น้ำมันหอมระเหยที่มีส่วนผสมของซิตัลเป็นตัวยับยั้งไทโรซิเนสที่มีศักยภาพ: วิธีการแบ่งส่วนทางชีวภาพ

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เชิงนามธรรม:

การผลิตเมลานินที่มากเกินไปทำให้เกิดปัญหาทางผิวหนังอย่างรุนแรง รวมถึงปัญหาด้านความงามเล็กน้อย (เช่น ฝ้ากระ และโรคเลนทิโก้จากแสงอาทิตย์) การลดระดับของไทโรซิเนสเป็นวิธีที่แพร่หลายในการรักษาโรคดังกล่าว และสารสกัดจากพืชมักได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นแหล่งที่มีคุณค่าของไทโรซิเนสสารยับยั้ง Citral (ส่วนผสมของ neral และ geranial) เป็นส่วนผสมของกลิ่นหอมที่สำคัญซึ่งแสดงศักยภาพในการต่อต้านไทโรซิเนส มีความเข้มข้นสูงในน้ำมันหอมระเหย (EOs) ของ Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. และ Verbenaofficinalis L. อย่างไรก็ตาม มีเพียง L. cubeba EO เท่านั้นที่ได้รับการตรวจสอบ ใช้เป็นสารฟอกสีผิวที่มีศักยภาพ งานนี้ประเมินผลในหลอดทดลองไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้งของ EO และการศึกษาเหล่านี้ โดยใช้การแยกส่วนเชิงวิเคราะห์ทางชีวภาพ ไม่ว่าองค์ประกอบทางเคมีที่แตกต่างกันของพวกมันจะมีอิทธิพลต่อกิจกรรมการยับยั้ง EO โดยรวมผ่านการทำงานร่วมกัน สารเติมแต่ง และ/หรือการทำงานร่วมกันที่เป็นไปได้ระหว่างส่วนประกอบ EOs หรือไม่ กิจกรรมการยับยั้งของ C. schoenanthus EO และของ M. officinalis EOs ที่มีปริมาณ Citronellal เพียงเล็กน้อย (บวก ) สอดคล้องกับปริมาณซิทรัล ในทางกลับกัน L. cubebaand V. officinalis EOs ยับยั้งไทโรซิเนสในระดับที่มากขึ้นตามที่มี -myrcene ซึ่งสนับสนุนกิจกรรม EO โดยรวม มีการสังเกตที่คล้ายกันสำหรับ M. officinalis EO ซึ่งมีปริมาณ (บวก ) -citronellal สูง ซึ่งเพิ่มกิจกรรมของ citral

คำสำคัญ:ไทโรซิเนสการยับยั้ง; น้ำมันหอมระเหย citral

cistanche มีฟังก์ชันไวท์เทนนิ่ง

บทนำ

ไทโรซิเนสเป็นเอนไซม์หลักในการสังเคราะห์เม็ดสีเมลานินในแบคทีเรีย เชื้อรา พืช สัตว์ และมนุษย์ ในมนุษย์ ไทโรซิเนสกระตุ้นขั้นตอนการจำกัดอัตราในวิถีการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของเมลานิน การสังเคราะห์ทางชีวภาพนี้มีลักษณะเฉพาะด้วยปฏิกิริยาของเอนไซม์และปฏิกิริยาทางเคมีหลายอย่างที่นำไปสู่การก่อตัวของเมลานินจากกรดอะมิโนแอล-ไทโรซีน โดยที่ไทโรซิเนสเร่งปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันของโอโดปาควิโนนผ่านกิจกรรมไมโคฟีโนเลตและไดฟีนอล แม้ว่าจะมีเอนไซม์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้องในการสร้างเมลาโนเจเนซิส แต่ปฏิกิริยาที่กระตุ้นด้วยไทโรซิเนสเท่านั้นที่ไม่สามารถเกิดขึ้นได้เองตามธรรมชาติ ในขณะที่ขั้นตอนที่เหลือสามารถดำเนินต่อไปได้โดยไม่มีการทำงานของเอนไซม์ที่ pH ทางสรีรวิทยา [1] ด้วยเหตุนี้ การปรับลดไทโรซิเนสจึงเป็นแนวทางที่แพร่หลายมากในการลดเมลานินที่มากเกินไป การผลิตและการใช้สารยับยั้งไทโรซิเนสเป็นสารฟอกสีผิวได้แสดงให้เห็นถึงความโดดเด่นทางคลินิกและเครื่องสำอางอย่างมีนัยสำคัญ [2]

ในตลาดสหภาพยุโรป theไทโรซิเนสสารยับยั้งที่ใช้เป็นตัวแทนในการทำให้ผิวขาวสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภทหลัก: สารต้องห้ามภายใต้กฎระเบียบเครื่องสำอางของสหภาพยุโรป1223/2009 (เช่น ไฮโดรควิโนนและโมโนเบนซิลอีเทอร์ไฮโดรควิโนน) เนื่องจากผลข้างเคียงที่รุนแรง แต่ที่ยังคงใช้ในการรักษารอยดำภายใต้การแพทย์ การดูแลและสารยับยั้งไทโรซิเนสที่ได้รับอนุญาตให้ใช้ในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง (เช่น อาร์บูติน ว่านหางจระเข้ กรดโคจิก) [2,3] อย่างไรก็ตาม กลุ่มที่สองนี้ยังคงมีลักษณะเฉพาะโดยอาจมีผลข้างเคียงที่มีนัยสำคัญ การศึกษาทางคลินิกเกี่ยวกับกรดโคจิกได้เน้นให้เห็นถึงกรณีที่เกิดผื่นแดง ความรู้สึกแสบ และการสัมผัสกลากหลังการใช้ ในทำนองเดียวกัน EuropeanScientific Committee on Consumer Safety ได้แสดงความกังวลเกี่ยวกับการใช้อาร์บูตินัสเป็นส่วนผสมในเครื่องสำอาง [2] เนื่องจากการไฮโดรไลซิสที่อาจเกิดขึ้นจากพันธะไกลโคซิดิกที่ปล่อยไฮโดรควิโนน ดังนั้นจึงมีความจำเป็นสำหรับต้นแบบโมเลกุลใหม่และ/หรือส่วนผสมของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพในการรักษารอยดำ

พืชเป็นแหล่งที่มีคุณค่าของสารทำให้ผิวขาว และสามในห้าของสารที่ใช้มากที่สุด ทั้งทางการแพทย์และเครื่องสำอาง สารเมแทบอไลต์เฉพาะจากพืช (เช่น ไฮโดรควิโนน -อาร์บูติน อะโลซิน) จนถึงปัจจุบัน สารประกอบฟีนอลได้รับการตรวจสอบเป็นหลักว่ามีศักยภาพไทโรซิเนสสารยับยั้ง และสิ่งเหล่านี้รวมถึงฟลาโวนอยด์ (เช่น เควอซิทิน [4]), สติลบีเนส (เช่น เรสเวอราทรอล [1]), ฟีนิลโพรพานอยด์ (เช่น ซินนามัลดีไฮด์ [5] และยูจีนอล [6]) และกรดฟีนอลิก (เช่น กรดอนิซิกและ กรดเบนโซอิก [7]). forterpenoids ที่น่าสนใจนั้นลดลงอย่างมากและพวกมันค่อนข้างถูกตรวจสอบไม่เพียงพอกับสารต่อต้านไทโรซิเนส

