Cistanche Glyside Rg1 ช่วยชะลอการเกิดพังผืดในตับที่เกิดจากวัยโดยการยับยั้ง NOX4/NLRP3 Inflammasome ในหนู SAMP8

เชิงนามธรรม.อายุมักมาพร้อมกับการบาดเจ็บของตับและพังผืดนำไปสู่การลดลงในที่สุดการทำงานของตับ. อย่างไรก็ตามกลไกของการบาดเจ็บของตับที่เกิดจากความชราและพังผืดยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้เท่าที่เราทราบ และขณะนี้ยังไม่มีทางเลือกในการรักษาที่มีประสิทธิภาพสำหรับอายุของตับ มีรายงานว่า Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) มีฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอยเนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพและฤทธิ์ต้านการอักเสบ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบผลการป้องกันและกลไกการออกฤทธิ์ของ Rg1 inการบาดเจ็บของตับที่เกิดจากความชราและพังผืดในชราภาพ-เร่งหนูทดลอง 8 (SAMP8) รักษาเป็นเวลา 9 สัปดาห์

คลิกที่นี่เพื่อรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ Cistanche Anti-aging treatment for Liver

ผลการตรวจทางจุลพยาธิวิทยาแสดงให้เห็นว่าการจัดเรียงตัวของเซลล์ตับไม่เป็นระเบียบ มีการเสื่อมสภาพคล้ายแวคิวโอลในเซลล์ส่วนใหญ่ และคอลลาเจน IV และ TGF‑ ระดับการแสดงออก 1 ระดับที่ตรวจพบผ่านทางอิมมูโนฮิสโตเคมียังถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม SAMP8 การรักษาด้วย Rg1 ดีขึ้นอย่างเห็นได้ชัดการบาดเจ็บของตับและพังผืดที่เกิดจากความชราและลดระดับการแสดงออกของคอลลาเจน IV และ TGF- ลงอย่างมาก 1. นอกจากนี้ ผลการย้อมด้วยไดไฮโดรเอทิลีนและ Western blotting แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย Rg1 ช่วยลดระดับของ reactive oxygen species (ROS) และ IL‑1 ได้อย่างมีนัยสำคัญ และลดระดับการแสดงออกของ NADPH oxidase 4 (NOX4), p47phox, p22phox, phosphorylated‑NF‑κB, caspase‑1, โปรตีนคล้ายจุดที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่มีโดเมนการสรรหาแคสเปสที่ปลาย C และโดเมน pyrin ตระกูล NLR ที่มี inflammasome 3 (NLRP3) ซึ่งถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อตับของหนู SAMP8 สูงอายุ โดยสรุปแล้ว ผลการวิจัยในปัจจุบันชี้ให้เห็นว่า Rg1 อาจลดทอนลงการบาดเจ็บของตับและพังผืดที่เกิดจากความชราโดยการลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของ ROS ที่อาศัย NOX4 และยับยั้งการกระตุ้นให้เกิดการอักเสบของ NLRP3

การแนะนำ

พังผืดในตับเป็นกระบวนการแบบไดนามิกที่เกี่ยวข้องกับการทับถมและการสลายอย่างต่อเนื่องของเมทริกซ์นอกเซลล์ ซึ่งส่วนใหญ่เป็นคอลลาเจนไฟบริลลา (3) ซึ่งมักเป็นขั้นตอนแรกในการบิดเบือนทางสถาปัตยกรรมและความผิดปกติที่ขัดขวางการทำงานปกติของตับ (4) หากไม่ได้รับการรักษา พังผืดในตับอาจนำไปสู่โรคตับแข็งและตับระยะลุกลาม (4) หลักฐานที่สะสมได้ชี้ให้เห็นว่าความไวต่อการเกิดพังผืดในตับและโรคตับอักเสบเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญตามอายุ (5) ดังนั้นจึงยังคงมีความสำคัญสูงในการศึกษาความชราของตับและกลไกพื้นฐานที่เกี่ยวข้องเพื่อจัดหากลยุทธ์ใหม่ในการป้องกันการเกิดพังผืดในตับที่เกี่ยวข้องกับอายุ7

ตัวรับการรับรู้ของโปรตีนคล้ายจุดที่เกี่ยวข้องกับ caspase‑1 และ apoptosis ที่มีโดเมนการสรรหา caspase ที่ปลาย C (ASC) จากการค้นพบการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า NLRP3 inflammasome ซึ่งเป็นชนิดของการอักเสบที่แสดงออกอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อจำนวนมาก รวมทั้งตับ ถูกค้นพบว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการวิวัฒนาการของพังผืดในตับและการลุกลามของการบาดเจ็บของตับและโรคตับที่เกี่ยวข้องกับอายุ ( 20-22). เมื่อเปิดใช้งานโดยสารระคายเคืองต่างๆ เช่น ATP และผลึกคอเลสเตอรอล ตลอดจนเชื้อโรคจากแบคทีเรีย ไวรัส และเชื้อรา (23,24) NLRP3 inflammasome จะตอบสนองต่อการอักเสบโดยการส่งเสริมการเจริญเติบโตของชุดของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ เช่น IL-1 และ IL‑18 (25) นอกจากนี้ มีรายงานว่าการสะสม ROS มากเกินไปกระตุ้น NLRP3 inflammasome ในตับในระหว่างกระบวนการชรา ซึ่งนำไปสู่โรคตับที่เกี่ยวข้องกับความชราในที่สุด (26)

