Cistanche Deserticola Polysaccharide กระตุ้นการสร้างเม็ดสีใน Melanocytes ลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและส่งเสริมการฟอกสีฟัน

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|หลิงเจียง1|Yujie Ouyang1|หลุนหยาง1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|หงเซียง3|จิง เฉิน1 ชิงไห่ เซง1

เชิงนามธรรม

เนื่องจากส่วนหลักของความผิดปกติของการสร้างเม็ดสี โรคผิวหนังที่เกิดจากรอยคล้ำ เช่น vitiligo และ achromic naevus เป็นเรื่องปกติมากและได้รับความสนใจมากขึ้นในขณะนี้ พยาธิกำเนิดของการเกิดสีตกรวมถึงการทำงานที่ผิดปกติและการสูญเสียของเมลาโนไซต์ ซึ่งอาจเกิดจากกรรมพันธุ์ ภูมิต้านทานผิดปกติ และความเครียดออกซิเดชันs. ในหมู่พวกเขาความเครียดออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญ อย่างไรก็ตาม การรักษาทางคลินิกเพียงเล็กน้อยสามารถจัดการกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้ ตามที่รายงานCistanche Deserticola พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพ จากข้อมูลนั้น เราได้ประเมินบทบาทในเมลาโนไซต์และเปิดเผยกลไกเพิ่มเติม ในการศึกษานี้ เราพบว่า CDP สามารถส่งเสริมการสร้างเม็ดสีในเมลาโนไซต์ผิวหนังของมนุษย์ (HEMs) และเซลล์เมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ มันยังทำให้เกิดการสร้างเม็ดสีในปลาม้าลายอีกด้วย นอกจากนี้,CDPสามารถกระตุ้นเส้นทางสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK) จากนั้นควบคุมการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) และยีนดาวน์สตรีม TYR, TRP1, TRP2 และ RAB27A ไม่เช่นนั้น เราพบว่า CDP สามารถลดทอน H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเมลาโนไซต์ได้ หลักฐานเพิ่มเติมเปิดเผยว่า CDP สามารถเพิ่มวิถีของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 และกำจัด ROS ภายในเซลล์ สรุป กปปส.ส่งเสริมได้การสร้างเม็ดสีและป้องกันเมลาโนไซต์จากออกซิเดชันความเครียดการบาดเจ็บ โดยบอกว่า CDP ช่วยรักษาสถานะปกติของเมลาโนไซต์ ดังนั้น,CDPอาจเป็นยาตัวใหม่ในการรักษาโรครอยคล้ำ

คีย์เวิร์ด

Cistanche deserticola polysaccharide, โรค depigmentation, melanocyte, melanogenesis, NRF2, ความเครียดออกซิเดชัน

สดCistanche

1|การแนะนำ

โรคที่เกิดจากการทำลายผิว เช่น vitiligo และ achromic naevus มีลักษณะเป็นหย่อมๆ หรือรอยคล้ำของผิวหนังเป็นวงกว้าง1 แม้ว่ารอยโรคที่ผิวหนังจะไม่ค่อยทำให้เกิดการบาดเจ็บทางร่างกายอย่างรุนแรง แต่ก็ส่งผลกระทบต่อรูปลักษณ์ของผู้ป่วยและสร้างภาระทางจิตใจอย่างรุนแรง แม้กระทั่งความผิดปกติทางสุขภาพจิต2 การเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่สำคัญในการเกิด depigmentation รวมถึงความผิดปกติและการสูญเสียของ melanocyte ซึ่งส่งผลกระทบอย่างมากต่อการสังเคราะห์และการขนส่งเมลานิน ส่งผลให้การสะสมของเมลานินในผิวหนังไม่เพียงพอ

กลไกที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด แต่การศึกษาได้ระบุปัจจัยที่เกี่ยวข้องบางประการ ในอีกด้านหนึ่ง การทำงานของเมลาโนไซต์ส่วนหนึ่งขึ้นอยู่กับปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในการส่งเสริมการแสดงออกของการสร้างเม็ดสี- ยีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส (TYR), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 1 (TRP1), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส 2 (TRP2), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับราส์ (RAB27A) และโปรตีนที่รวมกลุ่มฟัสซินแอคติน 1 (FSCN1) )4 ในบรรดายีนเหล่านี้ TYR มีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์เมลานินผ่านการออกซิไดซ์ l-dopa ไปเป็นโดปาควิโนน5 ในทางกลับกัน การศึกษาแนะนำปัจจัยหลายอย่างร่วมกันซึ่งอาจเป็นสาเหตุของการสูญเสียเมลาโนไซต์ รวมถึงการถ่ายทอดทางพันธุกรรม สิ่งแวดล้อม ภูมิคุ้มกันทำลายตัวเอง , และความเครียดออกซิเดชัน.6-9 ในบรรดาปัจจัยเหล่านี้ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันถือเป็นสิ่งสำคัญที่สุด

