทั้งหมด (B): ขนาดคริสตัล. (C): ตัวเลขคริสตัล (D): มวลผลึก (ดูสูตร 1 ใน "วัสดุและวิธีการ") ถูกวิเคราะห์จากอย่างน้อย 100 คริสตัลใน 15 HPFs แต่ละแถบแสดงค่าเฉลี่ย ±SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
มะเดื่อ 2. ผลกระทบของไดออสมินเกี่ยวกับการเติบโตของคริสตัล COM การสอบวิเคราะห์การโตของผลึกถูกดำเนินการหลังจากการตกผลึกเสร็จสมบูรณ์ (เพื่อป้องกันการเกิดผลึกใหม่) ด้วยปริมาตรที่เท่ากัน (4ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน (2.5–160nM) (A): สัณฐานวิทยาของผลึกในแต่ละสภาวะที่ T0 และ T60 กำลังขยายดั้งเดิมคือ 400 × สำหรับทุกแผง (B)-(J): ฮิสโตแกรมของขนาดคริสตัลที่วัดจากผลึกเดี่ยวที่ T0 และ T60 ในแต่ละกลุ่ม (K): Δขนาดคริสตัล (ดูสูตร 2 ใน "วัสดุและวิธีการ") วิเคราะห์จากอย่างน้อย 100 คริสตัลใน 15 HPFs แต่ละแท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *= p < 0.05="" เทียบกับการควบคุมที่ว่างเปล่า="" #="p">< 0.05="" เทียบกับ="">
มะเดื่อ 3. ผลกระทบของไดออสมินเกี่ยวกับการรวมคริสตัล COM การสอบวิเคราะห์การรวมตัวของผลึกถูกดำเนินการด้วยปริมาตรที่เท่ากัน (4ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน (2.5–160 นาโนโมลาร์) (A): ไมโครกราฟของผลึก COM ที่รวมเข้าด้วยกัน (ติดป้ายกำกับด้วยวงกลมประ) กำลังขยายเดิมคือ 400 ×สำหรับทุกแผง (B): จำนวนของผลึกมวลรวมถูกนับจาก HPF สุ่มอย่างน้อย 15 ตัวในแต่ละหลุม แต่ละแท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
มะเดื่อ 4. ผลกระทบของไดออสมินในการยึดเกาะเซลล์คริสตัล COM การสอบวิเคราะห์การยึดติดของเซลล์คริสตัลถูกดำเนินการด้วยปริมาตรที่เท่ากัน (4ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน (2.5–160 นาโนโมลาร์) (A): ภาพไมโครกราฟของผลึกที่เหลือซึ่งเกาะติดแน่นบนโมโนเลเยอร์ของเซลล์หลังจากขจัดผลึกที่ไม่ถูกผูกออกด้วยการล้างอย่างแรงด้วย PBS กำลังขยายดั้งเดิมคือ 200 × สำหรับทุกแผง (B): จำนวนของคริสตัลที่ยึดเกาะถูกนับจากอย่างน้อย 15 ฟิลด์สุ่มในแต่ละหลุม แต่ละแถบแสดงค่าเฉลี่ย ±SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
มะเดื่อ 5. ผลกระทบของไดออสมินในการทำให้ผลึกภายใน COM เข้าสู่เซลล์ท่อไต การทดสอบการฝังภายในของคริสตัลดำเนินการโดยใช้คริสตัล COM ที่ติดฉลาก FITC (FITC-COM) ในขณะที่คริสตัล COM ธรรมดา (ที่ไม่มีป้ายกำกับ) ใช้สำหรับการลบพื้นหลัง/สัญญาณรบกวน การสอบวิเคราะห์ถูกดำเนินการด้วยปริมาตรที่เท่ากัน (4ul) ของบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมว่าง), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) หรือไดออสมิน (2.5–160นาโนโมลาร์) (A): การวิเคราะห์โฟลว์ cytometric dot-plot ของขนาด (แกน y) และความเข้มของการเรืองแสง FITC (แกน x) ของเซลล์หลังจากขจัดผลึกที่ไม่ใช่ภายในที่มีทริปซิน 0.1 เปอร์เซ็นต์/2.5 มิลลิโมลาร์ EDTA (B): เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีผลึก COM ที่ติดฉลาก FITC ภายใน แต่ละแท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *= p<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
มะเดื่อ 6. ผลกระทบของไดออสมินในการบุกคริสตัล COM ผ่าน ECM การบุกรุกของผลึกผ่านการสอบวิเคราะห์ ECM ดำเนินการโดยใช้ผลึก COM ที่เคลือบด้วยบัฟเฟอร์การตกผลึก (กลุ่มควบคุมเปล่า), DMSO (กลุ่มควบคุมเชิงลบ), อัลบูมิน (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) หรือไดออสมิน (2.5–160 นาโนโมลาร์) (A): ไมโครกราฟของผลึก COM ที่บุกรุกหรือย้ายผ่านห้องอพยพ ECM กำลังขยายดั้งเดิมคือ 100 × สำหรับทุกแผง (B): ระยะการบุกรุกของคริสตัลถูกวัดจาก LPF สุ่มอย่างน้อย 15 ตัวในแต่ละห้อง แต่ละแถบแสดงค่าเฉลี่ย ±SEM ของข้อมูลที่ได้จากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. การอภิปราย
