Cyclopentanone ออกแรงต่อต้านการสร้างเม็ดสีและต่อต้านริ้วรอยใน B16F10 Melanoma

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2,Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 และ Hyung Ryong Moon 1, 2,*

เชิงนามธรรม:การได้รับรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) เป็นสาเหตุหลักของความชราของผิวภายนอก ซึ่งส่งผลให้เกิดรอยดำและรอยย่นของผิวหนัง ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบผลของการฟอกสีฟัน (2E,5E)-2,5-bis(3-ไฮดรอกซี-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP) ต่อมะเร็งผิวหนัง B16F10 และสารต้าน กิจกรรมริ้วรอยบนเซลล์ไฟโบรบลาสต์ Hs27 พบว่า BHCP สามารถยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสได้ โดยมีค่าความเข้มข้นการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ (IC50) เท่ากับ 1.10 ไมโครโมลาร์ และ 8.18 ไมโครโมลาร์ของฟอร์มาโคฟีโนเลต (แอล-ไทโรซีน) และไดฟีโนเลส (L-DOPA) และจากการศึกษาจลนศาสตร์ของเอนไซม์พบว่า BHCP เป็นตัวยับยั้งไทโรซิเนสประเภทแข่งขัน . นอกจากนี้ BHCP ยังยับยั้งปริมาณเมลานินและการทำงานของไทโรซิเนสของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ และลดระดับของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการถอดรหัสไมโครพทาลเมีย (MITF) ระดับฟอสโฟรีเลตของโปรตีน cAMP ที่มีผลผูกพัน (CREB) และไทโรซิเนสใน - ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH) เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 นอกจากนี้ BHCP ยังยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นของ p65 และการแสดงออกของเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน (MMP-1, MMP-9, MMP-12 และ MMP-13) ในไฟโบรบลาสต์ Hs27 กระตุ้นด้วยรังสียูวี ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า BHCP อาจเป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับการพัฒนายารักษาโรคสำหรับโรคที่เกี่ยวข้องกับรอยดำและรอยย่น

คำสำคัญ: (2E,5E)-2,5-ทวิ(3-ไฮดรอกซี-4-เมทอกซีเบนซิลิดีน)ไซโคลเพนทาโนน (BHCP); สารยับยั้งไทโรซิเนสต่อต้านการสร้างเม็ดสี; ต่อต้านริ้วรอย

Cistanche คือต่อต้านริ้วรอย

1. บทนำ

ริ้วรอยแห่งวัยของผิวเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนและก้าวหน้าซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงการทำงานและความสวยงามของผิว โดยปัจจัยทั้งภายในและภายนอกมีหน้าที่รับผิดชอบ [1] ความชราของผิวภายนอกนั้นเกิดจากการรุกรานของสิ่งแวดล้อม เช่น รังสีอัลตราไวโอเลต (UV) ความเครียด หรือการสูบบุหรี่ อย่างไรก็ตาม สาเหตุหลักมาจากการได้รับรังสียูวีจากแสงแดดซ้ำๆ ซึ่งเรียกว่าการถ่ายภาพ การเสื่อมสภาพของผิวหนังมีลักษณะเป็นริ้วรอยที่หยาบและลึก ความหนา ความหยาบ ความหมองคล้ำ และการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อ [2–4]

ไทโรซิเนส (EC 1.14.18.1) ซึ่งเรียกอีกอย่างว่าโพลีฟีนอลออกซิเดสเป็นหนึ่งในเอ็นไซม์ที่ประกอบด้วยทองแดงหลายฟังก์ชันที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์เมลานินและพบได้ทั่วไปในธรรมชาติ [5] ไทโรซิเนสมักพบในจุลินทรีย์ส่วนใหญ่ พืช และสัตว์ ในพืช ไทโรซิเนสทำหน้าที่โดยออกซิไดซ์โมโนฟีนอลเป็นไดฟีนอล (กิจกรรมไมโคฟีโนเลต) และเกี่ยวข้องกับการออกซิเดชันของโอ-ไดฟีนอลไปเป็นโอ-ควิโนน (กิจกรรมไดฟีโนเลส) ตามด้วยการออกซิเดชันของควิโนนให้เป็นเม็ดสีสีน้ำตาลเข้ม [6]