Citral เป็นหนึ่งในอนุพันธ์เทอร์พีนอยด์ที่มีคุณสมบัติต้านไทโรซิเนสจำนวนจำกัดที่ได้รับการศึกษา เป็นส่วนผสมของไอโซเมอร์สองชนิด ได้แก่ cis- และ trans-3,7-dimethyl-2,6-octadienal (เช่น neral และ geranial) ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าบล็อก เอนไซม์ในหลอดทดลองของเห็ดไทโรซิเนส[8]. นอกจากความสำคัญในฐานะที่เป็นส่วนผสมที่มีกลิ่นในเครื่องดื่ม อาหาร และเครื่องสำอางแล้ว citral ยังแสดงให้เห็นกิจกรรมทางชีววิทยาในหลอดทดลองที่มีแนวโน้มว่าจะได้ผล ซึ่งรวมถึงฤทธิ์ต้านเชื้อรา ต้านแบคทีเรีย สารต้านอนุมูลอิสระ และฤทธิ์ต้านการอักเสบ [9–11] นอกจากนี้ ผลการศึกษาล่าสุดยังพบว่า เน้นว่า citral มีความสำคัญในการรักษา เช่น ยาคลายกล้ามเนื้อเรียบและยาชาเฉพาะที่ เนื่องจากช่วยส่งเสริมการผ่อนคลายในกล้ามเนื้อเรียบของหลอดลม มดลูก และหลอดเลือด และยับยั้งการปลุกปั่นของเส้นประสาทในสัตว์ทดลอง [12-15]

Citral ได้มาจากน้ำมันหอมระเหย (EOs) ของพฤกษศาสตร์หลายชนิด รวมทั้ง Cymbopogon schoenanthus (L. ) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. และ Verbena officinalis L. เพื่อประโยชน์สูงสุดของผู้เขียน ความรู้ มีเพียง L. cubeba EO เท่านั้นที่ได้รับการตรวจสอบสำหรับไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้ง [16]. ดังนั้น การศึกษานี้จึงมุ่งที่จะประเมินกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของ C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis และ V.officinalis EO โดยใช้การทดสอบสีในหลอดทดลอง เพื่อประเมินว่าองค์ประกอบทางเคมีต่างๆ มีอิทธิพลต่อกิจกรรมการยับยั้ง EO โดยรวมหรือไม่ การทำงานร่วมกัน สารเติมแต่ง และ/หรือการทำงานร่วมกันที่เป็นไปได้ระหว่างส่วนประกอบต่างๆ การศึกษานี้ใช้วิธีการแยกส่วนด้วย abioassay-guided เพื่อประเมินองค์ประกอบ EOs และอีแนนชิโอเมอร์ของพวกมันอย่างครอบคลุม เมื่อใช้ chiral ซึ่งมีส่วนช่วยในการยับยั้ง EO ต่อแหล่งที่มาของเห็ดไทโรซิเนส ซึ่งเป็นระบบแบบจำลองที่ดีสำหรับการตรวจคัดกรองเบื้องต้นของไทโรซิเนสสารยับยั้ง [17]

2. ผลลัพธ์และการอภิปราย

2.1. องค์ประกอบทางเคมีและปริมาณ Citral ของน้ำมันหอมระเหยที่ตรวจสอบแล้ว

ในความพยายามของเราในการอธิบายลักษณะเฉพาะอย่างครอบคลุมของส่วนประกอบ EO ที่เป็นไปได้ทั้งหมดซึ่งนำไปสู่กิจกรรมทางชีววิทยาที่พิจารณาแล้ว EO ที่ตรวจสอบได้รับการวิเคราะห์โดย GC ด้วยการตรวจจับทั้ง FID และ MS ความอุดมสมบูรณ์ร้อยละสัมพัทธ์ที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (คำนวณจากพื้นที่สัมบูรณ์ที่ถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงมาตรฐานภายใน C13 โดยใช้ปัจจัยตอบสนอง [18,19]) ของสารประกอบที่ตรวจพบทั้งหมดถูกกำหนดหาและใช้เพื่อเปรียบเทียบองค์ประกอบEO รูปที่ 1 รายงานโปรไฟล์ GC-MS ของ EO ที่ตรวจสอบแล้ววิเคราะห์ด้วยคอลัมน์ทั่วไป ตารางที่ 1 แสดงรายการสำหรับ EO ที่ตรวจสอบแต่ละครั้ง สารประกอบที่แสดงเปอร์เซ็นต์ความอุดมสมบูรณ์ที่สูงกว่า 0.1 ในขณะที่องค์ประกอบทางเคมีของ EO ทั้งหมดจะรายงานในวัสดุเสริม (ตารางที่ S1–S5)

EO ที่ตรวจสอบทั้งหมดนั้นอุดมไปด้วย neral (cis{{0}},7-dimethyl-2,6-octadienal) andgeranial (trans-3,{ {5}}ไดเมทิล-2,6-ออกตาเดียนอล) ซึ่งเป็นสารประกอบที่มีมากที่สุด อัตราส่วนระหว่างอายุ/พืชพรรณมีความคล้ายคลึงกันมากใน EO ที่ตรวจสอบทั้งหมดและสอดคล้องกับ0.74 ± 0.05 C. schoenanthus และ L. cubeba EO แสดงเนื้อหา neral และ geranial สูงสุด ซึ่งคิดเป็นโดยเฉลี่ย 60 เปอร์เซ็นต์ขององค์ประกอบ EO ทั้งหมด และมากกว่าใน V. officinalis EO 1.5- เท่าและใน M. officinalis EO ทั้งสาม (เช่น ตัวอย่างที่ 1, 2 และ 3) สารประกอบออกซิเจนเพิ่มเติมที่พบได้ทั่วไปใน EO ทั้งหมดคือ6-เมทิล-5-เฮปเทน-1-หนึ่ง ไลนาลูล และซิโตรเนลลาล อย่างหลังมีปริมาณมากใน M. officinalis EO 1 อย่างมีนัยสำคัญมากกว่าใน EO อื่นๆ ที่ตรวจสอบ รวมถึง M. officinalis EO2 และ 3

