Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์มะเร็งตับ H22 ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายใน

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li และ Jinyao Li

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight เป็นยาจีนโบราณที่ทำให้รากของต้น Tamarix เป็นปรสิต และเคยใช้รักษาอาการหย่อนสมรรถภาพทางเพศของผู้ชาย ภาวะเป็นหมัน ความอ่อนแอของร่างกาย และเป็นยาบำรุงกำลัง อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์ต้านมะเร็งของมะเร็งตับก็ยังเข้าใจยาก เราตรวจสอบฤทธิ์ต้านเนื้องอกของC. tubulosa phenylethanoid ไกลโคไซด์(CTPG) บนเซลล์มะเร็งตับ H22 ทั้งในหลอดทดลอง และในร่างกาย และกลไกของเซลล์ วิธีการ: วิเคราะห์ลักษณะทางสัณฐานวิทยา ความมีชีวิต อะพอพโทซิส วัฏจักรเซลล์ และศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (Δψm) ของเซลล์ H22 ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว การทดสอบ MTT และโฟลว์ไซโตเมทรีตามลำดับ Western blot ตรวจพบการแสดงออกและการกระตุ้นโปรตีนในวิถีการตายของเซลล์ ผลการต้านเนื้องอกในร่างกายได้รับการประเมินในแบบจำลองเมาส์เนื้องอกที่สร้างขึ้นโดยใช้หนูเมาส์คุนหมิงเพศผู้ ผลลัพธ์: การรักษาด้วย CTPG ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและเวลา ซึ่งสัมพันธ์กับการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสที่เพิ่มขึ้นและการหยุดวงจรของเซลล์ที่ระยะ G0/G1 และ G2/M นอกจากนี้ การควบแน่นของโครโมโซมถูกสังเกตพบในเซลล์ H22 ที่บำบัดด้วย CTPG การรักษาด้วย CTPG เพิ่มอัตราส่วน Bax/ Bcl-2 อย่างมีนัยสำคัญ ลด Δψm และเพิ่มการปลดปล่อยไซโตโครมค ระดับของ caspase ที่แยกออก-8 และ caspase-9 ในเส้นทางการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายในเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญซึ่งเปิดใช้งาน caspase ตามลำดับ-7 และ -3 เพื่อแยก PARP สุดท้าย CTPG (Cistanchetubulosaฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์)ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ H22 ในหนูทดลอง และปรับปรุงอัตราการรอดชีวิตของหนูที่เป็นเนื้องอก สรุป: ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CTPG ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 ผ่านวิถีการตายของเซลล์ทั้งภายนอกและภายใน

