การเข้าถึง Chromatin และการแสดงออกของ MicroRNA ในเซลล์ต้นกำเนิดของ Nephron ระหว่างการพัฒนาไต

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, แอนดรูว์ บอดนาร์^2,3, เดโบรา มอลตา Cerqueira^2,3, หยูเล้งพั่ว^2,5,6,อลิสซ่า ลอว์เลอร์^8,9,10, Kristy Boggs⁷, อันเดรียส เฟนนิ่ง^8,10,จ็ากเกอลีน โฮ^2,3*และ Dennis Kostka^1,4*

¹Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA²ศูนย์วิจัย Rangos โรงพยาบาลเด็ก UPMC แห่ง Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA³Department of Pediatrics, Division of Nephrology, University of Pittsburgh School of Medicine, PA, USA⁴Department of Computational & Systems Biology and Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, สหรัฐอเมริกา⁵กองพันธุศาสตร์และพันธุศาสตร์ ภาควิชากุมารเวชศาสตร์ UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁶ภาควิชาพยาธิวิทยา ห้องปฏิบัติการพันธุศาสตร์ชีวเคมีคลินิก UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁷Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA.⁸ชีววิทยาคอมพิวเตอร์⁹วิทยาศาสตร์ชีวภาพและ¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, USA

เชิงนามธรรม

เนฟรอนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีต้นกำเนิดมาจากประชากรของเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนและการเปลี่ยนแปลงในทรานสคริปโทมของเซลล์เหล่านี้มีส่วนทำให้การหยุดการสร้างไตบกพร่อง ซึ่งเป็นตัวกำหนดที่สำคัญของจำนวนเนฟรอน ในการจำแนกลักษณะการแสดงออกของ microRNA (miRNA) และระบุขอบเขตการควบคุม cis สมมุติ เราได้รวบรวมเซลล์ต้นกำเนิด nephron จากเมาส์ไตที่วันเอ็มบริโอ 14.5 และศูนย์วันหลังคลอดและทดสอบการแสดงออกของอาร์เอ็นเอขนาดเล็กและโครมาตินที่เข้าถึงได้ เราตรวจพบการแสดงออกของ 1,104 miRNA (114 ที่มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออก) และ 46,374 โครมาตินบริเวณที่เข้าถึงได้ (2,103 ที่มีการเปลี่ยนแปลงไม่สามารถเข้าถึงได้) ทั่วทั้งจีโนม ข้อมูลของเราเน้นย้ำถึงกระบวนการต่างๆ เช่น การแยกเซลล์ การย้ายเซลล์ ปฏิสัมพันธ์ของเมทริกซ์นอกเซลล์ และเส้นทางการส่งสัญญาณการพัฒนา นอกจากนี้ พวกเขายังระบุผู้สมัครสอบองค์ประกอบ cis-regulatory ใหม่สำหรับ Eya1 และ Pax8 ทั้งสองยีนที่มีบทบาทในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดของ nephron สุดท้าย เราเชื่อมโยง miRNA ที่เปลี่ยนแปลงนิพจน์ ซึ่งรวมถึง let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p และ miR{{ 20}}p โดยมีองค์ประกอบการกำกับดูแลของผู้สมัครและยีนเป้าหมาย การวิเคราะห์เหล่านี้เน้นย้ำถึงตำแหน่งสมมุติฐาน cis-regulatory ใหม่สำหรับ miRNA ในบรรพบุรุษของ nephron

บทนำ

หน่วยการทำงานของไตคือ เนฟรอน ซึ่งทำหน้าที่กรองของเสีย และรักษาสภาวะสมดุลของน้ำ กรด-เบส และอิเล็กโทรไลต์ในร่างกายให้เป็นปกติ จำนวน Nephron แตกต่างกันอย่างมากในมนุษย์ (โดยทั่วไประหว่างสองแสนและมากกว่าหนึ่งล้าน nephrons (Hughson et al., 2003)) และเกิดขึ้นก่อนเกิดในมนุษย์ (ประมาณวันหลังคลอด 2-3 ในหนูเมาส์ (Hartman et al ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)) Nephrons ไม่สามารถงอกใหม่ได้หลังคลอดและการบริจาค nephron ที่ลดลงมีความสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของโรคไตเรื้อรังและความดันโลหิตสูง (Bertram et al., 2011) ในทางกลับกัน จำนวน Nephron ส่วนใหญ่ถูกกำหนดโดยประชากรของเซลล์ที่เรียกว่าเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน(เซเบรียนและคณะ, 2014b). ในระยะหลังของไตการพัฒนา บรรพบุรุษของ nephron เพิ่มความโน้มเอียงที่จะแยกแยะ ซึ่งค่อยๆ หมดสิ้นประชากรของพวกเขาและทำเครื่องหมายการสิ้นสุดของการเกิดโรคไตในที่สุด (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018) การทำความเข้าใจกลไกที่ควบคุมการหยุดการสร้างไตมีนัยสำคัญสำหรับการพิจารณาการบริจาคไตและความเสี่ยงต่อโรคไตที่ตามมา

ในระหว่างไตการพัฒนา การต่ออายุตัวเอง Cited1 plus /Six2 plus nephron progenitors จะถูกกระตุ้นให้กลายเป็น primed Cited1-/Six2 plus progenitors และต่อมาแยกความแตกต่างเป็น Wnt4-แสดงถุงน้ำไตเพื่อตอบสนองต่อ Wnt9b/ -catenin (McMahon และคณะ, 2016; Rumballe et al., 2011). การเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสที่แท้จริงในช่วงต้นและปลายของต้นกำเนิด nephron รวมถึงยีนและวิถีที่มีอิทธิพลต่อการเสื่อมสภาพของเซลล์ต้นกำเนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่ง mTor และตัวยับยั้ง hamartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018) แท้จริงแล้ว hamartin นั้นคิดว่าจะทำให้บรรพบุรุษของ nephron ไวต่อสัญญาณสำหรับการต่ออายุตัวเอง และด้วยเหตุนี้เองที่นำไปสู่การหยุดการทำงานของไตเทียม (S. Chen et al., 2015) สอดคล้องกับแนวคิดที่ว่าต้นกำเนิดของ nephron ในระยะแรกมีแนวโน้มที่จะสร้างตัวเองใหม่มากขึ้น คือการสังเกตว่าความสามารถในการเข้าถึงของโครมาตินนั้นได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นสำหรับบริเวณที่มีผลผูกพันของปัจจัยการถอดรหัสเซลล์ต้นกำเนิด nephron หลัก รวมถึง Six2 และ Wt1 เมื่อเปรียบเทียบกับต้นกำเนิดของ nephron ระยะสุดท้าย (Hilliard et al. , 2019). ปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้แสดงให้เห็นแล้วว่าสามารถจับลำดับของเอนแฮนเซอร์ที่อยู่ใน "จุดควบคุมจุดร้อน" ในจีโนม (O'Brien et al., 2018) การเหนี่ยวนำของต้นกำเนิดของ nephron เกิดขึ้นเนื่องจากระดับ -catenin ที่เพิ่มขึ้นซึ่งส่งผลให้มีการเปิดใช้งานคอมเพล็กซ์ Lef1 / Tcf7 ที่ยีนที่เตรียมพร้อมสำหรับการกระตุ้นโปรแกรมการสร้างไต (Park et al., 2012) และได้รับการแนะนำให้ซับซ้อนด้วย Tcf7l1 และ Tcf7l2 เพื่อสร้างและคงไว้ซึ่งการควบคุมโครมาตินลูปที่เอื้อต่อการกระตุ้นยีน (Guo et al., 2021)

คลิกเพื่อผง Cistanche tubulosa สำหรับรักษาโรคไต

การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับ microRNAs (miRNA) ในการควบคุมการหยุดการสร้างไต miRNA เป็นโมเลกุล RNA สั้น ๆ ที่ไม่มีการเข้ารหัสซึ่งกำหนดเป้าหมายการถอดรหัส RNA ของผู้ส่งสาร (mRNA) สำหรับการแปลที่ลดลงหรือการย่อยสลายที่เพิ่มขึ้นผ่านคอมเพล็กซ์การระงับเสียงที่เกิดจาก RNA (RISC) (Bartel, 2009) โปรตีน Lin28b เป็นตัวยับยั้งที่รู้จักกันดีของตระกูล miRNAs ให้-7 (Heo et al., 2008) การแสดงออกของ Lin28b ลดลงในต้นกำเนิดของ nephron เมื่อการเกิดไตเกิดขึ้น และสิ่งนี้เกิดขึ้นพร้อมกับการแสดงออกของตระกูล miRNA ให้ -7 เพิ่มขึ้น (Yermalovich et al., 2019) นอกจากนี้ การเหนี่ยวนำแบบมีเงื่อนไขของการแสดงออกของ Lin28b ใน Wt1-การสืบเชื้อสายส่งผลให้เกิดการปราบปรามของ miRNA ให้-7 ซึ่งเพียงพอต่อการยืดอายุการเกิดไต (Yermalovich et al., 2019) ไม่ทราบว่า miRNAs อื่น ๆ ควบคุมระยะเวลาของการสร้างไตหรือไม่ นอกจากนี้ ในขณะที่มีการระบุตัวเพิ่มที่ควบคุมการแสดงออกของ RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัสเป็นเวลานานในระหว่างการสร้างไต (Nishikawa et al., 2019) ไม่มีการแสดงใดที่ควบคุมการแสดงออกของ miRNA ในต้นกำเนิดของ nephron

ในการศึกษานี้ เราพยายามที่จะระบุ miRNA นวนิยายที่มีส่วนช่วยในการหยุดการเกิดไต ควบคู่ไปกับคุณสมบัติที่เป็นไปได้ของการควบคุม cis ดังนั้น เพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ miRNA และการเข้าถึงโครมาตินระหว่างตัวอ่อนวันที่ 14.5 (E14.5) และศูนย์วันหลังคลอด (P0) เราจึงสร้างชุดข้อมูล mRNA-seq และ ATAC-seq ที่ตรงกันจากหลักและไม่ผ่านเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนที่จุดสองเวลานี้ เราระบุ 114 miRNAs ที่แสดงความแตกต่างในเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนระหว่างจุดสองเวลาเหล่านี้ เช่นเดียวกับภูมิภาค 2,103 แห่งการเปลี่ยนแปลงการเข้าถึงของโครมาตินซึ่งเราเรียกว่าภูมิภาคที่เข้าถึงได้ต่างกัน (DAR) การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของเป้าหมายยีนที่คาดการณ์ไว้ของการเปลี่ยนแปลง miRNA อย่างมีนัยสำคัญ เช่นเดียวกับตำแหน่งจีโนมของ DAR ที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางที่ส่งผลต่อการสร้างความแตกต่างของเซลล์เยื่อบุผิว การย้ายเซลล์ ปฏิสัมพันธ์ของเมทริกซ์นอกเซลล์ และเส้นทางการส่งสัญญาณการพัฒนาที่สำคัญ เช่น Wnt, Notch และ TGF- การส่งสัญญาณ . เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการเข้าถึงได้ของโครมาตินและนำเสนอหลักฐานหลายบรรทัดที่เกี่ยวข้องกับบริเวณจีโนมสองแห่งในฐานะสารเพิ่มประสิทธิภาพสมมุติฐานสำหรับยีน Eya1 และ Pax8 ในเซลล์ต้นกำเนิดของเนฟรอน สุดท้าย เราได้ระบุการเข้าถึงโครมาตินที่สอดคล้องกันและการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ miRNA สำหรับ 33 คู่ของ miRNAs และ DAR รวมถึง let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p และ miR-9-3p และยีนเป้าหมายสมมุติที่มีอยู่ซึ่งแสดงออกในบรรพบุรุษของเนฟรอนสำหรับ miRNA ที่แสดงออกอย่างต่างกัน

ผลลัพธ์

การแยกประชากรเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนจาก E14.5 และ P0ไต