โรคนิ่วในไต เกิดจากการก่อตัวของนิ่วในไตไตและระบบอุ้งเชิงกราน กระบวนการสร้างนิ่วในไตที่พบบ่อย ได้แก่ การตกผลึก COM การเจริญเติบโต การรวมตัว การคงอยู่โดยการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล และการบุกรุกผ่านคั่นระหว่างไตที่อุดมไปด้วย ECM [21,22] มีการพยายามป้องกันโรคนี้หลายครั้งโดยใช้ยาและ/หรืออาหารเสริมที่หลากหลาย หลักฐานล่าสุดหลายบรรทัดรายงานว่าฟลาโวนอยด์ ฟลาโวนไกลโคไซด์ และสารประกอบอื่นๆ ที่สกัดจากผลส้มอาจมีผลในการป้องกันโรคนิ่วในไตและความผิดปกติอื่นๆ [23-25] กลุ่มคนเหล่านี้,ไดออสมิน, สารฟลาโวนไกลโคไซด์ธรรมชาติและอนุพันธ์ของเฮสเพอริดินที่พบในผลไม้เช่นมะนาวเป็นหลัก [1,2] ได้รับการแนะนำว่ามีบทบาทในการป้องกันการบาดเจ็บและความเสียหายของไตเนื้อเยื่อ [13,42]. นอกจากนี้ยังมีรายงานบทบาทต่อต้านโรคนิ่วในท่อไตในการศึกษาก่อนหน้านี้สองสามเรื่องโดยใช้แบบจำลองสัตว์ [26,27] อย่างไรก็ตาม ประโยชน์และกลไกพื้นฐานของไดออสมินในการป้องกันนิ่วในไตยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้นเราจึงตรวจสอบกิจกรรมการมอดูเลตของไดออสมินบนผลึก COM ทำการวิเคราะห์อย่างเป็นระบบในขั้นตอนต่างๆ ของCOMไตการก่อตัวของหิน รวมถึงการตกผลึก การเติบโตของผลึก การรวมตัว การยึดเกาะของเซลล์คริสตัล การฝังตัวเข้าไปในเซลล์ท่อไต และการบุกรุกผ่าน ECM
หลังรับประทานไดออสมินระดับพลาสม่าในมนุษย์อยู่ในช่วงตั้งแต่ {{0}}.5 ถึง 200ng/ml (หรือ 0.8–300nM) [43,44] ความเข้มข้นในพลาสมาสูงสุด (Cmax) อยู่ที่ประมาณ 50ng/ml (หรือ 85nM) [43,44] ดังนั้น ขนาดยาของไดออสมินที่ใช้ในการศึกษาปัจจุบันของเรา (2.5–160 นาโนโมลาร์) จึงอยู่ในช่วงที่เกี่ยวข้องทางเภสัชวิทยาสำหรับเภสัชจลนศาสตร์ของมัน เนื่องจาก DMSO ถูกใช้เป็นตัวเจือจางเพื่อละลายไดออสมินอย่างสมบูรณ์ตามคำแนะนำ DMSO จึงถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบในการศึกษานี้นอกเหนือจากการควบคุมที่ว่างเปล่าเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีผลกระทบจากตัวเจือจางเองที่อาจรบกวนการตีความข้อมูล ในการสอบวิเคราะห์ทั้งหมด ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าไม่มีผลกระทบที่มีนัยสำคัญจาก DMSO ที่สังเกตพบและข้อมูลเชิงปริมาณทั้งหมดที่ได้รับจากกลุ่มควบคุมเชิงลบสามารถเปรียบเทียบได้กับกลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่า
การทดสอบการตกผลึกของ COM พบว่าความเข้มข้นทั้งหมดของไดออสมิน(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 และ 160nM) สามารถลดขนาดคริสตัล COM ได้ แต่ในทางกลับกัน เพิ่มจำนวนคริสตัล เนื่องจากมวลคริสตัลเป็นผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของทั้งขนาดและจำนวนผลึก และมีความเกี่ยวข้องมากกว่าในการสะท้อนระดับของการตกผลึก COM เราจึงประเมินว่าไดออสมินส่งผลต่อดัชนีคริสตัลนี้หรือไม่ ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของไดออสมินทั้งหมดมีผลต่อมวลผลึก COM ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลเกี่ยวกับจำนวนคริสตัล หลังจากการตกผลึก ผลึก COM สามารถเติบโตต่อไปในขนาดที่ใหญ่ขึ้นสำหรับขั้นตอนต่อไปของไตการก่อตัวของหิน
ตรงกันข้ามกับการตกผลึก ไดออสมินที่ความเข้มข้นทั้งหมดแสดงผลการยับยั้งการเติบโตของผลึก COM ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา งานวิจัยก่อนหน้านี้บางชิ้นรายงานว่าความสามารถในการละลายของผลึก CaOx สามารถเพิ่มขึ้นได้ด้วยอนุพันธ์ของไฮดรอกซีแอนทราควิโนนที่มีไกลโคซิเลชัน [45] นอกจากนี้ การปรากฏตัวของน้ำตาลในสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพดังกล่าวสามารถจับกับแคลเซียมไอออนอิสระ ซึ่งอาจเนื่องมาจากกลุ่มไฮดรอกซิลในโครงสร้างโมเลกุล ดังนั้นจึงยับยั้งการก่อตัวของผลึก CaOx [45,46] ไดออสมินยังอาจส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมและออกซาเลตไอออนที่ละลายได้เป็นอนุภาคผลึก COM ในน้ำท่อไตในกระบวนการตกผลึก COM ตามกลไกนี้
อย่างไรก็ตาม การรวมคริสตัล COM ได้รับการส่งเสริมโดย 10–160nMไดออสมินซึ่งแสดงนัยถึงความสามารถของไดออสมินในการทำหน้าที่เป็นตัวเชื่อมโยงหรือโมเลกุลของสารยึดติดสำหรับการสรรหาผลึกแต่ละอันมาผูกเข้าด้วยกันเพื่อก่อรูปมวลรวมของผลึก การผูกนี้ยังส่งผลให้เกิดการลุกลามของสะพานกาวระหว่างผลึกแต่ละชิ้น และสามารถกระตุ้นการสร้างโครงสร้างขนาดใหญ่ของผลึก COM ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดการสะสมของหินไนดัสภายในไต[32].
