การโคลน การระบุฟังก์ชัน และการวิเคราะห์การแสดงออกของชาลโคนซินเทสจาก Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 ผลลัพธ์และการวิเคราะห์

3.1 การโคลนยีน CtCHS

ลำดับสี่ลำดับที่มีคำอธิบายประกอบเป็น "chalcone synthase" ถูกคัดออกโดยใช้ข้อมูลการถอดเสียงของดอก Cistanches tubulosa จากการเปรียบเทียบ Blast ของ NCBI พบว่ามีเพียงลำดับเดียวเท่านั้นที่มีความยาวเต็มของยีน CHS และมี FPKM มากกว่า 10 ไพรเมอร์เฉพาะได้รับการออกแบบตามลำดับนี้ และได้รับชิ้นส่วนประมาณ 1,200 bp โดยการขยาย PCR โดยใช้ ดอกไม้ Cistanches tubulosa cDNA เป็นแม่แบบ (รูปที่ 1) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกนำเจลกลับคืนมาและเชื่อมต่อกับเวกเตอร์ pCE2TA/Blunt-Zero ผลลัพธ์การจัดลำดับสอดคล้องกับการวิเคราะห์ทรานสคริปต์โตม ยีนนี้มีชื่อว่า CtCHS ความยาวของลำดับคือ 1,173 bp และเข้ารหัสกรดอะมิโน 390 ตัว

บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950

เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-ร้านค้า

3.2 การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศศาสตร์ของ CtCHS

3.2.1 คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ CtCHS และการวิเคราะห์โดเมนของเมมเบรน

ซอฟต์แวร์ออนไลน์ ProtParam ใช้เพื่อวิเคราะห์คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของโปรตีนที่เข้ารหัสโดยยีน CtCHS CtCHS เข้ารหัสกรดอะมิโน 390 ตัว สูตรโมเลกุลคือ C1908H3041N511O562S22 มวลโมเลกุลสัมพัทธ์คือ 42 836.54 จุดไอโซอิเล็กทริกทางทฤษฎีคือ 5.85 และไม่เสถียร ค่าสัมประสิทธิ์ II คือ 43.24 ซึ่งเป็นโปรตีนที่ไม่เสถียร และค่าความชอบน้ำโดยเฉลี่ยโดยรวม (GRAVY) คือ −0.052 ซึ่งเป็นโปรตีนที่ชอบน้ำ เครื่องมือออนไลน์ Prot Scale ถูกนำมาใช้เพิ่มเติมในการวิเคราะห์ความชอบน้ำ/ความสามารถในการไม่ชอบน้ำของโปรตีน ผลการวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าค่าสูงสุดของโปรตีน CtCHS hydrophilicity/hydrophobicity คือ 2.422 (342) และค่าต่ำสุดคือ −2.489 (119) สายโซ่เปปไทด์กรดอะมิโนที่เข้ารหัสโดยยีน CtCHS มีกรดอะมิโนที่ชอบน้ำมากกว่ากรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำ ดังนั้นจึงเป็นโปรตีนที่ชอบน้ำ ซอฟต์แวร์ออนไลน์ TMHMM ใช้เพื่อทำนายโครงสร้างเมมเบรนของโปรตีน โปรตีน CtCHS ไม่มีโดเมนของเมมเบรน

รูปที่ 1 การขยาย PCR ของยีน CtCHS

3.2.2 การทำนายโครงสร้างทุติยภูมิและโครงสร้างตติยภูมิของโปรตีน CtCHS

เครื่องมือออนไลน์ SOPMA ใช้เพื่อทำนายโครงสร้างทุติยภูมิของโปรตีน ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 2-A 44.87% -ขดลวด, 31.03% ขดลวดสุ่ม, 15.64% สายโซ่ขยาย และ 8.46% -แผ่นประกอบประกอบเป็นโครงสร้างรองของโปรตีน CtCHS โครงสร้างระดับ ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ออนไลน์ SWISS-MODEL ใช้เพื่อทำนายโครงสร้างตติยภูมิของโปรตีน และใช้โครงสร้างผลึกของข้าว CHS1 เป็นเทมเพลตในการทำนายโครงสร้างสามมิติของโปรตีน CtCHS ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 2-B ความสอดคล้องระหว่าง Cistanche tubulosa CtCHS กับข้าว CHS1 คือ 83.55%