กลไกของความเครียดออกซิเดชันทำให้เกิดรอยคล้ำได้รับการเปิดเผยบางส่วน; ปริมาณออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เกินพิกัดเป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญ10 การโอเวอร์โหลดของ ROS ในการเกิด depigmentation เกี่ยวข้องกับความไม่สมดุลระหว่างระบบโปรและสารต้านอนุมูลอิสระ11 หนึ่งในองค์ประกอบที่มีส่วนร่วมในความไม่สมดุลนี้คือปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ที่เกี่ยวข้อง แฟคเตอร์ 2/องค์ประกอบตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ (NRF2/ARE) วิถีทางต่อต้านอนุมูลอิสระบกพร่อง12 วิถีทางประกอบด้วย NRF2 และเอ็นไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น heme oxygenase-1 (HMOX-1, H2O-1) , catalase (CAT), กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส 1 (GPX1), และ NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO1).13 เมื่อเมลาโนไซต์สัมผัสกับ ROS มากเกินไป NRF2 สามารถย้ายเข้าไปในนิวเคลียสและจับกับ ARE ที่อนุรักษ์ไว้ จากนั้นจึงส่งเสริม การแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ อย่างไรก็ตาม ในบางโรคที่เกิดจากรอยด่างดำ เช่น โรคด่างขาว เส้นทางสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/ARE ที่บกพร่องไม่สามารถกำจัด ROS.14 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การรักษาทางคลินิกที่ใช้กันทั่วไปในการกำจัดเม็ดสีรวมถึงคอร์ติโคสเตียรอยด์เฉพาะที่หรือทั้งระบบ สารยับยั้ง calcineurin รังสีอัลตราไวโอเลตแบบวงแคบ B (NBUVB; 311 นาโนเมตร) 308-nm excimer light การปลูกถ่ายผิวหนังชั้นนอกของตนเอง และการรักษาด้วยยาแผนโบราณของจีน (TCM) Corticosteroids และ calcineurin inhibitors สามารถลดการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ผิดปกติได้ 15 ในขณะที่การบำบัดด้วยแสงใช้เป็นการรักษาทางเลือกแรก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง NBUVB กระตุ้นการเพิ่มจำนวน melanocyte และการทำลาย T-cell ในขณะที่ 308-nm excimer light กระตุ้น T cells apoptosis นอกจากนี้ ผลของการบำบัดด้วย TCM ยังเกี่ยวข้องกับการส่งเสริมการสร้างเม็ดสี.18 ในระดับหนึ่ง วิธีการเหล่านี้มีประโยชน์สำหรับการปรับปรุงการเสื่อมสภาพ แต่การควบคุมการลุกลามของโรคยังคงมีความท้าทาย จำเป็นต้องพัฒนาวิธีการรักษาใหม่ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับความเครียดออกซิเดชันซึ่งก่อนหน้านี้ถูกละเลย

Cistanche Deserticola เป็นที่รู้จักกันในนาม 'โสมทะเลทราย' 19 ส่วนประกอบของมันมีประโยชน์ในการบาดเจ็บที่ตับที่เกิดจากเอทานอลและการอักเสบในลำไส้มากเกินไป นอกจากนี้ยังสามารถใช้เป็นสารต่อต้านความเหนื่อยล้า ต้านการอักเสบ และต่อต้านเนื้องอกได้อีกด้วย20-22 เมื่อเร็ว ๆ นี้ Guo et al รายงานว่าCistanche Deserticola พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักอย่างหนึ่ง มีสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ป้องกันตับ20; อีกสองการศึกษาระบุถึงบทบาทในการปกป้องเซลล์จาก anความเครียดออกซิเดชันการบาดเจ็บในภาวะขาดออกซิเจน-กลูโคสกลับคืนสู่สภาพเดิมและโรคกระดูกพรุน23,24 อย่างไรก็ตาม บทบาทของ CDP ในโรคที่เกิดจากรอยด่างดำยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน ในที่นี้เราตั้งใจที่จะยืนยันว่าCDPอาจส่งผลกระทบการสร้างเม็ดสีและปกป้องเมลาโนไซต์จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

2|วัสดุและวิธีการ

2.1|สารเคมีและแอนติบอดี

Cistanche Deserticola พอลิแซ็กคาไรด์(CDP) และ l-dopa ซื้อมาจาก Yuanye Biotec (ความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2), ไดเมทิลซัลโฟออกไซด์ (DMSO), NaOH, ไทรทัน X-100, 4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล-2,5-ไดฟีนิลเตตทราโซเลียม โบรไมด์ ( MTT) และ Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit จาก Sigma-Aldrich ซื้อพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นกลาง 4% จาก Biosharp (เหอเฟย์, จีน); และชุดย้อมสีภูมิคุ้มกัน (Alexa Fluor 488) และ 2,7-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) จาก Beyotime Biotec (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) Fontana-Masson Stain Kit และ Nucleoplasmic Protein Extraction Kit ถูกซื้อจาก Sloarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) อาหารเสริมเพื่อการเจริญเติบโตของเมลาโนไซต์ของมนุษย์ (HMGS), สื่ออินทรีดัดแปลง (DMEM) ของ Dulbecco และสื่อ 254 ถูกซื้อจาก Gibco ซื้อซีรั่มวัวในครรภ์ (FBS) จาก BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel) แอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับ -แอกติน, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 และ HO-1 ถูกซื้อมาจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ ซึ่งเป็นสารปฐมภูมิ ซื้อแอนติบอดีสำหรับ MITF จากห้องปฏิบัติการของเซนต์จอห์น ซื้อแอนติบอดีหลักสำหรับ p-MITF จาก Affinity Biosciences ซื้อแอนติบอดีหลักสำหรับ GAPDH จาก Bioworld และซื้อแอนติบอดีหลักสำหรับ TRP1 จากเมอร์ค EMD

2.2|การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

เซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ขนาดกลางที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์และยาผสมยาปฏิชีวนะเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เมลาโนไซต์ของผิวหนังมนุษย์ (HEMs) ถูกแยกออกจากหนังหุ้มปลายลึงค์ของมนุษย์ (อ้างอิงจากการศึกษาก่อนหน้านี้ 25) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ 254 ที่เสริมด้วย HMGS, FBS 5 เปอร์เซ็นต์ และยาปฏิชีวนะผสมเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ทั้งหมดถูกเพาะเลี้ยงในตู้ฟักแบบเปียกที่ 37 องศาพร้อมคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ CDP ถูกละลายใน DMSO และเจือจางด้วยตัวกลางก่อนใช้ ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ต่ำกว่า 0.1 เปอร์เซ็นต์ H2O2 ถูกเจือจางด้วยตัวกลางก่อนใช้