การกักเก็บผลึก COM ผ่านการยึดเกาะของผลึกบนพื้นผิวเซลล์ท่อไตถือเป็นอีกก้าวที่สำคัญสำหรับการก่อตัวของนิ่วในไต [47] ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าไดออสมินสามารถลดความสามารถในการยึดติดของผลึก COM ในการจับกับพื้นผิวปลายของเซลล์ท่อไต MDCK การศึกษาก่อนหน้านี้บางชิ้นแสดงให้เห็นว่าไกลโคซามิโนไกลแคน (สารประกอบโพลีแซ็กคาไรด์) เคลือบบนผลึก CaOx หรือแสดงออกบนเซลล์ท่อไตสามารถรบกวนความสามารถในการยึดเกาะของผลึก CaOx บนเซลล์ท่อไต [48] นอกจากนี้ การแสดงออกของตัวรับคริสตัลบนเซลล์ท่อไตเป็นหนึ่งในกลไกสำคัญที่กำหนดการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล [21] ในขณะที่ผลึก CaOx ทำให้เกิดการบาดเจ็บของเยื่อหุ้มปลาย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง microvilli โพลีฟีนอลบางชนิด เช่น epigallocatechin gallate (EGCG) สามารถป้องกันการยึดเกาะของเซลล์คริสตัลและการบาดเจ็บของเซลล์ได้ [49] นอกจากนี้ ก่อนหน้านี้มีรายงานสารฟลาโวนอยด์ในสารสกัดจากพืชหลายชนิดเพื่อเพิ่มระดับ pH ในปัสสาวะ ซึ่งนำไปสู่การยับยั้งการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล [50,51] บางที,ไดออสมินอาจลดทอนการบาดเจ็บของเซลล์ดังกล่าวที่เกิดจาก COM ซึ่งจะช่วยลดการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล
การฝังภายในของผลึก COM ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าส่วนใหญ่เกิดจากเอนโดไซโทซิสผ่านทางวิถีแมคโครพิโนไซโตซิสที่อาศัยโครงร่างโครงร่างเซลล์โดยอาศัยแอคติน [40] มีรายงานว่าสารฟลาโวนอยด์ เช่น เควอซิทินส่งผลต่อโครงร่างโครงร่างของแอกตินที่จำเป็นสำหรับแมคโครพิโนไซโตซิส [52,53] การค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่าไดออสมินลดความสามารถของเซลล์ MDCK ในการทำให้ผลึก COM อยู่ภายใน ผลการยับยั้งดังกล่าวของไดออสมินอาจเกี่ยวข้องกับการประกอบหรือการจัดโครงสร้างโครงร่างโครงร่างของแอคตินภายในเซลล์ที่ส่งผลโดยตรงต่อวิถีแมคโครพิโนไซโตซิส [54,55]
หลังจากการทำให้อยู่ภายใน ผลึก COM ถูกย่อยสลายโดยเอนโดลีโซโซมส่งผลให้มีแคลเซียมและออกซาเลตไอออนอิสระเพิ่มขึ้นในคั่นระหว่างไต [37] การเพิ่มขึ้นของแคลเซียมและออกซาเลตไอออนดังกล่าวสามารถนำไปสู่การเกิดผลึกใหม่ COM ในช่องระหว่างไต [56,57] นอกจากนี้ การปรากฏตัวของผลึก COM คั่นระหว่างหน้าอาจมาจากข้อบกพร่องของรอยต่อที่แน่นหนาและอุปสรรคการยึดเกาะแบบพาราเซล ส่งผลให้มีการซึมผ่านของพาราเซลเพิ่มขึ้นและการโยกย้ายคริสตัล [58–60] คริสตัลเหล่านี้สามารถบุกรุก interstitium ของไตผ่าน ECM และต่อมาทำให้เกิดการตอบสนองต่อการอักเสบและความเสียหายของเนื้อเยื่อ [58–60] ในการศึกษานี้ เราสังเกตว่าการบุกรุกของผลึก COM ผ่านห้องการย้ายถิ่นของ ECM นั้นเกิดจากความเข้มข้นของไดออสมินทั้งหมด Diosmin อาจจับกับพื้นผิวคริสตัล COM และมีปฏิสัมพันธ์กับระบบ plasminogen-plasmin ที่ขับเคลื่อนการอพยพของผลึกในห้องอพยพ ECM [38,39]
Cistanche สำหรับไต