การสร้างเมลาโนเจเนซิสคือการเปลี่ยนแปลงของแอล-ไทโรซีนเป็น 34-ไดไฮดรอกซีฟีนิลอะลานีน (L-DOPA) โดยที่ L-DOPA จะถูกแปลงเป็น DOPA ควินิน [7] ดังนั้น ไทโรซิเนสจึงมีบทบาทสำคัญในการผลิตเมลานินในเมลาโนไซต์ และการยับยั้งไทโรซิเนสจึงเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับการปรับปรุงความผิดปกติของเม็ดสีและการพัฒนาสารฟอกสีฟัน [8,9] การสังเคราะห์เมลานินเกิดขึ้นจากสิ่งเร้าหลายอย่าง เช่น รังสียูวีและสารเคมี ซึ่งรวมถึงไอโซบิวทิลเมทิลแซนทีน (IBMX) และฮอร์โมนกระตุ้นอัลฟา-เมลาโนไซต์ ( -MSH) -MSH จับกับตัวรับ melanocortin 1 ตัวรับ (MC1R) ซึ่งต่อมาเพิ่มระดับไซโตพลาสซึมไซคลิก AMP (cAMP) ระดับแคมป์ที่เพิ่มขึ้นจะกระตุ้นโปรตีนไคเนส A (PKA) ซึ่งกระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) ผ่านฟอสโฟรีเลชันของโปรตีนที่จับกับแคมป์ (CREB) MITF กระตุ้นการแสดงออกของไทโรซิเนส โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส (TRP)-1 และ TRP-2 ซึ่งท้ายที่สุดส่งผลให้มีการสังเคราะห์เมลานินเพิ่มขึ้น [10] MITF ถือเป็นปัจจัยการถอดรหัสคีย์ของการสร้างเม็ดสี ดังนั้นจึงมีการศึกษาจำนวนมากเพื่อควบคุมการแสดงออกของ MITF เพื่อยับยั้งการสร้างเม็ดสี [11]

เป็นที่ทราบกันดีว่าการก่อตัวของริ้วรอยมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเสื่อมสภาพของ extracellularmatrix ของผิวหนัง และรังสี UV กระตุ้นปัจจัยนิวเคลียร์ - κB (NF-κB) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มการผลิตของการกระจายตัวของคอลลาเจนและเมทริกซ์ metalloproteinases (MMPs) [2] MMPs เอนโดเปปไทเดสที่ขึ้นกับ arezinc ซึ่งมีความสำคัญในการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเมทริกซ์นอกเซลล์ในผิวหนัง ดังนั้น การเสื่อมสภาพมากเกินไปของคอลลาเจนและเมทริกซ์โดย MMP ที่เกิดจากรังสียูวีจึงเป็นลักษณะเฉพาะของผิวที่ถูกทำร้ายด้วยแสง และ MMPs ถูกใช้เป็นเครื่องหมายหลักของการเกิดริ้วรอยจากแสงยูวีและการอักเสบของผิวหนัง [12]

อนุพันธ์ของโครงกระดูกคล้ายเคอร์คูมินไดอาริลเฮปตานอยด์รวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระ รายงานต้านมะเร็ง กิจกรรมนั่งร้าน รวมทั้ง (2E,5E)-2,5-ทวิ (3-ไฮดรอกซี-4-เมทอกซีเบนซิลิดีน)ไซโคลเพนทาโนน (BHCP) (รูปที่ 1),เพื่อแสดงฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต่อต้านการสร้างเม็ดสี โดยเฉพาะ Leow et al. [19] รายงานใน bioactivities, and anti-tyrosinase [13–18]dibenzylidene-cyclopentanone 2014 ที่อาจส่งผลต่อการป้องกันโรคกระดูกพรุนของมนุษย์ผ่านการควบคุมของ Wnt/ -cateninsignaling pathway อย่างไรก็ตาม การต่อต้านการสร้างเม็ดสีและการต่อต้านริ้วรอยของ BHCP ยังคงถูกค้นพบ และกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้กิจกรรมของ BHCP ยังไม่ได้รับการยืนยันอย่างชัดเจน

รูปที่ 1. โครงสร้างของ (2E,5E)-bis(3-ไฮดรอกซี-4-เมทอกซีเบนซิลิดีน)ไซโคลเพนทาโนน (BHCP)

ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบการต่อต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสและศักยภาพในการต่อต้านริ้วรอยของ BHCP และพยายามระบุกลไกที่เกี่ยวข้อง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในส่วนที่เกี่ยวกับเนื้อหาเมลานินและการทำงานของไทโรซิเนสของเซลล์ ซึ่งสำรวจโดยใช้การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนสและการวิเคราะห์จลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นว่า BHCP มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีและริ้วรอยที่เกี่ยวข้องกับการลด CREB/MITF/tyrosinase ในเซลล์มะเร็งผิวหนังของหนูเมาส์ B16F10 ที่เหนี่ยวนำให้เกิด -MSH และการยับยั้งฟอสโฟรีเลชันของ p65 และการแสดงออกของ MMP ในไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ Hs27 ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสียูวี

สมุนไพรมังกร cistanche

2. ผลลัพธ์และการอภิปราย

2.1. การสังเคราะห์ (2E,5E)-2,5-ทวิ(3-ไฮดรอกซี-4-เมทอกซีเบนซิลิดีน)ไซโคลเพนทาโนน (BHCP)