2.3|การเพาะเลี้ยงปลาม้าลายและการรักษา

ตัวอ่อนและสื่อของปลาม้าลายซื้อมาจาก EzeRinka Biotech โปรโตคอลการทดลองได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลเซาท์ ปลาม้าลายถูกเพาะเลี้ยงในเพลต12-หลุมที่ 37 องศาจากแสงและบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP ใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวเพื่อสังเกตและบันทึกเมลานินที่หัวและหางของปลาม้าลายทุกวัน หลังจากการสังเกต เราเปลี่ยนสื่อและเพิ่ม . เข้าไปใหม่CDP. วัดความหนาแน่นของเมลานินที่ส่วนหางของปลาม้าลายด้วย Image J และแสดงค่าเป็นความหนาแน่นทางแสงแบบบูรณาการ (IOD)

2.4|ความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกวัดโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของCDP, HEM และ B16F10 เซลล์ถูกปลูกฝังในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 2 × 103 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงจนกระทั่งเซลล์ถูกยึดติดเข้ากับเพลต จากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 และ 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของCDPเป็นเวลา 24, 48 หรือ 72 ชั่วโมง ก่อนการวัด MTT 20 ไมโครลิตรถูกเติมในแต่ละหลุมและเพลตถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากนั้น เราทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอนและเติม DMSO 160 ไมโครลิตรในแต่ละหลุมเพื่อละลายผลึกฟอร์มาซาน ค่าการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรวัดโดยเครื่องอ่านเพลตมัลติโหมด (PerkinElmer) เพื่อตรวจสอบผลของ CDP ในสภาวะความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย H2O2-, HEM และเซลล์ B16F10 ถูกชุบในเพลต 96-หลุมที่ความหนาแน่น 4 × 103 เซลล์/หลุม เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของCDP({{0}}, 20, 40 หรือ 80 ug/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ณ จุดที่เราเพิ่ม H2O2 (ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 μm สำหรับ HEM และ 1.0 มม. สำหรับเซลล์ B16F10) ในแต่ละหลุมและ ฟักตัวเซลล์ต่อไปอีก 24 ชั่วโมง เราตั้งค่ากลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วย CDP และกลุ่มควบคุมเชิงลบ (NC) ขั้นตอนการตรวจจับเหมือนกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

2.5|การทดสอบ NaOH ของปริมาณเมลานิน

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ 100- มม. และบำบัดด้วยCDPที่ความเข้มข้นต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มิลลิลิตร เราล้างเซลล์สองครั้งด้วยน้ำกลั่นสองครั้ง แขวนเซลล์ใหม่อีกครั้งในเอทานอล 1 มล. และหมุนเวียนเซลล์เพื่อปลดปล่อยเมลานิน จากนั้นเราปั่นแยกส่วนผสม (200 กรัม, 5 นาที) และทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอน เติม DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ 1 มล. (เจือจางด้วยสารละลาย NaOH 1 มม.) 1 มล. ลงในหลอดแต่ละหลอดและแขวนตะกอน เราฟักตัวในอ่างน้ำที่ 80 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้เมลานินละลาย สุดท้าย เราถ่ายโอนของเหลว 200 ไมโครลิตรไปยังเพลต 96-หลุม และใช้เครื่องอ่านเพลตแบบมัลติโหมดเพื่อวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 470 นาโนเมตร

Cistancheความคิดเห็น: ยับยั้งเมลานินการผลิต.

2.6|การวัดกิจกรรมของไทโรซิเนส

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ 100- มม. และบำบัดด้วยCDPก่อนการวัด ย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มล. และล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เราย้ายเซลล์ 106 เซลล์จากตัวอย่างแต่ละตัวอย่างไปยังหลอดใหม่ และทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอนหลังจากการปั่นแยก จากนั้นเติมไทรทัน X-100 1 มล. 0.5 เปอร์เซ็นต์ลงในเม็ดเซลล์และเก็บ ผสมที่อุณหภูมิ 0 องศาเป็นเวลา 15 นาที หลังจากนั้น เราได้เพิ่ม l-dopa 1 มล. (1 มม. เจือจางด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M) เป็นสารตั้งต้นและผสมสารละลาย ย้าย 200 ไมโครลิตรของของผสมเป็น { {16}}เจาะจานทันที และวัดค่าการดูดกลืนแสง (A0) ที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านเพลตมัลติโหมด ทำซ้ำการวัดที่ 10 นาที (A10) กิจกรรมของไทโรซิเนสคำนวณโดย (A10-A0)/105 และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ ( เปอร์เซ็นต์ ) เทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ

2.7|Fontana-Masson การย้อมสีเมลานิน

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 12-หลุมจนได้ความหนาแน่น 50 เปอร์เซ็นต์ หลังการรักษา เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นกลาง 4% เป็นเวลา 30 นาที และล้างด้วยน้ำกลั่น จากนั้นเราเติมสารละลายแอมโมเนีย-เงินฟอนทานา 500 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และเก็บจานไว้ในที่มืดเป็นเวลา 16 ชั่วโมงเพื่อย้อมเมลานิน ต่อไป เราล้างเซลล์ด้วยน้ำกลั่นห้าครั้ง (ในแต่ละครั้ง 1 นาที) และแช่เซลล์ในไฮโปซัลไฟต์ 500 ไมโครลิตรเป็นเวลา 5 นาที ในที่สุด เราก็เอาไฮโปซัลไฟต์ออกและล้างเซลล์อีกครั้งด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 1 นาที จากนั้นเราใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวเพื่อสังเกตและบันทึกเมลานิน

2.8|การสกัด RNA และปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ - โพลีเมอเรส