เพราะไดออสมินกระตุ้นทั้งการยับยั้งและส่งเสริมผลกระทบในกระบวนการต่างๆ ของการก่อตัวของหิน COM เราจึงกำหนดความสัมพันธ์โดยใช้การทดสอบสหสัมพันธ์ของเพียร์สัน การวิเคราะห์สหสัมพันธ์เปิดเผยว่าจำนวนคริสตัลมีความสัมพันธ์ผกผันกับทั้งขนาดคริสตัลและการเติบโตของผลึก (Δ ขนาดคริสตัล) (รูปที่ 7A และ B) ขนาดคริสตัลมีความสัมพันธ์อย่างมากกับการเติบโตของผลึก (รูปที่ 7C) แต่มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับมวลคริสตัล (รูปที่ 7D) สุดท้าย มวลคริสตัลมีความสัมพันธ์อย่างมากกับทั้งจำนวนคริสตัลและการรวมตัวของผลึก (รูปที่ 7E และ F) จากการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ ข้อมูลระบุว่าจำนวนผลึกและมวลผลึกมีความเกี่ยวข้องมากกว่าในการสะท้อนการตกผลึกมากกว่าขนาดผลึก (รูปที่ 7A, D และ E) นอกจากนี้ ขนาดของผลึกนีโอคริสตัลในระหว่างการตกผลึกนั้นสัมพันธ์กับการเติบโตของผลึกพรีฟอร์ม (รูปที่ 7C) ในขณะที่ระดับการตกผลึก (ตามที่สะท้อนด้วยจำนวนผลึกและมวลผลึก) มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับระดับการรวมตัวของผลึก (รูปที่ 7E และ ฉ). อย่างไรก็ตาม ความสัมพันธ์เหล่านี้มักจะเฉพาะเจาะจงกับผลกระทบของไดออสมิน ในขณะที่ผลกระทบจากโมดูเลเตอร์อื่นๆ อาจมีหรือไม่มีความสัมพันธ์เหมือนกัน ตัวอย่างเช่น ไฟโบรเนกตินลดมวลผลึกและยับยั้งการเติบโตของผลึก แต่ส่งเสริมการรวมตัวของผลึก [31] นอกจากนี้ Escherichia coli ที่ยังคงสภาพสมบูรณ์ยังเพิ่มขนาดและมวลของคริสตัล แต่ไม่มีผลต่อจำนวนคริสตัล [33] ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าความสัมพันธ์ระหว่างการทดสอบคริสตัล COM ต่างๆ ไม่เป็นสากลสำหรับโมดูเลเตอร์ทั้งหมด
สุดท้าย เราได้สรุปผลที่ได้จากการทดสอบต่างๆ และรวมเข้ากับกลไกการก่อโรคของไตโรคหิน (ดูแผนผังในรูปที่ 8) จากการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ diosmin ส่งเสริมการตกผลึก (รูปที่ 8A) ระหว่างการตกผลึกและการเติบโตของผลึกไดออสมินรักษาสมดุลที่ดีโดยส่งเสริมการตกผลึก แต่ในทางกลับกัน ยับยั้งการเติบโตของผลึก (รูปที่ 8B) เกี่ยวกับผลกระทบทั้งหมดต่อผลึก COM เพียงอย่างเดียว (โดยไม่คำนึงถึงเซลล์และ ECM ที่แทรกแซงด้วย) กิจกรรมส่งเสริมของไดออสมินมีความโดดเด่นมากกว่าการยับยั้งบนผลึก COM เนื่องจากส่งเสริมทั้งการตกผลึกและการรวมตัวของผลึก แต่ยับยั้งเฉพาะการเติบโตของผลึก ( มะเดื่อ 8C) แม้ว่าการตกผลึกจะเพิ่มขึ้น แต่ขนาดของผลึกจะลดลงและสัมพันธ์กับการยับยั้งการเจริญเติบโต (รูปที่ 7C) ข้อมูลนี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ที่รายงานโดย Kavanagh et al [61–63] แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของการตกผลึกนำไปสู่การลดลงของความอิ่มตัวยิ่งยวดของแคลเซียมและออกซาเลตไอออนในสารละลาย ซึ่งส่งผลให้การเจริญเติบโตลดลง อย่างไรก็ตาม การเติบโตของผลึกไม่ใช่ปัจจัยเดียวที่กำหนดไตการเกิดโรคของหิน [64] โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมวลคริสตัลล้นและเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของการรวมตัวของผลึก (รูปที่ 7F) ที่สามารถเพิ่มโอกาสที่วัสดุคริสตัลจะติดอยู่ในส่วนท่อขนาดเล็ก (ในสมมติฐานภายใน) จึงเพิ่มขึ้น โอกาสที่จะเกิดหิน นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงข้อมูลที่สอดคล้องกับการค้นพบของเรา ซึ่งบ่งชี้ว่าการเพิ่มจำนวนคริสตัลเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของการรวมตัวของผลึกและการขยายตัวของหิน [63]
มะเดื่อ 7. การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ (A)–(F): สหสัมพันธ์ระหว่างหมายเลขคริสตัล COM ขนาดคริสตัล Δ ขนาดคริสตัล มวลคริสตัล และมวลรวมคริสตัลจำนวนหนึ่งถูกวิเคราะห์โดยการทดสอบสหสัมพันธ์แบบเพียร์สัน.