เซลล์ต้นกำเนิด Nephronถูกแยกออกโดยการคัดเลือกเชิงบวกสำหรับ Itg 8 ที่ E14.5 หรือที่ P0 และแต่ละตัวอย่างถูกแบ่งออกเพื่อทำ mRNA-seq, ATAC-seq และการควบคุมคุณภาพ (รูปที่ 1 AB เสริม) PCR เชิงปริมาณ (qRT-PCR) ยืนยันว่ายีนมาร์กเกอร์ต้นกำเนิดของ nephron Six2 และ Cited1 (Huang et al., 2016) แสดงออกอย่างมากในตัวอย่างต้นกำเนิดของ nephron ที่แยกได้เมื่อเทียบกับทั้งหมดไตมากกว่าเครื่องหมายสำหรับเซลล์ประเภทอื่นๆ (รวมถึง ureteric bud (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), เซลล์บุผนังหลอดเลือด (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), stroma ไต (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) และ renal vesicle (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (รูปที่ 1 C) เพิ่มเติมเกี่ยวกับเพศครอกที่ใช้สำหรับตัวอย่าง E14.5 มีตั้งแต่ ตัวเมีย 27 ถึง 50 เปอร์เซ็นต์ และลูกครอกสำหรับตัวอย่าง P0 อยู่ระหว่าง 31 เปอร์เซ็นต์ ถึง 75 เปอร์เซ็นต์ ตัวเมีย โดยเฉลี่ย ตัวอย่าง E14.5 เป็นเพศหญิง 38 เปอร์เซ็นต์ และตัวอย่าง P0 เป็นเพศหญิง 49 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 1 D) -การจับคู่ประชากรเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนช่วยให้เราวิเคราะห์ได้การเข้าถึงโครมาตินและการแสดงออกของ RNA ขนาดเล็กในระยะเดียวกันของการพัฒนาที่จุดสองเวลา (E14.5 และ P0)

บรรพบุรุษของ nephron ในช่วงต้นและปลายมีโปรไฟล์การถอดรหัส miRNA ที่แตกต่างกัน

การหาลำดับ RNA ขนาดเล็กตรวจพบ 1,104 ทรานสคริปต์ miRNA ที่รู้จักและระบุ 114 miRNA ที่แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกระหว่าง E14.5 และ P{{10}} ตัวอย่าง (อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด ( FDR)=0.05; ตารางเสริม 1) miRNA ที่แสดงออกอย่างต่างกันครึ่งหนึ่งแสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นที่ P0 เมื่อเทียบกับ E14.5 และการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักเน้นย้ำความเป็นเนื้อเดียวกันมากขึ้นในการแสดงออกของ miRNA ในกลุ่มตัวอย่าง E14.5 เมื่อเทียบกับ P0 (รูปที่ 1A) การจัดกลุ่มตามลำดับชั้นเผยให้เห็นการจัดกลุ่มที่ชัดเจนของ miRNAs เป็นนิพจน์ที่เพิ่มขึ้นและลดลงระหว่าง E14.5 และ P0 ตามลำดับ (รูปที่ 1B) สมาชิกของ miRNAs ในตระกูล let-7 เป็นหนึ่งใน miRNA ที่มีการแสดงออกมากที่สุด และเราสังเกตว่าสมาชิกในครอบครัวทั้งหมดที่มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญแสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นที่ P0 (ไม่แสดงข้อมูล) ซึ่งสอดคล้องกับผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่าการลดการแสดงออกของ Lin28b นำไปสู่การเพิ่มขึ้นในวงกว้างของการแสดงออกของครอบครัว Let-7 ตลอดระยะเวลาการเกิดไต (Yermalovich et al., 2019) miRNA อื่นที่มีการแสดงออกที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญที่ P0 ได้แก่ miR-429-3p ซึ่งเป็นสมาชิกของตระกูล miR-200 ที่ทราบว่าส่งผลต่อความแตกต่างของ podocyte (Z. Li et al., 2016) และทั้ง miR{{30 }}a-5p และ miR-125b-5p สองหลังนี้เป็นที่ทราบกันดีว่ายับยั้งการถอดเสียง Lin28 ในสภาพแวดล้อมของเซลล์ที่แตกต่างกัน (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017) miRNA ที่มีการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญที่ P0 รวมถึงการสร้างเส้นเลือดใหม่ (S. Wang et al., 2008) และการส่งเสริมการเพิ่มจำนวน (Schober et al., 2014) miR-126

เครื่องมือ DIANA miRPath ช่วยให้สามารถวิเคราะห์เส้นทางของ KEGG ของ miRNA ตามเป้าหมายของยีนที่เกี่ยวข้อง ตามที่คาดการณ์โดย micro T-CDS (Vlachos et al., 2015) เราพบว่า miRNA ที่มีการเปลี่ยนแปลงมากที่สุดในการแสดงออกระหว่าง E14.5 และ P0 (ขึ้นหรือลง) คือค่าที่ควบคุมเส้นทางที่มีบทบาทสำคัญในการสร้างไต (รูปที่ 1C รูปที่ 2) ตัวอย่างเช่น Tgf- ถูกหลั่งโดยเซลล์ stromal โดยรอบเพื่อส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของต้นกำเนิดของ nephron (Rowan et al., 2{{50}}18) และเราสังเกตเห็นการแสดงออกที่ลดลงในหมู่ nephron progenitor miRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปยังเอฟเฟกต์ดาวน์สตรีมของ "เส้นทางการส่งสัญญาณ TGF-" (เส้นทาง KEGG mmu04350, p-value 1.45e- 6) "เส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK" (mmu04010) มีอิทธิพลต่อองค์กรและการเตรียมต้นกำเนิดของเนฟรอนสำหรับการสร้างความแตกต่าง และควบคุมการโต้ตอบกับเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) ผ่าน Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018) เราสังเกตจำนวน miRNA ที่มีการควบคุมขึ้นและลงที่มีนัยสำคัญซึ่งกำหนดเป้าหมายยีนที่แตกต่างกันในเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK นี้ (ค่า p เท่ากับ 3.5e- 6 และ 3.0e- 4 สำหรับรายการขึ้นและลงตามลำดับ) . ในที่สุด ทางเดินของ KEGG "ปฏิสัมพันธ์ของตัวรับเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM)" (mmu04512) เป็นเส้นทางที่สมบูรณ์ที่สุดที่ระบุได้ และยีนที่เป็นส่วนประกอบของมันมีเป้าหมายที่สำคัญกว่ามากโดย miRNA ซึ่งเพิ่มขึ้นในการแสดงออกเมื่อเวลาผ่านไป (ค่า p 7.4e{ {32}} ระหว่างการเพิ่ม miRNA เทียบกับ 1.1e-2 จากการลดลง) ยีนที่เกี่ยวข้องกับ ECM กำหนดเป้าหมายโดย miRNA ที่แสดงออกอย่างสูงและเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่เราตรวจพบ ซึ่งรวมถึง miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125ก-5p และให้-7f-5p โดยเฉพาะอย่างยิ่ง miR-196a-5p คือ miRNA ที่แสดงออกมาสูงสุดในตัวอย่างของเรา และพบว่ามีการเพิ่มขึ้น 8-เท่าระหว่าง E14.5 และ P0 การถอดรหัสยีนที่เป็นเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้ของ miRNA (โดยใช้ TargetScan (Agarwal et al., 2015)) ด้วยการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นที่ P0 รวมถึง Bach2 การเชื่อมโยงระดับโมเลกุลที่เสนอระหว่างเส้นทาง MAPK/AP1 และ Six2/ -catenin สำหรับการต่ออายุตัวเองและการสร้างความแตกต่าง ในบรรพบุรุษของเนฟรอนตามลำดับ (Hilliard et al., 2019).

เพื่อระบุเป้าหมายสมมุติของ miRNA ที่แสดงออกอย่างต่างกันในบรรพบุรุษของ nephron เราใช้คำอธิบายประกอบเชิงคำนวณของ miRNA ที่ให้ไว้ใน miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) และปฏิกิริยาระหว่าง miRNA-mRNA ทดลองที่มีคำอธิบายประกอบจากฐานครก (HY Huang et al., 2020) ร่วมกับชุดข้อมูลการจัดลำดับ RNA เซลล์เดียว E14.5 ที่เราสร้างขึ้นก่อนหน้านี้ (Bais et al., 2020) ดังนั้นเราจึงสร้างรายการของการทำงานร่วมกันของ miRNA-mRNA ที่อาจเกิดขึ้นตามการแสดงออกที่แตกต่างกันของ miR ระหว่าง E14.5 และ P0 ในต้นกำเนิดของ nephron ที่มีการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันในการแสดงออกของยีนเป้าหมายระหว่างการต่ออายุตัวเองและต้นกำเนิดของ nephron ที่เตรียมไว้ตลอดจน primed และ การแยกความแตกต่างของบรรพบุรุษของเนฟรอน (รูปที่ 2) การวิเคราะห์ของเราชี้ให้เห็นว่า Meis2 และ Hmga2 เป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้ของตระกูล miRNAs -7 ของ miRNAs ในบรรพบุรุษของ nephron (รูปที่ 2) โดยมีการแสดงออกของ Meis2 และ Hmga2 ที่ลดลงซึ่งสัมพันธ์กับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของสมาชิกในครอบครัวให้-7 ในการสร้างความแตกต่างหรือแก่ชรา nephron progenitors ปัจจัยการถอดรหัส Meis2 นั้นแสดงออกอย่างชัดเจนในต้นกำเนิดของ nephron และ stroma ของไตในช่วงไตการพัฒนา (Lam et al., 2014) และเชื่อมโยงกับการควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ในบริบทอื่น (Abruzzese et al., 2019) Hmga2 เป็นโปรตีนที่จับกับโครมาตินแบบ nonhistone ซึ่งแสดงออกอย่างมากในเซลล์ต้นกำเนิด และมีความเกี่ยวข้องกับเนื้องอกในเยื่อหุ้มเซลล์หลายชนิด (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014) ในทำนองเดียวกัน มีการแสดงออก Jag1 เพิ่มขึ้นที่เกี่ยวข้องกับการลดการแสดงออกของ miR-34b-5p, miR-983p และ miR-200a-3p ในการสร้างความแตกต่าง หรือบรรพบุรุษของเนฟรอนที่มีอายุมากขึ้น (รูปที่ 2) Jag1 เป็นแกนด์หลักในการส่งสัญญาณ Notch ซึ่งการแสดงออกเพิ่มขึ้นเมื่อต้นกำเนิดของ nephron แตกต่าง (Chung et al., 2016) เป้าหมาย miRNA ที่คาดการณ์หรือใส่คำอธิบายประกอบทั้งหมดสำหรับยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกระหว่างการกำเนิดของเนฟรอนที่ต่ออายุเอง ไพรม์ และแยกความแตกต่างมีอยู่ในส่วนเสริม

รูปที่ 1 การเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการแสดงออกของ miRNA ระหว่าง E14.5 และ P0 nephron progenitors.A) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักแสดงให้เห็นว่าจุดเวลาในการพัฒนาเป็นปัจจัยหลักที่ทำให้เกิดความแปรผันของการแสดงออกของ miRNA B) แผนที่ความร้อนแสดงการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miRNA ที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งหมด คอลัมน์ที่มีตัวอย่าง E14.5 ทางด้านซ้ายจะมีคำอธิบายประกอบเป็นสีเขียวอ่อน และคอลัมน์ที่มีตัวอย่าง P0 ทางด้านขวาจะมีคำอธิบายประกอบเป็นสีเขียวเข้ม C) การเพิ่มคุณค่าของยีนจากวิถี KEGG เฉพาะในกลุ่มเป้าหมายของยีนที่คาดการณ์ไว้ของ miRNA ที่ควบคุมขึ้นและลง (แถบสีแดงและสีน้ำเงินตามลำดับ) ค่า p ต่ำสุดที่รวมคือ 1e-5