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 6-หลุม หลังการบำบัด เซลล์ถูกย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มล. เราล้างเซลล์ด้วย PBS สองครั้ง จากนั้นเติมบัฟเฟอร์ lysis 1 มล. ปั่นส่วนผสม และวางหลอดบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อทำให้เซลล์แตกสลายอย่างสมบูรณ์ RNA ถูกสกัดโดยใช้ Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) และ reverse-transcribed (RT) โดยใช้ ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ-โพลีเมอเรส (PCR) ถูกก่อรูปโดยการใช้ KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO) ปริมาตรปฏิกิริยาของของผสม RT คือ 20 ไมโครลิตร ในขณะที่ปริมาตรปฏิกิริยาของของผสม PCR คือ 20 ไมโครลิตร (cDNA 1-8 ไมโครลิตร, MIX 10 ไมโครลิตร, ไพรเมอร์ F 1 ไมโครลิตร, ไพรเมอร์ R 1 ไมโครลิตร, เพิ่ม DEPC H2O ถึง 20 ไมโครลิตร ). การทดลองได้ดำเนินการตามโปรโตคอล ลำดับของไพรเมอร์แสดงอยู่ในตาราง S1

2.9|การสกัดโปรตีนและ Western blotting/immunofluorescence

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ 100- มม. หลังการบำบัด เซลล์ถูกย่อยด้วยทริปซินและรวบรวมในหลอด 1.5-มล. เราล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS จากนั้นเติมใน 500 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ RIPA lysis (Thermo Fisher) เสริมด้วยฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ (Thermo Fisher) 1 มม. และค็อกเทลสารยับยั้งฟอสฟาเตสเจือจาง 1:100 (โรช) โปรตีนนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึมถูกสกัดโดยใช้ชุดสกัดโปรตีนนิวคลีโอพลาสซึมตามระเบียบวิธีของผู้ผลิต เราวางหลอดไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาทีและหมุนวนทุกๆ 5 นาทีเพื่อทำให้เซลล์แตกสลายอย่างสมบูรณ์ เราปั่นแยกเซลล์ (200 กรัม 4 องศา 15 นาที) ย้ายส่วนลอยเหนือตะกอนไปยังหลอดใหม่ และวัดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (KeyGEN Biotec) เราต้มโปรตีนด้วยบัฟเฟอร์โหลด 5 เท่า (Beyotime Biotec, China) ที่ 100 องศาเป็นเวลา 10 นาที แล้วเก็บไว้ที่ −80 องศา วิธีโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (PAGE) ถูกใช้ใน Western blotting และแยกโปรตีน 20 ไมโครกรัมของแต่ละกลุ่มและถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ หลังจากการปิดกั้นแอนติเจน เราฟักตัวเมมเบรนในแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง 1:1000 เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 4 องศา จากนั้นล้างเมมเบรนด้วย PBST และบ่มใน 1:{24}} แอนติบอดีทุติยภูมิเจือจางเจือจางเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา . ตรวจพบความเข้มของการเรืองแสงโดยใช้ระบบการถ่ายภาพ Odyssey CLx (LI-COR) อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ดำเนินการโดยใช้ชุดย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (Alexa Fluor 488) ด้วยการเจือจาง 1:100 ของแอนติบอดีปฐมภูมิ

cistanche reddit

2.10|การวัดการตายของเซลล์

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเชื้อ {{0}} มม. และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของCDPเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และเติม H2O2 (ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 ไมโครเมตรสำหรับ HEM, 1.0 มม. สำหรับเซลล์ B16F10) ลงในแต่ละหลุมและบ่มต่อไปอีก 24 ชั่วโมง นอกจากนี้เรายังตั้งกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDP และกลุ่ม NC หลังการรักษา เราย่อยเซลล์ด้วยทริปซินที่ปราศจาก EDTA และรวบรวมพวกมันในหลอด จากนั้นล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS และแขวนลอยใหม่ใน 100 ไมโครลิตรของ PBS เซลล์ถูกย้อมด้วย Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit ตามโปรโตคอลและตรวจพบโดย flow cytometry (FCM) ซอฟต์แวร์ FlowJo ใช้ในการวิเคราะห์อัตราการตายของเซลล์

2.11|การวัด ROS ภายในเซลล์

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต {{0}}หลุมและบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่างกัน (0, 20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของCDPเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งเราได้เพิ่ม H2O2 (ความเข้มข้นสุดท้าย: 500 ไมโครเมตรสำหรับ HEM, 1.0 มม. สำหรับเซลล์ B16F10) ในแต่ละหลุม ฟักไข่ต่อไปอีก 24 ชั่วโมงและตั้งค่ากลุ่มที่บำบัดด้วย CDP และกลุ่ม NC หลังการรักษา เราล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS เพื่อเอาสื่อและ FBS ออกทั้งหมด จากนั้นเจือจางโพรบ DCFH-DA เป็น 1:1000 ด้วยสื่อและเพิ่มในแต่ละหลุม เราฟักเซลล์ที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที และล้างเซลล์เหล่านั้นสามครั้งด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัม เราใช้ anกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงกลับด้านเพื่อสังเกตและบันทึกการเรืองแสง จากนั้นใช้ ImageJ เพื่อวัดความเข้มของการเรืองแสง

2.12|สถิติและการวิเคราะห์

ข้อมูลในงานนี้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) และการวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 7.0) หรือ SPSS (เวอร์ชัน 220) และ Student's t-test หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายกลุ่ม ค่าสีเทาของแถบโปรตีน WB ถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย GAPDH หรือ -แอกติน ค่าของ P < .05="" ถือว่ามีนัยสำคัญ="">