มะเดื่อ 8. แผนผังสรุปผลการปรับของไดออสมินบน COMไตกระบวนการสร้างหิน (A): ผลของไดออสมินต่อการตกผลึก COM (B): ผลของไดออสมินต่อการตกผลึก COM และการเติบโตของผลึก (C): ผลกระทบของไดออสมินต่อการตกผลึกของ COM การเติบโตและการรวมกลุ่ม (D): ผลของไดออสมินต่อกระบวนการสร้างนิ่วในไต COM ทั้งหมด
เมื่อพิจารณาถึงปฏิสัมพันธ์กับเซลล์ท่อไตและ ECM ภาพรวมของผลกระทบคู่ของไดออสมินการก่อตัวของนิ่วในไต COM จะชัดเจนขึ้นมาก (รูปที่ 8D) Diosmin ยับยั้งการยึดเกาะของเซลล์คริสตัล ซึ่งจะช่วยลดการเคลื่อนภายในของผลึกเข้าไปในเซลล์ สิ่งนี้สามารถอธิบายได้ว่าผลึก COM ที่มีขนาดเล็กกว่านั้นมีความสามารถในการยึดเกาะกับเซลล์ท่อไตน้อยกว่าเมื่อเทียบกับเซลล์ที่ใหญ่กว่าตามที่รายงานในการศึกษาล่าสุดของเรา [34] และการศึกษาก่อนหน้าโดยกลุ่มอื่น [65] ความสามารถในการยึดเกาะที่น้อยลงของผลึก COM ที่มีขนาดเล็กกว่านั้นเกิดจากแรงยึดเกาะที่น้อยกว่าของพวกมันกับพื้นผิวเซลล์และจำนวนตัวรับคริสตัล COM ที่ผูกติดกับพวกมันน้อยลงตามที่กำหนดโดยกล้องจุลทรรศน์กำลังอะตอมและการวิเคราะห์โปรตีโอมตามลำดับ [34] Diosmin ยังยับยั้งการฝังภายในของผลึก โปรดทราบว่ากระบวนการทำให้เป็นภายในเป็นดาบสองคมที่ต้องการการตีความอย่างระมัดระวัง การทำให้เป็นภายในหรือเอนโดไซโทซิสในกลไกการป้องกันอย่างหนึ่งที่เซลล์ใช้ในการกำจัดผลึกโดยเอนโดไลโซโซม อย่างไรก็ตาม การเสื่อมสลายของผลึกที่ไม่บุบสลายจะสร้างแคลเซียมและออกซาเลตไอออนอิสระที่สามารถย้ายจากส่วนภายในเซลล์ไปยังคั่นระหว่างไต ซึ่งสามารถสร้างนีโอคริสตัลได้ [56,57] ในทางกลับกัน diosmin ส่งเสริมการบุกรุกของผลึกผ่าน ECM ซึ่งเป็นหนึ่งในกลไกที่สำคัญสำหรับการเกิดโรคนิ่วในไต (โดยเฉพาะในแบบจำลองแผ่นโลหะของ Randall) [58–60] โดยรวม รูปที่ 8D สรุปผลการปรับสองทางของไดออสมินบนCOMไตกระบวนการสร้างหิน ควรสังเกตว่าความสมดุลของผลกระทบที่ส่งเสริมและยับยั้งเหล่านี้ไม่สามารถคำนวณได้อย่างแม่นยำ (ต่างจากสมการทางคณิตศาสตร์) นอกจากนี้ยังมีปัจจัยภายนอกและปัจจัยภายนอกอีกหลายอย่างที่สามารถแทรกแซงกระบวนการก่อหินได้ ในที่สุด ไดออสมินยังแสดงผลทางอ้อมหลายอย่างต่อการก่อตัวของนิ่วในไต ซึ่งรวมถึงคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ [5,6] ที่ควรนำมาพิจารณาด้วย ดังนั้น ผลลัพธ์สุดท้ายของผลมอดูเลเตอร์คู่ของไดออสมินบน COMไตการก่อตัวของหินจำเป็นต้องเพิ่มเติมในการตรวจสอบร่างกายและการศึกษาในอนาคตกลุ่มใหญ่
5. สรุปผลการวิจัย
โดยสรุป เรารายงานในที่นี้ถึงผลกระทบคู่ของไดออสมินต่อการมอดูเลตคริสตัล COM ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ในขณะที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของผลึก COM การยึดเกาะของเซลล์คริสตัล และการทำให้อยู่ภายในเซลล์ท่อไตไดออสมินส่งเสริมการตกผลึก การรวมกลุ่ม และการบุกรุกของ COM ผ่าน ECM ดังนั้นบทบาทในการต่อต้านโรคนิ่วในไตจึงเป็นที่น่าสงสัยและควรระมัดระวังในการใช้ในโรคนิ่วในไต
คำแถลงผลงานการประพันธ์ CRediT
สุภาภรณ์ คำชื่น: Conceptualization, Methodology, Software, Validation, Formal analysis, Investigation, Data Curation, Writing – original draft, Visualization, Sunisa Yoodee: Conceptualization, Methodology, Software, Validation, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing – original draft, Visualization, เยี่ยมชม ทองบุญเกิด: Conceptualization, Methodology, Software, Validation, Resources, Writing – review & edit, Supervision, Project administrator, Funding Acquisition.
