การหมุนเวียน MiRNAs ในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 ที่มีและไม่มีอัลบูมินนูเรียในมาเลเซีย

เชิงนามธรรมการแนะนำ: โรคไตเบาหวาน(DKD) ยังคงเป็นสาเหตุสำคัญของโรคไตเรื้อรัง มีการรายงานความผิดปกติของการไหลเวียน miRNAs ซึ่งบ่งบอกถึงบทบาททางพยาธิวิทยาของพวกมันใน DKD การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันในซีรั่มของผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DM) ที่มีและไม่มีภาวะอัลบูมินในปัสสาวะในประชากรมาเลเซียที่เลือกวิธี:ผู้ป่วย T2DM สี่สิบเอ็ดรายที่ติดตามผลที่คลินิกชุมชนแบ่งออกเป็นกลุ่มปกติ (NA) ไมโคร (MIC) และ Macroalbuminuria (MAC) ระดับความแตกต่างของ miRNA ใน 12 ตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้อาร์เรย์ miScript miRNA qPCR ที่เน้นวิถีทาง (พังผืดของมนุษย์) และได้รับการตรวจสอบความถูกต้องใน 33 ตัวอย่าง โดยใช้อาร์เรย์ qPCR แบบกำหนดเองของ miScript (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, ประเทศเยอรมนี)ผลลัพธ์:แนวโน้มของการควบคุม 3 miRNA ในซีรัม ได้แก่ miR-874-3p, miR-101-3p และ miR-145-5p ของผู้ป่วย T2DM ที่มี MAC เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ที่มี NA การควบคุม miR- 874-3p ที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (p= 0.04) และ miR-101-3p (pพบ=0.01) ในกลุ่มการตรวจสอบความถูกต้อง ความสัมพันธ์เชิงลบที่มีนัยสำคัญระหว่างอัตราการกรองไตโดยประมาณ (eGFR) และ miR-874-3p (p= 0.05), มิเรอร์-101-3พี (p= 0.03) และ miR-145-5p (p= 0.05) รวมถึงความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่าง miR-874-3p และอายุ (p= 0.03) แสดงโดยการวิเคราะห์สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สันบทสรุป:การศึกษานี้พบการควบคุม miRNA ที่รู้จักก่อนหน้านี้ กล่าวคือ miR-145-5p และอาจเป็นไปได้ใหม่ เช่น miR-874-3p และ miR-101-3p ในซีรั่มของผู้ป่วย T2DM . มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่าง eGFR และ miRNA เหล่านี้ ข้อค้นพบของการศึกษานี้ได้ให้หลักฐานที่สนับสนุนเพื่อตรวจสอบบทบาทสมมุติของ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันเหล่านี้เพิ่มเติมดีเคดี.

คลิกเพื่อ cistanche herba สำหรับโรคไต

การแนะนำ

โรคไตโรคเบาหวาน (DKD) คิดเป็น 39% ของโรคไตวายระยะสุดท้ายในสหรัฐอเมริกา [1] ในทำนองเดียวกัน DKD ยังคงเป็นสาเหตุหลักของโรคไตเรื้อรัง (CKD) ในมาเลเซีย โดยมีส่วนทำให้ผู้ป่วยฟอกไตรายใหม่ถึง 69% ในปี 2561 [2] พยาธิวิทยาของ DKD คิดว่ามีสาเหตุหลักมาจากน้ำตาลในเลือดสูง ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์และท้ายที่สุดคือเกิดพังผืดในไต [3] แม้จะมีความก้าวหน้าในการจัดการ แต่ตัวชี้วัดทางชีวภาพและการบำบัดในปัจจุบันก็ล้มเหลวในการป้องกันการลุกลามของโรคไตวายระยะสุดท้าย [3] ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับผู้ไกล่เกลี่ยและกลไกของ DKD อย่างเร่งด่วน