3|ผลลัพธ์

3.1|CDP กระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์ HEM และ B16F10

ก่อนที่เราจะเริ่มต้น เราใช้การทดสอบ MTT เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่อาจเกิดขึ้นของ CDP บน HEM และเซลล์เมลาโนมา B16F10 ของหนูเมาส์ เซลล์ได้รับการรักษาด้วยCDPที่ความเข้มข้นต่างกันเป็นเวลา 24, 48 หรือ 72 ชั่วโมง การทดสอบความมีชีวิตของ HEM แสดงให้เห็นว่าเมื่อความเข้มข้นต่ำกว่า 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CDP ไม่มีผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ อย่างไรก็ตาม ความอยู่รอดได้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อความเข้มข้นถึง 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรที่ 24, 48 และ 72 ชั่วโมง (P < .05;="" รูปที่="" 1a)="" ความมีชีวิตของเซลล์="" b16f10="" ก็ลดลงเช่นกันที่="" 48="" และ="" 72="">CDPถึง 320 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (P < .01)="" แต่ไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงที่ความเข้มข้นที่ต่ำกว่า="" (รูปที่="" 1b)="" จากนั้นเราได้สำรวจบทบาทของ="" cdp="">การสร้างเม็ดสีและเปรียบเทียบผลกระทบของฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH; ความเข้มข้น: 20, 100 และ 400 นาโนเมตร) และ DMSO (0.1 เปอร์เซ็นต์) ใน HEMs ผลการย้อมสีเมลานิน กิจกรรมของไทโรซิเนส และการทดสอบปริมาณเมลานินชี้ให้เห็นว่า CDP เทียบได้กับ -MSH ในการส่งเสริมการสร้างเม็ดสี ในขณะที่การรักษาด้วย DMSO 0.1 เปอร์เซ็นต์ไม่มีความแตกต่าง (รูปที่ S1)

เราปรับปรุงการสำรวจของเราเพิ่มเติมตามลำดับ HEMs ได้รับการรักษาด้วยCDPที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง การทดสอบการย้อมสีเมลานิน ปริมาณเมลานิน และการทดสอบฤทธิ์ของไทโรซิเนสได้ดำเนินการ และทั้งหมดแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วย CDP ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นซึ่งสูงสุดในกลุ่ม 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (P < .05,="" รูปที่="" 2a-c)="" จากนั้นเราวัดระดับ="" mrna="">การสร้างเม็ดสี-ยีนที่เกี่ยวข้อง (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A และ FSCN1) CDP เพิ่มระดับ mRNA ของยีนเหล่านั้นใน HEM อย่างมีนัยสำคัญ (P < .05;="" รูปที่="" s2a)="" นอกจากนี้="" ระดับของโปรตีน="" mitf,="" tyr,="" trp1="" และ="" rab27a="" เพิ่มขึ้น="" เช่นเดียวกับอัตราส่วนของ="" mitf="" ที่มีฟอสโฟรีเลตต่อ="" mitf="" ทั้งหมด="" (p="">< .05)="" ในขณะที่="" trp2="" และ="" fscn1="" ไม่มีความแตกต่าง="" (รูปที่="" 2d,e)="" ผลการวิจัยพบว่า="" cdp="">

นอกจากนี้เรายังตรวจสอบผลกระทบของCDPอีกครั้งกับเซลล์ B16F10 และพบว่าปริมาณเมลานินของเซลล์ B16F10 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P < .01;="" รูปที่="" s2b)="" นอกจากนี้="" cdp="" ยังเพิ่มระดับ="" mrna="" ของ="" .="">การสร้างเม็ดสียีนที่เกี่ยวข้อง (P < .05; รูปที่ S2C) และระดับโปรตีนของ MITF, TYR, TRP1, TRP2 และ RAB27A ก็เพิ่มขึ้นเช่นกันหลังการรักษาด้วย CDP (P < .05; รูปที่ S2D-E)

รูปที่ 1 ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ CDP ในเซลล์ HEM และ B16F10

3.2|CDP ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีในปลาม้าลาย

เพื่อตรวจสอบว่าCDPโปรโมทได้การสร้างเม็ดสีในร่างกาย เราใช้ตัวอ่อนของปลาม้าลาย เอ็มบริโอของ zebrafish ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่มและบำบัดอย่างต่อเนื่องด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเพียงอย่างเดียว (NC) หรือ CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ug/mL); บันทึกความหนาแน่นและการกระจายของเม็ดเมลานินทุกวัน เมื่อเอ็มบริโอของ zebrafish โตขึ้น เราพบว่าความหนาแน่นของเมลานินค่อยๆ เพิ่มขึ้นที่หัวและหาง ในวันที่ 3 ความแตกต่างระหว่างกลุ่มสามารถแยกแยะได้ และความแตกต่างยังคงเพิ่มขึ้นจนกว่าเราจะสิ้นสุดการทดสอบในวันที่ 6 (รูปที่ 3A) เราใช้ Image J เพื่อวัดความหนาแน่นของเมลานินในหางของปลาม้าลาย ความหนาแน่นของเมลานินในกลุ่มที่บำบัดด้วย CDP สูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < .05;="" รูปที่="">

3.3|เส้นทางสัญญาณ MAPK ที่เปิดใช้งาน CDP ในเซลล์ HEM และ B16F10

เพื่อเปิดเผยกลไกโดยที่CDPเลื่อนขั้นการสร้างเม็ดสีเราบำบัด HEM ด้วย CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ug/mL) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงตรวจสอบระดับฟอสโฟรีเลตและระดับรวมของโปรตีน ERK, JNK และ p38 ในเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ตามที่วัดโดย Western blotting ระดับ p-ERK, p-JNK และ p-p38 เพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย CDP (P < .05)="" ในขณะที่ระดับทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลง="" (รูปที่="" 4a,="" b)="" การทดลองซ้ำกับเซลล์="" b16f10="" และระดับฟอสโฟรีเลตของโปรตีน="" erk,="" jnk="" และ="" p38="" เพิ่มขึ้น="" (p="">< .05)="" แต่ระดับ="" mapk="" ทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลง="" (รูปที่="" 4c,="" d)="" สอดคล้องกับผลลัพธ์="" ใน="">