แถลงการณ์ความขัดแย้งทางผลประโยชน์
ผู้เขียนประกาศไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
รับทราบ
ขอขอบคุณสำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิคของกิตติยา สุวรรณากุด งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากสำนักงานคณะกรรมการนโยบายการวิจัยและนวัตกรรมวิทยาศาสตร์การอุดมศึกษาแห่งชาติ (NXPO) ผ่าน PMU-B และกองทุนสนับสนุนการวิจัยประเทศไทย (IRN60W0004) VT ยังได้รับการสนับสนุนจากทุน "เฉลิมพระเกียรติ" คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล
อ้างอิง
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,ไดออสมิน– เทคนิคการแยก การกำหนดในวัสดุพืชและสูตรยา และการใช้ทางคลินิก, นัท แยง. คอมมูนิตี้ 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, การเผาผลาญและกิจกรรมทางเภสัชวิทยาของ diosmin สารที่เป็นประโยชน์ต่อสุขภาพตามธรรมชาติ, Food Funct 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: การประเมินผลกระทบต่อคุณภาพชีวิตในภาวะหลอดเลือดดำไม่เพียงพอเรื้อรัง, Angiology 57 (2006) 131–138
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, เศษฟลาโวนอยด์บริสุทธิ์ Micronised: การทบทวนการใช้งานในภาวะหลอดเลือดดำไม่เพียงพอเรื้อรัง, แผลในหลอดเลือดดำและริดสีดวงทวาร, ยา 63 (2003) 71–100
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflammatory, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้าน apoptotic ของ diosmin ในโรคลำไส้ใหญ่บวมเป็นแผลที่เกิดจากกรดอะซิติก, Hum ประสบการณ์ ท็อกซิคอล 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin ยับยั้งผู้ไกล่เกลี่ย proinflammatory ในมาโครฟาจ RAW264.7 ที่เกิดจาก lipopolysaccharide ผ่านเส้นทางสัญญาณ NF-kappaB และ MAPK, Gen. Physiol ชีวฟิสิกส์ 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin กระตุ้นการตายของเซลล์โดยการมอดูเลตของ STAT-3 การส่งสัญญาณใน 7,12 dimethylbenz (a) anthracene ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการก่อมะเร็งที่กระพุ้งแก้ม, Biomed เภสัช. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, การชราภาพที่เกิดจาก Diosmin, apoptosis และ autophagy ในเซลล์มะเร็งเต้านมที่มีสถานะ p53 ต่างกันและกิจกรรม ERK, Toxicol เลตต์. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, การรวมกันของยาไดออสมินที่นำกลับมาใช้ใหม่กับกรดอะม็อกซีซิลลิน - คลาวูลานิกทำให้เกิดการยับยั้งการเจริญของมัยโคแบคทีเรีย, Sci. ตัวแทน 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, ฤทธิ์ลดน้ำตาลในเลือดของ diosmin ซึ่งเป็นฟลาโวนอยด์จากส้ม ถูกเหนี่ยวนำผ่าน beta-endorphin ภายนอกในหนูที่เป็นเบาหวานชนิดที่ 1 Clin ประสบการณ์ เภสัช. ฟิสิออล 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,ไดออสมินการปรับสภาพก่อนปรับปรุงการทำงานของหัวใจและยับยั้งความเครียดออกซิเดชันในหัวใจของหนูหลังจากขาดเลือด/กลับเป็นเลือด, Eur. เจ. ฟาร์ม. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin ปกป้องเรตินาของหนูจากการบาดเจ็บที่ขาดเลือด / การกลับเป็นซ้ำ, J. Ocul เภสัช. เธอ. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, ผลการป้องกันของ hesperidin และ diosmin ต่อตับที่เกิดจากอะคริลาไมด์, ไต, และความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของสมองในหนู สภาพแวดล้อม วิทย์. มลพิษ ความละเอียด อินเตอร์ 26 (2019) 35151–35162.
[14] ค. ทองประยูร, AE Krambeck, AD Rule, การกำหนดภาระที่แท้จริงของไตโรคหิน, แนท. รายได้ Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. ดูแล 47 (2020) 661–671
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, นิ่วในไต, แอน คลินิก Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, องค์ประกอบของหินและการกลายเป็นปูนในหลอดเลือดในผู้ป่วยโรคไตอักเสบ, J. Nephrol 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, การวิเคราะห์หิน, Urol. ความละเอียด 34 (2549) 146–150.
[19] อ. วินัยพัทธ์, ส. อัลลักษณสุวรรณ, เจ. มณีศร, ส. สุทธิเมธากรณ์, วี. ทองบุญเกิด, การตอบสนองของเซลล์ท่อไตต่อชนิดและปริมาณของผลึกแคลเซียมออกซาเลต: การวิเคราะห์เครือข่ายโปรตีโอมแบบบูรณาการและการตรวจสอบการทำงาน, โปรตีโอมิกส์ 17 (2017 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, การวิเคราะห์เครือข่ายโปรตีนและการศึกษาการทำงานของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากผลึกแคลเซียมออกซาเลตในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต, Proteomics 18 (2018), 1800008