ปริมาณไฮโดรคาร์บอนในปริมาณมากจะแตกต่างกันอย่างมากใน EOs.M. officinalis EO 1 มีเพียงทรานส์- -caryophyllene และ -humulene เป็น sesquiterpenehydrocarbons ซึ่งคิดเป็น 2.7 เปอร์เซ็นต์และ 0.13 เปอร์เซ็นต์ของ EO ทั้งหมดตามลำดับ C.schoenanthus EO แสดงเศษส่วนของไฮโดรคาร์บอนที่เข้มข้นกว่าเล็กน้อยกว่า M. officinalis EO 1 (กล่าวคือ 7.0 เปอร์เซ็นต์ ) ที่มีโมโนเทอร์พีนทั้งสอง (เช่น แคมฟีน ซิส{{1{{20 }}}}ocimene, limonene, -pinene,trans- -ocimene, -thujene) และ sesquiterpenes (เช่น trans- -caryophyllene, -cadinene,δ-cadinene, germacrene D, -elemene) ในระดับปานกลาง จำนวนเงิน ใน L. cubeba และ V.officinalis EO เศษส่วนของไฮโดรคาร์บอนคิดเป็น 20 เปอร์เซ็นต์ของ EO ทั้งหมดและลิโมนีนเป็นสารประกอบที่มีมากที่สุด (เช่น 15.0 และ 10.9 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) ตามด้วย -pinene, pinene , sabinene, ทรานส์- -caryophyllene, -myrcene, camphene และ -copaene สุดท้าย M.officinalis EO 2 และ 3 มีลักษณะเฉพาะด้วยปริมาณเศษส่วนของไฮโดรคาร์บอนสูงสุด (38.8 เปอร์เซ็นต์และ 31.8 เปอร์เซ็นต์ของ EO ทั้งหมดตามลำดับ) ในทั้งสองตัวอย่าง เศษส่วนของไฮโดรคาร์บอนส่วนใหญ่ประกอบด้วย sesquiterpenes คือทรานส์- -caryophyllene (27.8 เปอร์เซ็นต์ และ 20.0 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) และ -humulene (3.0 เปอร์เซ็นต์ และ 2.6 เปอร์เซ็นต์ ) และเศษส่วนของโมโนเทอร์พีนที่ลดลงซึ่งส่วนใหญ่แสดงลักษณะโดยลิโมนีน ( 4.2 เปอร์เซ็นต์ และ 3.2 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ)

สามตัวอย่างของ L. cubeba, V. officinalis และ C. schoenanthus Eos ที่ผลิตในปีที่ต่างกัน รวมถึงตัวอย่าง M. officinalis EO สามตัวอย่างจากการผลิตที่แตกต่างกัน การวิเคราะห์ GC-MS ของ C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis และ V. officinalis ไม่ได้เปิดเผยความแตกต่างเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณที่มีนัยสำคัญในองค์ประกอบทางเคมีของตัวอย่างสามตัวอย่างในปีการผลิตที่แตกต่างกัน ซึ่งอาจกำหนดเงื่อนไขการจัดเก็บที่เหมาะสม เช่น ในภาชนะแก้วสีเหลืองอำพันที่อุณหภูมิ 4 ◦C ในที่มืดโดยมีพื้นที่ส่วนหัวเพียงเล็กน้อย ในทางกลับกัน การวิเคราะห์ด้วย GC-MS แสดงให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของมะนาวและทรานส์{{4 }}caryophyllene ใน M. officinalis EO ที่ได้รับการตรวจสอบทั้งสามรายการ Citronellala อยู่ที่ 19.6 เปอร์เซ็นต์ , 0.26 เปอร์เซ็นต์ และ 0.31 เปอร์เซ็นต์ใน M. officinalis EO 1, 2 และ 3 ตามลำดับ ในทางตรงกันข้าม ดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ทรานส์- -caryophyllene มีความอุดมสมบูรณ์มากขึ้นใน M. officinalis EOs 2 และ 3 มากกว่าใน M. officinalis EO 1 ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการค้นพบที่รายงานโดย Seidler-Lozykawska et al., ซึ่งเน้นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของ citral, citronellal และ trans- -caryophyllene ใน EOs ที่ได้รับจากจีโนไทป์ของ M. officinalis จำนวน 22 ชนิดที่มีต้นกำเนิดจากสวนพฤกษศาสตร์ยุโรป [20]

การหาปริมาณที่แท้จริงดำเนินการโดยการสอบเทียบมาตรฐานภายนอกเพื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์ของสารประกอบเฉพาะที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพได้อย่างแม่นยำ (เช่น neral, geranial, limonene, -myrcene และ citronellal ตารางที่ 2 และ 3 รายงานไอออนการวินิจฉัย (m/z) ที่ใช้สำหรับ SIM- การหาปริมาณ MS ของสารประกอบเครื่องหมายภายใต้การตรวจสอบร่วมกับช่วงการสอบเทียบ สมการเส้นโค้งการสอบเทียบ ค่าสหสัมพันธ์ และข้อผิดพลาดมาตรฐานการถดถอยของสารวิเคราะห์แต่ละตัวและผลการหาปริมาณตามลำดับ

2.2. กิจกรรมการยับยั้งในหลอดทดลองของน้ำมันหอมระเหยที่ตรวจสอบกับเห็ดไทโรซิเนส

ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ EOs ของ C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba และ V.officinalis นำเสนอ citral ในระดับสูง ซึ่งมีลักษณะเฉพาะจากการยับยั้งการออกฤทธิ์ที่ไม่แข่งขันกับแหล่งที่มาของเชื้อราของไทโรซิเนส [8,16,21] . การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบในหลอดทดลองไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้งของ EO เหล่านี้เพื่อสำรวจว่าการมีฤทธิ์ยับยั้งของพวกมันสามารถกำหนดได้เฉพาะเนื้อหาในซิตรัลของพวกมันเท่านั้น หรือมีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นๆ ที่มีอิทธิพลต่อผลการยับยั้งของ EO หรือไม่

เห็ดไทโรซิเนสถูกนำมาใช้ที่นี่เนื่องจากมีความคล้ายคลึงกันสูงกับฮิวแมนไทโรซิเนส มีต้นทุนค่อนข้างต่ำและพร้อมใช้งาน ซึ่งทำให้เป็นระบบแบบจำลองที่ดีสำหรับการตรวจคัดกรองเบื้องต้นของสารยับยั้งไทโรซิเนส [17] ความแม่นยำของหลอดทดลองไทโรซิเนสการทดสอบการยับยั้งได้รับการประเมินในแง่ของความสามารถในการทำซ้ำ (โดยการทดสอบการยับยั้งด้วยเอนไซม์ห้าครั้งในวันเดียวกัน) และความแม่นยำระดับกลาง (โดยการทดสอบการยับยั้งด้วยเอนไซม์ซ้ำห้าครั้งทุกสี่สัปดาห์ในช่วงหกเดือน) ตารางที่ 4 รายงานค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (CV) สำหรับการทดสอบการยับยั้งด้วยกรดโคจิก ซึ่งใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก และด้วย L. cubeba EO ผลลัพธ์เป็นที่น่าพอใจเนื่องจาก CV ไม่เคยเกิน 7 เปอร์เซ็นต์สำหรับการทำซ้ำและ 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับความแม่นยำระดับกลาง ตารางที่ 4 รายงานค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันสำหรับการทดสอบการยับยั้งด้วยกรดโคจิก ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก และด้วย L. cubeba EO ได้ค่าความแม่นยำที่คล้ายกันสำหรับ EO ที่ทดสอบทั้งหมด

กราฟความเข้มข้น-การตอบสนองของ Citral ถูกศึกษาโดยพล็อตการออกฤทธิ์ยับยั้งที่สังเกตได้ซึ่งเป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นในส่วนผสมของปฏิกิริยา EO ทั้งหมดได้รับการทดสอบที่ความเข้มข้น 166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งจัดให้มีโดยไม่คำนึงถึง EO ซึ่งเป็นผลลัพธ์ของความเข้มข้นของซิตรัลภายในช่วงเชิงเส้นของเส้นโค้งตอบสนองความเข้มข้น (y=0.3956x บวก 1.8094,R{{7} }.9951 ข้อผิดพลาดในการถดถอย: 2.08448 ช่วงความเป็นเส้นตรง: 6.7–166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และไม่ได้สร้างปัญหาความสามารถในการละลายในส่วนผสมของปฏิกิริยา