3.2.3 การเปรียบเทียบลำดับและการวิเคราะห์และการประยุกต์ต้นไม้สายวิวัฒนาการ

ซอฟต์แวร์ DNAMAN ทำการเปรียบเทียบที่คล้ายคลึงกันระหว่างลำดับกรดอะมิโน CtCHS และ CHS ของสายพันธุ์อื่น ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 3-C ลำดับกรดอะมิโนของ CtCHS สอดคล้องกับ Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) และ Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) และ Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (NP_196897.1) ลำดับกรดอะมิโนของ CHS มีความคล้ายคลึงกันอย่างมาก โดยมีความคล้ายคลึงกันคือ 90.93%, 90.68%, 90.18%, 89.42%, 89.42% และ 81.61%

สารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 30% และแอคทีโอไซด์ 12%

นอกจากนี้ การจัดตำแหน่งหลายลำดับยังแสดงให้เห็นว่า CtCHS ได้อนุรักษ์ตัวเร่งปฏิกิริยาที่ตกค้าง Cys164, His303 และ Asn336 เพื่อให้เข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับตำแหน่งวิวัฒนาการของ Cistanche tubulosa CtCHS ในตระกูล CHS ของพืช ซอฟต์แวร์ MEGA-X จึงถูกนำมาใช้เพื่อสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการระหว่างโปรตีน CtCHS และ CHS ของพืชชนิดอื่น ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS มีความสัมพันธ์กันอย่างใกล้ชิด

3.3 การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรคาริโอตของ CtCHS

พลาสมิดของ pET-28a-CtCHS ถูกแปลงไปเป็นสายพันธุ์ของการแสดงออก E. coli BL21 (DE3) และการแสดงออกของโปรตีนถูกกระตุ้นโดย IPTG ที่อุณหภูมิต่ำ โปรตีนถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟีที่มีสัมพรรคภาพนิกเกิลไอออน และโปรตีนที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ถูกตรวจพบโดย SDSPAGE 10% ผลลัพธ์ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 3 แถบโปรตีน CtCHS ปรากฏใกล้กับ 40,000 ซึ่งสอดคล้องกับมวลโมเลกุลสัมพัทธ์ของโปรตีน CtCHS ที่ 42,800

3.4 การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ CtCHS

เพื่อระบุการทำงานของ CtCHS โปรตีน CtCHS บริสุทธิ์ถูกบ่มด้วย malonyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA และผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบโดยใช้ HPLC และ MS ภายใต้สภาวะทางธรรมชาติ naringenin-chalcone จะไม่เสถียรในสารละลายและสามารถหมุนเวียนเป็น naringenin ได้ง่าย ดังนั้นจึงเลือกนารินเจนิน-ชาลโคนและนารินเจนินเป็นสารควบคุมมาตรฐาน

ผลการทดสอบ HPLC แสดงในรูปที่ 4-A และ B เวลากักเก็บของผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยากับเอนไซม์จะใกล้เคียงกับเวลาของมาตรฐานนาริงเกนิน ทั้งสองชนิดมีการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ 289 นาโนเมตรในสเปกตรัมการดูดกลืนรังสียูวี ซึ่งแตกต่างจากเวลากักเก็บของนาริงเกนิน-ชาลโคน เวลาและสเปกตรัมการดูดกลืนแสง UV แตกต่างกัน แต่เป็นการควบคุมเชิงลบ ผลิตภัณฑ์หลังการฟักตัวของโปรตีน CtCHS ที่ถูกยับยั้งอุณหภูมิสูงด้วยซับสเตรตไม่มีสารนารินเจนิน ชาลโคน และนาริงเจนิน การตรวจจับเพิ่มเติมผ่านแมสสเปกโตรเมทรี สเปกตรัมมวลระดับแรก (รูปที่ 4-C, D) แสดงให้เห็นว่าผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาของเอนไซม์มี [MH]-พีค m/z271.060 97 ในขณะที่นาริงเกนินมี [MH ]-จุดสูงสุด m/z 271.060 91

เมื่อเปรียบเทียบสเปกตรัม MS2 (รูปที่ 5-E, F) ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาของเอนไซม์ CtCHS และนารินเจนินต่างก็มียอดของชิ้นส่วนที่มีลักษณะเฉพาะที่ m/z 107, 151 และ 177 ซึ่งสอดคล้องกับรายงานวรรณกรรม [19] บ่งชี้ว่า CtCHS มีสารเชิงซ้อนชาลโคน กิจกรรมของเอนไซม์ มันสามารถกระตุ้นปฏิกิริยาของ malonyl-CoA และ 4-coumaroyl-CoA ให้เป็น naringenin-chalcone