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nephrolithiasis: กลไกระดับโมเลกุลของการเกิดนิ่วในไตและบทบาทที่สำคัญของ modulators, Biomed ความละเอียด อินเตอร์ 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, กลไกการก่อหิน, Clin. รายได้ คนขุดแร่กระดูก. เมตาบ 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, บทบาทการป้องกันของ flavonoids และสารสกัดจากพืชที่อุดมด้วยฟลาโวนอยด์เพื่อต่อต้าน urolithiasis: บทวิจารณ์, Crit. รายได้วิทยาศาสตร์อาหาร. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, พืชอาหารสำหรับการป้องกันและจัดการไตหิน: หลักฐานทางคลินิกและพรีคลินิกและกลไกระดับโมเลกุล, Int. เจ โมล. วิทย์. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, ความเข้าใจเชิงกลไกของโพลีฟีนอลในการบรรเทาแคลเซียมออกซาเลต urolithiasis, Biomed เภสัช. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, การประเมินผลการป้องกันของ diosmin (ฟลาโวนอยด์ส้ม) ใน urolithiasis ที่เกิดจากสารเคมีในหนูทดลอง, Pharm. ไบโอล. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,ไดออสมินลดการสะสมแคลเซียมออกซาเลตและการเสื่อมสภาพของเนื้อเยื่อในไตอักเสบในหนู: การศึกษาสเตอริโอ, เกาหลี J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] ว. ทองบุญเกิด, ต.เสมังเงิน, ส.ชุติพงศ์ธเนท, ปัจจัยกำหนดประเภทและสัณฐานวิทยาของผลึกแคลเซียมออกซาเลต: ความเข้มข้นของโมล, บัฟเฟอร์, ค่า pH, การกวนและอุณหภูมิ, คลินิก. ชิม. แอคตา 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, การวิเคราะห์โปรตีโอมิกของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากผลึกแคลเซียมออกซาเลตโมโนไฮเดรตในเซลล์ท่อไตส่วนปลาย, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] ป. อมิมานันท์, ร. ทวิชกรตระกูล, คุณ ฟองเงิน, ป. ศรีเบญจลักซ์, อ. ลุลิตานนท์, ว. ประสงค์วัฒนา, ค. วงษ์คำ, ป. บุญศิริ, WJ Umka, V. ทองบุญเกิด, ปัจจัยการยืดตัว Tu บน Escherichia coli ที่แยกได้จากปัสสาวะของผู้ป่วยนิ่วในไตส่งเสริมการเจริญเติบโตและการรวมตัวของผลึกแคลเซียมออกซาเลต Sci. ตัวแทน 7 (2017) 2953
[31] ส. คำชุน, คุณ ศึกษิดิ์, ส. ชัยฤทธิ์, วี. ทองบุญเกิด, Modulatory effects of fibronectin ต่อการตกผลึกของแคลเซียมออกซาเลต, การเจริญเติบโต, การรวมกลุ่ม, การยึดเกาะบนเซลล์ท่อไต, และการบุกรุกผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์, เจ. ไบโอล. อินทร์. เคมี. 24 (2019) 235–246.
[32] ส. ชัยฤทธิ์, ว. ทองบุญเกิด, การกำหนดและการวิเคราะห์อย่างเป็นระบบของดัชนีการรวมกลุ่มเพื่อประเมินระดับของการรวมตัวของผลึกแคลเซียมออกซาเลต, ด้านหน้า. เคมี. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum รับผิดชอบในการส่งเสริมผลกระทบของ Escherichia coli ที่ทำงานได้ต่อการตกผลึกแคลเซียมออกซาเลต, การเติบโตของผลึก, และการรวมตัวของผลึก, Front. ไมโครไบโอล 10 (2019) 2507.
[34] ป. พีรเพ็ญ, ว. ทองบุญเกิด, Differential bound proteins and adhesive ability of calcium oxalate monohydrate crystals with various sizes, Int. เจ. ไบโอล. แมคโครโมล 163 (2020) 2210–2223.
[35] คุณฟองเงิน, คุณ ศึกษิษฐ์, ว. ทองบุญเกิด, โปรตีนช็อตความร้อนพื้นผิว 90 ทำหน้าที่เป็นตัวรับที่มีศักยภาพสำหรับผลึกแคลเซียมออกซาเลตบนเยื่อหุ้มปลายของเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต, เจ. ไบโอล. อินทร์. เคมี. 21 (2016) 463–474.
[36] ส. ชัยฤทธิ์, ส. มังดี, ว. ทองบุญเกิด, การติดฉลากปลอดสารกัมมันตภาพรังสีของผลึกแคลเซียมออกซาเลตสำหรับการตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างเซลล์คริสตัลและการสร้างภายใน, ทวารหนัก. วิธีที่ 2 (2010) 1536–1541
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Calcium oxalate monohydrate crystals ที่ถูกฝังเข้าไปในเซลล์ท่อไตจะถูกย่อยสลายและละลายโดย endolysosomes, Chem. ไบโอล. มีปฏิสัมพันธ์. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, การทดสอบนวนิยายเพื่อประเมินผลการส่งเสริมของโปรตีนต่อการบุกรุกผลึกแคลเซียมออกซาเลตผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์ตามกิจกรรม plasminogen/plasmin, Talanta 101 (2012) 240–245
[39] ว. วชิรเชียงจง, วี. ทองบุญเกิด, ผลึกแคลเซียมออกซาเลตเพิ่มการหลั่งอีโนเลส-1จากเซลล์ท่อไตซึ่งต่อมาได้เพิ่มการบุกรุกของคริสตัลและโมโนไซต์ผ่านคั่นระหว่างไต, Sci. ตัวแทน. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Macropinocytosis เป็นกลไกสำคัญในการ endocytosis ของผลึกแคลเซียมออกซาเลตเข้าสู่เซลล์ท่อไต Cell Biochem. ชีวฟิสิกส์ 67 (2013) 1171–1179.