พล็อตกล่องที่รายงานในรูปที่ 2 แสดงเปอร์เซ็นต์ของไทโรซิเนสการยับยั้งสำหรับแต่ละ EO สำหรับ L. cubeba, V. officinalis และ C. schoenanthus EOs ผลลัพธ์ที่รายงานในรูปที่ 2 สอดคล้องกับฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดของ EO เท่ากับ 2020 เนื่องจากการวิเคราะห์ความแปรปรวนไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่าง EO ที่แตกต่างกัน ปีที่ผลิต (p > 0.05) ในส่วนที่เกี่ยวกับ L. cubeba และ C. schoenanthus EO ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลลัพธ์ที่ได้จากการวิเคราะห์ GCMS เชิงปริมาณที่เผยให้เห็นปริมาณซิทรัลที่เกือบจะเหมือนกันใน EO ของปีการผลิตต่างๆ ชุด 2020 ของ V. officinalis EO มีปริมาณ citral ที่สูงกว่าเล็กน้อยรุ่น 2019 และ 2018 อย่างไรก็ตาม ตามความเข้มข้นของ citral–responsecurve ความเข้มข้นของ citral ส่วนเกินในชุด 2020 นั้นไม่เพียงพอต่อการพิจารณาเปอร์เซ็นต์ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติของการยับยั้งเอนไซม์เมื่อพิจารณาจากสุ่ม ข้อผิดพลาดที่เกี่ยวข้องกับการวัด สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติม โปรดดูรูปที่ S1 ในเอกสารประกอบ ในทางกลับกัน การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) ตามด้วย Tukey–Kramer post-hoctest เปิดเผยว่า M. officinalis EOs ที่ทดสอบทั้งสามชนิดที่ผลิตโดยผู้ผลิตที่แตกต่างกันคือเห็ดยับยั้งไทโรซิเนสในขอบเขตที่แตกต่างกัน ซึ่งจะอธิบายเพิ่มเติมในย่อหน้าต่อไปนี้ กิจกรรมการยับยั้งที่ยิ่งใหญ่ที่สุดถูกสังเกตพบสำหรับ EO ของ L.cubeba, M. officinalis 1 และ V. officinalis ซึ่งยับยั้ง 59 ± 6 เปอร์เซ็นต์ , 55 ± 7 เปอร์เซ็นต์ และ 52 ± 6 เปอร์เซ็นต์ของไทโรซิเนสการออกฤทธิ์ ตามลำดับ เมื่อทดสอบที่ความเข้มข้น 166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร กิจกรรมที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05)="" ถูกสังเกตพบสำหรับ="" eo="" ของ="" c.="" schoenanthus="" และ="" m.officinalis="" 2="" และ="" 3="" ซึ่งฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์เท่ากับ="" 42="" ±="" 5="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" 40="" ±="" 5="" เปอร์เซ็นต์="" และ="" 38="" ±="" 6="" เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ="" ตารางที่="" 5="" จัดให้มีความเข้มข้นของตัวยับยั้งที่ลดการทำงานของเอนไซม์ลงครึ่งหนึ่งในสภาวะการทดลองที่กำหนด="" (ic50)="" สำหรับตัวยับยั้งที่ตรวจสอบแต่ละตัว="" (กล่าวคือ="" eo,="" สารประกอบเดี่ยว="" และกรดโคจิก)="" eo="" ทั้งหมดสามารถยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดได้อย่างมีประสิทธิภาพและแสดงฤทธิ์การยับยั้งที่โดยเฉลี่ย="" 100-="">

2.3. การระบุส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพเพิ่มเติม นอกเหนือจาก Citral โดย Bioassay-Guided Fractionation ฮิสโตแกรมที่รายงานในรูปที่ 3 เปรียบเทียบเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งเอนไซม์ที่วัดจากการทดลองกับค่าที่คาดว่าจะได้รับหาก neral และ geranial (ด้านตรงข้ามเป็นผลรวม กล่าวคือ citral) เป็น เฉพาะสารออกฤทธิ์ใน EO ที่ตรวจสอบ ค่าเหล่านี้ถูกวัดผ่านการประมาณค่าจากกราฟการตอบสนองความเข้มข้นของซิทรัล ดังที่สังเกตได้ C. schoenanthus, M. officinalis 2 และ M. officinalis 3 แสดงฤทธิ์ต้านไฟฟ้ากระแสสลับที่สอดคล้องกับเนื้อหาในซิทรัล ขณะที่ L. cubeba, M. officinalis 1 และ V. officinalis EOs ยับยั้งเห็ด ไทโรซิเนสในระดับที่มากกว่าที่คาดไว้ แนวทางชีวภาพถูกนำมาใช้เพื่อระบุสารประกอบเพิ่มเติมที่เอื้อต่อกิจกรรมของ citral เศษส่วนของออกซิเจนและไฮโดรคาร์บอนของ L. cubeba, M. officinalis 1 และ V. officinalis EOs ถูกแยกออกโดย flash chromatography และทดสอบแยกกันสำหรับเห็ดของพวกมันไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้ง เศษส่วนทางพฤกษศาสตร์ทดสอบสำหรับกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด เศษส่วนทางพฤกษศาสตร์ของเศษส่วนได้รับการทดสอบที่ความเข้มข้นเดียวกันกับความเข้มข้นที่เป็นผลลัพธ์เมื่อทดสอบ EO ที่ 166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ EO ตามลำดับ (ดูหัวข้อวัสดุและวิธีการในส่วน 3.2) ตารางที่ 6 รายงานความเข้มข้นของเนอรัล เจอเรเนียล ซิโตรเนลลาล ลิโมนีน และ -ไมร์ซีนในเศษส่วนของออกซิเจนและไฮโดรคาร์บอนของ EO ที่ถูกแยกส่วน

สำหรับ L. cubeba และ V. officinalis EOs ทั้งเศษส่วนของออกซิเจนและไฮโดรคาร์บอนยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด แม้ว่าจะมีขอบเขตต่างกัน กิจกรรมของเศษส่วนที่มีออกซิเจน (53 ± 3 เปอร์เซ็นต์และ 44 ± 5 ​​ตามลำดับ) คิดเป็นส่วนใหญ่ของ EOsanti-ไทโรซิเนสที่มีศักยภาพและสอดคล้องกับเนื้อหาในซิทรัลตามลำดับ โดยบอกว่าสารประกอบที่ก่อให้เกิดกิจกรรมของซิตรัลเป็นของเศษส่วนของไฮโดรคาร์บอน เศษส่วนไฮโดรคาร์บอนของ L. cubeba และ V. officinalis EOs มีองค์ประกอบทางเคมีที่ค่อนข้างคล้ายคลึงกัน Limonene (68.4 และ 50.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ), trans- -caryophyllene (12.0 และ 7.8 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ), -pinene (1.7 และ 7.5 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) -pinene (2.5 และ 12.9 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ), sabinene (2.7 และ 3.8 ตามลำดับ) และ -myrcene (2.0 และ 2.4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) เป็นสารประกอบที่มีมากที่สุดในเศษส่วนทั้งสองและมีปริมาณใกล้เคียงกัน ยกเว้น -pinene และ -pinene ซึ่งมีอยู่ใน V. officinalis EO ไฮโดรคาร์บอนเศษส่วน