วัสดุและวิธีการ

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >ร้อยละ 98 ; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) วันละครั้งเป็นเวลา 9 สัปดาห์ กลุ่ม SAMP8 และ SAMR1 ได้รับการบำบัดด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 9 สัปดาห์ หลังจากการรักษา 9 สัปดาห์ หนู 6 ตัวในแต่ละกลุ่มถูกสังเวยเนื่องจากความคลาดเคลื่อนของปากมดลูก ตับถูกเก็บเกี่ยวและเก็บไว้ในอุณหภูมิ -80˚C เพื่อใช้ในการทดลอง blotting แบบตะวันตกในภายหลัง หรือวางไว้

tome (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) ที่ -20˚C ชิ้นส่วนถูกล้างด้วย PBS และบ่มด้วยสารละลาย Hoechst 33258 5 มก./ลิตร (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น ส่วนต่างๆ จะถูกปิดผนึกด้วยสารป้องกันการเรืองแสง (Beyotime Institute of Biotechnology) และแสดงภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Olympus IX72; Olympus Corporation; กำลังขยาย x400) ซอฟต์แวร์ Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) ใช้เพื่อตรวจจับความหนาแน่นเฉลี่ยของการเรืองแสงสีแดงจากช่องมองภาพที่สุ่มเลือกสามช่องในแต่ละส่วนเพื่อระบุการผลิต ROS

การตรวจทางพยาธิวิทยาของเนื้อเยื่อตับ

การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในตับได้รับการตรวจสอบโดยใช้ H&E, periodic acid‑Schiff (PAS) และเทคนิคการย้อมสีไตรโครมของ Masson การย้อมสี H&E เป็นวิธีที่พบได้บ่อยที่สุดในการสังเกตการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพในเนื้อเยื่อ (38) โดยสังเขป ตัวอย่างตับถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง ทำให้แห้งและฝังพาราฟิน จากนั้นตัดออกเป็นส่วนหนา 5-µm ส่วนของตับ (n=4) ถูกลดพาราฟินในไซลีนและคืนน้ำในชุดแอลกอฮอล์แบบแบ่งระดับ (เอทานอลปราศจากน้ำ, เอทานอล 85 เปอร์เซ็นต์, เอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์) จากนั้นย้อมด้วยเฮมาทอกซีลินเป็นเวลา 3 นาทีและอีโอซินเป็นเวลา 30 วินาที ขั้นตอนทั้งหมดนี้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้อง ส่วนถูกปิดผนึกด้วยเรซินที่เป็นกลางและสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Olympus IX72; Olympus Corporation; กำลังขยาย x200)

การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนที่ฝังพาราฟิน (n=4) ถูกลดพาราฟินและคืนน้ำตามวิธีที่อธิบายไว้สำหรับการย้อมสี H&E จากนั้น ชิ้นส่วนถูกบ่มด้วย H2O2 ร้อยละ 3 เป็นเวลา 10 นาทีที่ 37˚C เพื่อสกัดกั้นกิจกรรมของเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสภายในร่างกายก่อนที่จะนำไปแช่ในบัฟเฟอร์โซเดียมซิเตรตเดือดเป็นเวลา 7 นาทีในเตาอบไมโครเวฟเพื่อดึงแอนติเจนออกมา หลังจากนั้น ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยซีรั่มแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ (cat. no. C0265; Beyotime Institute of Biotechnology) ที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 30 นาที เพื่อป้องกันการจับตัวที่ไม่จำเพาะเจาะจง จากนั้น ส่วนต่างๆ จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีหลักต่อไปนี้ที่อุณหภูมิ 4˚C ข้ามคืน: Rabbit polyclonal anti‑collagen IV (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS1072), rabbit polyclonal anti‑NLRP3 (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS90949) และ rabbit polyclonal anti‑TGF‑ 1 (1:100; Abcam; cat. no. ab92486)