พื้นหลัง

มะเร็งตับอยู่ในอันดับที่หกสำหรับอุบัติการณ์มะเร็งและอันดับที่สี่สำหรับการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งทั่วโลก นอกจากนี้ ยังอยู่ในอันดับที่สี่สำหรับอุบัติการณ์มะเร็งและอันดับหนึ่งสำหรับอัตราการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งในประเทศที่มีดัชนีทางสังคมวิทยาต่ำ [1] ในประเทศจีน มะเร็งตับเป็นสาเหตุอันดับ 3 ของการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งในปี 2558 [2] มะเร็งตับปฐมภูมิมากกว่าร้อยละ 90 เป็นมะเร็งตับ (HCC) ในโลก [3] ปัจจุบัน การผ่าตัดตับเป็นทางเลือกหลักสำหรับการรักษา HCC อย่างไรก็ตาม น้อยกว่า 30 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่มี HCC ตรงตามเกณฑ์ของการผ่าตัดรักษาตับ และอัตราการรอดชีวิตโดยรวม 5-ปียังคงต่ำถึง 35-50 เปอร์เซ็นต์เนื่องจากอัตราการกลับเป็นซ้ำสูง [4, 5 ]. ทางเลือกในการรักษาสำหรับผู้ป่วยที่มี HCC ระดับกลางถึงขั้นสูงนั้นมีจำกัดมาก Sorafenib ซึ่งเป็นยาที่มีเป้าหมายในระดับโมเลกุล ได้รับการอนุมัติจาก FDA ให้เป็นการรักษาทางเลือกแรกสำหรับ HCC ขั้นสูง อย่างไรก็ตาม โซราเฟนิบสามารถยืดอายุการอยู่รอดได้เพียง 3 เดือนเท่านั้น และอัตราการตอบสนองน้อยกว่า 4 เปอร์เซ็นต์ [6, 7] การพัฒนายาใหม่หรือกลยุทธ์ต่อต้านจุดตรวจสุขภาพฯ เป็นเรื่องเร่งด่วน แพทย์แผนจีน (TCM) เพียงอย่างเดียวหรือใช้ร่วมกับกลยุทธ์อื่น ๆ ถูกนำมาใช้ในการรักษา HCC และแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ทางคลินิกรวมถึงเวลาการอยู่รอดที่ยาวนาน คุณภาพชีวิตที่ดีขึ้น อาการไม่พึงประสงค์ลดลง และอื่น ๆ [8, 9]Cistancheเป็น TCM ชนิดหนึ่ง มีหน้าที่ทางชีวภาพต่างๆ เช่นต่อต้านอนุมูลอิสระ, ต้านการอักเสบ, ต่อต้านริ้วรอย,และการป้องกันระบบประสาท [10, 11] Phenylethanoid glycosides ได้รับการพิจารณาว่าเป็นส่วนประกอบสำคัญของCistancheซึ่งมีกิจกรรมที่หลากหลายรวมถึงการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน ต้านการอักเสบ การป้องกันตับ และการป้องกันระบบประสาท [12–15] กลุ่มของเราได้รายงานว่าCistanche tubulosa phenylethanoid ไกลโคไซด์(CTPG) สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ melanoma B16-F10 และยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกในหนูเมาส์ [16] ในการศึกษานี้ เราวัดผลต้านเนื้องอกของ CTPG ต่อเซลล์ HCC H22 ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย และตรวจสอบกลไกของมัน เราพบว่า CTPG ทำให้เกิดการตายของเซลล์ H22 ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายใน และยับยั้งการเติบโตของเนื้องอก H22 ในหนูทดลอง

วิธีการ

เซลล์ไลน์

เซลล์มะเร็งตับ H22 ของหนูเมาส์ได้มาจาก Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, China) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 (Gibco) ที่เสริมด้วย 100 U/ml penicillin และ 100 ug/ml สเตรปโตมัยซินและซีรั่มโคนมของทารกในครรภ์ที่ไม่ใช้งานความร้อน 10 เปอร์เซ็นต์ (Gibco) ที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้น CO2 5 เปอร์เซ็นต์

การทดสอบ MTT

CTPG ซื้อมาจาก Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, China) และสารประกอบหลักของ CTPG มีคุณสมบัติและวัดปริมาณโดยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง [16] ความอยู่รอดของเซลล์ถูกประเมินโดย 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Sigma, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) การทดสอบ เซลล์ H22 ถูกฉีดวัคซีนลงในจาน 96-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 104 เซลล์ในตัวกลาง 100 ul ต่อหลุมและเพาะเลี้ยงที่ 37 องศา หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ 0.3 เปอร์เซ็นต์ DMSO (เท่ากับใน 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG) เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมงตามลำดับ . หลังจากการปั่นแยกที่ 1000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 7 นาที, สารลอยลอยเหนือตะกอนถูกละทิ้งและ 100 ul ของสารละลาย MTT (5 มก./มล. ใน PBS) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 4 ชั่วโมงและเติม 100 ul DMSO เพื่อละลายผลึกฟอร์มาซานที่ก่อรูป ค่า OD490 ตรวจพบโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท 96- หลุม (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) ความมีชีวิตของเซลล์คำนวณตามสูตร: ความมีชีวิตของเซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 เปอร์เซ็นต์

การตรวจหาอะพอพโทซิส

เซลล์ H22 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มล.) หรือ 0.3 เปอร์เซ็นต์ DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นย้อมด้วย Annexin V FITC/ Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection Kit (YEASEN ประเทศจีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur, USA)

การตรวจหาศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย

เซลล์ H22 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นย้อมด้วยสีย้อม JC-1 ที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ (Beyotime, China) เป็นเวลา 20 ปี นาทีที่ 37 องศา . หลังจากการล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ JC-1 ตัวอย่างถูกแขวนลอยใหม่ด้วยบัฟเฟอร์ JC-1 300 ul และวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur, USA)

การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์

เซลล์ H22 ถูกฉีดวัคซีนในจานเพาะเลี้ยง 60 มม. และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ 0.3 เปอร์เซ็นต์ DMSO สำหรับ 24 ชม. เซลล์ทั้งหมดถูกรวบรวมและล้างสองครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกตรึงในเอธานอลที่เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง 70 เปอร์เซ็นต์ ที่ -20 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง และล้างสองครั้งด้วย PBS จากนั้นแขวนตะกอนอีกครั้งใน 300 ul Propidium iodide/RNase staining buffer (BD Biosciences) หลังจาก 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกรวบรวมโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur สหรัฐอเมริกา) และการกระจายวัฏจักรเซลล์ถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ ModFit LT 3.0

Hoechst 33,258 การย้อมสี

การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของนิวเคลียสของเซลล์ H22 ถูกวิเคราะห์โดยการย้อมสี Hoechst 33,258 ซึ่งจับ DNA ที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ เซลล์ H22 ถูกเพาะในจาน 6-หลุมที่ความเข้มข้น 1 × 105 เซลล์/หลุมในตัวกลางขนาด 2 มล. หลังจากการบรรจบกัน 60 เปอร์เซ็นต์ ~ 70 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกบำบัดด้วย CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกรวบรวมและตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ที่เย็นเป็นน้ำแข็ง 4 เปอร์เซ็นต์ที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์ถูกย้อมด้วย Hoechst 33,258 (Beyotime, China) ที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกสังเกตโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัว (Nikon Eclipse Ti-E, Japan)

หยดตะวันตก

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl-2 และ anti-Bax ถูกซื้อจาก Beyotime Biotech Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) แอนติ-แคสเปส-7, แอนติ-คีม-แคสเปส-7, แอนตี้-แคสเปส-8, แอนตี้-คลีฟ-แคสเปส-8, แอนติ-แคสเปส-9, แอนติ -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleaved PARP, anti-mouse IgG-HRP และ anti-rabbit IgG-HRP ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology Anti- -actin ซื้อมาจาก Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (ปักกิ่ง ประเทศจีน)

เซลล์ H22 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ 0.3 เปอร์เซ็นต์ DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกรวบรวมและสลายด้วย Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) เป็นเวลา 30 นาทีบนน้ำแข็ง ตัวอย่างถูกปั่นลง (12,000 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา ) เพื่อรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนและความเข้มข้นของโปรตีนถูกวัดโดยชุด BCA (Thermo Fisher Scientific, USA) ปริมาณโปรตีนที่เท่ากันในแต่ละตัวอย่างถูกแยกออกโดย SDS-PAGE 12 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF (Biosharp, China) หลังจากการปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์ TBST มีนมที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่สอดคล้องกันและแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) ตามลำดับ หลังจากล้างด้วย TBST ตรวจพบโปรตีนเป้าหมายโดยชุดทดสอบ ECL (Beyotime, China)

คำแถลงเกี่ยวกับสัตว์และจริยธรรม

หนูคุนหมิงเพศผู้อายุ 6-8 สัปดาห์ถูกซื้อมาจาก Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, China) หนูถูกเลี้ยงไว้ในห้องควบคุมสัตว์แบบหมุนรอบแสงมาตรฐานของมหาวิทยาลัยซินเจียง การศึกษาในสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัยซินเจียง โปรโตคอลได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองกับสัตว์ของ Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (BRGE-AE001) มหาวิทยาลัยซินเจียง

การศึกษาหนูเนื้องอก

สำหรับการเหนี่ยวนำของแบบจำลองเมาส์เนื้องอก หนูเมาส์คุนหมิงเพศผู้ถูกฉีดใต้ผิวหนังด้วยเซลล์ H22 1 × 106 เซลล์ใน 100 ul PBS เข้าไปในปีกขวา หลังจาก 3 วัน หนูถูกสุ่มแบ่งเป็น 3 กลุ่ม (7 หนู/ กลุ่ม) กลุ่มควบคุมถูกฉีดด้วย DMSO 0.1 มล. ใต้ผิวหนังรอบๆ เนื้องอก กลุ่ม CTPG-200 และ CTPG- 400 ถูกฉีดใต้ผิวหนังด้วย CTPG 200 หรือ 400 มก./กก. ใน DMSO 0.1 มล. รอบเนื้องอก หนูได้รับการรักษาทุก 2 วันนานถึง 21 วัน วัดขนาดเนื้องอกโดยใช้เครื่องวัดเส้นผ่าศูนย์กลางสูงสุด 25 วัน และปริมาตรเนื้องอกคำนวณตามสูตร: ปริมาตรเนื้องอก (mm3 )=(ยาว×กว้าง 2 )/2 หลังจาก 25 วัน การรอดชีวิตของหนูเนื้องอกได้รับการตรวจสอบทุกวันจนกระทั่งสิ้นสุดการศึกษานี้