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 เปอร์เซ็นต์ใน EO ทั้งสอง), ลิโมนีน (97 และ 94 เปอร์เซ็นต์ใน L. cubeba และ V. officinalis EO ตามลำดับ) และซาบีนีน (87 เปอร์เซ็นต์ใน EO ทั้งสอง) ในขณะที่สังเกตเห็นความเกินของอีแนนทิโอเมอร์ที่แตกต่างกันสำหรับ -pinene ((-)- enantiomer: 38 เปอร์เซ็นต์ใน L. cubebaEO และ 73 เปอร์เซ็นต์ใน V. officinalis EO) และ -pinene ((-)-enantiomer: 67 เปอร์เซ็นต์ใน L. cubeba EO และ 88 เปอร์เซ็นต์ใน V. officinalis EO) ใน EO ทั้งสอง (-)-limonene มีสัดส่วนมากกว่าร้อยละ 50 ของเศษส่วนทั้งหมด อย่างไรก็ตาม แม้ว่าการศึกษาก่อนหน้านี้จะรายงานถึงการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสจากเห็ดเนื่องจากมีปริมาณมาก [22,23] แต่ (-)-ลิโมนีนในที่นี้ไม่ได้แสดงฤทธิ์ในการยับยั้งไทโรซิเนส ได้รับผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันสำหรับ (บวก )-ลิโมนีน,ของผสมราซิมิก, และสารประกอบ (-)-ทรานส์- -แคริโอฟิลลีน, (±)- -พินีนและ(±)- -พีนีน . ซาบีนีนไม่ได้รับการทดสอบเนื่องจากได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีเห็ดเล็กน้อยไทโรซิเนสผลการยับยั้ง [8]. สอดคล้องกับการค้นพบครั้งก่อน [8] ไมร์ซีนลดกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ด เมื่อทดสอบที่ความเข้มข้นที่สังเกตพบใน L. cubeba และ V. officinalis EOs 166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร กิจกรรม -ไมร์ซีนจะเชื่อมช่องว่างระหว่างผลการยับยั้งที่คาดไว้ของ EO ถ้า citral เป็นสารประกอบออกฤทธิ์เพียงชนิดเดียวและผลการทดลอง ตรงกันข้ามกับการสังเกตโดยมัตสึอุระและคณะ [8], -ไมร์ซีนพิสูจน์แล้วว่าเป็นสารยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดที่มีศักยภาพมากกว่าซิตรัล เนื่องจาก IC50 ของมันต่ำกว่าเกือบสิบเท่า (13.3 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเทียบกับ 121.8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ความแตกต่างนี้อาจถูกกำหนดโดยพื้นผิวที่แตกต่างกันที่ใช้ มัตสึอุระและคณะ ศึกษาเฉพาะเห็ด tyrosinase diphenolaseactivity เท่านั้น เนื่องจากใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ในขณะที่ในการศึกษานี้ ใช้ L-tyrosine ผลการวิจัยในปัจจุบันชี้ให้เห็นว่า -ไมร์ซีนอาจมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสโมโนฟีโนเลสมากกว่าไดฟีโนเลส

M. officinalis EO 1 แสดงเศษส่วนของไฮโดรคาร์บอนขนาดเล็กซึ่งคิดเป็นสัดส่วนน้อยกว่า 3 เปอร์เซ็นต์ของทั้งหมด และไม่มีฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนส อย่างไรก็ตาม M. officinalisEO 1 Oxygenated Fraction ยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดในระดับที่มากกว่าที่คาดไว้จากปริมาณซิตรัล (รูปที่ 3) ส่วนนี้ประกอบด้วยซิโตรเนลอลจำนวนมากนอกเหนือจากเนอรัลและเจอราเนี่ยล และการวิเคราะห์ chiral เผยให้เห็นความบริสุทธิ์ของซิโตรเนลอลที่มีความบริสุทธิ์สูง เพื่อสนับสนุน (บวก) อิแนนทิโอเมอร์ (98.3 เปอร์เซ็นต์) เมื่อทำการทดสอบอย่างอิสระที่ความเข้มข้น 166.7 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (บวก )-citronellal ยับยั้ง Mushroomtyrosinase ได้เพียงเล็กน้อย แม้ว่ากิจกรรมของมันจะดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อทดสอบร่วมกับ citral ผลลัพธ์เหล่านี้อาจอธิบายความแตกต่างที่สังเกตได้ในเปอร์เซ็นต์ของเห็ดไทโรซิเนสการยับยั้งใน M. officinalis EOs ต่างๆ M.officinalis EO 2 และ 3 มีปริมาณ Citronellal ต่ำมาก ซึ่งอาจเป็นสาเหตุว่าทำไมกิจกรรมการยับยั้งของ M. officinalis EO 1 จึงต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. รีเอเจนต์

ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), ไทโรซิเนสจากเห็ดจาก Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosine, กรดโคจิก, citral, citronellal, -myrcene, ( บวก )-ลิโมนีน, (-)-ลิโมนีน,(±)-ลิโมนีน, ( ±)- และซื้อไพนีนจาก Merck Life Science Srl (มิลาน ประเทศอิตาลี) Litsea cubeba, Verbena officinalis และ Cymbopogon schoenanthus EOs ได้รับการจัดหาโดย Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italy) สามกลุ่มของปีที่แตกต่างกัน (เช่น 2020,2019, 2018) ได้รับการทดสอบสำหรับแต่ละรายการ ตัวอย่าง EO ของ Melissa officinalis สามตัวอย่างได้รับการตรวจสอบ ตัวอย่างหนึ่งจัดทำโดย Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria) หนึ่งตัวอย่างโดย ErboristeriaMagentina Srl ในขณะที่ชุดสุดท้ายซื้อจากร้านค้าในท้องถิ่นและมาจาก SpecchiasolS.rl (Bussolengo, อิตาลี) ในข้อความนี้ ผู้เขียนอ้างถึง EO ต่างๆ ของ Melissaofficinalis ว่า M. officinalis EOs 1, 2 และ 3 ตามลำดับ ได้รับ EO ที่ให้มาตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ใน European Pharmacopoeia [24] Melissa officinalis และ Verbena officinalis EOs ถูกผลิตขึ้นโดยการกลั่นน้ำจากใบและส่วนพืชทางอากาศตามลำดับ ในทำนองเดียวกัน Litsea cubeba และ Cymbopogon schoenanthus EO ได้มาจากการกลั่นด้วยไอน้ำของผลไม้สดและชิ้นส่วนทางอากาศสดตามลำดับ EachEO ได้รับการวิเคราะห์ทีละส่วนโดย GC-MS ทันทีที่ซื้อ/จัดหาโดยผู้ผลิตที่เกี่ยวข้อง ทุกปีที่จัดเก็บ และก่อนการศึกษากิจกรรมการยับยั้งเห็ดไทโรซิเนส

