เชิงนามธรรม

การแนะนำ: พรอพอลิสเป็นสารธรรมชาติที่เป็นยางที่ผึ้งเก็บมาจากดอกตูมและน้ำย่อยของต้นไม้และพืชต่างๆ เป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่าองค์ประกอบของโพลิสขึ้นอยู่กับลักษณะทางพฤกษศาสตร์ของแหล่งรวบรวม

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และสามารถกำจัดสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา ป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่อาหารเสริม Cistanche Tubulosa

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

วัตถุประสงค์: การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบองค์ประกอบทางพฤกษเคมีของสารสกัดเอทานอลจากโพลิส 8 ชุดที่เก็บรวบรวมในภูมิภาคต่างๆ ของเบนิน (เหนือ กลาง และใต้) และคองโก แอฟริกา

วัสดุและวิธีการ:การแสดงลักษณะของตัวอย่างโพลิสดำเนินการโดยใช้วิธีการทางโครมาโตกราฟีแบบยัติภังค์ที่ต่างกัน รวมกับคาร์บอน-13 นิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ (13C NMR) จำลองแบบด้วยซอฟต์แวร์ MixONat จากนั้นจึงประเมินกิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระหรือผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายไกลเคชั่นต้านขั้นสูง (ต่อต้านวัย) โดยใช้การตรวจวิเคราะห์ด้วย

ผลลัพธ์: การวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟีร่วมกับการจำลองแบบ 13C NMR แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างสองตัวอย่างจากศูนย์กลางของประเทศเบนินแสดง นอกเหนือจากปริมาณของเพนตะไซคลิก ไตรเทอร์พีน เมทอกซิเลต สติลเบนอยด์ หรือฟีแนนทรีน ซึ่งมีหน้าที่ในการต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดสำหรับตัวอย่างแรก ในหมู่พวกเขา combretastatin อาจเป็นพิษต่อเซลล์ สำหรับตัวที่สอง ฟลาวาโนน prenylated ที่รู้จักในโพรโพลิสชนิด Macaranga มีหน้าที่ในการต่อต้านวัยที่มีนัยสำคัญ ตัวอย่างจากประเทศคองโกประกอบด้วยอนุพันธ์ของไตรเทอร์พีนหลายชนิดที่เป็นของสายพันธุ์ Mangifera indica

บทสรุป: ดังนั้น พรอพอลิสจากใจกลางเบนินจึงดูน่าสนใจเป็นพิเศษ เนื่องจากมีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านวัย อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการกำหนดมาตรฐานของพรอพอลิสเป็นเรื่องยากในเขตร้อนเนื่องจากมีความหลากหลายทางคีโมอย่างมาก จึงจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์ทางพฤกษเคมีอย่างเป็นระบบก่อนที่จะส่งเสริมการใช้พรอพอลิสในอาหารและผลิตภัณฑ์เพื่อสุขภาพในแอฟริกา

คำสำคัญ

13C NMR dereplication, methoxylated stilbenoids หรือ phenanthrenes, pentacyclic triterpenes, prenylated flavanones, พรอพอลิส