3.5 การวิเคราะห์การแปลตำแหน่งเซลล์ย่อย

เพื่อศึกษาบทบาทของโปรตีน CtCHS ในเซลล์ พลาสมิดของ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ถูกสร้างขึ้นและเปลี่ยนเป็นโปรโตพลาสต์ Arabidopsis thaliana เพื่อสังเกตตำแหน่งที่ต่ำกว่าเซลล์ของมัน ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 5 โดยในกลุ่มควบคุม โปรตีน pCAMBIA1300-35S-GFP ถูกกระจายในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม ในขณะที่ฟิวชันโปรตีน pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ส่วนใหญ่กระจายอยู่ใน พลาสซึมแสดงให้เห็นว่าโปรตีน CtCHS อาจทำงานในไซโตพลาสซึมของเซลล์พืช การทำงาน.

3.6 การวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออก CtCHS

qRT-PCR ใช้เพื่อตรวจจับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ CtCHS ในดอกไม้ Cistanche Deserticola ที่มีสามสี: สีขาว สีม่วง และสีแดง ผลลัพธ์แสดงไว้ในรูปที่ 6 การแสดงออกของ CtCHS ในดอกไม้สีม่วงและสีแดงสูงกว่าในดอกไม้สีขาวอย่างมีนัยสำคัญ ปริมาณ. เมื่อเปรียบเทียบกับดอกไม้สีขาว ระดับการแสดงออกของ CtCHS ในดอกไม้สีม่วงจะสูงกว่า 8.44 เท่า และระดับการแสดงออกของ CtCHS ในดอกไม้สีแดงจะสูงกว่า 3.21 เท่า ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเปลี่ยนแปลงในระดับการแสดงออกของ CtCHS อาจเกี่ยวข้องกับความแตกต่างของสีดอกไม้ของ Cistanche Deserticola ยิ่งระดับการแสดงออกสูง สีดอกไม้ก็จะยิ่งเข้มขึ้น ยิ่งระดับการแสดงออกต่ำ สีดอกไม้ก็จะยิ่งจางลง

****P＜0.000 1รูปที่ 6 ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ CtCHS ในดอกไม้ที่มีสีต่างกัน

4. การอภิปราย

CHS คือเอนไซม์สำคัญในกระบวนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฟลาโวนอยด์และเกี่ยวข้องกับธการควบคุมสีดอกไม้ในพืชหลายชนิด เช่น สีของดอกไม้Dianthus chinensisล.[20] และพิทูเนีย×ลูกผสมฮอร์ต เอ็กวิล์ม[22] ล้วนได้รับผลกระทบจาก CHS ควบคุม.ซิแทนเชสทูบูโลซาส่วนใหญ่มีดอกไม้สามสี: สีขาว สีแดง และสีม่วง แต่ยังไม่มีรายงานกลไกการควบคุมสีของดอกไม้ ในการศึกษานี้ มีการโคลนยีน CtCHS โดยใช้ RT-PCRการวิเคราะห์ข้อมูลการถอดเสียงของดอก Cistanches tubulosa, และมัน

การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศศาสตร์และผลการวิจัยพบว่า CtCHS มีความคล้ายคลึงกันสูงและมีความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมที่ใกล้ชิดกับลำดับกรดอะมิโนของ ElCHS ของ Physalis nigra (AHJ80976.1) CHS เป็น polyketide synthase ประเภท III (PKSIII) และการศึกษาพบว่า CHS มีตัวเร่งปฏิกิริยา Cys-His-Asn แบบอนุรักษ์ไว้ [23] ในการศึกษานี้ การวิเคราะห์การจัดลำดับกรดอะมิโนแสดงให้เห็นว่า CtCHS ได้อนุรักษ์ตัวเร่งปฏิกิริยาที่ตกค้าง Cys164, His303 และ Asn336 ซึ่งบ่งชี้ว่า CtCHS อาจมีฟังก์ชันการสังเคราะห์ชาลโคนทั่วไป

สามารถ. การวิเคราะห์ฤทธิ์ของเอนไซม์ดำเนินการโดยใช้การแสดงออกของโปรคาริโอตของโปรตีน CtCHS ใน Escherichia coli และตรวจพบโดย HPLC และ MS พบว่าโปรตีน CtCHS สามารถเร่งปฏิกิริยา 4-coumaroyl-CoA และ malonyl-CoA ให้ผลิต naringenin-chalcone