การซับแบบตะวันตก

โปรตีนทั้งหมดสกัดจากเนื้อเยื่อตับ (n{{0}}) โดยใช้ RIPA lysis buffer (cat. no. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) และเครื่องบดตัวอย่างอย่างรวดเร็วอัตโนมัติ (Jinxing Industrial Development Co.,Ltd. .) ที่ 65 Hz เป็นเวลา 60 วินาทีที่ 4˚C โปรตีนทั้งหมดถูกหาปริมาณโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA และโปรตีน (20 µg) ถูกแยกออกผ่านทาง SDS/PAGE 8-15 เปอร์เซ็นต์ โปรตีนที่แยกออกมาต่อมาถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF (มิลลิพอร์ซิกมา) และปิดกั้นด้วยนมขาดมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ Tween‑20 (TBST) ของ TBS‑0.05 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น เยื่อถูกบ่มด้วยแอนติบอดีหลักต่อไปนี้ข้ามคืนที่ 4˚C: Anti‑NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS90949), anti‑ASC (1:1 ,000; BIOSS; cat. no. bs‑67412‑R), anti‑caspase‑1(1:1,000; Abcam; cat. no. ab1872), anti‑IL‑1 (1:500; Abcam;cat. no. ab9722), anti‑NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology,Inc.; cat. no. BS60435), anti‑p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS4852), anti‑p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS60290), anti‑NF‑κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;

หลังจากการบ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ เยื่อจะถูกล้างด้วย TBST สามครั้ง (ครั้งละ 10 นาที) และบ่มด้วย HRP‑conjugated แพะ anti‑rabbit IgG (1:10,000; Affinity Biosciences; cat. no. S 0001) และแพะที่ต่อต้านหนู IgG (1:10,000 Affinity Biosciences; cat. no. S0002) แอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง มองเห็นแถบโปรตีนโดยใช้ชุด ECL (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) และระบบ Bioshine Chemi Imaging System (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology) ความหนาแน่นของออปติกของแต่ละแบนด์ถูกวัดแบบกึ่งปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ 1.53a (National Institutes of Health) และทำให้เป็นมาตรฐานในการแสดงออกของ GAPDH

การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ของการทดลองอิสระมากกว่าหรือเท่ากับ 3 ครั้ง ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.) ใช้ในการวิเคราะห์ทางสถิติ การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบเฉพาะกิจของ Tukey ดำเนินการเพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่ม พี< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ผลลัพธ์

สำรวจว่า Rg1 ช่วยบรรเทาการเกิดพังผืดในตับที่เกี่ยวข้องกับอายุหรือไม่ การวัดการสะสมของคอลลาเจนในเนื้อเยื่อตับโดยใช้การย้อมสีของ Masson ผลการวิจัยพบว่าพื้นที่ที่เป็นบวกสีน้ำเงินเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อตับของกลุ่ม SAMP8 เมื่อเทียบกับกลุ่ม SAMR1 (รูปที่ 2A และ B) อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง SAMP8 ระดับของการสะสมคอลลาเจนจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มการรักษาเทมพอล อะโพไซนิน และ Rg1 (5 และ 10 มก./กก.) (รูปที่ 2A และ B) นอกจากนี้ ยังวัดระดับการแสดงออกของคอลลาเจน IV และ TGF- 1 ในเนื้อเยื่อตับโดยใช้การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี

ผลของการย้อมสีคอลลาเจน IV พบว่าคอลลาเจน IV แสดงออกในระดับต่ำในเนื้อเยื่อตับในกลุ่ม SAMR1 (รูปที่ 3A และ C) อย่างไรก็ตาม เมื่อเทียบกับกลุ่ม SAMR1

การรักษาด้วย Rg1 ช่วยลดการผลิต ROS และการแสดงออกของ NOX4 ในตับของหนู SAMP8 ROS เป็นปัจจัยสำคัญในการพัฒนาของพังผืดในตับ (41) ในการศึกษาครั้งนี้ มีการใช้โพรบ ROS หรือ DHE เพื่อตรวจหาระดับการผลิต ROS ในเนื้อเยื่อตับ ผลการวิจัยพบว่ามีการผลิต ROS ในเนื้อเยื่อตับของกลุ่ม SAMR1 ในระดับต่ำ อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAMR1 ระดับการผลิต ROS เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม SAMP8 (รูปที่ 4A และ B) ในขณะที่เปรียบเทียบกับกลุ่ม SAMP8, การรักษาด้วย tempol, apocynin และ Rg1 (5 และ 10 มก./กก.) อย่างมีนัยสำคัญ ลดระดับการผลิต ROS ในเนื้อเยื่อตับ (รูปที่ 4A และ B) เพื่อยืนยันผลกระทบของ NOX4 ต่อการสะสม ROS ระหว่างอายุ จึงมีการวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ NOX4 ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAMR1 ระดับการแสดงออกของ NOX4, p22phox และ p47phox ในเนื้อเยื่อตับถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม SAMP8 (รูปที่ 5A-D)

อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAMP8 การรักษาด้วย tempol, apocynin และ Rg1 (5 และ 10 มก./กก.) ได้ลดระดับการแสดงออกของ NOX4, p22phox และ p47phox ในเนื้อเยื่อตับระหว่างอายุลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5A-D) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาด้วย Rg1 อาจช่วยแก้ไขการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นที่เกิดจาก ROS ในเนื้อเยื่อตับโดยการยับยั้ง NOX4 ในช่วงอายุของหนู