สารละลายของ {{0}}ไฮดรอกซี-4-เมทอกซีเบนซาลดีไฮด์ (100 มก., 0.66 มิลลิโมล, ไอโซวานิลลิน) และไซโคลเพนทาโนน (0.03 มล., 0.33 มิลลิโมล) ในสารละลายกรด HCl-อะซิติก 1 นิวตัน (0.02 มล.) ถูกกวนผสมที่ 25 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากยืนเป็นเวลา 1 วัน ส่วนผสมของปฏิกิริยาถูกบำบัดด้วยน้ำเย็นโดยมีเมทานอลจำนวนเล็กน้อย กรองและล้างด้วยน้ำเย็นเพื่อผลิต BHCP (65.9 มก.) ให้ได้ผลผลิต 56.9 เปอร์เซ็นต์ BHCP ถูกระบุโดยวิธีสเปกโทรสโกปี ซึ่งรวมถึง 1H และ 13C-NMR รวมทั้งโดยการเปรียบเทียบกับข้อมูลสเปกตรัมที่เผยแพร่และการวิเคราะห์โครมาโตกราฟีแบบบาง (TLC) [19] โครงสร้างแสดงในรูปที่ 1

BHCP: ผงอสัณฐานสีเหลือง (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.25 (s, 2H, 2 × OH),7.28(s,2H,2×vinylicH), 7.14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H),7.01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3.81 (s, 6H, 2 × OMe), 3.01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26.6; ESI-MS: m/z 351 (M – H)–

2.2. ผลการยับยั้งของ BHCP ต่อกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ด

ตามที่แสดงในตารางที่ 1 BHCP ยับยั้งไทโรซิเนสด้วยค่า IC50 ที่ 1.10 ± 0.12 μMand 8.18 ± 0.44 μM ในขณะที่กรดโคจิก (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) มีค่า IC50 ที่ 18.68 ± 1.40 μMand 33.89 ± 1.16 ไมโครโมลาร์สำหรับโมโนฟีโนเลสและไดฟีโนเลสตามลำดับ ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวกับสารยับยั้งศักยภาพการสังเคราะห์ของไทโรซิเนส เราพบกลไกผ่านการศึกษาแบบจำลองระดับโมเลกุลโดยที่กลุ่มเบนซิลิดีน 3-ไฮดรอกซีและ4-เมทอกซีของเบนซิลิดีนมีแนวโน้มที่จะผูกมัดอย่างมากต่อไซต์ที่ทำงานของไทโรซิเนส [20] จากผลการศึกษานี้ แสดงให้เห็นว่ากลุ่มฟังก์ชัน (3-กลุ่มไฮดรอกซีและ 4-กลุ่มเมทอกซี) สัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนส

ตารางที่ 1. กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสและการวิเคราะห์จลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ของ BHCP

นอกจากนี้ ยังได้ศึกษากลไกที่รับผิดชอบในการยับยั้งไทโรซิเนสโดย BHCP การวิเคราะห์ไบน์ไซม์ไคเนติกในการศึกษานี้ (ตารางที่ 1 และรูปที่ 2) วาดแผนผัง Lineweaver–Burk โดยใช้ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาจลนศาสตร์ และได้ค่าคงที่การยับยั้ง (Ki) จากแปลง Dixon แผนผังซึ่งกันและกันของ Lineweaver–Burk บ่งชี้ถึงการยับยั้งประเภทการแข่งขัน ดังแสดงในรูปที่ 2a–c BHCP ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งการแข่งขันของทั้ง L-tyrosine และ L-DOPA นอกจากนี้ การสกัดกั้นบนแกน x ของแปลง Dixon นั้นเป็นเรื่องปกติ ใช้เพื่อกำหนดประเภทค่าคงที่การยับยั้งเอนไซม์ (Ki) สำหรับสารเชิงซ้อนของเอนไซม์-ตัวยับยั้ง [21,22] โดยที่ค่าของแกน x ระบุค่าของ −Ki ตามที่แสดงในรูปที่ 2b–d ค่า Ki ของ BHCP เท่ากับ 1.7 µM และ 10.5 µM เป็นสารตั้งต้นสำหรับ L-tyrosine และ L-DOPA ตามลำดับ เนื่องจากค่า Ki แสดงถึงความเข้มข้นที่จำเป็นในการสร้างสารเชิงซ้อนของเอ็นไซม์-ตัวยับยั้ง ค่า Ki ที่ต่ำกว่าจึงบ่งชี้ว่าการยับยั้งไทโรซิเนสมีประสิทธิภาพมากกว่า

รูปที่ 2 แผนผัง Lineweaver–Burk (a,c) และ Dixon (b,d) สำหรับการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสโดย BHCP

2.3. ผลของ BHCP ต่อความมีชีวิตของเซลล์ B16F10 เมลาโนมาและเซลล์ไฟโบรบลาสต์ Hs27

ก่อนพิจารณาว่า BHCP ออกฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีและต่อต้านริ้วรอยหรือไม่ เราได้ตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของเซลล์ BHCP ถึง B16F10 และเซลล์ Hs27 โดยการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ BHCP สำหรับช่วงเวลาที่ต่างกัน และวัดความมีชีวิตของเซลล์ด้วยการทดสอบ EZ-Cytox ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3a,b มากถึง 10 ไมโครโมลาร์ของ BHCP เป็นเวลา 48 ชั่วโมงไม่ลดการอยู่รอดของเซลล์ B16F10 หรือเซลล์ Hs27 อย่างใดอย่างหนึ่ง ต่อจากนั้น การศึกษาในหลอดทดลองเพิ่มเติมเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีและการต่อต้านริ้วรอยของ BHCP ได้ดำเนินการกับ 1, 5 และ 10 ไมโครโมลาร์