รูปที่ 2 ปฏิกิริยาระหว่าง miRNA-mRNA กับบทบาทที่เป็นไปได้ในการแก่และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดของ nephron ที่แสดงคือ miRNA (วงกลม) และ mRNA (สี่เหลี่ยม) miRNA ที่มีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นระหว่าง E14.5 และ P0 จะแสดงเป็นสีแดง miRNA ที่ลดลงจะแสดงเป็นสีน้ำเงิน ยีนเป้าหมายที่มีคำอธิบายประกอบ (จาก mirDB และ mir TarBase) พร้อมการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นระหว่างการต่ออายุตัวเอง ไพรม์ หรือการสร้างความแตกต่างเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน(Bais et al., 2020) แสดงเป็นสีแดง mRNA โดยมีนิพจน์ลดลงเป็นสีน้ำเงิน ขอบจาก mirDB และ mirTarDB ที่ไม่สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงนิพจน์ที่สังเกตได้ถูกตัดออก แต่รวมอยู่ในตารางเพิ่มเติมที่ 2

บรรพบุรุษของเนฟรอนตอนต้นและปลายมีสภาพแวดล้อมของโครมาตินที่แตกต่างกัน

ข้อมูล ATAC-seq จาก E14.5 และ P0 nephron progenitors ช่วยให้เราสามารถระบุ 46,374 ภูมิภาคของโครมาตินที่สามารถเข้าถึงได้ (ด้วยอัตราการค้นพบที่ลดลง (Boleu et al., 2015) เกณฑ์ของ {{ 22}}.1 ดู (รูปที่ 3 C ตารางเพิ่มเติม 3) รวมกันระหว่างตัวอย่างและจุดเวลา เราทราบว่าข้อมูลของเราสอดคล้องกับแนวทาง ATAC-seq ของโครงการ ENCODE (ENCODE, nd) (รูปที่ 3 A, B) และเราสังเกตเห็นอัตราการอนุรักษ์ที่เพิ่มขึ้นระหว่างยอด IDR มากกว่าที่เห็นในการควบคุมแบบสุ่ม (รูปที่ 3 D) ในบรรดา IDR ที่เรารายงาน 3,576 มีสารเพิ่มประสิทธิภาพที่บันทึกไว้ใน VISTA (Visel et al., 2007) และ/หรือ FANTOM5 (de Rie et al., 2017) ฐานข้อมูลเอนแฮนเซอร์ และ 13,495 มีลำดับดีเอ็นเอที่มีบทบาทด้านกฎระเบียบที่คาดการณ์ไว้ในเนื้อเยื่อหรือเซลล์ของเมาส์อย่างน้อยหนึ่งชนิดตาม EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020)

การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (ปรับตามความแตกต่างทางเพศระหว่างกลุ่มตัวอย่าง) เผยให้เห็นกลุ่มตัวอย่างที่ชัดเจนตามจุดเวลาการพัฒนา (รูปที่ 3A) เพื่อระบุตำแหน่งจีโนมที่มีการเปลี่ยนแปลงในการเข้าถึงโครมาติน เราได้เปรียบเทียบสัญญาณ ATAC-seq ระหว่างตัวอย่าง E14.5 และ P0 เราสังเกต DAR 2,103 DAR ควบคุม FDR ที่ 10 เปอร์เซ็นต์ จาก 1,323 ราย (55 เปอร์เซ็นต์) แสดงให้เห็นความสามารถในการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นที่ P0 เมื่อเทียบกับ E14.5 และการจัดกลุ่มตามลำดับชั้นเผยให้เห็นความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่าง DAR ที่เปิดและปิดระหว่าง E14.5 และ P0 ตามลำดับ (รูปที่ 3B)

รอยเท้าปัจจัยการถอดความถูกระบุโดยใช้ HINT และจับคู่กับโปรตีนที่จับกับ DNA โดยใช้ลวดลายจากฐานข้อมูล HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) ในบรรดา 431 ลวดลายที่ทดสอบ DAR ที่มีรอยเท้าของโปรตีนปัจจัยการถอดรหัสหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการเกิดไตแสดงความสามารถในการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นระหว่าง E14.5 และ P0 ในบรรดารอยเท้าที่อยู่ใน DAR ที่เพิ่มความสามารถในการเข้าถึงได้โดยเฉลี่ย หกอันดับแรกเป็นรอยเท้าปัจจัยการถอดความที่ตรงกับ Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), มิ.ย. (0.12) และ Fos (0.11) รอยเท้าที่มีคำอธิบายประกอบใน DAR ปิด ได้แก่ ปัจจัยการถอดรหัส E2F2 และ E2F4 ซึ่งทราบว่ามีอิทธิพลต่อความก้าวหน้าของวัฏจักรเซลล์ (Gaudet et al., 2011) และเพื่อส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ (D. Wang et al., 2000) ในบริบทของเซลล์อื่นๆ (ตัวเลขเสริม) 4).

ในการประเมินบริบททางชีววิทยาของการเปิดและปิด DAR เราใช้ Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010) เพื่อเน้นชุดยีนด้วยการเสริมคุณค่าของภูมิภาคโครมาตินที่เปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้อง ด้วยวิธีการดังกล่าว เราระบุกระบวนการทางชีววิทยาของยีนออนโทโลจี (GO) ที่เชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับการพัฒนาต้นกำเนิดของเนฟรอน: โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กระบวนการที่สำคัญที่สุดในการเปิด DAR คือ "กฎระเบียบของการแยกเซลล์เยื่อบุผิว" (GO:0030856, ค่าทวินาม Q-value {{3) }}.5e-5) และ "การควบคุมเชิงบวกของการสร้างความแตกต่างของเซลล์เยื่อบุผิว" (GO:0030858 ค่า Binomial Q-value=5e-3) เป็นหนึ่งใน 10 อันดับแรกที่ได้รับการเสริมสมรรถนะที่สำคัญที่สุด ( รูปที่ 5) ทั้งสองมีความสอดคล้องกับแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นของต้นกำเนิดของ nephron ที่จะได้รับการเปลี่ยนแปลงของ mesenchymal-to-epithelial (MET) ในขณะที่พวกเขาสร้างความแตกต่าง (S. Chen et al., 2015) เส้นทางที่เสริมคุณค่าอย่างมีนัยสำคัญอื่นๆ ได้แก่ "กฎเกณฑ์เชิงบวกของเส้นทางสัญญาณ Notch" (GO:0045747, ค่าทวินาม Q-value=2e-5) ซึ่งสอดคล้องกับบทบาทของสัญญาณ Notch ในการส่งเสริมความแตกต่างของต้นกำเนิดของ nephron ( Chung et al., 2016). DAR ปิด 10,083 รายการที่ตรวจพบไม่ได้เปิดเผยเงื่อนไข GO ที่สำคัญตามเกณฑ์เริ่มต้นของ GREAT สำหรับความสำคัญ (ดูรูปเพิ่มเติมที่ 5)

รูปที่ 3 ความแตกต่างของความสามารถในการเข้าถึงโครมาตินของลักษณะ E14.5 กับ P0เซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน.A) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักของตัวอย่าง ATAC-seq เน้นจุดเวลาในการพัฒนาว่าเป็นแหล่งสำคัญของการเปลี่ยนแปลง B) แผนที่ความร้อนแสดงขอบเขต IDR ที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง ATAC-seq ตัวอย่าง/คอลัมน์ E14.5 มีคำอธิบายประกอบเป็นสีเขียวอ่อน และตัวอย่าง/คอลัมน์ P0 มีคำอธิบายประกอบด้วยสีเขียวเข้ม C) GO Biological Process Terms ได้รับการเสริมประสิทธิภาพสำหรับภูมิภาคจีโนมที่เปิดระหว่าง E14.5 และ P0 ตาม GREAT จัดอันดับโดย binomial P-value, FDR น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001

ต่อไปเราสำรวจการเข้าถึงโครมาตินในพื้นที่ของจีโนมที่มีโปรโมเตอร์และเอนแฮนเซอร์สำหรับยีนที่มีบทบาทเผยแพร่ในการแยกเซลล์ต้นกำเนิดของเนฟรอน ในบรรดาปัจจัยเหล่านี้ ปัจจัยการถอดรหัส Six2 มีความสำคัญต่อการรักษาศักยภาพของเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน(Self et al., 2006) และในตัวอย่างทั้งหมด เราสังเกตเห็นโครมาตินที่เข้าถึงได้โดยรอบโปรโมเตอร์ของมันและตัวเสริม Six2 ที่รู้จัก ~50kb ต้นน้ำของไซต์เริ่มต้นการถอดรหัส Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (รูปที่ 4A, B, พื้นที่แรเงาสีน้ำเงิน) เรายังสังเกตบริเวณของโครมาตินที่เข้าถึงได้บนโปรโมเตอร์และสารเอนแฮนเซอร์ที่เผยแพร่สำหรับโปรตีน Gdnf (รูปที่ 4D, E) ซึ่งหลั่งโดยต้นกำเนิดของเนฟรอนเพื่อส่งเสริมการแตกแขนงของตาของท่อไต (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). เอนแฮนเซอร์นี้อยู่ที่ประมาณ 113kb ต้นน้ำของโปรโมเตอร์ของยีน และเป็นที่ทราบกันว่าตอบสนองต่อการส่งสัญญาณ Wnt ในบริบทของการพัฒนาต้นกำเนิดของเนฟรอน (Park et al., 2012) แม้ว่าโปรโมเตอร์สำหรับ Gdnf จะไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเวลาผ่านไป แต่เอนแฮนเซอร์ที่มีคำอธิบายประกอบทำให้การเข้าไม่ถึงเพิ่มขึ้นอย่างมาก นอกจากนี้เรายังสังเกตบริเวณของโครมาตินที่เข้าถึงได้โดยรอบสารเพิ่มประสิทธิภาพที่เผยแพร่ซึ่งทำงานอยู่ในบรรพบุรุษของเนฟรอนสำหรับ Eya1 ซึ่งอยู่ที่ ~325kb ต้นน้ำของ TSS ของยีน (Park et al., 2012) (รูปที่ 6) Eya1 เป็นปัจจัยการถอดความที่โต้ตอบกับ Six2 เพื่อรักษา multipotency ของ nephron progenitor (J. Xu et al., 2014)

เราสังเกต DAR หลายตัวที่ไม่ทับซ้อนกับคุณลักษณะด้านกฎระเบียบที่รู้จัก แต่ครอบคลุมบริเวณที่คาดการณ์ว่าจะมีกิจกรรมเอนแฮนเซอร์สำหรับยีนเฉพาะในเซลล์เมาส์ประเภทต่างๆ ตามคำอธิบายประกอบใน EnhancerAtlas 20 (Gao & Qian, 2020) นอกเหนือจากตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่เผยแพร่ของ Eya1 (Park et al., 2012) (รูปที่ 6) การปิด DAR ในอินตรอนของ Eya1 (รูปที่ 5A-B) ยังครอบคลุมบริเวณที่คาดการณ์ว่าจะมีกิจกรรมเอนแฮนเซอร์ในยีน Eya1 ในเมาส์ เซลล์ต้นกำเนิดประสาทและเซลล์ต้นกำเนิด granulocyte-monocyte (Gao & Qian, 2020). เพื่อให้สอดคล้องกับการลดลงของกิจกรรมเอนแฮนเซอร์ เราได้สังเกตเห็นก่อนหน้านี้ว่าการแสดงออกของ Eya1 ลดลงในการแยกแยะต้นกำเนิดของเนฟรอนโดยใช้ข้อมูล E14.5 scRNA-seq (รูปที่ 7) (Bais et al., 2020) สิ่งนี้สอดคล้องกับข้อมูล ChIP-seq ที่เผยแพร่ในบรรพบุรุษ E16.5 nephron หลักที่แสดงการขาดเครื่องหมายเอนแฮนเซอร์ที่ใช้งานอยู่ H3K27ac และการขาดการเชื่อมโยงจาก Ctnnb1, Lef1, Six2 และ Tcf7 (รูปที่ 5) (Guo et al ., 2021). สารเพิ่มประสิทธิภาพที่มีศักยภาพนี้ยังประกอบด้วยรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสสำหรับ Hoxd10 ภายในจุดสูงสุด ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่จำเป็นสำหรับการสร้างความแตกต่างและการรวมตัวของต้นกำเนิดของเนฟรอนระหว่างการเปลี่ยนผ่านจากเยื่อหุ้มเซลล์สู่เยื่อบุผิว (MET) (Yallowitz et al., 2011)