3.2. การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนสในหลอดทดลอง

ดิไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้งของ EOs และสารประกอบที่แยกได้ถูกตรวจสอบในหลอดทดลองโดยใช้การทดสอบเอนไซม์ตามการอ่านค่าสีที่ปรับให้เหมาะสมโดย Zengh et al [25] โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของ EO รวมถึงไฮโดรคาร์บอนและเศษส่วนออกซิเจนและสารประกอบบริสุทธิ์ตามลำดับถูกตรวจสอบในหลอดแก้วการทดสอบเอนไซม์ตามการอ่านค่าสีที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมโดย Zengh et al [25] โดยดัดแปลงเล็กน้อย: ทำการทดสอบที่อุณหภูมิห้องและไทโรซิเนสการยับยั้งถูกวัดโดยพิจารณาจากกลุ่มควบคุมและการดูดกลืนแสงของตัวอย่างหลังจากการบ่มเพาะ 6 นาที แทนที่จะเป็นหลังจาก 20 นาที เพื่อดำเนินการภายใต้ส่วนเชิงเส้นของปฏิกิริยาของเอนไซม์ ซึ่งให้ผลการยับยั้งที่แม่นยำยิ่งขึ้น [26,27] เห็ด tyrosinase จาก Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach ได้รับการคัดเลือกสำหรับการศึกษานี้ L-Tyrosine ถูกใช้เป็นสารตั้งต้น ซึ่งหมายความว่ากิจกรรมการยับยั้ง tyrosinase โดยรวมได้รับการตรวจสอบโดยไม่แยกความแตกต่างระหว่าง tyrosinase monophenolase และ diphenolase activity การวัดด้วยแสงที่ 475 นาโนเมตรได้กระทำบน Thermo spectronic Genesys6 และใช้กรดโคจิกเป็นตัวยับยั้งการควบคุมเชิงบวก สารละลายของสารยับยั้งที่เป็นไปได้ที่ตรวจสอบแล้ว (EO, เศษส่วนที่แยกได้ของ EO, สารประกอบแต่ละอย่างของ EO และโคจิคาซิด) ถูกเตรียมใน DMSO ตารางที่ 7 รายงานความเข้มข้นที่ทดสอบแล้วสำหรับตัวยับยั้งศักยภาพที่ผูกมัดแต่ละตัว เห็ดไทโรซิเนสสารละลาย 200 U/มล. (27.9 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเตรียมในโซเดียม ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.8) และส่วนย่อยของ 9 มล. ถูกเก็บไว้ที่ −18 ◦C และละลายก่อนการทดลอง สารละลายไทโรซีน 0.1 มก./มล. ถูกเตรียมในบัฟเฟอร์โซเดียม ฟอสเฟต (pH 6.8) และต่ออายุทุกวัน ของผสมของปฏิกิริยาถูกใส่ลงในขวดไวอัลในลำดับต่อไปนี้: 1 มล. ของไทโรซิเนสสารละลายจากเห็ด 200 U/mL; สารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 1 มล. 10 ไมโครลิตรของ EO/สารประกอบเดี่ยว/สารละลายกรดโคจิก และสุดท้ายคือ 1 มล. ของสารละลายไทโรซีน 0.1 มก./มล. เปอร์เซ็นต์ DMSO สุดท้ายในของผสมปฏิกิริยาคือ 0.3 เปอร์เซ็นต์ การสอบวิเคราะห์ถูกดำเนินการในขวดไวอัลปิดผนึกขนาด 4 มล. เพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียส่วนประกอบ EO ใดๆ ไปในสิ่งแวดล้อมโดยรอบและเพื่อลดการปลดปล่อยของพวกมันลงในช่องว่างส่วนหัวเหนือส่วนผสมของปฏิกิริยา ของผสมปฏิกิริยาถูกบ่มในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิคงที่ที่ 25 ◦C เป็นเวลา 6 นาที ต่อจากนั้น ค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรถูกบันทึก เนื่องจากความยาวคลื่นนี้ช่วยให้สามารถระบุโดปาโครมได้ ค่าการดูดกลืนแสงที่สอดคล้องกับ 100 เปอร์เซ็นต์ของแอคติวิตีของไทโรซิเนสถูกวัดโดยการแทนที่ EO/สารประกอบแต่ละชนิด/สารละลายกรดโคจิกด้วย 10 ไมโครลิตรของ DMSO บริสุทธิ์ สารละลายเปล่าถูกเตรียมดังนี้: 2 มล. ของสารละลายบัฟเฟอร์โซเดียม ฟอสเฟต, 10 ไมโครลิตรของ EO/สารประกอบแต่ละชนิด /กรดโคจิก/สารละลาย DMSO และ 1 มล. ของสารละลายไทโรซินีนละลาย 0.1 มก./มล. เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งไทโรซิเนสถูกวัดตามสมการด้านล่าง: เปอร์เซ็นต์ การยับยั้ง=∆A (การควบคุม) − ∆A (ตัวอย่าง) / ∆A (การควบคุม) × 100,∆A (การควบคุม) หรือ (ตัวอย่าง) {{ 33}} A475 (Control) หรือ (Sample) − A475 (Control Blank) หรือ (Sample Blank)

3.3. โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์แฟลช

การแยกส่วน EO ดำเนินการบนระบบแฟลชคอลัมน์โครมาโตกราฟี PuriFlash450 โดย Sepachrom (เมืองโร มิลาน ประเทศอิตาลี) ซึ่งติดตั้งทั้งเครื่องตรวจจับ UV และ ELSD ปริมาณ EO ที่แยกส่วน: 900.0 มก. ระยะอยู่กับที่: อนุภาคซิลิกาเจลทรงกลม 50 µm, 25 มก. (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) มาจาก Sepachrom; เฟสเคลื่อนที่: Petrolether (A) และเอทิลอะซิเตท (B); อัตราการไหล 25 มล./นาที การชะแบบเกรเดียนต์เชิงเส้นถูกนำไปใช้จาก 100 เปอร์เซ็นต์ของ A ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ของ A และ 20 เปอร์เซ็นต์ของ B ตลอด 20 นาที

3.4. เงื่อนไขการวิเคราะห์

สารละลาย EO และของแยกย่อยตามลำดับถูกเตรียมในไซโคลเฮกซาเนตที่ความเข้มข้น 5.0 มก./มล. และวิเคราะห์โดย GC-MS Citral, citronellal, -myrcene และ limonene ถูกหาปริมาณในแต่ละ EO และเศษส่วนที่เกี่ยวข้องกันโดยใช้วิธีการสอบเทียบมาตรฐานภายนอก ระดับการสอบเทียบที่เหมาะสมถูกเตรียมโดยอินไซโคลเฮกเซนและวิเคราะห์โดย GC-MS Tridecane (C13) 1.0 มก./มล. ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายในเพื่อทำให้สัญญาณที่วิเคราะห์เป็นปกติ ตารางที่ 2 สรุปช่วงความเข้มข้นที่พิจารณาแล้วสำหรับสารประกอบเชิงปริมาณแต่ละชนิด