2.4. การยับยั้ง BHCP ต่อเนื้อหาเมลานินและการทำงานของเซลล์ไทโรซิเนสในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10

เพื่อตรวจสอบว่า BHCP มีศักยภาพในการยับยั้งปริมาณเมลานินของเซลล์ B16F10 ที่เหนี่ยวนำโดย MSH หรือไม่ เซลล์จะถูกปรับสภาพก่อนด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันที่ระบุ (1, 5 และ 10 ไมโครโมลาร์) ของ BHCP หรือกรดโคจิก (5 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงกระตุ้น ด้วย -MSH เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ดังที่แสดงในรูปที่ 4a ปริมาณเมลานินในเซลล์ที่บำบัดด้วย BHCP ต่อหน้า -MSH ลดลงในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น ซึ่งแสดง 113 เปอร์เซ็นต์ที่ 1 ไมโครโมลาร์ 106 เปอร์เซ็นต์ ที่ 5 ไมโครโมลาร์ และ 102 เปอร์เซ็นต์ที่ 10 ไมโครโมลาร์ เมื่อเปรียบเทียบกับ กลุ่มควบคุมที่รับการรักษาด้วย -MSH เท่านั้น (186 เปอร์เซ็นต์ ) ที่น่าสนใจคือ BHCP (1 ไมโครโมลาร์) ยับยั้งปริมาณเมลานินได้ดีกว่ากรดโคจิก (5 mM) นอกจากนี้ ได้ทำการทดสอบกิจกรรมของไทโรซิเนสในระดับเซลล์เพื่อวัดผลการยับยั้งของ BHCP ต่อเซลล์ B16F10 ดังแสดงในรูปที่ 4b BHCP ลดลงในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นด้วยกิจกรรมของไทโรซิเนส 120 เปอร์เซ็นต์ที่ 1 ไมโครโมลาร์,116 เปอร์เซ็นต์ที่ 5 ไมโครโมลาร์ และ 105 เปอร์เซ็นต์ที่ 10 ไมโครโมลาร์ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย -MSH เท่านั้น (181 เปอร์เซ็นต์ ) ผลการยับยั้ง BHCP มีศักยภาพมากกว่ากรดโคจิก การยับยั้ง BHCP ที่1 ไมโครโมลาร์นั้นเหนือกว่ากรดโคจิกที่ 5 มิลลิโมลาร์ (131 เปอร์เซ็นต์) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า BHCP มีผลในการฟอกสีฟันโดยการยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินและการสังเคราะห์ไทโรซิเนสภายในเซลล์ในเมลาโนไซต์ B16F10

รูปที่ 4 การยับยั้งเนื้อหาเมลานิน (a) และกิจกรรมของไทโรซิเนสในเซลล์ (b) ของ BHCP ในเซลล์ B16F10melanoma

2.5. ผลของ BHCP ต่อการแสดงออกของ MITF/Tyrosinase และ Phosphorylated CREB ในเซลล์ B16F10

MITF ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะ มีบทบาทสำคัญในการกระตุ้นการทำงานของเมลาโนเจน รวมทั้งไทโรซิเนส เร่งขั้นตอนการจำกัดอัตราในการสังเคราะห์เมลานิน: TRP-1 และ TRP-2 การแสดงออกของ MITF อาจ เพิ่มขึ้นโดยฟอสโฟรีเลชั่นของ CREB [23] CREB เป็นโปรโมเตอร์ที่สำคัญของ MITF [24,25] และฟอสโฟรีเลชั่นของ CREB ในเมลาโนไซต์จะเพิ่มการแสดงออกของ MITF โดยจับกับ CREB (โปรตีนจับองค์ประกอบการตอบสนอง c-AMP) ในเมลาโนไซต์ [26] เพื่ออธิบายเส้นทางของโมเลกุลที่รับผิดชอบต่อฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ BHCP ในเซลล์ B16F10 เราได้ตรวจสอบระดับโปรตีนของโมเลกุลที่สำคัญ ซึ่งรวมถึง CREB และ MITF ที่มีบทบาทสำคัญในการสร้างเม็ดสีโดยการวิเคราะห์ Western blot เซลล์ถูกบำบัดด้วย BHCP หรือกรดโคจิกและกระตุ้นโดย -MSH เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ช่วงเวลาสำหรับการวัดเป็นไปตามวิธีการที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [27] ดังแสดงในรูปที่ 5 ระดับไทโรซิเนสและ MITF เพิ่มขึ้นด้วย -MSH แต่ BHCP ลดระดับโปรตีนเหล่านี้ นอกจากนี้ ฟอสโฟรีเลชั่นของ CREB ยังถูกยับยั้งโดย BHCP อย่างมีนัยสำคัญ กฎระเบียบของ CREB phosphorylation ที่เกิดจาก -MSH เป็นที่ทราบกันดีว่ามีความสำคัญในการควบคุมการสร้างเม็ดสี [28] ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ BHCP เป็นผลมาจากการปรับลด MITF และไทโรซิเนสผ่านการปรับลด CREB ของฟอสโฟรีเลต การศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าการอธิบายกลไกการยับยั้งของ BHCP ต่อไทโรซิเนสและการสร้างเมลาโนเจเนซิสเป็นสิ่งสำคัญและต้องได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมในอนาคต แม้ว่าเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16F10 โดยทั่วไปจะเหมาะสมกว่าสำหรับการตรวจสอบกลไกการส่งสัญญาณในหลอดทดลอง แต่สายเซลล์ B16F10 นั้นเป็นมะเร็งผิวหนังของสัตว์ฟันแทะ ดังนั้น จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับเมลาโนไซต์ของมนุษย์เพื่อยืนยันการค้นพบนี้