[41] ส. ศัสนารักษ์กิจ, ป. พีระเพ็ญ, วี. ทองบุญเกิด, StoneMod: ฐานข้อมูลสำหรับไตโปรตีนมอดูเลตริกจากหินที่มีหลักฐานการทดลอง, วิทย์. ตัวแทน 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, ผลของไดออสมินต่อความเสียหายของตับและไตที่เกิดจากอะฟลาทอกซิน, สิ่งแวดล้อม วิทย์. มลพิษ ความละเอียด อินเตอร์ 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, การดูดซึมเปรียบเทียบของสองไดออสมินสูตรหลังการบริหารช่องปากให้กับอาสาสมัครสุขภาพดี โมเลกุล 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, เภสัชจลนศาสตร์ของ flavanone glycosides หลังจากการกลืนกินน้ำส้มคั้นสดครั้งเดียวเทียบกับน้ำส้มที่แปรรูปในเชิงพาณิชย์ในมนุษย์ที่มีสุขภาพดี J. Agric . เคมีอาหาร. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, การสังเคราะห์อนุพันธ์ไกลโคไซด์ของไฮดรอกซีแอนทราควิโนนที่มีความสามารถในการละลายและยับยั้งการก่อตัวของผลึกแคลเซียมออกซาเลต สารประกอบที่มีศักยภาพในการบำบัดด้วยนิ่วในไต, Eur. เจ เมด เคมี. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, การศึกษาครีมที่ใช้ myo-inositol hexaphosphate-based เพื่อป้องกันไม่ให้ dystrophic calcinosis cutis, Br. เจ. เดอร์มาทอล. 152 (2005) 1022–1025.
[47] ว. ทองบุญเกิด, Proteomics ของปฏิกิริยาระหว่างเซลล์คริสตัล: แบบจำลองสำหรับการวิจัยนิ่วในไต, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, การรักษาผลึกในโรคนิ่วในไต: บทบาทที่สำคัญสำหรับ glycosaminoglycan hyaluronan? แยม. ซ. เนฟรอล 17 (2549) 1673–1687.
[49] คุณฟองเงิน, อ. วินัยพัทธ์, วี. ทองบุญเกิด, การบาดเจ็บของไมโครวิลลาร์ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตที่เกิดจากผลึกแคลเซียมออกซาเลตและบทบาทการป้องกันของอีพิกัลโลคาเทชิน-3-แกลเลต, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, ฟลาโวนอยด์ทั้งหมดของ Desmodium styracifolium ลดทอนการก่อตัวของไฮดรอกซี- แคลเซียมออกซาเลต urolithiasis ที่เกิดจากแอล- โพรลีนในหนูแรท Urolithiasis 46 (2018) 231–241
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, การประเมินอย่างเป็นระบบสำหรับผลกระทบของ pH ของปัสสาวะต่อการตกผลึกของแคลเซียมออกซาเลต ตัวแทน 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhibitive effect on phagocytosis of Candida albicans ที่เหนี่ยวนำโดยการปรับสภาพด้วย quercetin ผ่านการรบกวนของ actin cytoskeleton, J. Tradit คาง. เมดิ. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin ยับยั้งการโยกย้ายมาโครฟาจที่เกิดจาก LPS โดยการยับยั้งวิถี iNOS/FAK/paxillin และปรับโครงร่างโครงร่าง, Cell Adhes . อพยพ 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Macropinocytosis-mediated membrane การรีไซเคิลเมมเบรนทำให้เกิดการโยกย้ายยอดประสาทโดยส่ง F- แอคตินกับลาเมลิโพเดียม, Proc. นัท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 117 (2020) 27400–27411
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, RapGEF GflB ที่จับกับ F-actin เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ macropinocytosis ที่มีประสิทธิภาพใน Dictyostelium, J. Cell Sci 130 (2017) 3158–3172.
[56] ก. ข่าน ความชุก กลไกทางพยาธิสรีรวิทยาและปัจจัยที่มีผลต่อโรคนิ่วในไต ยูรอล เนฟรอล 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, กลไกของการเกิดนิ่วในไตของมนุษย์, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32
[58] ส. ชัยฤทธิ์, ว. ทองบุญเกิด, ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียและไตโรคหินด้านหน้า ฟิสิออล 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan ลักษณะทางเนื้อเยื่อวิทยาของแบบจำลอง "อนุภาคคงที่" ของการก่อตัวของหิน: การศึกษาในสัตว์, Urolithiasis 45 (2017) 75–87
[60] VY Bird, SR Khan, หินก่อตัวอย่างไร? การรวมทฤษฎีเกี่ยวกับการก่อตัวของหินเป็นไปได้หรือไม่? โค้ง. อีสป. ยูรอล 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Methods for the study of calcium oxalate crystallisation และการประยุกต์ใช้กับการวิจัย urolithiasis, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704 อภิปราย 704-5
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, จลนพลศาสตร์การตกผลึกของแคลเซียมออกซาเลตที่ความเข้มข้นต่างกันของปัสสาวะมนุษย์และปัสสาวะเทียม โดยมีอัตราส่วนแคลเซียมต่อออกซาเลตคงที่ Urol ความละเอียด 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, crystalluria และการรวมกลุ่ม: ส่วนผสมหลักสำหรับการขยายหิน Urol ความละเอียด 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, วิศวกรรมย้อนกลับของไต: การสร้างแบบจำลองแคลเซียมออกซาเลตโมโนไฮเดรตตกผลึกในเนฟรอน, Med. ไบโอล. อังกฤษ คอมพิวเตอร์. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, ผลของ intracrystalline และ osteopontin ที่จับกับพื้นผิวต่อการยึดติดของผลึกแคลเซียมออกซาเลตไดไฮเดรตกับเซลล์ไตสุนัข Madin-Darby (MDCK) ในปัสสาวะของมนุษย์ที่ผ่านการกรองด้วยอัลตราซาวด์ BJU Int 109 (2012) 1100–1109.