DAR ที่เพิ่มความไม่สามารถเข้าถึงได้บนโครโมโซม 24 ทับซ้อนบริเวณโครมาตินด้วยกิจกรรมการเพิ่มประสิทธิภาพที่คาดการณ์ไว้สำหรับปัจจัยการถอดรหัส Pax8 ในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงจากไตของเมาส์ เยื่อบุผิวในลำไส้ และมดลูก (Gao & Qian, 2020) Pax8 มีความซ้ำซ้อนบางส่วนกับ Pax2 แต่ต้องมีปัจจัยการถอดรหัสอย่างน้อยหนึ่งในสองปัจจัยในบรรพบุรุษของ nephron สำหรับไตการพัฒนา (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007) ก่อนหน้านี้เราสังเกตว่าการแสดงออกของ Pax8 เพิ่มขึ้นในต้นกำเนิดของ nephron ที่สร้างความแตกต่างและแตกต่างกัน (รูปที่ 7) และเราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมากในการเข้าถึงได้ใน DAR ที่ครอบคลุมคุณลักษณะด้านกฎระเบียบนี้ ภูมิภาคนี้ยังเกี่ยวข้องกับเครื่องหมายเอนแฮนเซอร์ที่ใช้งานอยู่ H3K27ac และการผูกมัดของ Ctnnb1, Lef1, Six2 และ Tcf7 ในข้อมูล ChIP-seq ที่เผยแพร่จากต้นกำเนิด E16.5 nephron หลัก (รูปที่ 5) (Guo et al., 2021) เราสังเกตรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสจำนวนหนึ่งซึ่งอยู่ในจุดสูงสุดของความสามารถในการเข้าถึงที่ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงของ DAR ซึ่งรวมถึงสองรอยสำหรับ Sall1 ซึ่งเป็นปัจจัยนิวเคลียร์ที่ทราบว่ามีผลกระทบต่อการเกิดไต (Kanda et al., 2014) และรอยเท้าที่จัดกลุ่มอย่างใกล้ชิดเจ็ดแห่งสำหรับนิ้วสังกะสีที่เกี่ยวข้องกับ MYC โปรตีน (Maz) ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีผลต่อไตพัฒนาการของมนุษย์และหนู (Haller et al., 2018). ตารางเพิ่มเติมที่ 3 ประกอบด้วยรายการที่สมบูรณ์ของบริเวณที่เข้าถึงได้ที่เราพบ รวมทั้งสถิติการช่วยสำหรับการเข้าถึงที่แตกต่างกันตามลำดับ คำอธิบายประกอบสำหรับยีน เอ็กซอน และโปรโมเตอร์ที่ซ้อนทับกัน และรายการของรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสที่เชื่อมโยงกับไตเทียมที่สำคัญที่ระบุ

รูปที่ 4 โปรไฟล์ ATAC-seq ที่ตำแหน่งกฎข้อบังคับที่ทราบและสมมุติฐาน สำหรับแต่ละแผงจากบนลงล่างการเข้าถึงโครมาตินในตัวอย่าง E14.5 และ P0 โดยมี IDR และ DAR ระบุว่าไฮไลต์เป็นสีน้ำเงิน (ไม่มีการเปลี่ยนแปลง IDR) และสีเขียว (เปิด DAR) และสีแดง (ปิด DAR) แง่มุมต่อไปนี้แสดงคำอธิบายประกอบของยีน ตำแหน่งนิวคลีโอโซม (สีเทา) และบริเวณที่ปราศจากนิวคลีโอโซม (สีแดง) ที่วัดในตัวอย่าง E14.5 และ P0 ที่รวบรวมไว้ และคะแนนการอนุรักษ์ PhastCon60 (สีดำหมายถึง 1{{ 12}}การอนุรักษ์ร้อยละ 0 สีขาวอนุรักษ์ร้อยละ 0 A) โปรโมเตอร์และยีนของปัจจัยการถอดรหัส Six2 B) Enhancer for Six2 เผยแพร่โดย Park et อัล C) ตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่เข้าถึงได้แบบต่างๆ สำหรับ Gdnf พร้อมการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นที่ P0 D) โปรโมเตอร์สำหรับ Gdnf

รูปที่ 5 DARs ที่ทับซ้อนกันสารเพิ่มประสิทธิภาพใหม่ที่มีศักยภาพสำหรับยีนที่เชื่อมโยงกับ nephrogenesis A และ C) แผงแสดงแผนที่ของภูมิภาค 1MB รอบ ๆ ยีนที่น่าสนใจโดยมียีนที่เข้ารหัสโปรตีนเป็นสีเขียวและปฏิสัมพันธ์ของเอนแฮนเซอร์ / โปรโมเตอร์ที่เสนอเป็นวงสีดำ . B และ D) จากบนลงล่าง แผงแสดงถึงการเพิ่มคุณค่าของการเข้าถึงโครมาตินวัดในตัวอย่าง E14.5 และ P0 โดย IDR เน้นด้วยสีเขียว (เปิด) และสีแดง (ปิด) ตามด้วยการวัด ChIP-seq ในพื้นที่เหล่านี้วัดโดย Guo et อัล ในต้นกำเนิดของเนฟรอนปฐมภูมิเซลล์(Guo et al., 2021) แผงที่สามแสดงคำอธิบายประกอบของยีน (สีน้ำเงิน) และองค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่คาดการณ์ไว้จาก Enhancer Atlas 2.0 (สีแดง) และแผงที่สี่แสดงถึงรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสที่ระบุในข้อมูล ATAC-seq แผงที่ห้าแสดงนิวคลีโอโซม (สีเทา) และ NFR (สีแดง) และแผงด้านล่างแสดงถึงการอนุรักษ์ A) พื้นที่ 1MB ที่มีเนื้อยีนสำหรับ Eya1 และตัวเสริมศักยภาพ Eya1 ที่มีศักยภาพประมาณ 325kb ต้นน้ำ B) พื้นที่ 4.5kb ที่มีตัวเสริมศักยภาพ Eya1 C) พื้นที่ 1MB ที่มีโลคัสของยีน Pax8 และเอนแฮนเซอร์ที่คาดการณ์ไว้ D) พื้นที่ 4.5kb ที่มีตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่คาดการณ์ไว้และ DAR ที่ทับซ้อนกัน

โดเมนที่เชื่อมโยงทางทอพอโลยีช่วยระบุศักยภาพเอนแฮนเซอร์—ความสัมพันธ์ของ miRNA

โดเมนที่เกี่ยวข้องกับโทโพโลยีที่เกี่ยวข้อง (TADs) คือบริเวณมาตราส่วนเมกะเบสของการจัดระเบียบโครมาตินที่มีลำดับสูงกว่าซึ่งเป็นผลมาจากการบรรจุโครมาตินเข้าไปในนิวเคลียสในพื้นที่สามมิติ (Dixon et al., 2012) และโดยทั่วไปการโต้ตอบระหว่างเอนแฮนเซอร์และโปรโมเตอร์จะถูกจำกัดไว้ที่ องค์ประกอบภายใน TAD เดียวกัน (Symmons et al., 2014) เราประมาณค่า TAD จากต้นกำเนิดของ nephron โดยใช้คำอธิบายประกอบที่สร้างจากเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนของเมาส์ (ESC) (Y. Wang et al., 2018) เพื่อตรวจสอบขอบเขตการควบคุม cis ที่เป็นไปได้ของ miRNA เราสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงในการเข้าถึงโครมาตินด้วย miRNA ที่แสดงออกต่างกันภายใน TAD เดียวกัน โดยรวมแล้ว 42,778 ภูมิภาคที่เข้าถึงได้ที่ไม่ซ้ำกัน (ประมาณ 92 เปอร์เซ็นต์ ) อยู่ภายใน TAD ที่มีคำอธิบายประกอบ และใน 30,626 แห่ง (ประมาณ 72 เปอร์เซ็นต์) จะไม่ทับซ้อนกับโปรโมเตอร์ที่รู้จัก ซึ่งรวมถึง 2,103 DAR โดยมีการเปิดและปิด 1,180 และ 923 เมื่อเวลาผ่านไปตามลำดับ DAR การเปิดสิบห้ารายการแบ่งปัน TAD กับ miRNA หนึ่งรายการขึ้นไปโดยมีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นระหว่าง E14.5 และ P0 และ DAR การปิดเก้ารายการแบ่งปัน TAD กับ miRNA หนึ่งรายการขึ้นไปที่มีการแสดงออกที่ลดลง รูปที่ 6 สรุปวิธีการนี้และแสดงระยะห่างระหว่าง DAR และ miRNA ที่ตรงกัน ซึ่งมีตั้งแต่ 27 kb ถึงมากกว่า 1 mb (เฉลี่ย: 447 kb) ตารางที่ 1 รายละเอียดชุดของความสัมพันธ์ DAR – miRNA ที่เป็นไปได้ โดยมีรายการ DAR หนึ่งรายการต่อ miRNA ที่ตรงกัน

ในบรรดาคู่ miRNA-enhancer ที่มีคำอธิบายประกอบ เราสังเกตเห็นสิ่งที่น่าสนใจสามอย่างเป็นพิเศษ ขั้นแรก การเปิด DAR ได้รับการระบุ 120 kb ดาวน์สตรีมของ let-7c-5p และ 73 kb ดาวน์สตรีมของ miR-125b-5p ซึ่งเชื่อมโยงกับ Six2 ไซต์ที่มีผลผูกพันในชุดข้อมูล E16.5 nephron progenitor ChIP-seq ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (รูปที่ 7A) (Guo et al., 2021) ให้-7c-5p เป็นหนึ่งใน let-7 miRNAs ที่แสดงออกมากที่สุดที่เราตรวจพบ และเป็นที่ทราบกันดีว่าตระกูล let-7 ยับยั้ง Lin28btranscripts (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). เราทราบว่า Hmga2 และ Meis2 นั้นยังถูกระบุว่าเป็นเป้าหมายใหม่ที่เป็นไปได้ของตระกูล let-7 ในบรรพบุรุษของเนฟรอน (รูปที่ 2) miR-125b-5p ยังแสดงเพื่อยับยั้งการถอดรหัส Lin28 ในเซลล์เม็ดเลือดและเซลล์ต้นกำเนิดของเมาส์ (Chaudhuri et al., 2012) ประการที่สอง miR-9-3p เป็นส่วนประกอบย้อนกลับของ miR-9-5p ซึ่งเป็น miRNA ที่เพิ่งได้รับการแสดงเพื่อปกป้องจากไตพังผืดโดยการกำหนดเป้าหมายเส้นทางการเผาผลาญ (Fierro‐Fernández et al., 2020) เราตรวจพบการลดลงมากกว่า 10-เท่าใน miR-9-3ptranscripts ระหว่าง E14.5 และ P0 nephron progenitors และเราได้ระบุองค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่เป็นไปได้ซึ่งอยู่ห่างออกไปประมาณ 249kb (รูปที่ 7B) เราสังเกตรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสสำหรับ Snai1 และ Snai2 ใน DAR ที่เกี่ยวข้อง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าส่งเสริมการเปลี่ยนผ่านของเยื่อบุผิวเป็นมีเซนไคม์ (EMT) (Sundararajan et al., 2019) สุดท้าย เราจับคู่ miR-181a-2-3p กับ locus-regulatory cis-regulatory ที่เป็นไปได้ 131kb อัพสตรีมบนโครโมโซม 2 โดยที่เราสังเกตรอยเท้าของปัจจัยการถอดรหัสสำหรับปัจจัยการถอดรหัส Wt1 ซึ่งเป็นตัวควบคุมหลักของต้นกำเนิดของ nephron การอยู่รอด (Kreidberg et al., 1993) และการผูกมัด Six2 ในชุดข้อมูล E16.5 nephron progenitor ChIP-seq ที่เผยแพร่ (รูปที่ 7C) ) (Guo et al., 2021)