2.6. ผลของ BHCP ต่อการกระตุ้น NF-κB p-p65 ที่กระตุ้นด้วยรังสี UV ในเซลล์ Hs27

ต่อไปเราจะตรวจสอบผลของ BHCP ต่อการแสดงออกของสารสื่อกลางการอักเสบที่เกิดจากรังสียูวีโดยใช้ไฟโบรบลาสต์ Hs27 มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าฟอสโฟรีเลชั่นของ p65 (Ser536) มีความสำคัญต่อความสามารถในการถ่ายทอดยีน [29] ดังนั้นระดับโปรตีนของ p-p65 (Ser536) และ p65 จึงถูกตรวจสอบในส่วนของนิวเคลียสโดย Western blotting ตามที่ระบุไว้ในรูปที่ 6a,b ใน Hs27cells UV เพิ่มระดับโปรตีนของ p-p65 (Ser536) ในนิวเคลียส ในขณะที่การบำบัดของ BHCP ทำให้ระดับโปรตีนของนิวเคลียส p-p65 (Ser536) ลดลง ในทำนองเดียวกัน ปริมาณทั้งหมดของ p65 ลดลงในไซโตพลาสซึมโดย UV และฟื้นฟูโดย BHCP (รูปที่ 6c,d) แม้ว่าระดับการแสดงออกของโปรตีนของ p65 จะลดลงในไซโตพลาสซึมและเพิ่มขึ้นในนิวเคลียสหลังจากการเหนี่ยวนำรังสียูวี การปรับสภาพด้วย BHCP กลับแนวโน้มเหล่านี้ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่าการยับยั้ง p-p65 โดย BHCP อาจส่งผลต่อการป้องกันการสร้างเม็ดสีผิวและการทำลายคอลลาเจนต่อรังสียูวี

รูปที่ 6 ผลของ BHCP ต่อระดับการแสดงออกของ p-p65 (Ser536) ในเซลล์ Hs27 humanfibroblast ที่เหนี่ยวนำด้วย UV

2.7. ผลของ BHCP ต่อการแสดงออกของ MMP ในเซลล์ Hs27

MMPs มีบทบาทสำคัญในการแก่ก่อนวัยของผิว การฉายรังสี UV จะเปลี่ยนเนื้อเยื่อเกี่ยวพันของผิวหนังโดยควบคุมการแสดงออกของ MMPs [30,31] MMP-1 เป็นเอนไซม์ที่สลายคอลลาเจนซึ่งเร่งการสลายตัวของคอลลาเจนที่สังเคราะห์ขึ้นจากโปรคอลลาเจนชนิดที่ 1 MMP-9 isa เจลาติน-เอนไซม์สลายตัวที่ทำลายเส้นใยคอลลาเจนที่ตัดโดย MMP-1 ทำให้เกิดรอยย่นเพิ่มขึ้นและสูญเสียความยืดหยุ่น เพื่อตรวจสอบผลการต่อต้านริ้วรอยของ BHCP ต่อการเหนี่ยวนำรังสียูวี เราได้กำหนดระดับของโปรตีน MMP-1 และ MMP-9 โดย Western blotting นอกจากนี้ เซลล์ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสี UV ยังแสดงให้เห็นระดับ MMP ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ-13 ซึ่งเริ่มการเสื่อมสลายของคอลลาเจนประเภท I และ III แทนที่จะเป็น MMP-1 [32] เราตรวจสอบการเพิ่มขึ้นของ MMP (MMP1, MMP9, MMP12 และ MMP13) หลังการรักษาเซลล์ Hs27 ที่เกิดจากรังสี UV ด้วย BHCP ที่ 1 และ 10 μM ดังที่แสดงในรูปที่ 7 ระดับการแสดงออกของ MMP-1, MMP-9, MMP-12 และ MMP-13 เพิ่มขึ้นหลังจากการเหนี่ยวนำรังสี UV อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วย BHCP ลดการแสดงออกในขนาดยา - ลักษณะที่พึ่งพา ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า BHCP อาจมีส่วนช่วยในการป้องกันการก่อตัวของริ้วรอยโดยการลดการผลิต MMP ที่ผิดปกติซึ่งเกิดจากการสัมผัสกับรังสียูวี ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งบอกว่า BHCP ยับยั้งการแสดงออกของ MMP ใน Hs27fibroblasts เพื่อป้องกันการสลายตัวของคอลลาเจน และทำให้การผลิตริ้วรอย ดังนั้น BHCP จึงมีศักยภาพในการใช้เป็นยาป้องกันและรักษาโรคผิวหนัง