CHS เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ฟลาโวนอยด์ในพืชหลายชนิด แต่ตำแหน่งของเซลล์ย่อยจะแตกต่างกันไปในแต่ละสายพันธุ์ ตัวอย่างเช่น Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenphorum Spreng. EaCHS[26] ทั้งหมดอยู่ในไซโตพลาสซึม ในขณะที่ Paeonia delavayi var. lutea (Delavay อดีต Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27] มะเขือยาว Solanum melongena L. SmCHS [28] ตั้งอยู่ในไซโตพลาสซึมและนิวเคลียส และในองุ่น Vitis vinifera L. VvCHS ตั้งอยู่ในไซโตพลาสซึม นิวเคลียส และผนังเซลล์ [29] ในการศึกษานี้ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS พลาสมิดถูกใช้เพื่อเปลี่ยนโปรโตพลาสต์ของ Arabidopsis thaliana และพบว่าโปรตีน CtCHS ส่วนใหญ่ถูกทำให้เฉพาะที่ในไซโตพลาสซึม และอาจกระตุ้นการผลิตของนารินเจนิน-ชาลโคนในไซโตพลาสซึมเป็น ส่งเสริมการสะสมของฟลาโวนอยด์

วิถีฟีนิลโพรพานอยด์แยกจาก 4-คูมาโรอิล-CoA ไปสู่วิถีการสังเคราะห์ฟลาโวนอยด์และวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพลิกแนน CHS เร่งปฏิกิริยา 4-coumaroyl-CoA และ malonyl-CoA เพื่อสร้าง naringenin และ chalcone เพื่อเริ่มต้นฟลาโวนอยด์ วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของสารประกอบคล้ายสารประกอบเป็นเอนไซม์หลักตัวแรกในวิถีนี้ [30] ดังนั้น CHS ที่แสดงออกอย่างมากจึงเป็นประโยชน์ต่อพืชในการสะสมฟลาโวนอยด์ในระดับที่สูงขึ้นและสร้างดอกสีเข้มขึ้น ตัวอย่างเช่น ระดับการแสดงออกของ CHS ในพันธุ์ดอกสีม่วงของ Hosta plantaginea (Lam.) Aschers จะสูงกว่าพันธุ์ดอกสีขาว Hosta HpCHS ถูกเปลี่ยนเป็นยาสูบเพื่อให้ได้มา เมื่อเปรียบเทียบกับยาสูบประเภทป่า พืชที่แสดงออกมากเกินไปจะมีกลีบสีเข้มกว่าและมีปริมาณแอนโทไซยานินรวมสูงกว่า [31]

ในการศึกษานี้ ระดับการแสดงออกของยีน CtCHS มีความสัมพันธ์กับสีของดอก Cistanches tubulosa มีลักษณะเด่นอย่างมากด้วยดอกสีม่วงเข้มและดอกสีแดง และมีดอกสีขาวสีอ่อนเล็กน้อย ความแตกต่างในการแสดงออกของ CtCHS อาจเนื่องมาจากความแตกต่างในดอก Cistanches tubulosa สาเหตุหนึ่งที่ทำให้มีชุดและสีต่างกัน โดยสรุป การศึกษานี้ได้โคลนยีน CtCHS จากดอก Cistanche Deserticola และดำเนินการวิเคราะห์ชีวสารสนเทศศาสตร์กับยีนดังกล่าว โปรตีนรีคอมบิแนนท์ของ CtCHS ได้รับจากการแสดงออกภายนอกใน Escherichia coli การวิเคราะห์แอคติวิตีของเอนไซม์พิสูจน์ว่าโปรตีน CtCHS สามารถเร่งปฏิกิริยาโคเอนไซม์ 4-คูมาโรอิลได้ A และ malonyl-coenzyme A สร้าง naringenin-chalcone พบว่ายีน CtCHS มีการแสดงออกสูงในดอกสีม่วงแดงและมีดอกสีขาวต่ำ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่ายีน CtCHS อาจควบคุมการผลิตสีดอกไม้ที่แตกต่างกันใน Cistanche Deserticola ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกการกำกับดูแลของสีดอกไม้ Cistanche tubulosa และให้ข้อมูลอ้างอิงสำหรับการวิจัยในภายหลังเกี่ยวกับบทบาทของ CtCHS ในการควบคุมของ สีดอกไม้ใน Cistanche Deserticola