ตารางที่ 1. การเปลี่ยนแปลงนิพจน์ miRNA จับคู่กับ DAR อย่างน้อยหนึ่งรายการใน TAD เดียวกัน

รูปที่ 6 การค้นหาเอนแฮนเซอร์ของผู้สมัคร—คู่เป้าหมาย-miRNAA) แผนผังลำดับงานแสดงว่าพื้นที่ของความสามารถในการเข้าถึงได้รับการจัดลำดับความสำคัญอย่างไรสำหรับการควบคุมการแสดงออกของ miRNA ที่เป็นไปได้ B) ตำแหน่งจีโนมของ miRNA ที่คัดกรองแต่ละรายการที่สัมพันธ์กับเอนแฮนเซอร์ของผู้สมัคร (แถบแนวตั้งสีส้ม) มาตราส่วนของการเปลี่ยนแปลงพับ log2 จะแสดงบนแกน y และ miRNA ที่มีนิพจน์เพิ่มขึ้นหรือลดลงจะถูกเน้นด้วยสีเขียวและสีแดงตามลำดับ

รูปที่ 7 ตัวเสริมศักยภาพสี่คู่ - คู่ miRNA เป้าหมาย TAD ถูกเน้นด้วยสีเทา จัดแนวตามจุดเริ่มต้น และวาดในมาตราส่วนเดียวกันเพื่อแสดงขนาดสัมพัทธ์ ยีนที่เป็นที่รู้จักจาก Ensembl จะแสดงเป็นสีม่วง และส่วนที่เข้มกว่าบ่งชี้ถึง exons การเข้าถึงแบบสัมพัทธ์ที่ E14.5 และ P0 จะแสดงเป็นกราฟแท่งด้านบนและด้านล่างของเส้นสีดำแนวนอน ตามลำดับ เช่นเดียวกับในแผนภาพแทรกที่แสดงการซ้อนใน DAR ที่ระบุพร้อมกับข้อมูล ChIP-seq ที่เผยแพร่โดย Guo et . อัล (Guo et al., 2021). รอยเท้าปัจจัยการถอดความที่ระบุโดย HINT แสดงอยู่ในแบนเนอร์สีส้ม กราฟแท่งในแผงแยกทางด้านขวาระบุการแสดงออกของ miRNA (สีเขียว) และเหตุการณ์การแทรก Tn5 ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในบริเวณเอนแฮนเซอร์ที่เสนอ (สีส้ม) A) ให้-7 สมาชิกในครอบครัวให้-7c-5p แสดงออกอย่างมากในเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนและจับคู่กับ "พีค_54636" ที่อยู่ห่างออกไป 119kb ในภูมิภาคอินเทอร์เจนิก B) miR-9-3p จับคู่กับ DAR ที่อยู่ห่างออกไป 249kb C) miR-181a 2-3p อยู่ห่างจาก "พีค_5887" 131kb ซึ่งเป็นตัวเพิ่มประสิทธิภาพในยีนที่เป็นไปได้

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราพยายามที่จะระบุ miRNA นวนิยายที่มีส่วนช่วยในการหยุดการเกิดไต ควบคู่ไปกับคุณสมบัติที่เป็นไปได้ของการควบคุม cis เราระบุ 114 miRNAs ที่แสดงออกต่างกันในเซลล์ต้นกำเนิดของ nephron เช่นเดียวกับ 2,103 DAR ใน E14.5 เทียบกับ P0ไต. เราสังเกตคุณสมบัติหลายอย่างที่ทำนายการเสริมสมมุติฐานใหม่สำหรับยีน Eya1 และ Pax8 ในเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน. ในที่สุด เราระบุความสอดคล้องการเข้าถึงโครมาตินและการแสดงออกของ miRNA เปลี่ยนแปลงไปสำหรับ 33 คู่ของ miRNAs และ DAR รวมถึง let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p และ miR-9-3p และยีนเป้าหมายสมมุติที่แสดงออกในบรรพบุรุษของเนฟรอนสำหรับ miRNA ที่แสดงออกอย่างต่างกัน ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นจริงกับต้นกำเนิดของ nephron และขึ้นอยู่กับระยะของการเกิดไตจะสะท้อนให้เห็นในสภาพแวดล้อมของโครมาตินของเซลล์ต้นกำเนิดและในการถอดรหัส miRNA

ในบรรดาการเปลี่ยนแปลงที่เราสังเกตเห็นในยีน miRNA ต้นกำเนิดของ nephron เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกในวงกว้างในตระกูล let{{0}} เมื่ออายุของต้นกำเนิด ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้: โปรตีน Lin28b และตระกูล miRNA ของ let-7 เป็นปฏิปักษ์ร่วมกันและก่อให้เกิดสวิตช์แบบ bistable ที่ควบคุมการแสดงออกของ let-7 ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (Zhu et al., 2011) และใน กำเนิดของ nephron การเปลี่ยนไปสู่การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นให้-7ส่งผลโดยตรงต่อระยะเวลาของการหยุดการเกิดโรคไต (Yermalovich et al., 2019) นอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ miR-125b-5p ซึ่งเป็นที่รู้จักกันว่ายับยั้งการแสดงออกของ Lin28b ในบริบทของเซลล์อื่นๆ (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017) ให้-7 family และ miR-125b-5p อยู่ในกลุ่ม 114 miRNA ที่แสดงความแตกต่างระหว่าง E14.5 และ P0 ในบรรพบุรุษของ nephron ซึ่งแนะนำบทบาทของ miRNAs ในการพัฒนาต้นกำเนิดของ nephron ไม่จำกัดให้-7/Lin28b. ตัวอย่างเช่น miRNAs ซึ่งลดการแสดงออกรวมถึงสมาชิกสองคนของตระกูล miR-200 ซึ่งได้รับรายงานว่ามีบทบาทในการสร้างความแตกต่างของ podocyte (Z. Li et al., 2016):miR-200b -3p และ miR-429-3p นอกจากนี้ เราสังเกตเห็นการลดลงของการแสดงออกของ miR-126a 5p ซึ่งทราบว่าส่งเสริมการสร้างหลอดเลือด (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008) สิ่งนี้อาจสะท้อนถึงสายเลือด mesenchymal ทั่วไปของต้นกำเนิด vasculogenic และ nephron และความมุ่งมั่นของเซตย่อยของเซลล์เหล่านี้ที่จะกลายเป็นต้นกำเนิดของ nephron

การวิเคราะห์เส้นทางของเป้าหมายยีนที่คาดการณ์ไว้ของการเปลี่ยนแปลง miRNAs โดยใช้ DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) แสดงการเสริมสมรรถนะ MAPK และการส่งสัญญาณ TGF- ทั้งตัวควบคุมหลักของต้นกำเนิด nephron (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). วิถีทาง KEGG อื่น ๆ อีกหลายอย่างก็แสดงให้เห็นมากเกินไปในเป้าหมายของยีนที่คาดการณ์ไว้ของ miRNAs ที่มีการควบคุมขึ้น ซึ่งรวมถึงเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับเมทริกซ์นอกเซลล์ โครงร่างโครงร่างของแอกติน และการยึดเกาะโฟกัส: แง่มุมที่สำคัญทั้งหมดของการย้ายเซลล์ การแยกส่วน การแตกแขนง การยึดติด โพลาไรซ์ (โรซาริโอ & เดซิโมน, 2010). ยีนที่เกี่ยวข้องกับ ECM กำหนดเป้าหมายโดย miRNA ที่แสดงออกอย่างสูงและเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่เราตรวจพบ รวมถึงการถอดเสียงที่แสดงออกสูงสุดที่เราตรวจพบ: miR-196a-5p miR-196a-5p มีเป้าหมายที่จะกำหนดเป้าหมาย Col1a1, Col1a2 และ Col3a1 ซึ่งเป็นยีนที่ได้รับการควบคุมใน Pax2-บรรพบุรุษของ nephron ที่บกพร่องซึ่งได้รับการถ่ายทอดผ่านไปยัง stroma ของไต (Naiman et อัล., 2017). ดังนั้น การแสดงออกของ miR-196a-5 ที่เพิ่มขึ้นอาจมีบทบาทในการหนุนขอบเขตเชื้อสายตามอายุบรรพบุรุษ นอกจากนี้ เรายังระบุศักยภาพใหม่ของปฏิสัมพันธ์เป้าหมายของ miRNA-mRNA ที่อาจนำไปสู่การหยุดการสร้างไต ซึ่งรวมถึงการควบคุมของตระกูล let-7 ที่อาจกำหนดเป้าหมาย Hmga2 และ Meis2 (เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนเซลล์) (Abruzzese et al ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) เมื่ออายุของ nephron progenitors Hmga2 ไม่มีบทบาทที่เป็นที่รู้จักในไตการพัฒนา. อย่างไรก็ตาม คิดว่า Meis2 มีฟังก์ชันทับซ้อนกับปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้อง Meis1 ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าจำเป็นสำหรับการพัฒนาไต (Hisa et al., 2004) เรายังสังเกตการลดลงของ miRs (miR-34b-5p, miR-983p และ miR-200a-3p) ที่อาจกำหนดเป้าหมาย Jag1 ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่ามีการควบคุมและมีความสำคัญในการสร้างความแตกต่างของไต (Chung et al., 2016).

นอกเหนือจากการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัส miRNA แล้ว เรายังวัดการเปลี่ยนแปลงในสภาพแวดล้อมโครมาตินของเซลล์ต้นกำเนิด nephron ระหว่าง E14.5 และ P0 เราอธิบายตัวเสริมนวนิยายสมมุติสองตัวสำหรับ Eya1 และ Pax8 โดยพิจารณาจาก (i) ความใกล้ชิดกับผู้ก่อการยีนเหล่านี้ (ii) การเปลี่ยนแปลงตามลำดับในการเข้าถึงโครมาตินในระหว่างการพัฒนาที่สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนเทียมระหว่างการสร้างความแตกต่าง (iii) รอยเท้าของไตปัจจัยการถอดรหัสการพัฒนา (iv) การอนุรักษ์ลำดับ (v) หลักฐานของการทำงานของเอนแฮนเซอร์ในเนื้อเยื่อ/เซลล์ประเภทอื่นๆ จาก Enhancer Atlas20 (Gao & Qian, 2020) และ (vi) ข้อมูล ChIP-seq ใน E16 .5 กำเนิดของเนฟรอนสำหรับเครื่องหมายของสารเสริมออกฤทธิ์ (H3K27ac) และปัจจัยการถอดรหัสของ Ctnnb1, Lef1, Six2 และ Tcf7 เราสังเกตเห็นการลดลงของความสามารถในการเข้าถึงโครมาตินสำหรับ Eya1 Enhancer ซึ่งสอดคล้องกับบทบาทของ Eya1 ในการส่งเสริม nephron progenitor multipotency และด้วยรายงานว่าการสูญเสีย Eya1 ส่งผลให้เกิดการเยื่อบุผิวในช่วงต้นของประชากรต้นกำเนิด (J. Xu et al., 2014; PX Xu และคณะ, 1999) Pax8 และ Pax2 ที่คล้ายคลึงกันทำให้เกิดการจำแนกเชื้อสายของบรรพบุรุษของ nephron (Bouchard et al., 2002) และบรรพบุรุษของ nephron ที่ไม่มียีนเหล่านี้อย่างน้อยหนึ่งตัวจะไม่ได้รับ MET (Narlis et al., 2007) ความสามารถในการเข้าถึงโครมาตินที่เพิ่มขึ้นที่เราตรวจพบสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ Pax8 ที่สมมุติขึ้นนั้นสอดคล้องกับการแสดงออกของ Pax8 ที่เพิ่มขึ้นในเยื่อบุผิวของไตเนื่องจาก nephrons แยกความแตกต่าง

การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า (McLean et al., 2010) ของ DARs เปิดเผยว่า "Regulation of Epithelial Differentiation" เป็นคำที่มีความหมายมากที่สุดในบรรดาขอบเขตของโครมาตินที่เปิดอยู่ ซึ่งบ่งชี้ว่า DAR ที่เราตรวจพบอาจมีคุณลักษณะด้านกฎระเบียบที่ขับเคลื่อนหรือตอบสนองต่อสัญญาณเพื่อสร้างความแตกต่างและการพัฒนาของเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนเป็นเซลล์เยื่อบุผิวชนิดต่างๆ การส่งสัญญาณด้วยรอยบากเป็นหนึ่งในคำศัพท์ GO ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะที่สำคัญที่สุดซึ่งระบุไว้ในการเปิด DAR และในต้นกำเนิดของ nephron เป็นที่ทราบกันว่าเส้นทางนี้ยับยั้งการแสดงออกของ Six2 และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิด nephron (Chung et al., 2016) ในบรรดายีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางนี้คือ Jag1 ซึ่งเป็นแกนหลักในการส่งสัญญาณของ Notch ซึ่งมีรายงานว่าการแสดงออกมีความสัมพันธ์แบบผกผันกับการแสดงออกของ Six2 และ Hes1 (Chung et al., 2016) เราทราบว่า Jag1 เป็นเป้าหมายที่มีคำอธิบายประกอบสำหรับ miRNA สามรายการที่มีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้น (miR34b-5p, miR98-3p และ miR200a-3p รูปที่ 2) สุดท้าย เราสังเกตการเพิ่มคุณค่าของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของหลอดเลือดและการสร้างรูปร่างในการเปิด DAR แม้ว่าสิ่งนี้ดูเหมือนจะเป็นผลมาจากยีนที่ใช้ร่วมกันระหว่างเส้นทางการพัฒนาเหล่านี้และการสร้างความแตกต่างของเซลล์เยื่อบุผิว ซึ่งรวมถึง Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 และ Hey2

การเปลี่ยนแปลงในการเข้าถึงโครมาตินท่ามกลางเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนมีการวัดในการศึกษาก่อนหน้านี้ (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019)

โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ โดยเน้นย้ำถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับ Notchsignaling และ Pax8- โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีความแตกต่างในการทดลองในการศึกษาก่อนหน้านี้เมื่อเปรียบเทียบกับรายงานนี้ การแยกตัวของต้นกำเนิด nephron ที่แสดงออก GFP โดยใช้เซลล์ที่กระตุ้นการเรืองแสงจากหนูตัวรายงาน TGC ทรานส์ยีน Six2- อาจทำให้สับสนได้โดยการค้นพบว่าอัลลีลนี้มีรายงานจำนวน nephron ลดลงประมาณ 45 เปอร์เซ็นต์ (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). นอกจากนี้ บรรพบุรุษของ nephron ที่เพาะเลี้ยง (เติบโตด้วย CHIR ขนาดต่ำหรือสูง) แสดงให้เห็นว่ามีทรานสคริปต์ที่แตกต่างจากต้นกำเนิดของ nephron ปฐมภูมิ ซึ่งบ่งชี้ว่าการเข้าถึงโครมาตินของพวกมันก็จะแตกต่างกันเช่นกัน (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). เนื่องจากเป้าหมายของการศึกษาของเราคือการทำความเข้าใจว่าการเปลี่ยนแปลงในภูมิทัศน์ของโครมาตินส่งผลต่อการแสดงออกของ miRNA ในช่วงต้นหรือช่วงปลายของ nephron progenitors การวิเคราะห์ของต้นกำเนิด nephron หลักจึงมีความจำเป็น

Cistanche ดีกว่าสำหรับไต

ด้วยการรวมการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้เหล่านี้ในสภาพแวดล้อมของโครมาตินกับการเปลี่ยนแปลงที่ตรงกันในการแสดงออกของ miRNA เราจึงเชื่อมโยงคู่ miRNA-enhancer สมมุติที่แปลกใหม่หลายคู่ในการหยุดการเกิดไตเพื่อการศึกษาต่อไป ตัวอย่างเช่น miRNAs miR-125a-5p และให้-7c-5p มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกระหว่าง E14.5 และ P0 และนี่คือบทสรุปโดยการเพิ่มการเข้าไม่ถึงของ DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) ใน TAD เดียวกัน DAR นี้ยังเชื่อมโยงกับไซต์ที่มีผลผูกพัน Six2 (Guo et al., 2021) และอาจแสดงถึงการเพิ่มประสิทธิภาพที่ส่งผลต่อการแสดงออกของ miR-125a-5p และ/หรือ let{{18} }c-5p ซึ่งในทางกลับกันสามารถส่งเสริมความแตกต่างผ่านการปราบปราม Lin28b ในทำนองเดียวกัน เราสังเกตการเพิ่มประสิทธิภาพที่เป็นไปได้สำหรับ miR 181a ซึ่งทราบกันดีว่าปรับการแสดงออกของเรนินในมนุษย์ (Marques et al., 2015) และได้รับการพิจารณาว่าเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคไตเพื่อลดพิษต่อไตเนื่องจากความสามารถในการกดขี่ BIRC6 และการตายของเซลล์ (Liu et อัล., 2018). สุดท้าย เราสังเกตการปิด DAR ที่เกี่ยวข้องกับ miR-9-3p ซึ่งมีรอยเท้าปัจจัยการถอดรหัสสำหรับโปรตีนที่ตอบสนองต่อสัญญาณ Wnt Snai1 และ Snai2.miR-9-3p's reverse component, miR-9-5p, เป็นที่รู้กันว่าปกป้องจากไตการเกิดพังผืด (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 และ Snai2 ได้รับการแสดงเพื่อส่งเสริมการแพร่กระจายของมะเร็งในเซลล์มะเร็งผิวหนังของหนูเมาส์ (Olmeda et al., 2008) และเพื่อส่งเสริมการเปลี่ยนเยื่อบุผิวเป็น mesenchymal (EMT) ในผู้ป่วยมะเร็ง (Sundararajan et al., 2019) ในขณะที่ miR-9 เป็นที่รู้จักในการส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดใหม่และการอพยพของเซลล์บุผนังหลอดเลือดเนื้องอก (Zhuang et al., 2012) กลไกอาจมีอยู่ซึ่งการส่งสัญญาณ Wnt ที่เพิ่มขึ้นส่งผลให้การแสดงออกของ Snai1 และ Snai2 ลดลง ซึ่งจะลดการแสดงออกของ miR-9-3p เพื่อรองรับความแตกต่างของต้นกำเนิดของ nephron

การศึกษาของเราระบุการเปลี่ยนแปลงอย่างครอบคลุมในภูมิทัศน์ของโครมาตินและการถอดรหัส miRNA ของต้นกำเนิด nephron ในระหว่างการพัฒนาของตัวอ่อน และเราได้ระบุขอบเขตของการควบคุม cis-regulatory และ miRNA ของผู้สมัครที่อาจมีบทบาทในการหยุดการเกิดไต การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าสำหรับทั้งข้อมูล mRNA-seq และ ATAC-seq ให้เบาะแสที่น่าดึงดูดเกี่ยวกับกลไกที่อาจเกี่ยวข้อง เช่น เส้นทางที่ควบคุมความแตกต่างของต้นกำเนิดของ nephron รวมถึง Notch และ TGF- นอกจากนี้เรายังรายงานองค์ประกอบการกำกับดูแลสมมุติฐานใหม่สององค์ประกอบสำหรับ Eya1 และ Pax8 ซึ่งเป็นยีนที่ทราบว่ามีความสำคัญในไตการพัฒนาและลำดับการกำกับดูแลที่เป็นไปได้สำหรับคีย์ miRNA ที่สำคัญซึ่งเกี่ยวข้องกับการหยุดการสร้างไต

วิธีการ

เมาส์สายพันธุ์

Wildtype CD-1 หญิงตั้งครรภ์ที่จับคู่เวลาได้มาจาก Charles River Laboratories, Inc. (วิลมิงตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา, RRID: MGI:5659424) และไตเก็บจากครอกในวันที่ตัวอ่อน E14.5 หรือ P0 สัตว์ทั้งหมดถูกเลี้ยงในสวนสัตว์ที่ศูนย์วิจัย Rangos ที่โรงพยาบาลเด็ก UPMC เมืองพิตต์สเบิร์ก (พิตต์สเบิร์ก รัฐเพนซิลเวเนีย สหรัฐอเมริกา) และการทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการตามนโยบายของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัย พิตต์สเบิร์ก เพศของตัวอ่อนหรือลูกสุนัขแต่ละตัวถูกระบุโดยการทำ PCR กับจีโนม DNA ที่แยกได้จากการตัดหางโดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้สำหรับยีน Y-chromosome Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ และ SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3' เป็น เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (McFarlane et al., 2013)

การหาลำดับและการวิเคราะห์ RNA ขนาดเล็ก

รวม RNA ที่แยกได้จากเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนที่เหลือหลังจากนำเศษส่วนของเซลล์ ATAC-seq ออกถูกส่งไปยัง Health Sciences Sequencing Core ที่โรงพยาบาลเด็ก UPMC แห่งพิตต์สเบิร์ก เพื่อเตรียมห้องสมุดโดยใช้ชุดเตรียมห้องสมุด QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{10}}2) การจัดลำดับแบบปลายเดียวของไลบรารี mRNA-seq ถูกดำเนินการบน Illumina NextSeq500 และไลบรารีถูกจัดลำดับที่ระดับความลึกประมาณ 50 ล้านการอ่านแบบปลายเดียวต่อไลบรารี การอ่านที่เรียงลำดับแล้วถูกจัดตำแหน่งให้สอดคล้องกับจีโนม mm10 ของเมาส์โดยใช้แพ็คเกจ Rsubread (Liao et al., 2019) (เวอร์ชัน 2.0.1) และใส่คำอธิบายประกอบให้กับ miRNA ที่รู้จักซึ่งแสดงรายการใน miRBase (เวอร์ชัน 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) ด้วยฟังก์ชัน featureCounts ของแพ็คเกจ Rsubread นิพจน์เชิงอนุพันธ์ของ miRNA ที่รู้จักถูกวัดโดยใช้แพ็คเกจ DESeq2 R (เวอร์ชัน 1.26.0) (Love et al., 2014) เศษส่วนของการอ่านแบบเรียงชิดกันที่มีหมายเหตุประกอบกับ miRNA ที่รู้จัก รวมทั้งเศษส่วนของตัวอ่อนเพศเมียต่อตัวอย่างถูกรวมเป็นปัจจัยร่วมในแบบจำลองการทดสอบที่ส่งไปยัง DESeq2 จากนั้นระบุ miRNA ที่แสดงออกอย่างแตกต่างในขณะที่ควบคุมอัตราการค้นพบที่ผิดพลาดที่ 5 เปอร์เซ็นต์ และทิศทางของการเปลี่ยนแปลง (เพิ่มขึ้นเทียบกับลดลง) ถูกกำหนดโดยพิจารณาจากค่าการเปลี่ยนแปลงส่วนพับ ("เพิ่มขึ้น" ซึ่งบ่งชี้การแสดงออกที่สูงขึ้นที่ P0 เมื่อเทียบกับ E14.5) . การเพิ่มคุณค่าของวิถีการกำกับดูแลระหว่างเป้าหมายยีนที่คาดการณ์ไว้ของ miRNA ด้วยการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นและลดน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญคำนวณโดยใช้เครื่องมือ DIANA miRPath เวอร์ชัน 3.0 (Vlachos et al., 2015) การถอดรหัสเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้สำหรับ miRNA ถูกดึงมาจากที่เก็บ TargetScan (Agarwal et al., 2015) และ miRDB (Y. Chen & Wang, 2020)