3.4|CDP ที่ลดทอน H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเซลล์ HEM และ B16F10

เราใช้ H2O2 เพื่อจำลองสภาพแวดล้อมของความเครียดออกซิเดชัน และสำรวจบทบาทของ CDP ในเมลาโนไซต์เพิ่มเติมภายใต้ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ความเข้มข้นสุดท้ายของ H2O2 ที่ใช้ใน HEM คือ 500 ไมโครเมตร ในขณะที่ในเซลล์ B16F10 คือ 1.0 มม. ในการตรวจสอบผลของ CDP ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2- เราได้ทำการปรับสภาพเซลล์ HEM และ B16F10 ด้วยCDPที่ความเข้มข้นต่างกัน (20, 40 และ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเติม H2O2 และบำบัดต่อไปเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนดำเนินการสังเกตและการสอบวิเคราะห์ MTT

H2O2 ทำให้เกิดการหลั่งของเมมเบรนและการหดตัวของเซลล์ใน HEMs ในกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วย CDP สถานการณ์ก็บรรเทาลง การบำบัดด้วย CDP เพียงอย่างเดียวไม่มีผล (รูปที่ 5A) การทดสอบ MTT แสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันในการรักษาด้วย H2O2 ที่ลดความสามารถในการมีชีวิตของ HEM ในขณะที่ CDP ช่วยบรรเทาผลกระทบที่เป็นอันตรายนี้ได้อย่างมีนัยสำคัญ (P < .01);="">CDPเพียงอย่างเดียวไม่ได้สร้างความแตกต่าง (รูปที่ 5C) จากนั้นเราตรวจสอบเอฟเฟกต์การป้องกันอีกครั้งในเซลล์ B16F10 การบำบัดด้วย H2O2 เหนี่ยวนำให้เกิดการตกของเยื่อหุ้มเซลล์และการหดตัวของเซลล์ ในขณะที่สภาวะที่ไม่เอื้ออำนวยยังถูกแก้ไขโดย CDP ในเซลล์ B16F10 (รูปที่ 5B) ในขณะเดียวกัน การทดสอบ MTT แสดงให้เห็นว่าความมีชีวิตของเซลล์ B16F10 ลดลงหลังการรักษาด้วย H2O2 แต่สถานการณ์ดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่บำบัดด้วย CDP (P < .05;="" รูปที่="">

นอกจากนี้ เราใช้ FCM เพื่อวัดการตายแบบอะพอพโทซิสที่เกิดจาก H2O2-ของ HEM และเซลล์ B16F10 ผลการวิจัยพบว่า H2O2 ทำให้เกิดการตายของเซลล์ HEM และ B16F10 อย่างมีนัยสำคัญ แต่ก่อนการบำบัดด้วยCDPที่ความเข้มข้นต่างกันสามารถลดการตายของเซลล์ได้อย่างมีนัยสำคัญ มิฉะนั้น การบำบัดด้วย CDP เพียงอย่างเดียวไม่ได้ทำให้เกิดความแตกต่าง (รูปที่ 5E, F) อัตราการตายของเซลล์เพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย H2O2 แต่ลดลงในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย CDP การเปลี่ยนแปลงมีนัยสำคัญทั้งในเซลล์ HEM และ B16F10 (P < .05,="" รูปที่="" 5g,="">

รูปที่ 2 CDP ส่งเสริมการสร้างเม็ดสีใน HEMs

3.5|CDP scavenged H2O2-กระตุ้น ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ HEM และ B16F10

เพื่อตรวจสอบกลไกของCDPสำหรับการลด H2O2-ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ เราได้ตรวจพบ ROS ภายในเซลล์เพิ่มเติมในเซลล์ HEM และ B16F10 โดยใช้โพรบเรืองแสง DCFH-DA การรักษาเหมือนกันกับที่อธิบายไว้ข้างต้น วัดความเข้มของการเรืองแสงเพื่อแสดงถึงระดับ ROS ตามที่เราสังเกตใน HEMs การรักษาด้วย H2O2 นั้นมีประสิทธิภาพในการยกระดับ ROS แต่ CDP กำจัด ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่บำบัดด้วย H2O2- (P < .01;="" รูปที่="" 6a,="" c);="" นอกจากนี้="" การใช้="" cdp="" เพียงอย่างเดียวไม่ได้ทำให้เกิดความแตกต่าง="" เรายืนยันผลลัพธ์อีกครั้งในเซลล์="" b16f10="" ในเซลล์="" b16f10="" การรักษาด้วย="" cdp="" เพียงอย่างเดียวไม่ส่งผลต่อระดับ="" ros="" ในขณะที่การรักษาด้วย="" h2o2="" เพิ่มระดับ="" ros="" อย่างเห็นได้ชัด="" แต่การเปลี่ยนแปลงนี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญด้วยการปรับสภาพด้วย="" cdp="" (p="">< .05;="" รูปที่="" 6b,="">

3.6|CDP ที่ควบคุม NRF2/H2O-1 เส้นทางสารต้านอนุมูลอิสระในเมลาโนไซต์

เพื่อเปิดเผยเพิ่มเติมถึงกลไกที่ CDP กำจัด ROS ขั้นแรก เราได้วัดระดับโปรตีนของวิถีทางของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 ในเซลล์ B16F10 เราพบว่าการรักษาด้วย CDP เพียงอย่างเดียวไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อโปรตีน NRF2 และ HO-1 แต่ในกลุ่มที่ได้รับ H2O2- ระดับของโปรตีนทั้งสองนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และCDPการปรับสภาพเพิ่มระดับความสูง (p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPแสดงให้เห็นความแตกต่างบางประการ ดังที่เราเห็นได้ว่าการเรืองแสงในนิวเคลียสนั้นแรงกว่าในไซโตพลาสซึม และการกระจายอยู่ใกล้ที่ความเข้มข้น CDP สามระดับ (รูปที่ 7C)