กรดไมโครริโบนิวคลีอิก (miRNA) เป็นตระกูลของ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสขนาดเล็กซึ่งกลายเป็นตัวควบคุมการแสดงออกของยีนหลังการถอดรหัสที่สำคัญ [4] มีการสังเกตการแสดงออกของ miRNAs อย่างผิดปกติและการมีส่วนร่วมในกลไกของเซลล์ของ DKD [3] การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อระบุรูปแบบการแสดงออกของ miRNA ที่เลือกในซีรั่มของผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DM) ที่มีและไม่มีภาวะอัลบูมินูเรีย ทั่วโลก มีการศึกษาที่คล้ายกันในประชากรหลากหลาย ดังที่ได้ทบทวนไว้ก่อนหน้านี้ [5–7] เรามุ่งเป้าที่จะตรวจสอบรูปแบบของการแสดงออกที่แตกต่างกันของการเลือก miRNA ที่เกี่ยวข้องกับวิถี fibrotic ในผู้ป่วย T2DM ซึ่งบางส่วนได้รับการศึกษาก่อนหน้านี้ใน DKD การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แนะนำความแตกต่างที่เกี่ยวข้องกับชาติพันธุ์ในการแสดงออกของ miRNA [8, 9] ก่อนหน้านี้ นอกเหนือจากความสามารถในการยืนยันการค้นพบก่อนหน้านี้แล้ว การศึกษานี้ยังอาจเผยให้เห็น miRNA ใหม่ๆ ซึ่งอาจแสดงออกอย่างมีเอกลักษณ์เฉพาะในประชากรมาเลเซีย

วัสดุและวิธีการ

ศึกษาประชากร

การศึกษาภาคตัดขวางนี้เกี่ยวข้องกับผู้ป่วย T2DM ที่มีอยู่ 41 รายในการติดตามผลที่คลินิกชุมชน ตั้งแต่เดือนมกราคมถึงเมษายน 2019 การศึกษานี้เกี่ยวข้องกับ 2-ขั้นตอนขั้นตอน: (1) miRNA ในกลุ่มผู้ป่วย 12 ราย (กลุ่มการคัดกรอง ) ได้รับการทำโปรไฟล์และ (2) miRNA ที่เกี่ยวข้องมากที่สุดได้รับการตรวจสอบกับซีรั่มจากผู้ป่วย 33 ราย (เรียกว่ากลุ่มการตรวจสอบความถูกต้อง) รวมผู้ป่วย 4 รายจากกลุ่มคัดกรอง ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้ป่วยแต่ละราย การอนุมัติทางจริยธรรมสำหรับการศึกษาครั้งนี้ได้รับจากคณะกรรมการวิจัยและจริยธรรมทางการแพทย์ (MREC) กระทรวงสาธารณสุขมาเลเซีย เกณฑ์การคัดเลือกคือผู้ป่วย T2DM และข้อมูลทางคลินิกและห้องปฏิบัติการที่มีอยู่ ผู้ป่วยประเภท 1 DM; ไม่ใช่ DKD; โรคร่วม เช่น มะเร็ง อาการไข้เฉียบพลัน หรือการติดเชื้อล่าสุด การตั้งครรภ์; และไม่รวมหลังคลอด

ข้อมูลต่อไปนี้ดึงมาจากเวชระเบียนของผู้ป่วย: (1) ข้อมูลประชากรรวมทั้งอายุและเพศ; (2) ข้อมูลทางคลินิก เช่น ความดันโลหิต น้ำหนัก ระยะเวลาของ T2DM การรักษา และภาวะแทรกซ้อนอื่น ๆ ของโรคเบาหวาน (3) ข้อมูลทางห้องปฏิบัติการซึ่งรวมถึงกลูโคสในพลาสมาขณะอดอาหาร, ไกลเคเตตฮีโมโกลบิน A1c (HbA1c), อัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีน และครีเอตินีนในซีรั่ม ผู้ป่วยแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามระดับอัลบูมินูเรีย, นอร์โมอัลบูมินูเรีย (NA), ไมโครอัลบูมินูเรีย (MIC) และมาโครอัลบูมินูเรีย (MAC)

คำนิยาม

ในการศึกษาครั้งนี้

NA, MIC และ MAC ถูกกำหนดให้เป็นอัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีน<30, between 30 and 300 and >ครีเอตินีน 300 มก./กรัม ตามลำดับ อย่างน้อย 2 ใน 3 คอลเลกชันปัสสาวะเฉพาะจุด [10] อัตราการกรองของไตโดยประมาณ (eGFR) คำนวณตามสมการครีเอตินีนของโรคไตเรื้อรัง-ระบาดวิทยา