การแยกต้นกำเนิด Nephron

ไตถูกผ่าจากลูกครอกของตัวอ่อน E14.5 ของ {{0}} หรือลูก P0 และครอกแต่ละครอกถือเป็นตัวอย่างเดียว หนึ่งไตต่อตัวอย่างถูกใช้สำหรับการแยกอาร์เอ็นเอทั้งหมดเพื่อใช้เป็น "การควบคุมไตทั้งหมด" ในการวิเคราะห์ที่ตามมา (ดูด้านล่าง) รวบรวมตัวอย่างทั้งหมดสามตัวอย่างในแต่ละช่วงเวลา เซลล์เยื่อหุ้มสมองถูกแยกออกจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้การเรียงลำดับเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแม่เหล็ก (MACS) ตามที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Brown et al., 2011) โดยสังเขป ไตได้รับการย่อยบางส่วนด้วย 2mM collagenase A (Roche 11088793001) และ 3.5mM pancreatin (Sigma P1625) ในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 องศา ปฏิกิริยาการย่อยอาหารหยุดลงโดยใช้ซีรัมของตัวอ่อนวัวในครรภ์เย็น 100 เปอร์เซ็นต์ (FBS) และสารแขวนลอยของเซลล์ถูกรวบรวมและแขวนลอยใหม่ในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (DPBS) ของ Dulbecco ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอสฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ (PMSF) 1 มิลลิโมลาร์ (Sigma-Aldrich 10837091001) เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์การแยกแบบเย็นด้วยน้ำแข็งซึ่งประกอบด้วย FBS 2 เปอร์เซ็นต์ใน PBS จากนั้นบ่มด้วยเม็ดบีดแม่เหล็ก (Dynabeads FlowComp Flexi kit, ThermoFisher 11061D) ที่ไบโอตินเป็นแอนติบอดีสำหรับ Integrin alpha 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) โดยใช้ชุดฉลากโปรตีนไบโอติน DSB-X (ThermoFisher D-20655) บรรพบุรุษของ Nephron ที่ผูกติดกับลูกปัดเหล่านี้ถูกแยกออกตามที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ (Hemker et al., 2020) และรวมกลุ่มกันทั่วไตสำหรับแต่ละตัวอย่าง ส่วนย่อยของเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอน 50,000 ถูกประมวลผลทันทีผ่านการเข้าถึงโครมาตินโปรโตคอลการเตรียมห้องสมุด (ดูด้านล่าง) และ RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากสารแขวนลอยของเซลล์ที่เหลือโดยใช้ Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004)

เพื่อยืนยันการเพิ่มคุณค่าของเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนเทียบกับเซลล์ประเภทอื่น RNA ทั้งหมดแยกได้จากต้นกำเนิดของเนฟรอนและจากทั้งหมดไต(การควบคุมไตทั้งหมด ดูด้านบน) และ PCR การถอดความเชิงปริมาณ (qRT-PCR) สำหรับเครื่องหมายต่อไปนี้ได้ดำเนินการ: ตัวบ่งชี้ต้นกำเนิดของ nephron Six2 และ Cited1 (L. Huang et al., 2016) และสำหรับ Lhx1, Pdgfr , Pecan และ Caleb ที่ทำเครื่องหมายถุงน้ำในไต (Brunskill et al., 2014), stroma ของไต (S. Chen et al., 2015), endothelial (Kobayashi et al., 2008) และ ureteric bud (Cebrian et al., 2014a ) เซลล์ตามลำดับ ดูรูปเพิ่มเติมที่ 1 Gapdh (Barber et al., 2005) ถูกใช้เป็นยีนดูแลทำความสะอาดและคำนวณหาปริมาณสัมพัทธ์โดยใช้วิธี 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001) ไพรเมอร์สำหรับการถอดเสียงเหล่านี้รวมอยู่ในตารางที่ 2

ตารางที่ 2. ไพรเมอร์ RT-PCR

การเข้าถึงโครมาตินการเตรียมห้องสมุด

ประมาณ 50,000เซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนถูกใช้เพื่อสร้างแต่ละไลบรารีลำดับสำหรับ ATAC-seq โดยใช้ Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) พร้อมการปรับเปลี่ยนตามวิธีการที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Buenrostro et al., 2013) โดยสังเขป เซลล์ถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์ไลซิสแบบเย็นที่เย็นจัดซึ่งประกอบด้วย 10mM Tris, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 1mM PMSF protease inhibitor และ 0.05 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 โดยปริมาตรเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อแยกเซลล์ เมมเบรนในขณะที่ปล่อยให้เยื่อหุ้มนิวเคลียสไม่เสียหาย นิวเคลียสต้นกำเนิดของเนฟรอนที่ไม่บุบสลายถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การขนย้ายที่มีเอ็นไซม์ทรานส์โพเซสและฟักที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที จีโนม DNA อิสระที่ปล่อยออกมาโดยกระบวนการขนย้ายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ MinElute PCR Purification kit (Qiagen 2804) จากนั้นจัดทำดัชนีโดยใช้ไพรเมอร์ดัชนี forward (i7) และ reverse (i5) จาก Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011) การรวมดัชนีและการขยายชิ้นส่วนทำได้โดยใช้โปรแกรมการหมุนเวียนความร้อนด้วยการขยาย PCR ของวิธีการ

ในการกำหนดจำนวนที่เหมาะสมที่สุดของรอบการขยายที่จำเป็นสำหรับไลบรารี ATAC-seq ปฏิกิริยาข้างเคียงของ qPCR ถูกดำเนินการโดยใช้ SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) และ 96-หลุม C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) เพื่อคำนวณการทำให้เป็นมาตรฐาน ค่านักข่าว (Rn) สำหรับแต่ละรอบ หมายเลขรอบที่ปฏิกิริยาไปถึงหนึ่งในสามของการเรืองแสงสูงสุดถูกระบุว่าเป็นจำนวนรอบการขยายที่เหมาะสมที่สุดที่เหลืออยู่ และปริมาตรที่เหลือของปฏิกิริยาการย้ายตำแหน่ง ATAC-seq ที่จัดทำดัชนีจะขึ้นอยู่กับจำนวนรอบเพิ่มเติมนั้นในการขยายเสียงขั้นสุดท้าย โปรแกรม. ห้องสมุดสุดท้ายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ลูกปัดแม่เหล็ก Ampure XP (Beckman Coulter A63881)

การเข้าถึงโครมาตินลำดับ

การจัดลำดับแบบปลายคู่ของไลบรารี ATAC-seq ดำเนินการบน Illumina NextSeq500 โดย Health Sciences Sequencing Core ที่ UPMC Children's Hospital of Pittsburgh ซึ่งทวีคูณด้วยความเข้มข้นของไลบรารีที่คาดว่าจะให้ผลการอ่านแบบคู่ขนาน 90 ล้านครั้งต่อตัวอย่าง . การอ่านถูกตัดแต่งคุณภาพโดยใช้ TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (เวอร์ชัน 0.4.3) ในโหมด "--จับคู่" และด้วยการตั้งค่าเริ่มต้นอื่นๆ การอ่านสอดคล้องกับจีโนม mm10 (Church et al., 2011) โดยใช้ Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (เวอร์ชัน 2.3.1) ด้วยการตั้งค่า "--local -q -X 2000 -- ม". การอ่านที่เกิดจาก PCR ที่ซ้ำกันของชิ้นส่วน DNA เดียวกันถูกทำเครื่องหมายโดยใช้ฟังก์ชัน MarkDuplicates ของ Picard Tools (เวอร์ชัน 2.10.9) พร้อมการตั้งค่าเริ่มต้น การอ่านที่จับคู่อย่างคลุมเครือไปยังตำแหน่งมากกว่าหนึ่งแห่งในจีโนมได้รับการสุ่มให้เป็นหนึ่งในตำแหน่งเหล่านี้ หากมีความเป็นไปได้น้อยกว่าสี่อย่าง และถูกกำจัดออกไป (ENCODE, nd) (โดยใช้สคริปต์ Python ที่มีให้ที่ https://github com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) ด้วยการตั้งค่า "--paired-end -k") Samtools (H. Li et al., 2009) (เวอร์ชัน 1.3.1) ใช้สำหรับกรองการอ่านซ้ำ ไม่ได้แมป กำพร้า และไมโตคอนเดรีย รวมถึงการจัดเรียงและจัดทำดัชนีไฟล์ BAM การควบคุมคุณภาพของข้อมูล ATAC-seq เป็นไปตามแนวทาง ATAC-seq ของโปรเจ็กต์ ENCODE (ENCODE, nd) และไลบรารีตัวอย่างถูกสุ่มสุ่มตัวอย่างให้แต่ละไฟล์มีการอ่านแบบคู่ขนาน 31 ล้านครั้ง เพื่อปรับความแตกต่างของขนาดไลบรารีให้เป็นมาตรฐาน

Cistanche ป้องกันการติดเชื้อที่ไต

การระบุบริเวณโครมาตินที่เข้าถึงได้

ไฟล์ BAM ที่มีการอ่าน ATAC-seq ที่กรองแล้วถูกแปลงเป็นรูปแบบ BED แบบคู่โดยใช้ Bedtools '(Quinlan & Hall, 201{{20}}) (เวอร์ชัน 2.26.0) 'bombed ' ฟังก์ชั่นพร้อมการตั้งค่า "- bed pe -mate1" ระบุขอบเขตของโครมาตินที่เข้าถึงได้โดยใช้เครื่องมือวิเคราะห์ตามแบบจำลองของเครื่องมือ ChIP-seq (MACS2 เวอร์ชัน 2.1.1.20160309) อัลกอริธึมการโทรแบบกว้าง (Zhang et al., 2008) พร้อมการตั้งค่า "--รูปแบบ BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --broad --shift 37 --ขนาดข้อความ 75 --Keep-dup all --model". เพื่อระบุภูมิภาคที่เข้าถึงได้ที่มีความมั่นใจสูง การเปรียบเทียบแบบคู่ (ของการทำซ้ำแต่ละชุดจากจุดเวลาที่กำหนด) ถูกดำเนินการและอัตราการค้นพบที่ไม่สามารถทำซ้ำได้ (IDR) (Q. Li et al., 2011) ถูกคำนวณโดยใช้ข้อมูลที่เปิดเผยต่อสาธารณะ การใช้งาน Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) พร้อมการตั้งค่า "--input-file-type wide peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในแต่ละช่วงเวลา ไฟล์ BED ที่ต่อกันของภูมิภาคที่เข้าถึงได้ทั้งหมดถูกส่งผ่านอาร์กิวเมนต์ "--peak-list" สำหรับการเปรียบเทียบแต่ละรายการ (เช่น เมื่อเปรียบเทียบตัวอย่าง E14.5 สองตัวอย่าง พีคกว้าง E14.5 ทั้งหมด ใช้ระหว่างทั้งสามซ้ำ) ภูมิภาคของการเข้าถึงได้ซึ่งสอดคล้องกันโดย IDR ในการเปรียบเทียบการจำลองแบบคู่อย่างน้อยสองรายการ (ที่มีการทับซ้อนกันอย่างน้อย 20 เปอร์เซ็นต์) ถูกรวมเป็นชุดของภูมิภาคที่เข้าถึงได้ที่มีความมั่นใจสูงแบบรวมเป็นหนึ่ง ("ภูมิภาค IDR")

การเปลี่ยนแปลงในภูมิภาคโครมาตินที่เข้าถึงได้

การเข้าถึงได้ของบริเวณ IDR แต่ละส่วนภายในตัวอย่างที่กำหนดถูกหาปริมาณโดยการนับจำนวนเหตุการณ์การเคลื่อนย้ายที่เกิดขึ้นขณะทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับลำดับเนื้อหา GC ทั่วทั้งตัวอย่าง ซึ่งทำได้โดยใช้สคริปต์ที่กำหนดเอง (มีให้ที่คลังซอฟต์แวร์ที่แนบมา โปรดดูข้อมูลเพิ่มเติม) การเปลี่ยนแปลงในการช่วยสำหรับการเข้าถึงนี้ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบค่าเหล่านี้ในช่วงเวลาต่างๆ โดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ Limma-voom (เวอร์ชัน 3.42.2) (Ritchie et al., 2006) ในการอธิบายเพศของตัวอ่อน เศษส่วนของตัวอ่อนเพศเมียในแต่ละตัวอย่างถูกรวมเป็นปัจจัยร่วมในแบบจำลองเชิงเส้นที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์การช่วยการเข้าถึงแบบแยกส่วน และจะถูกลบออกเป็นเอฟเฟกต์แบบกลุ่มในการแสดงภาพโดยใช้ฟังก์ชันการลบแบบกลุ่มของแพ็คเกจ Limma บริเวณที่เข้าถึงได้ต่างกันของโครมาติน (DAR) ถือว่าเปิดได้อย่างมีนัยสำคัญ (ความสามารถในการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นระหว่าง E14.5 และ P0) หรือการปิด (การเข้าถึงได้ลดลงระหว่าง E14.5 และ P0) เมื่อควบคุมอัตราการค้นพบที่ผิดพลาดที่ 10 เปอร์เซ็นต์ . การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะการทำงานของพื้นที่เปิดและปิดของจีโนมถูกกำหนดโดยการส่งพิกัดตามลำดับไปยังเครื่องมือเสริมคำอธิบายประกอบของภูมิภาคจีโนม (GREAT มีให้ที่ http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). คำอธิบายประกอบของตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่รู้จักและคาดการณ์ได้มาจากที่เก็บ FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) และ EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020)