รูปที่ 3 CDP ส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิสในปลาม้าลาย

4|การอภิปรายและข้อสรุป

ในการศึกษานี้ เราได้ศึกษาบทบาทของCDPในเซลล์ HEM และ B16F10 เป็นครั้งแรกที่เราพบว่า CDP สามารถส่งเสริมการสร้างเม็ดสีในเมลาโนไซต์และส่งเสริมการสร้างเม็ดสีในปลาม้าลาย การทดลองต่อมาแสดงให้เห็นว่าวิถีการส่งสัญญาณ MAPK ถูกกระตุ้นภายใต้การบำบัดด้วย CDP เราได้ตรวจสอบบทบาทของมันเพิ่มเติมในความเครียดออกซิเดชันและพบว่า CDP สามารถลดทอน H2O2- ที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์และการตายของเซลล์ในเมลาโนไซต์ ในขณะเดียวกัน CDP สามารถกระตุ้นเส้นทางของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 และกำจัด ROS ภายในเซลล์ภายใต้สภาวะความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

ไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนเป็นวิถีทางที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมของ MITF ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญที่ส่งเสริมการแสดงออกของการสร้างเม็ดสี-ยีนที่เกี่ยวข้องและส่งผลต่อการสังเคราะห์และการขนส่งเมลานินในเวลาต่อมา26,27 ในการศึกษาของเรา การกระตุ้นการทำงานของ ERK, JNK และ p38 ในเมลาโนไซต์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษา CDP; ในขณะเดียวกัน นิพจน์ของ TYR ที่ขับเคลื่อนด้วย MITF/p-MITF และ MITF, TRP1, TRP2 และ RAB27A ได้รับการควบคุมตามลำดับ ดังนั้น เราขอแนะนำว่า CDP สามารถส่งเสริมได้การสร้างเม็ดสีผ่านการเปิดใช้งานเส้นทาง MAPK แต่อย่างไรCDPเปิดใช้งาน MAPKs ยังไม่ทราบ จากการศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ ตัวรับโทรลไลค์ 4 (TLR4) แสดงออกอย่างมากในเมลาโนไซต์และเกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี.28,29 TLR4 เป็นโปรตีนทรานส์เมมเบรนที่สำคัญซึ่งสามารถจับไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS)30 อย่างจำเพาะ; จากการศึกษารายงานว่า LPS สามารถกระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสได้29 ที่น่าสนใจคือ พอลิแซ็กคาไรด์หลายตัวที่สกัดจากพืชหรือเห็ดมีรายงานว่าเปิดใช้งาน TLR และเส้นทางส่งสัญญาณปลายน้ำ เช่น MAPK และปัจจัยนิวเคลียร์แคปปาเบตา (NF-κB) 31,32 เราจึงสงสัยว่าCDPสามารถรับรู้และผูกมัดโดย TLR จากนั้นเปิดใช้งานเส้นทางส่งสัญญาณ MAPK ดาวน์สตรีมและส่งเสริมการสร้างเม็ดสี. นอกจากนี้ นิวคลีโอไทด์ที่มีผลผูกพัน oligomerization domain-like receptors (NLRs) ยังรู้จักลิแกนด์ภายในเซลล์และกระตุ้นการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK และ NF-κB 33,34 ตามรายงาน โพลีแซคคาไรด์ที่สกัดจากเห็ดหลินจือและแอสตรากาลัสสามารถเข้าสู่เซลล์ได้ และส่งผลกระทบต่อ NLRs.35,36 ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ CDP สามารถเข้าสู่เมลาโนไซต์และควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ผ่าน NLR อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันสมมติฐานนี้

งานวิจัยบางชิ้นจนถึงปัจจุบันรายงานการใช้สมุนไพรพอลิแซ็กคาไรด์ในการสร้างเมลาโนเจเนซิสเพื่อยับยั้งการผลิตเมลานิน37,38 อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้CDPเลื่อนขั้นการสร้างเม็ดสีในเมลาโนไซต์ และผลกระทบนี้ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมหลังจากเปรียบเทียบกับ -MSH CDP ยังเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ชนิดหนึ่งที่สกัดจากสมุนไพร เราสงสัยว่าผลตรงกันข้ามของ CDP อาจเกี่ยวข้องกับความแตกต่างทางโครงสร้างระหว่าง CDP กับพอลิแซ็กคาไรด์อื่นๆ โพลีแซ็กคาไรด์เกิดขึ้นจากกระบวนการพอลิเมอไรเซชันของโมโนแซ็กคาไรด์ แต่แปรผันในประเภทโมโนแซ็กคาไรด์ องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์ พันธะไกลโคซิดิก โครงสร้างสายข้าง และน้ำหนักโมเลกุล39,40 ปัจจัยเหล่านี้คิดว่าเป็นตัวกำหนดหน้าที่ทางชีววิทยา 41 การศึกษาที่มีอยู่ได้เสนอโครงสร้างของCDPและแนะนำว่าโครงสร้าง CDP มีอิทธิพลต่อการทำงานของมันในเวลาต่อมา42 ดังนั้น จำเป็นต้องมีการพิสูจน์เพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจ CDP อย่างถ่องแท้และยืนยันสมมติฐานของเรา