การวิเคราะห์ทางสถิติ

นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวในกลุ่มบำบัดและกลุ่มควบคุม ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) p < 0.05="">

ผลลัพธ์

CTPG ลดความมีชีวิตของเซลล์ H22 ในหลอดทดลอง

เพื่อที่จะสำรวจผลต้านเนื้องอกของ CTPG ต่อ HCC เซลล์ H22 ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ในหลอดทดลอง หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง สังเกตลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ H22 โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว เราพบว่าสัณฐานวิทยาของเซลล์ H22 เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากโดยการรักษาด้วย CTPG ด้วยความเข้มข้นของ CTPG ที่เพิ่มขึ้น เซลล์จึงมีขนาดเล็กและกลม และจำนวนเซลล์ก็ลดลงอย่างมากเช่นกัน (รูปที่ 1a) การสอบวิเคราะห์ MTT ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ H22 หลังการบำบัดด้วย CTPG เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง ตามลำดับ CTPG ลดความมีชีวิตของเซลล์ H22 อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและขึ้นอยู่กับเวลา (รูปที่ 1b) CTPG ที่ 300 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรมาถึงอัตราการยับยั้งที่ดีที่สุด (รูปที่ 1c) ค่าของ IC50 ของ CTPG สำหรับเซลล์ H22 คือ 236 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรที่ 24 ชั่วโมงและ 169.8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรที่ 48 ชั่วโมง

CTPG ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ H22

เพื่อตรวจสอบว่าความมีชีวิตที่ลดลงของเซลล์ H22 เป็นสื่อกลางโดยการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์ H22 ได้รับการรักษาด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG (0, 100, 200, 300 และ 400 ug/ml) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและย้อมสี ด้วย PI และ Annexin V. ผลลัพธ์ของโฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่า CTPG ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ H22 อย่างมีนัยสำคัญ (รวมถึงอะพอพโทซิสในระยะต้นและปลาย) ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 2a) แม้ว่า CTPG ในปริมาณสูงจะช่วยเพิ่มเนื้อร้ายของเซลล์ H22 ได้อย่างมีนัยสำคัญ แต่เนื้อร้ายมีบทบาทสำคัญในการยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 เนื่องจากสัดส่วนที่ต่ำกว่า (8.3 เปอร์เซ็นต์) เมื่อเทียบกับการตายของเซลล์ (52.6 เปอร์เซ็นต์) นอกจากนี้ โปรตีนทั้งหมดของเซลล์ H22 ถูกแยกออกหลังการบำบัดด้วย CTPG และการแสดงออกของมะเร็งต่อมน้ำเหลืองต้านอะพอพโทซิสบีเซลล์ 2 (Bcl-2) และโปรอะพอพโทซิส BCL-2-โปรตีน X ที่เกี่ยวข้อง (Bax) ถูกตรวจพบโดย หยดตะวันตก ข้อมูลการสแกนระดับสีเทาแสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ Bax และ Bcl-2 เพิ่มขึ้นและลดลงตามลำดับ อัตราส่วน Bax/Bcl-2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2b) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CTPG กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ H22

CTPG ทำให้เกิดการรวมตัวของโครโมโซมและการหยุดวงจรของเซลล์ในเซลล์ H22

มีรายงานว่าความเสียหายของดีเอ็นเอและการจับกุมวัฏจักรของเซลล์ที่เกิดจากยาสามารถยับยั้งการเติบโตของเซลล์เนื้องอกและทำให้เกิดการตายของเซลล์เนื้องอกได้ [17, 18] เพื่อตรวจหาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของนิวเคลียสในเซลล์ H22 หลังการรักษาด้วย CTPG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ H22 ถูกย้อมโดย Hoechst 33,342 และสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัว เซลล์ที่บำบัดด้วย CTPG แสดงการเพิ่มขึ้นตามขนาดยาของโครมาตินที่ควบแน่นอย่างสว่างสดใสของนิวเคลียส ในขณะที่เซลล์ที่ไม่บำบัดแสดงนิวเคลียสที่ย้อมเป็นเนื้อเดียวกัน (รูปที่ 3a) การกระจายตัวของวัฏจักรเซลล์ในเซลล์ H22 ถูกวิเคราะห์เพิ่มเติมโดยการย้อมสี PI หลังการบำบัดด้วย CTPG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ดังแสดงในรูปที่ 3b การรักษาด้วย CTPG เพิ่มสัดส่วนของเซลล์ G0/G1- และ G2/M อย่างมีนัยสำคัญ และลดสัดส่วนของเซลล์ S-phase อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่า CTPG เหนี่ยวนำ G 0/G1 และ G2/M การหยุดเฟสในเซลล์ H22 ปริมาณสูงของ CTPG ยังเพิ่มสัดส่วนของเซลล์ย่อย G1 อย่างมีนัยสำคัญ