รอยเท้าปัจจัยการถอดความ

รอยเท้าปัจจัยการถอดความถูกระบุโดยการรวมไฟล์ BAM ทั้งหมดจากจุดเวลาเดียวกัน จากนั้นเรียกใช้ซอฟต์แวร์การระบุรอยเท้า TF ตามข้อกำหนดของ Genomics (HINT) ของ Regulatory Genomics (เวอร์ชัน 0.12.3) โดยเฉพาะรูปแบบรอยเท้าสำหรับ ATAC -seq data (มีอยู่ที่ www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018) ซอฟต์แวร์นี้ทำงานด้วยการตั้งค่า "right-hint footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end" จากนั้นรอยเท้าถูกใส่คำอธิบายประกอบด้วยลวดลายการผูกเมาส์ที่รู้จักจากฐานข้อมูล HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) โดยใช้ฟังก์ชันการจับคู่แม่ลายของ HINT พร้อมการตั้งค่า "การวิเคราะห์แม่ลายที่ตรงกัน --สิ่งมีชีวิต=mm10" ไม่รวมรอยเท้าที่มีคะแนน HINT ต่ำกว่า 10 สุดท้ายนี้ รูปแบบกิจกรรมเชิงอนุพันธ์ระหว่างรอยเท้าที่จับคู่แม่ลายถูกวัดโดยใช้ฟังก์ชันดิฟเฟอเรนเชียลของโปรแกรม RGT-HINT ด้วยการตั้งค่า "right-hint differential --organism=mm10 --bc {{27} }NC 12 --โปรไฟล์เอาต์พุต" ระดับกิจกรรมที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญถูกระบุโดยอิงตามการตัดค่า p ที่ 0.05 (วิธีฟรีดแมน-เนเมนี)

Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต

การกำหนดค่านิวคลีโอโซม

การอ่านที่ตรงกันจากจุดเวลาเดียวกันถูกรวมเป็นไฟล์ BAM ไฟล์เดียว และแพ็คเกจ NucleoATAC (เวอร์ชัน 0.3.4) ถูกใช้เพื่อระบุรูปแบบในความยาวการอ่านที่บ่งบอกถึงทั้งสีย้อมของนิวคลีโอโซมที่ถูกผูกไว้และของบริเวณที่ปราศจากนิวคลีโอโซม ( NFRs) (Scep et al., 2015). ซอฟต์แวร์นี้ดำเนินการโดยใช้การตั้งค่าเริ่มต้น นิวคลีโอโซมได้รับการทำหมายเหตุประกอบไว้เนื่องจากบริเวณ 146bp มีศูนย์กลางอยู่รอบ ๆ แต่ละส่วนที่เรียกว่านิวคลีโอโซม dyad

การแสดงออก RNA เซลล์เดียว

ข้อมูลการแสดงออกของยีนเซลล์เดียวได้รับการประมวลผลสำหรับต้นฉบับก่อนหน้า (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) และดึงมาจาก Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). ข้อมูลที่ประมวลผลซึ่งรวมอยู่ในรูปที่ 7 รวมถึงประเภทเซลล์ ระดับการแสดงออกของยีน การฝังแบบมิติต่ำ (tSNE) และหมายเหตุประกอบเวลาเทียมที่สัมพันธ์กับวิถีโคจรที่สร้างขึ้นระหว่างกลุ่มของการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของต้นกำเนิดของเนฟรอน เข้าถึงและจัดระเบียบข้อมูลโดยใช้แพ็คเกจ SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019)

ปฏิสัมพันธ์ของ miRNA-mRNA ในการแก่และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิด nephron

ยีนที่มีการแสดงออกที่เปลี่ยนไประหว่างการต่ออายุตัวเอง การลงสีพื้น และการสร้างความแตกต่างเซลล์ต้นกำเนิดเนฟรอนได้มาจากตารางเสริม 3 และ 4 ที่เผยแพร่โดย Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

การจัดลำดับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันของโครมาตินในต้นกำเนิดของเนฟรอนปฐมภูมิ

ข้อมูล Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) สำหรับการจับ -catenin, Lef1, Six2 และ Tcf7 ในต้นกำเนิดของ nephron หลักถูกดึงมาจากไฟล์ BedGraph ภายในที่เก็บ GEO (GSE131119) สำหรับ Guo et al., 2021 ค่าสัญญาณการตกแต่งแบบพับมีค่าเฉลี่ย ข้ามตัวอย่างที่ทำซ้ำ

การคัดกรององค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่มีผลต่อการแสดงออกของ miRNA

ในการตรวจหาสารเสริมศักยภาพของ miRNA เราได้ใส่หมายเหตุประกอบ miRNA และ DAR ด้วยโดเมนที่เกี่ยวข้องกับทอพอโลยี (TAD) ซึ่งอยู่บนพื้นฐานของหมายเหตุประกอบ mm10 จากเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนของเมาส์ ดาวน์โหลดจาก 3D Genome Browser (มีอยู่ที่ http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). ภูมิภาคของการเข้าถึงโครมาตินและ miRNA ได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวเสริมของผู้สมัคร - คู่ miRNA หากพวกเขาครอบครอง TAD เดียวกันและแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันในการเข้าถึงและการแสดงออก (ความสามารถในการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นด้วยการแสดงออกของ miRNA ที่เพิ่มขึ้นและในทางกลับกัน) DAR ถูกพิจารณาว่าเป็น "คุณลักษณะด้านกฎระเบียบ" ที่เป็นไปได้เท่านั้น หากไม่ทับซ้อนกับโปรโมเตอร์ที่รู้จักหรือจุดสิ้นสุดของ exon คู่ที่เป็นไปได้ของ miRNA และองค์ประกอบควบคุมสมมุติฐานได้รับการจัดลำดับความสำคัญหากพวกเขา 1) อยู่ใน TAD เดียวกันและ 2) พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญระหว่าง E14.5 และ P0 (การแสดงออกของ miRNA ที่เพิ่มขึ้นและการเข้าถึงภูมิภาค IDR ที่เพิ่มขึ้น และในทางกลับกัน) .

รับทราบ

Shelby Hemker และ Abha Bais มีส่วนร่วมในการออกแบบการทดลอง การจัดลำดับสำหรับ ATAC-seq และ mRNA-seq ดำเนินการโดย Health Sciences Sequencing Core ที่ UPMC Children's Hospital of Pittsburgh

การแข่งขันความสนใจ

ไม่มีการประกาศผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

เงินทุน

AC ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันโรคเบาหวานและการย่อยอาหารแห่งชาติและไตโรคภายใต้สถาบันสุขภาพแห่งชาติ (T32DK061296-17) DK ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันวิทยาศาสตร์การแพทย์ทั่วไปแห่งชาติภายใต้สถาบันสุขภาพแห่งชาติ (R01GM115836) JH ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันแห่งชาติของโรคเบาหวานและทางเดินอาหารและโรคไตภายใต้สถาบันสุขภาพแห่งชาติ (R01DK103776 และ 125015) DMC ได้รับการสนับสนุนจาก Nephrotic Syndrome Study Network (NEPTUNE) Career Development Award และ Children's Hospital of Pittsburgh Research Advisory Council Postdoctoral Fellowship YP ได้รับการสนับสนุนจากทุนจาก UPMC Children's Hospital of Pittsburgh และ North American Mitochondrial Disease Consortium

ความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ตัวเสริมเมาส์ที่คาดการณ์ไว้ถูกดึงมาจาก FANTOM5 (DOI: 10.1038 / nature12787 ไฟล์มีให้ที่นี่), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; ไฟล์มีให้ที่นี่) และ EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980; ไฟล์เมาส์มีให้ที่นี่) ฐานข้อมูล จีโนม mm10 ของเมาส์และคำอธิบายประกอบถูกดาวน์โหลดผ่านโปรเจ็กต์ Illumina genomes (มีให้ที่นี่) ไฟล์ over-chain สำหรับยกพิกัด mm9 เป็น mm10 ถูกดึงมาจากเบราว์เซอร์จีโนม UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; ไฟล์มีให้ที่นี่) บันทึกย่อ TAD จากเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนของเมาส์ถูกดึงมาจาก 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; ไฟล์มีให้ที่นี่) เป้าหมายการถอดรหัส miRNA ที่คาดการณ์ไว้ถูกดึงมาจาก TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005 มีไฟล์อยู่ที่นี่) และจาก miRDB เวอร์ชัน 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757 มีไฟล์อยู่ที่นี่) ข้อมูล ATAC-seq รวมถึงตำแหน่ง IDR/DAR คำอธิบายประกอบ และผลการตกแต่งเชิงอนุพันธ์มีอยู่ใน GEO (GSE168339) เช่นเดียวกับข้อมูล mRNA-seq ซึ่งรวมถึงหมายเหตุประกอบและผลการแสดงออกเชิงอนุพันธ์ (GSE168342) รหัสคอมพิวเตอร์ที่ใช้ในการประมวลผลและวิเคราะห์ข้อมูล และเพื่อสร้างตัวเลขสามารถดูได้ที่ https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

บรรณานุกรม

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M . (2019). ปัจจัยการถอดรหัส homeobox MEIS2 เป็นตัวควบคุมการอยู่รอดของเซลล์มะเร็งและกิจกรรม IMiDs ใน Multiple Myeloma: การปรับโดย Bromodomain และสารยับยั้งโปรตีน Extra-Terminal (BET) การตายของเซลล์และโรค, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015) การทำนายไซต์เป้าหมาย microRNA ที่มีประสิทธิภาพใน mRNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม อีไลฟ์. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, ก. (2014). แผนที่ของเอนแฮนเซอร์ที่ออกฤทธิ์ทั่วทั้งเซลล์และเนื้อเยื่อของมนุษย์ ธรรมชาติ, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

บาบราฮัมแล็บ (2014). ทริมมากมาย. ในชีวสารสนเทศศาสตร์ http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_มากมาย

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. และ Kostka, D. (2020) การจัดลำดับ RNA เซลล์เดียวเผยให้เห็นกิจกรรมของวัฏจักรเซลล์ที่แตกต่างกันในประชากรเซลล์ที่สำคัญในระหว่างการสร้างไต BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

ช่างตัดผม, RD, Harmer, DW, Coleman, RA, & Clark, BJ (2005) GAPDH เป็นยีนการดูแลทำความสะอาด: การวิเคราะห์การแสดงออกของ GAPDH mRNA ในแผงเนื้อเยื่อของมนุษย์ 72 ชิ้น จีโนมสรีรวิทยา. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

บาร์เทล, DP (2009). MicroRNA Target Recognition และฟังก์ชั่นการควบคุม เซลล์, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011) จำนวน nephron ของมนุษย์: นัยต่อสุขภาพและโรค โรคไตในเด็ก, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015) อัตราการค้นพบที่ไม่สามารถทำซ้ำได้ (2.0.3) https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M. , Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). ข้อมูลจำเพาะเกี่ยวกับเชื้อสาย Nephric โดย Pax2 และ Pax8 ยีนและการพัฒนา. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

จาก: Journal Pre-proof

2021 เผยแพร่โดย Elsevier Inc.