การเตรียมเซรั่ม

Vacutainer เก็บตัวอย่างเลือดครบส่วนอดอาหาร (น้อยกว่าหรือเท่ากับ 8 ชั่วโมง) ในหลอด 10-mL BD ®SSTTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30- นาที การแข็งตัวก่อนการปั่นเหวี่ยง 10- นาทีที่ 1.900 กรัม เก็บเกี่ยวเฟสบน กรองด้วยตัวกรอง Minisart®PES 0.22-μm (ซาร์โทเรียส กอตติงเกน ประเทศเยอรมนี) และแบ่งส่วนลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์เพื่อเก็บรักษาที่ −80 องศาจนกระทั่งทำการวิเคราะห์

มิอาร์เอ็นเอทั้งหมด

การแยก miRNA ทั้งหมดถูกแยกออกโดยใช้ miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen GmbH) ตามระเบียบการของผู้ผลิต โดยสรุป รีเอเจนต์ของ Qiazol Lysis ถูกเติมลงในเซรั่มปริมาณ 200 ไมโครลิตรสำหรับการสูญเสียสภาพธรรมชาติ ตามด้วย miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA mimic (Qiagen GmbH) เพื่อติดตามการฟื้นตัวของ RNA และย้อนกลับ ประสิทธิภาพการถอดความ เติมคลอโรฟอร์มสำหรับการแยกเฟสตามด้วยการเติมเอธานอล 100% ไปยังเฟสน้ำส่วนบน ขั้นตอนการล้างทำได้สำเร็จโดยบัฟเฟอร์ RWT, บัฟเฟอร์ RPE และเอทานอล 80% RNA ถูกชะออกโดยการเติมน้ำที่ปราศจาก RNase 14 μL ลงในเมมเบรนคอลัมน์หมุน RNeasy MinElute ปริมาณและคุณภาพ RNA ถูกกำหนดโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 1,000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA) ก่อนเก็บรักษาที่ −80 องศาจนกระทั่งใช้งาน การถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) ของ miRNA เป็น cDNA และการขยายสัญญาณล่วงหน้าดำเนินการด้วยชุด miScript RTII (Qiagen GmbH) และ miScript PreAMP PCR Kit (Qiagen GmbH) ตามลำดับตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยใช้เทมเพลต RNA 6 μL และ 5 μL ของเจือจาง ซีดีเอ็นเอ ตามลำดับ

การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ

miRNA ที่หมุนเวียนในซีรัมของกลุ่มการตรวจคัดกรองถูกระบุโดย miScript miRNA qPCR array (Qiagen GmbH) ที่มุ่งเน้นวิถี (การเกิดพังผืดของมนุษย์) และ miRNA ที่เลือกได้รับการตรวจสอบในภายหลังในกลุ่มการตรวจสอบความถูกต้องด้วย miScript miRNA qPCR array แบบกำหนดเอง (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วยเทมเพลต cDNA, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay และน้ำที่ปราศจาก RNase และเทมเพลต cDNA เจือจางเพื่อสร้างปริมาตรรวม 25 μL PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการบน Eppendorf Mastercycler ep realplex 4 ซึ่งได้รับการตั้งโปรแกรมดังนี้: 15 นาทีที่ 95 องศา 15 วินาทีที่ 94 องศา 30 วินาทีที่ 55 องศา และ 30 วินาทีที่ 70 องศาด้วย 40 รอบ