ประโยชน์ของก้านซิสแทนเช่

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. เคมีภัณฑ์และเครื่องมือวัด

ไทโรซิเนสจากเห็ด (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tyrosine, 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA),dimethyl sulfoxide (DMSO) และกรดโคจิกซื้อมาจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, มิสซูรี สหรัฐอเมริกา).Dulbecco's modified Eagle (DMEM), fetal bovine serum, streptomycin และ amphotericin ซื้อมาจาก Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, USA) แอนติบอดีต้าน MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, ไทโรซิเนส, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , และ -actin ถูกซื้อจาก Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) เยื่อแผ่นโพลีไวนิลลิดีนไดฟลูออไรด์ (PVDF) ได้มาจากบริษัทมิลลิพอร์คอร์ปอเรชั่น (เบดฟอร์ด รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) ซื้อภาชนะพลาสติกปลอดเชื้อสำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจาก SPL Labware (โซล ประเทศเกาหลี) แหล่งกำเนิดแสงยูวีจัดทำโดยชุดหลอดครอสลิงค์ 800 (UVP, CA, USA) 6 หลอด (8 วัตต์/หลอด) โครมาโตกราฟีแบบชั้นบางและซิลิกาเจล 60 (ตาข่าย 230–400) ถูกดำเนินการบนซิลิกาเจลF{{27} }แผ่นเคลือบจากเมอร์ค (Darmstadt, Germany) สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกโดยใช้เครื่องมือ Varian Unity INOVA 400 (400 MHz สำหรับ 1H, 100 MHz สำหรับ 13C) และ Varian Unity AS 500 (500 MHz สำหรับ 1H) ค่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมี (δ) ถูกรายงานโดยอ้างอิงถึงตัวทำละลายตกค้างหรือพีคดิวเทอเรตตามลำดับ (δH 2.50 และ δC 39.51 สำหรับ DMSO) ข้อมูลแมสสเปกโตรเมตรีความละเอียดต่ำได้มาจาก Expression CMS mass spectrometer (Advion, Ithaca, NY, USA)

3.2. การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดถูกกำหนดโดยใช้ทั้งสารตั้งต้น L-tyrosine และ L-DOPA ตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย Jung et al [23]. โดยสังเขป 190 ไมโครลิตรของเอนไซม์ไทโรซิเนส (1000 U เจือจางด้วยบัฟเฟอร์ไทโรซิเนสเห็ด รวมทั้ง 1 มิลลิโมลาร์ L-ไทโรซีนและสารละลาย L-DOPA) ถูกเติมโดยมีหรือไม่มีสารประกอบ (ความเข้มข้นสุดท้ายตั้งแต่ 1 ถึง 20 ไมโครโมลาร์ที่ละลายใน 100 เปอร์เซ็นต์ DMSO) ให้กับแต่ละหลุมของเพลต 96-หลุม เพื่อให้ปริมาตรสุดท้ายเป็น 200 ไมโครลิตร เพลตถูกบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที กิจกรรมของไทโรซิเนสถูกหาปริมาณโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่492 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (TECAN, ซาลซ์บูร์ก, ออสเตรีย) และเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ ) ได้มาจากสมการต่อไปนี้:

เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

โดยที่ Ac คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวควบคุม และ As คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง ค่า IC50 คำนวณจากเส้นโค้งล็อก-เชิงเส้นและสมการ แสดงผลลัพธ์เฉลี่ยสำหรับการวิเคราะห์สามครั้ง กรดโคจิกถูกใช้เป็นสารควบคุมเชิงบวก