CTPG ลดศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียและเพิ่มการปลดปล่อยไซโตโครม c

เส้นทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรียมีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ [19, 20] การเปลี่ยนแปลงศักย์ของเยื่อหุ้มยล (Δψm) สามารถตรวจสอบได้โดยการย้อมสี JC-1 เนื่องจากการรวมตัวของ JC-1 (การเรืองแสงสีแดง) สามารถแตกตัวเป็นโมโนเมอร์ (เรืองแสงสีเขียว) โดยมีค่าลดลง Δψm [21] หลังการบำบัดด้วย CTPG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ H22 ถูกย้อมด้วยสีย้อม JC- 1 ข้อมูลโฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่าการเรืองแสงสีแดงในช่อง FL-2 และการเรืองแสงสีเขียวในช่อง FL-1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญและเพิ่มขึ้นตามการบำบัดด้วย CTPG สัดส่วนของ PE− FITC บวกเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4a) ซึ่งบ่งชี้ว่า CTPG ลด Δψm ในเซลล์ H22 ซึ่งสอดคล้องกับอัตราส่วน Bax/Bcl-2 ที่เพิ่มขึ้น ด้วยเหตุนี้ เราสังเกตเห็นการปลดปล่อยของไซโตโครม c เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อทำการรักษาด้วย CTPG (รูปที่ 4b) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG อาจชักนำการตายแบบอะพอพโทซิสบางส่วนในเซลล์ H22 ผ่านทางวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย (ภายใน)

CTPG เปิดใช้งานเส้นทางแคสเปสและป้องกันการซ่อมแซมดีเอ็นเอ

ต่อมา การกระตุ้นแคสเปสที่เหนี่ยวนำโดย CTPG ผ่านทางวิถีการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายในถูกวิเคราะห์ หลังจากการรักษาด้วย CTPG เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์ H22 และ Western blot ตรวจพบระดับของโปร-และแคสเปสแยก เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัดหรือกลุ่มควบคุม DMSO การบำบัดด้วย CTPG ที่มีการควบคุมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ไม่เพียงแต่ระดับของแคสเปสที่แยกออก-8 (วิถีภายนอก) แต่ยังรวมถึงระดับของแคสเปสแบบแยก-9 (วิถีทางภายใน) ด้วย (รูปที่ 5). ตามลำดับ แคสเปสที่ถูกกระตุ้น-8 และ -9 แยกโปรแคสเปสดาวน์สตรีม-3 และ -7 ที่สังเกตพบในรูปที่ 5 แคสเปสที่ถูกกระตุ้น-3 แยกดีเอ็นเอ ซ่อมแซมเอนไซม์ของโพลี (ADP-ไรโบส) โพลีเมอเรส (PARP) เพื่อป้องกันการซ่อมแซมดีเอ็นเอและสะสมความเสียหายของดีเอ็นเอตามที่สังเกตได้จากรูปที่ 3a

ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ H22 ผ่านทางวิถีการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายใน

CTPG ยับยั้งการเจริญเติบโตของ H22 HCC ในร่างกาย และเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของหนูเนื้องอก