การวิเคราะห์ GC-MS ดำเนินการโดยใช้เครื่องเก็บตัวอย่างอเนกประสงค์ Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr ประเทศเยอรมนี) ที่ติดตั้งบน Agilent 6890 N GC ร่วมกับ 5975 MSD และติดตั้ง ChemStation เวอร์ชัน E 02.02.1431 ระบบประมวลผลข้อมูล (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA) เงื่อนไข GC: อุณหภูมิหัวฉีด: 250 ◦C; โหมดการฉีด: แยก; อัตราส่วน: 1/20; ก๊าซพาหะ: ฮีเลียม; อัตราการไหลคงที่: 1 มล./นาที; คอลัมน์: Mega5 (95 เปอร์เซ็นต์ polydimethylsiloxane, 5 เปอร์เซ็นต์ phenyl) df 0.25 µm, dc 0.25 mm, length 25 m, from MEGA(Legnano, Italy). โปรแกรมอุณหภูมิ: 50 ◦C//3 ◦C/นาที//180 ◦C//10 ◦C/นาที//250 ◦C (5 นาที) เงื่อนไข MSD: MS ทำงานในโหมด EI (70 eV); ช่วงการสแกน: 35 ถึง 350 amu; เวลาพัก 40 ms; อุณหภูมิแหล่งกำเนิดไอออน: 230 ◦C; อุณหภูมิสี่ขั้ว: 150 ◦C; อุณหภูมิสายส่ง: 280 ◦C ตัวบ่งชี้ EO ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบทั้งดัชนีการกักเก็บเชิงเส้น (ITs) ของพวกมันซึ่งคำนวณกับของผสมไฮโดรคาร์บอน C9-C25 และแมสสเปกตรัมของพวกมันกับตัวอย่างจริงหรือจากไลบรารีแมสสเปกตรัมที่มีจำหน่ายในท้องตลาด (Adams, 2007) การวิเคราะห์ EO ไครัลถูกดำเนินการโดยใช้สภาวะการวิเคราะห์เดียวกันบน 2,3-di-O-methyl-6-Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0.25 µm, dc 0.25 มม. ยาว 25 ม. จาก MEGA โปรแกรมอุณหภูมิ: 40 ◦C (1 นาที)//2 ◦C/นาที//220 ◦C (5 นาที)

การวิเคราะห์ GC-FID ดำเนินการในเครื่องมือเดียวกัน เงื่อนไข GC: อุณหภูมิหัวฉีด: 250 ◦C; โหมดการฉีด: แยก; อัตราส่วน: 1/20; ก๊าซพาหะ: ไฮโดรเจน; อัตราการไหล: 1 มล./นาที โปรแกรมอุณหภูมิ: 40 ◦C (1 นาที)//2 ◦C/นาที//220 ◦C (5 นาที)

4. บทสรุป

วัตถุประสงค์ของการตรวจสอบนี้คือ (1) เพื่อตรวจสอบอย่างครอบคลุมใน vitromushroomไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้ง Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis และ Verbena officinalis EOs และ (2) เพื่อตรวจสอบว่าฤทธิ์ทางชีวภาพของพวกมันถูกกำหนดตามเนื้อหา citral เท่านั้นหรือหากมี monoterpenes ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพเพิ่มเติมที่นำไปสู่กิจกรรมทางชีววิทยาที่ตรวจสอบโดยใช้ a แนวทางการวิเคราะห์ทางชีวภาพ-การนำเศษส่วน การศึกษานี้ระบุว่าใน L. cubeba และ V. officinalis EOs -myrcene มีส่วนในกิจกรรมการยับยั้ง EOs แม้ว่าจะมีปริมาณเพียงเล็กน้อย และแสดงให้เห็นว่ามีพลังในการยับยั้ง citral ที่มากกว่า การค้นพบที่สำคัญประการที่สองคือว่า ( บวก ) - เห็ดซิโทรเนลเสริมมะนาวไทโรซิเนสพลังการยับยั้ง อาจมีปฏิสัมพันธ์ร่วมกันเนื่องจากไม่ได้แสดงกิจกรรมใดๆ ในตัวมันเอง การค้นพบครั้งหลังได้อธิบายว่าทำไมใน M. officinalis EOs ที่มีปริมาณมะนาว (บวก) เล็กน้อย กิจกรรมการยับยั้งจึงสอดคล้องกับเนื้อหาในซิตรอลในขณะที่ตรงกันข้ามเป็นจริงสำหรับ M. officinalis EO ที่มีความอุดมสมบูรณ์ของมะนาวค่อนข้างสูง (บวก) แม้กระทั่ง แม้ว่าจะยังคงต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อกำหนดประเภทของปฏิกิริยาโต้ตอบที่เกิดขึ้นระหว่าง -ไมร์ซีนและซิทรัล และระหว่างซิโตรเนลลาและซิทรัลอย่างแม่นยำ และเพื่อประเมินกิจกรรมการยับยั้งของ EO เหล่านี้และสารประกอบแต่ละตัวในมนุษย์ไทโรซิเนสผลของการศึกษานี้อาจช่วยในการออกแบบส่วนผสมของ EO หรือ EO ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีเหตุผล ซึ่งช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพทางชีวภาพของพวกมัน และเพิ่มศักยภาพของพวกมันในฐานะสารเสริมในการรักษารอยดำ

อ้างอิง

1. พิลไลยาร์ ต.; Manickam, ม.; Namasivayam, V. สารฟอกสีผิว: มุมมองทางเคมียาของสารยับยั้งไทโรซิเนส เอนไซม์ ยับยั้ง เมดิ. เคมี. 2017, 32, 403–425. [ข้ามอ้างอิง]

2. Desmedt, B.; หลักสูตร, พี.; เดอเบียร์ JO; โรเจอร์ส, วี.; Grosber, ม.; Deconinck, E.; De Paepe, K. ภาพรวมของตัวแทนผิวขาวพร้อมข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับตลาดเครื่องสำอางที่ผิดกฎหมายในยุโรป เจ. ยูโร. อคาเด เดอร์มาทอล เวเนเรรอล. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, อี.; โรเจอร์ส, วี.; หลักสูตร, พี.; เดอเบียร์ JO; เดอ เป้เป้, เค.; Deconinck, E. ลักษณะของเครื่องสำอางฟอกสีผิวที่น่าสงสัย เจ. ฟาร์ม. ไบโอเมด ก้น 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. คูโบะ ฉัน; Ikuyo, KH Flavonols จากดอกหญ้าฝรั่น: ฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสและกลไกการยับยั้ง เจ. อากริก. เคมีอาหาร 1999, 47, 4121–4125. [ข้ามอ้างอิง]

5. ช้าง, C.-TT; ช้าง, W.-LL; Hsu, J.-CC; ชิห์ วาย.; Chou, S.-TT องค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสของน้ำมันหอมระเหยจากขี้เหล็ก Cinnamomum บอท. สตั๊ด. 2013, 54, 2–8. [ข้ามอ้างอิง]

6. การ์เซีย-โมลินา, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; การ์เซีย-โมลินา, เอฟ.; การ์เซีย-รุยซ์ เพนซิลเวเนีย; Garcia-Canovas, F. การกระทำของ tyrosinase onortho-substituted phenols: อิทธิพลที่เป็นไปได้ต่อการเกิดสีน้ำตาลและการสร้างเม็ดสี เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2012, 60, 6447–6453. [ข้ามอ้างอิง]

7. คูโบะ ฉัน.; Kinst-Hori, I. สารยับยั้ง Tyrosinase จากยี่หร่า เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 1998, 46, 5338–5341. [ข้ามอ้างอิง]

8. มัตสึอุระ ร.; อุเคดะ, เอช.; Sawamura, M. กิจกรรมการยับยั้ง Tyrosinase ของน้ำมันหอมระเหยส้ม เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2549,54, 2309–2313. [ข้ามอ้างอิง]