3.3. การวิเคราะห์จลนศาสตร์ของการยับยั้งไทโรซิเนส

เพื่อตรวจสอบกลไกจลนศาสตร์ ใช้วิธีจลนศาสตร์สองวิธี (แผนภาพ Lineweaver–Burk และ Dixon) เสริมกัน [21,22,33] สำหรับแผนภาพคู่ของ Lineweaver–Burk (พล็อต 1/ความเร็วของเอนไซม์ (1/V) เทียบกับความเข้มข้น 1/สารตั้งต้น (1/[S])) กำหนดประเภทการยับยั้งโดยใช้ความเข้มข้นต่างๆ ของ L-tyrosine (1, 2, และ 4 มิลลิโมลาร์) และ L-DOPA (0.5, 1 และ 2 มิลลิโมลาร์) เป็นสารตั้งต้นเมื่อมีความเข้มข้นต่างกันของ BHCP ความเข้มข้นของ BHCP มีดังนี้:0, 0.5, 1.{{20}} และ 2.0 μM สำหรับ L-tyrosine; และ 0, 2.5, 5 และ 10 μM สำหรับ L-DOPA พล็อต Dixon เป็นวิธีการแบบกราฟิก (พล็อตที่ความเร็ว 1/เอนไซม์ (1/V) เทียบกับความเข้มข้นของสารยับยั้ง (I)) สำหรับการกำหนดประเภทของการยับยั้งเอนไซม์และใช้เพื่อกำหนดค่าคงที่การแยกตัวหรือ Ki สำหรับสารเชิงซ้อนของสารยับยั้งเอนไซม์ แปลง Dixon (แปลงกลับเดียว) ของการยับยั้งได้รับในการแสดงตนของซับสเตรต L-tyrosine ที่ 1, 2 และ 4 mM และ {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} และ 2.0 μM สำหรับ BHCP; และ L-DOPAsubstrate ที่ {{50}}.5, 1.0 และ 2.0 mM และ 0, 2.5, 5.0 และ 10.0 μM สำหรับ BHCP

พืชผักชนิดหนึ่งเป็นสารยับยั้งไทโรซิเนส

3.4. เส้นเซลล์และการเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู B16F10 ได้มาจากธนาคารสายเซลล์เกาหลี สายเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ Hs27 ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) เซลล์เหล่านี้ได้รับการบำรุงรักษาใน DMEM ที่เสริมด้วย bovineserum ของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, เพนิซิลลิน 100 U/มล. และสเตรปโตมัยซิน 100 มก./มล. ในตู้ฟัก CO2 ที่ความชื้น 5 เปอร์เซ็นต์ 37 ◦C ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังบนจานขนาด 100 มม. ถูกบำบัดด้วย BHCP และสัมผัสกับ 50 mJ/cm2UV ใน DMEM ที่ปราศจากซีรัม (แหล่งกำเนิดแสง UV, UVP) เซลล์ Hs27 ถูกเพาะเลี้ยงให้มาบรรจบกัน 70–80 เปอร์เซ็นต์ในจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 มม. และถูกใช้ระหว่างข้อความที่ 5 และ 15

3.5. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกประเมินโดยใช้การสอบวิเคราะห์แบบคิท EZ-Cytox โดยสรุป เซลล์ B16F10 และ Hs27fibroblasts ถูกเพาะลงในจาน 96-หลุมที่ความหนาแน่น 1 × 104 เซลล์/หลุม และบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกป้อน DMEM ที่สดและปราศจากซีรัมซึ่งมีความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 1, 2, 5 และ 10 ไมโครโมลาร์) ของ BHCP และบ่มเป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ต่อมา 10 ไมโครลิตรของสารละลาย EZ-Cytox ถูกบรรจุลงในแต่ละหลุมและเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 2-4 ชั่วโมง การวัดค่าการดูดกลืนแสงของเซลล์ในกรณีที่ไม่มีการบำบัดใดๆ ถือเป็นการอยู่รอดของเซลล์ 100 เปอร์เซ็นต์ การรักษาแต่ละครั้งดำเนินการสลับซับซ้อนและการทดลองแต่ละครั้งทำซ้ำสามครั้ง

3.6. ความมุ่งมั่นของการทดสอบเนื้อหาเมลานิน

ผลของ BHCP ต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เกิดจาก -MSH ในเซลล์ B16F10 เป็นไปตามวิธีที่ใช้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [34] โดยสังเขป เซลล์ B16F10 (5 × 104 เซลล์/หลุม) ใน 6-หลุมเพลตได้รับอนุญาตให้เติบโตถึง 70–80 เปอร์เซ็นต์ที่บรรจบกัน จากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ BHCP (1, 5 และ 10 ไมโครโมลาร์) หรือกรดโคจิก (5 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นกระตุ้นด้วย -MSH (5 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังการบำบัด เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นจัด ละลายในสารละลาย 90 ไมโครลิตร 1 โมลาร์ รวมถึง DMSO (5 เปอร์เซ็นต์ ) ที่ 60 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรด้วยไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (TECAN, ซาลซ์บูร์ก , ออสเตรีย). ในการวัดปริมาณเมลานินในการทดลอง อัตราการยับยั้งในกลุ่มบำบัดคำนวณจากค่าการดูดกลืนแสงของความเข้มข้นของเมลานินสังเคราะห์ที่ทราบ ซึ่งแก้ไขเป็นปริมาณโปรตีนทั้งหมดที่มีอยู่ในส่วนลอยเหนือตะกอนของเซลล์ไลเสต การดูดกลืนแสงของเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัดถูกวัดเป็นสามเท่า