ปริมาณสัมพัทธ์ของ miRNA

การวิเคราะห์ข้อมูล PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Qiagen Gene Globe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/) การแสดงออกเชิงสัมพัทธ์ (RE) ได้มาจากวิธี 2−∆Ct โดยที่การแสดงออกของ miRNA แต่ละรายการนั้นถูกทำให้เป็นมาตรฐานของยีนดูแลทำความสะอาด SNORD95 หรือ Global Ct Mean การเปลี่ยนแปลงการพับคำนวณจากการแสดงออก miRNA ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในแต่ละกลุ่ม (MIC หรือ MAC) หารด้วยการแสดงออก miRNA ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในกลุ่มควบคุม (NA) ค่า p ถูกคำนวณตามตัวอย่าง t -test อิสระของค่า RE (2−∆Ct) ซ้ำสำหรับแต่ละยีนในกลุ่มควบคุมและกลุ่มทดสอบ การตรวจสอบเพิ่มเติมของการวิเคราะห์ข้อมูล qPCR ดำเนินการด้วยตนเองโดยใช้ Microsoft Excel และ IBM SPSS (แพ็คเกจทางสถิติสำหรับสังคมศาสตร์; IBM Corp, Ar Monk, NY, USA) รุ่น 25 สำหรับซอฟต์แวร์ Microsoft Windows

การเลือก miRNA ในกลุ่มการคัดกรองเพื่อการตรวจสอบความถูกต้อง

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 ถือเป็นการแสดงออกเชิงลบ ตามที่แนะนำโดยศูนย์วิเคราะห์ข้อมูล Qiagen GeneGlobe (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/) ตารางเสริมออนไลน์ที่ 1 (สำหรับวัสดุเสริมออนไลน์ทั้งหมด ดูที่ www.karger.com/doi/10.1159/000518866) แสดง RE ของ 84 miRNAs ในกลุ่มการคัดกรองที่ทำให้เป็นมาตรฐานกับค่าเฉลี่ย Ct ทั่วโลก MiRNA ที่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ±2.0- เท่าและมีคุณภาพดีถูกเลือกสำหรับการตรวจสอบความถูกต้อง ตามที่กำหนดโดยซอฟต์แวร์ นอกจากนี้ miRNA อื่น ๆ ยังได้รับการคัดเลือกตามการจัดอันดับของค่า p และการมีส่วนร่วมในการศึกษาก่อนหน้านี้ในเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับ DKD และ DKD โดยที่ miRNAs ที่มีจำนวนเป้าหมาย Messenger RNA สมมุติสูงสุดถูกเลือก ตารางเสริมออนไลน์ที่ 2 แสดงเกณฑ์เพิ่มเติมที่ใช้สำหรับการเลือก miRNA สำหรับการตรวจสอบ ในการวิเคราะห์การตรวจสอบความถูกต้อง การแสดงออกของ miRNA ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น SNORD95 เนื่องจากวิธีเฉลี่ย Ct ทั่วโลกไม่เหมาะสม และ Ct > 35 ถือเป็นการแสดงออกเชิงลบ เพื่อสร้างมาตรฐาน เราได้วิเคราะห์ RE ของ miRNA ที่เลือกอีกครั้งในกลุ่มการคัดกรองโดยยึดตามการทำให้เป็นมาตรฐานของ SNORD95 และใช้สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลังเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มการตรวจสอบความถูกต้อง

การวิเคราะห์ทางสถิติ

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >ดำเนินการ 2 กลุ่มอิสระโดยใช้ตัวอย่างอิสระทดสอบ Kruskal-Wallis (ตารางที่ 1) การเปรียบเทียบตัวแปรเด็ดขาดทำได้โดยใช้การทดสอบเหตุการณ์ฉุกเฉิน χ2 หรือการทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ (ตารางที่ 1) ความสัมพันธ์ระหว่าง miRNA RE ที่เลือกกับตัวแปรต่อเนื่อง (ข้อมูลประชากรและข้อมูลทางคลินิก) ทำได้โดยใช้สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน การทดสอบการถดถอยพหุคูณใช้เพื่อวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่าง miRNA RE ที่เลือกกับตัวทำนายที่สำคัญ การคำนวณทางสถิติเสร็จสิ้นโดยใช้ IBM SPSS (แพ็คเกจทางสถิติสำหรับสังคมศาสตร์; IBM Corp) รุ่น 25 สำหรับ Microsoft Windows และแพ็คเกจโปรแกรมซอฟต์แวร์เชิงสถิติ Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, USA) นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดเป็น p < 0.05

บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950

เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-ร้านค้า

รับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับการติดเชื้อในไต