การสร้างเมลาโนเจเนซิสเป็นกลไกป้องกันที่สำคัญในการต่อต้านความเสียหายของรังสีอัลตราไวโอเลตและการรักษาสภาวะสมดุลของร่างกาย43; ในเวลาเดียวกัน เมลาโนไซต์สามารถสัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยได้ง่าย เช่น ROS โอเวอร์โหลด11 เป็นที่ทราบกันดีว่า ROS มีส่วนร่วมในการส่งเสริมการสร้างเม็ดสี ซึ่งเป็นกลไกหนึ่งที่กระตุ้น MAPKs44 แต่การศึกษายังเปิดเผยว่าผลกระทบนี้มีอยู่ใน ROS ที่แน่นอนเท่านั้น ระดับในขณะที่ ROS โอเวอร์โหลดบั่นทอนการสร้างเม็ดสีอย่างมีนัยสำคัญ45ความสัมพันธ์ระหว่าง ROS, MAPK และการสร้างเม็ดสีมีความแปรปรวนภายใต้สภาวะที่แตกต่างกัน ดังนั้น ความสมดุลระหว่างระบบโปรและสารต่อต้านอนุมูลอิสระจึงมีความสำคัญอย่างเห็นได้ชัด ในโรคที่เกิดจากรอยด่างดำ เช่น โรคด่างขาว ระบบต้านอนุมูลอิสระที่ไม่สมดุลและ ROS เกินพิกัดที่ควบคุมไม่ได้จะทำลายเมลาโนไซต์และลดความมีชีวิตของเซลล์11,46 ในการศึกษานี้ เราใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ H2O2 เพื่อจำลองการโอเวอร์โหลด ROS ในเซลล์ และ HEM มีความทนทานน้อยกว่า H2O2 มากกว่าเซลล์ B16F10 เมื่อเมลาโนไซต์ได้รับการรักษาด้วย H2O2 ความมีชีวิตและอัตราการตายของเซลล์จะแย่ลง แต่การปรับสภาพด้วย CDP อาจทำให้แนวโน้มกลับแย่ลงได้บางส่วน ในเวลาเดียวกัน ROS ก็ถูกไล่ออก ตามที่รายงาน การกระตุ้นเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระ NRF2/ARE เป็นวิธีการสำคัญในการกำจัด ROS ในเซลล์ผิวหนัง14 ในการทดลองของเรา ระดับโปรตีนของ NRF2 และ H2O-1 ในเมลาโนไซต์ได้รับการควบคุมขึ้นหลังการบำบัดด้วย H2O2 โดยไม่มี CDP; นี่หมายความว่า H2O2-ถูกเหนี่ยวนำความเครียดออกซิเดชันสามารถเปิดใช้งานเส้นทาง NRF2/HO-1 แต่ไม่เพียงพอสำหรับการรักษาสมดุลรีดอกซ์และปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บ อย่างไรก็ตาม การปรับสภาพด้วย CDP ได้ปรับปรุงเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 และช่วยคืนความสมดุล ดังนั้น เราขอแนะนำว่า CDP สามารถปกป้องเซลล์เมลาโนไซต์จากการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านการกระตุ้นเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 และการขจัด ROS

นี่คือผลิตภัณฑ์ของเรา

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม กรุณาคลิกที่นี่

เราพบว่าCDPการรักษาเพียงอย่างเดียวไม่มีผลต่อ ROS หรือ NRF2/HO-1 ในเมลาโนไซต์ ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นว่า CDP สามารถส่งผลกระทบต่อสมดุลรีดอกซ์ภายใต้ความเครียดออกซิเดชันแต่สภาพไม่ปกติ นอกจากนี้ มีรายงานว่าเส้นทางการต้านอนุมูลอิสระของ NRF2/HO-1 ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K, NF-κB และ MAPK47,48 ในการศึกษาของเรา CDP สามารถเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ได้ เป็นไปได้ที่ CDP สามารถเปิดใช้งานเส้นทาง NRF2/HO-1 ผ่าน MAPK ที่ควบคุมขึ้น ตามที่ Slominski รายงาน เมลาโนไซต์เป็นเซ็นเซอร์ความเครียดที่เกี่ยวข้องกับเครือข่ายการกำกับดูแล และหน้าที่ของพวกมันสามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่างรวดเร็วตามสภาพแวดล้อม49 เราขอแนะนำว่าบทบาทของ CDP นั้นได้รับอิทธิพลจากสถานะของเมลาโนไซต์การสร้างเม็ดสีโดยไม่ส่งผลกระทบต่อระบบต้านอนุมูลอิสระในสภาวะปกติ แต่คืนสมดุลรีดอกซ์ภายใต้สภาวะความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ดังนั้น CDP จึงสามารถรักษาหน้าที่ของเมลาโนไซต์และการอยู่รอดได้สองวิธี CDP ช่วยให้เมลาโนไซต์รักษาสภาวะสมดุล ซึ่งเป็นหน้าที่สำคัญของการสร้างเม็ดสี.50,51

สรุปแล้ว,CDPสามารถส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิสของเมลาโนไซต์ผ่านการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK CDP สามารถปรับปรุงการอยู่รอดของเมลาโนไซต์ผ่านการกระตุ้นเส้นทางของสารต้านอนุมูลอิสระ NRF2/HO-1 และการกำจัด ROS ภายในเซลล์ภายใต้ความเครียดออกซิเดชันเงื่อนไข. การค้นพบของเรามีความหมายเพราะแสดงให้เห็นว่า CDP สามารถส่งเสริมได้ทั้งคู่การสร้างเม็ดสีและปกป้องเมลาโนไซต์จากการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งอาจส่งผลต่อการทำงานและการสูญเสียของเมลาโนไซต์ ผลการศึกษานี้บ่งชี้ว่า CDP อาจเป็นยาใหม่ในการรักษาโรครอยคล้ำ