3.7. การทดสอบกิจกรรมเซลล์ไทโรซิเนส

การทดสอบกิจกรรมของเซลล์ไทโรซิเนสดำเนินการโดยการวัดอัตราการออกซิเดชันของ L-DOPA [35] เซลล์ B16F10 ที่ความหนาแน่น 5 × 104/เซลล์ถูกใส่ในจานหลุม 6-หลุมและบ่มข้ามคืน จากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ BHCP (1, 5 และ 10 ไมโครโมลาร์)หรือกรดโคจิก (5 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นกระตุ้นด้วย -MSH (5 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และสลายในสารละลายที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ 100 ไมโครลิตร (pH 6.5), 0.1 มิลลิเมทิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ (PMSF) และไทรทัน 1 เปอร์เซ็นต์-100 จากนั้น เซลล์ถูกวางในเครื่องแช่แข็งแบบลึก (−80 ◦C) เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการละลายเซลล์ สารสกัดของเซลล์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ◦C ทั้งหมด 80 ไมโครลิตรของส่วนลอยเหนือตะกอนและ 20 ไมโครลิตรของL-DOPA (2 มก./มล.) ถูกเติมลงในเพลต 96-หลุม และการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 492 นาโนเมตรถูกวัดทุก 10 นาที ในระหว่าง 1 ชั่วโมงที่ 37 ◦ C พร้อมเครื่องอ่านเพลท ELISA (TECAN, ซาลซ์บูร์ก, ออสเตรีย)

3.8. การเตรียมสารสกัด Cytosolic และ Nuclear ของเซลล์ Hs27

เซลล์ Hs27 ถูกล้างด้วย PBS ที่เย็นจัดและเก็บเกี่ยว บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 10 mM Tris(pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 เปอร์เซ็นต์ NP-40 และสารยับยั้งโปรตีเอสถูกใช้สำหรับการสกัดเศษส่วนไซโตซอลโดย การหมุนเหวี่ยงที่ 12,{13}} รอบต่อนาที ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 15 นาที และแยกเศษส่วนนิวเคลียร์ออกจากเม็ดโดยใช้บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl และตัวยับยั้งโปรตีเอส ฟักบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที แล้วหมุนเหวี่ยงที่ 13,000× g เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ◦C เพื่อให้ได้เศษส่วนนิวเคลียร์

3.9. ซับตะวันตก

ตัวอย่างไลเซตถูกต้มเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์สำหรับบรรจุเจล (125 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl, โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 4 เปอร์เซ็นต์ (SDS), 10 เปอร์เซ็นต์ 2-เมอร์แคปโตเอธานอล และโบรโมฟีนอล 0.2 เปอร์เซ็นต์ สีฟ้า; pH 6.8) ที่ปริมาตร 1:1 โปรตีนที่เทียบเท่ากันทั้งหมดสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกแยกโดย SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis (PAGE) โดยใช้เจลอะคริลาไมด์ตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย Laemmli [36] และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ที่ 80 V เป็นเวลา 2 ชั่วโมงโดยใช้ระบบถ่ายโอนแบบเปียก เยื่อเมมเบรนถูกใส่ลงในบัฟเฟอร์บล็อกทันที (นมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์) ใน 10 mM Tris, pH 7.5, 100 mMNaCl และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween-20 จุดถูกบล็อกเพื่อป้องกันการจับที่ไม่จำเพาะที่ 25 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่จำเพาะที่ 4 ◦C ในชั่วข้ามคืน ตามด้วยการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตที่คอนจูเกตจากพืชชนิดหนึ่งที่ 25 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง . ตรวจพบการติดฉลากแอนติบอดีโดยการเพิ่มประสิทธิภาพของเคมีเรืองแสงตามคำแนะนำของผู้ผลิต การหาปริมาณโปรตีนดำเนินการโดยใช้ Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea) เครื่องหมายโปรตีนที่เตรียมไว้ใช้สำหรับกำหนดน้ำหนักโมเลกุล

3.10. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) สำหรับความแตกต่างระหว่างการรักษาตามด้วยการทดสอบ Bonferroni post-hoc ค่า p < 0.05="">

4. บทสรุป

โดยสรุป ผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า BHCP มีผลทำให้ผิวขาวขึ้นผ่านการยับยั้งไทโรซิเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์หลักสำหรับการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์เมลาโนไซต์ B16F10 ที่เกิดจาก MSH นอกจากนี้ BHCP ยังลดการแสดงออกของระดับโปรตีน MMP ในไฟโบรบลาสต์ที่เกิดจากรังสียูวี ซึ่งคาดว่าจะมีผลในการต่อต้านริ้วรอย จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อยืนยันผลการฟอกสีฟันและต่อต้านริ้วรอยของ BHCP ผ่านการศึกษาในสัตว์ทดลองและทางคลินิก สุดท้าย BHCP ได้รับการระบุว่ามีทั้งการฟอกสีฟันและต่อต้านริ้วรอย ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพในการพัฒนาสารรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับรอยดำและรอยย่น

cistanche คืออะไร

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม กรุณาคลิกที่นี่