9. เลิศสถิตธนากร, ป.; ทวีชัยศุภพงษ์, ส.; อารมณ์ดี, ค.; คุณกิตติ, ว. ฤทธิ์ทางชีวภาพในหลอดทดลองของน้ำมันหอมระเหยที่ใช้สำหรับควบคุมสิว อินเตอร์ เจ อโรมาเธอร์. 2549, 16, 43–49. [ข้ามอ้างอิง]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; เอลเฟกิ, A.; Talarmin, H. คุณสมบัติทางชีวภาพของ citral และการป้องกันที่อาจเกิดขึ้นกับความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากแอสไพรินในเซลล์ IEC-6 ไบโอเมด เภสัช. 2017, 87, 653–660. [ข้ามอ้างอิง]

11. ลี เอช.เจ.; จอง, HS; คิม ดีเจ; โน วายเอช; ยุค DY; Hong, JT Inhibitory effect ของ citral ต่อการผลิต NO โดยการปราบปรามการแสดงออกของ iNOS และการกระตุ้น NF-κBในเซลล์ RAW264.7 โค้ง. เภสัช. ความละเอียด 2551, 31, 342–349. [ข้ามอ้างอิง]

12. คาร์วัลโญ่, PMM; Macêdo, CAF; ริเบโร, ทีเอฟ; ซิลวา เอเอ; ดาซิลวา RER; เดอโมเรส์ LP; Kerntopf นาย; Menezes, IRA;Barbosa, R. ผลของ Lippia alba (Mill.) น้ำมันหอมระเหย NE Brown และองค์ประกอบหลัก citral และ limonene ต่อกล้ามเนื้อ trachealsmooth ของหนู เทคโนโลยีชีวภาพ ตัวแทน. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; ซิลวา, AdA; ดาซิลวา RER; คอสตา, RHSd; มอนเตโร, Á.B.; บาร์โบซา, CRdS; อาโมริม, ทีดีเอส; เดอเมเนเซส, ไออาร์เอ; Kerntopf นาย; Barbosa, R. กิจกรรม Tocolytic ของน้ำมันหอมระเหย Lippia alba และองค์ประกอบหลัก citral andlimonene บนมดลูกที่แยกได้ของหนู เคมี. ไบโอล. มีปฏิสัมพันธ์. 2019, 297, 155–159. [ข้ามอ้างอิง]

14. ดา ซิลวา, RER; เดอโมเรส์ LP; ซิลวา เอเอ; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf นาย; Menezes, ไออาร์เอ; ลีล-คาร์โดโซ,JH; Barbosa, R. Vasorelaxant ผลของน้ำมันหอมระเหย Lippia alba และส่วนประกอบหลักของ citral ต่อการหดตัวของหลอดเลือดแดงใหญ่ที่แยกได้ ไบโอเมด เภสัช. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. ซูซา ดีจี; ซูซา SDG; ซิลวา, RER; ซิลวา-อัลเวส แคนซัส; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf นาย; Menezes, ไออาร์เอ; ลีล-คาร์โดโซ,JH; Barbosa, R. น้ำมันหอมระเหยจาก Lippia alba และซิทรัลที่เป็นส่วนประกอบหลักขัดขวางความตื่นเต้นง่ายของเส้นประสาทไซอาติกของหนู บราซ. เจ. เมด.ไบโอล. ความละเอียด 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. หวง X.-W.; เฟิง Y.-C.; หวาง, Y.; หลี่, H.-L. ศักยภาพการใช้น้ำมันหอมระเหยที่สกัดจากผลไม้ Litsea cubeba จากประเทศจีน เจ. เอสเซนท์. ความละเอียดของน้ำมัน 2013, 25, 112–119. [ข้ามอ้างอิง]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; ฮัสซันข่าน มอนแทนา; Muñoz-Munoz, เจ.; การ์เซีย-โมลินา, เอฟ.; การ์เซีย-คาโนวาส, เอฟ.; Saboury, AA การทบทวนอย่างครอบคลุมเกี่ยวกับสารยับยั้งไทโรซิเนส เจ. เอนไซม์. ยับยั้ง เมดิ. เคมี. 2019, 34, 279–309. [ข้ามอ้างอิง]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; มัตเตโอโด, ม.; Sgorbini, B.; มอนเดลโล, L.; เซลล์เนอร์, บีดี; คอสต้า, อาร์.; Rubiolo, P. การวิเคราะห์เชิงปริมาณของน้ำมันหอมระเหย: งานที่ซับซ้อน กลิ่นหอม จ. 2008, 23, 382–391. [ข้ามอ้างอิง]

19. รูบิโอโล, พี.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; คอร์เดโร, C.; Bicchi, C. น้ำมันหอมระเหยและสารระเหย: การเตรียมตัวอย่างและการวิเคราะห์ รีวิวFlavour Fragr. จ. 2010, 25, 282–290. [ข้ามอ้างอิง]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, เจ.; Król, D. การประเมินความแปรปรวนของลักษณะทางสัณฐานวิทยาและทางเคมีของมะนาวบาล์มที่เลือก (Melissa officinalis L. ) จีโนไทป์ Ind. พืชผล Prod. 2013, 49, 515–520. [ข้ามอ้างอิง]

21. คูโบะ ฉัน; Kinst-Hori, I. กิจกรรมการยับยั้ง Tyrosinase ของสารประกอบรสน้ำมันมะกอก เจ. อากริก. เคมีอาหาร. 2542, 47, 4574–4578.[ข้ามอ้างอิง] [PubMed]

22. Fiocco, D.; อาร์ซิอูลี, ม.; อารีน่า, ส.ส.; Benvenuti, S.; Gallone, A. องค์ประกอบทางเคมีและศักยภาพในการต่อต้านการสร้างเม็ดสีของน้ำมันหอมระเหยต่างๆ กลิ่นหอม จ. 2016, 31, 255–261. [ข้ามอ้างอิง]

23. หู เจเจ; หลี่ X .; หลิว XH; Zhang, WP Inhibitory effect ของน้ำมันหอมระเหยมะนาวต่อกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ดในหลอดทดลอง มด อาหารวิทย์. เทคโนโลยี 2015, 31, 97–105. [ข้ามอ้างอิง]

24. สภายุโรป. เภสัชตำรับยุโรป ฉบับที่ 10; สภายุโรป: สตราสบูร์ก, ฝรั่งเศส, 2020; ไอเอสบีเอ็น 978-92-871-8921-9

25. เจิ้ง ZP; ตาล HY; เฉินเจ .; Wang, M. การกำหนดลักษณะของสารยับยั้งไทโรซิเนสในกิ่งของ Cudrania tricuspidata และการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรม Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. วิลเลียมส์ เคพี; Scott, JE Enzyme Assay Design สำหรับการคัดกรองปริมาณงานสูง ในการคัดกรองปริมาณงานสูง วิธีการในอณูชีววิทยา (วิธีการและโปรโตคอล); Janzen, WP, Paul, B. , Eds.; Humana Press: คลิฟตัน, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา, 2552; เล่ม 565,หน้า. 107–126.

27. บรูคส์ HB; Geeganage, S.; คาห์ล SD; มอนโทรส, C.; Sittampalam, ส.; สมิธ เอ็มซี; Weidner, JR Basics of Enzymatic Assays สำหรับ HTS ในคู่มือแนะแนวการทดสอบ; Markossian, S. , Sittampalam, S. , Grossman, A. , Eds.; Eli Lilly & Company และ NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004