ในที่สุด ผลการต้านเนื้องอกของ CTPG ต่อ HCC ถูกประเมินในแบบจำลองหนูเมาส์ที่เป็นเนื้องอก ซึ่งถูกสร้างขึ้นโดยการฉีดใต้ผิวหนังของเซลล์ H22 หลังจาก 3 วันของการฉีดเซลล์ H22 หนูที่เป็นเนื้องอกได้รับการรักษาด้วย CTPG 8 ครั้ง น้ำหนักตัวของหนูเมาส์และขนาดเนื้องอกถูกเฝ้าติดตามที่จุดเวลาที่ระบุ ดังแสดงในรูปที่ 6a น้ำหนักตัวของหนูในแต่ละกลุ่มไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าขนาดยาที่เลือกของ CTPG ไม่มีผลข้างเคียงที่ชัดเจน ที่น่าสนใจคือ การเติบโตของเนื้องอกในหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย CTPG ทั้ง 200 มก./กก. และ 400 มก./กก. ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6b) ยิ่งกว่านั้น การบำบัดด้วย CTPG สองขนาดช่วยปรับปรุงการอยู่รอดของหนูที่เป็นเนื้องอกอย่างมาก (3/7, 3/7) อย่างมากเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (0/7) ที่ส่วนท้ายของการทดลอง (รูปที่ 6b) นอกจากนี้เรายังพบว่า CTPG ช่วยเพิ่มการแพร่กระจายของ splenocytes ที่แยกได้จากหนู Kunming เพศผู้อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 6c) ซึ่งบ่งชี้ว่า CTPG มีผลกระตุ้นภูมิคุ้มกัน

การอภิปราย

มีการใช้ TCM ในการรักษาโรคต่างๆ รวมทั้งมะเร็งมาอย่างยาวนาน มีรายงานว่า TCM สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์เนื้องอกประเภทต่างๆ ผ่านทางช่องทางการส่งสัญญาณภายนอก (ขึ้นอยู่กับตัวรับความตาย) และภายใน (ขึ้นอยู่กับไมโตคอนเดรีย) เพื่อออกฤทธิ์ต้านเนื้องอก [22-25] สองเส้นทางสามารถเปิดใช้งาน caspase-8 และ -9 ตามลำดับ [24, 26] ที่นี่ เราพบว่า CTPG ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 อย่างมีนัยสำคัญผ่านการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์และการหยุดวงจรของเซลล์ ระดับของ caspase แบบแยกส่วน-8 และ -9 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญโดยการรักษาด้วย CTPG ซึ่งบ่งชี้ว่าทั้งเส้นทางการส่งสัญญาณภายนอกและภายในมีส่วนเกี่ยวข้องในการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราพบว่า CTPG ทำให้เกิดการตายของเซลล์ melanoma B16-F10 โดยวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรียซึ่งเพิ่มระดับของแคสเปสที่แยกออก-9 แต่ไม่ใช่แคสเปส-8 [16] CTPG อาจกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณที่แตกต่างกันในเซลล์เนื้องอกประเภทต่างๆ

ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียถูกควบคุมอย่างเข้มงวดโดยสมาชิกของตระกูลโปรตีน BCL-2 ซึ่งรวมถึง Bax และ Bcl-2 [27, 28] อัตราส่วนของ Bax ต่อ Bcl-2 มีบทบาทสำคัญในวิถีการตายของเซลล์ที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย [29] ในเซลล์ H22 ที่บำบัดด้วย CTPG อัตราส่วน Bax/Bcl-2 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งอาจทำให้ Δψm ลดลงและการปลดปล่อยไซโตโครม c ที่สังเกตพบในการศึกษานี้ ดังนั้น pro-caspase-9 จึงถูกแยกออกและเปิดใช้งาน สุดท้าย ผู้ริเริ่มของ caspase ที่ใช้งานอยู่-8 และ -9 ได้กระตุ้นผู้ดำเนินการ caspase-3 เพื่อแยก PARP เพื่อป้องกันการซ่อมแซม DNA เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CTPG เหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ H22 ผ่านทางวิถีการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายใน

ในรูปแบบเมาส์เนื้องอก CTPG ยับยั้งการเจริญเติบโตของ H22 HCC อย่างมีนัยสำคัญ และปรับปรุงการอยู่รอดของหนูเนื้องอกอย่างมาก ที่น่าสนใจคือ CTPG ขึ้นกับขนาดยาส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามจากหนูคุนหมิง ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา [16]

ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CTPG อาจยับยั้งการเจริญเติบโตของ H22 HCC ในหนูขาวผ่านทั้งฤทธิ์ต้านเนื้องอกโดยตรงและการเพิ่มภูมิคุ้มกันทางอ้อม

บทสรุป

CTPG ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ H22 ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย และกระตุ้นการตายของเซลล์ใน H22 ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณทั้งภายนอกและภายใน ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG อาจเป็นตัวเลือกที่มีศักยภาพสำหรับการรักษา HCC