1. บทนำ

พรอพอลิสเป็นสารยางธรรมชาติที่ผึ้งเก็บรวบรวมจากตาและสารคัดหลั่งของต้นไม้และพืชต่างๆ ผสมกับขี้ผึ้งและเอนไซม์น้ำลาย1 ผึ้งใช้เพื่อป้องกันทางเข้าจากผู้บุกรุก อุดรู ผนังภายในเรียบ ทำมัมมี่สัตว์ที่ตายแล้ว (แมลงตัวเล็กๆ) ภายในรัง และรักษาสมดุลของความชื้นหรือสภาวะแห้งแล้ง2,3 โพรโพลิสถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในการแพทย์พื้นบ้านตั้งแต่สมัยโบราณ เนื่องจากมีคุณสมบัติในการรักษาที่หลากหลาย4 โพรโพลิสโดยทั่วไปประกอบด้วยเรซิน (ร้อยละ 50) ขี้ผึ้ง (ร้อยละ 30) น้ำมัน (ร้อยละ 10) เกสรดอกไม้ (ร้อยละ 5) และสารประกอบฟีนอลอื่นๆ เช่น ฟลาโวนอยด์5,6 องค์ประกอบทางเคมีของโพลิสนั้นซับซ้อนและแตกต่างกันไปตามชนิดของพืชที่ขึ้นรอบๆ รังผึ้ง ซึ่งผึ้งเก็บสารคัดหลั่ง7 เป็นที่ยอมรับว่ามีหลายปัจจัย เช่น องค์ประกอบของดอกไม้ในพื้นที่ สถานที่และเวลาเก็บ ฤดูกาล ประเภทของที่เก็บ ความพร้อมและความสูง และกิจกรรมอาหารที่พัฒนาขึ้นในช่วง การใช้ประโยชน์จากพรอพอลิสมีผลกระทบต่อองค์ประกอบทางเคมีของพรอพอลิส8,9 พรอพอลิสมีหลายประเภทขึ้นอยู่กับพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ของการผลิต แหล่งพฤกษศาสตร์ และองค์ประกอบทางเคมี พรอพอลิสชนิดที่พบได้บ่อย ได้แก่ เขตอบอุ่น ต้นเบิร์ช เขตร้อน เมดิเตอเรเนียน และแปซิฟิก10 พรอพอลิสจากเขตภูมิอากาศอบอุ่น เช่น ยุโรป อเมริกาเหนือ หรือภูมิภาคที่ไม่ใช่เขตร้อนของเอเชีย ส่วนใหญ่มาจากการหลั่งของดอกตูมของสายพันธุ์ Populus ( Salicaceae) จึงอุดมไปด้วยฟลาโวนอยด์และกรดฟีนอลและเอสเทอร์ของพวกมัน อย่างไรก็ตาม พรอพอลิสเขตร้อนซึ่งมีต้นกำเนิดจากภูมิภาคที่ทั้งป็อปลาร์และต้นเบิร์ชไม่เติบโตนั้นอุดมไปด้วยอนุพันธ์ของกรด p-coumaric, benzophenones หรือ terpenoids11 พรอพอลิสแปซิฟิกซึ่งโดยทั่วไปอุดมไปด้วยฟลาวาโนนพรีไนเลต เป็นพรอพอลิสที่สำคัญอีกชนิดหนึ่งที่พบในไต้หวัน ญี่ปุ่น และหมู่เกาะโซโลมอน และพบพรอพอลิสต้นเบิร์ชโดยเฉพาะในรัสเซีย12 การศึกษาพรอพอลิสจากเอเชียเขตร้อนนำไปสู่การค้นพบ Macaranga denarius L. และ Mangifera indica L. ซึ่งเป็นแหล่งพืชพรอพอลิสของอินโดนีเซีย13 ในทางกลับกัน ต้นสนในวงศ์ Cupressaceae เป็นแหล่งพฤกษศาสตร์หลักของโพลิสในภูมิภาคเมดิเตอร์เรเนียน14 การวิเคราะห์ทางเคมีพบว่าโพลิสมีผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ (NPs) มากกว่า 300 ชนิด รวมถึงอนุพันธ์ของกรดฟีนอล คูมาริน ฟลาโวนอยด์ sesquiterpenes ไดเทอร์พีน triterpenes, steroids, lignans หรือ benzophenones ที่ prenylated15 ผลกระทบทางชีวภาพของโพลิสได้รับการอธิบายโดยส่วนใหญ่เกี่ยวกับสารต้านอนุมูลอิสระเท่านั้น16–18 ต่อต้าน AGE (เช่นการยับยั้งการก่อตัวของ glycation end-product [AGE] ขั้นสูง),19 ต่อต้าน - การอักเสบ,20 และฤทธิ์ต้านเนื้องอก,21–23 แต่ยังต้านแบคทีเรีย,24–26 ต้านเชื้อรา,15 ต้านไวรัส,27 และต้านปรสิต28 โพรโพลิสยังเป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นการผลิตแอนติบอดี โดยแนะนำให้ใช้เป็นสารเสริมในวัคซีน 29 การใช้สารธรรมชาติที่มีองค์ประกอบที่หลากหลายนี้เพิ่มมากขึ้น และกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลายในอุตสาหกรรมยา เครื่องสำอาง และอาหารกำลังสร้างความสนใจเป็นพิเศษ ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อพูดถึงการกำหนดองค์ประกอบทางเคมี การศึกษาส่วนใหญ่ดำเนินการกับตัวอย่างจากยุโรป19,30–33 และละตินอเมริกา โดยเฉพาะอย่างยิ่งบราซิล20,23,34–36 ในขณะที่การศึกษาเพียงเล็กน้อยดำเนินการในแอฟริกา37–41 ข้อมูลเกี่ยวกับโพลิสของเบนินีและคองโก42 ยังหายาก

ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาลักษณะเฉพาะของสารประกอบหลักจากตัวอย่างโพลิสที่เก็บรวบรวมในเขตพฤกษภูมิศาสตร์ต่างๆ ของเบนินและคองโก (แอฟริกา) โดยใช้การทำซ้ำด้วยคลื่นสนามแม่เหล็กนิวเคลียร์ 13C (NMR) กับซอฟต์แวร์ MixONat43,44 การศึกษาเบื้องต้นโดยใช้ฐานข้อมูล (DB) ที่มี NPs ที่รายงานก่อนหน้านี้จากโพลิสพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมี (δC) ที่ทำนายไว้ 13C ของพวกเขาไม่ได้ให้ข้อมูลใด ๆ ที่ใช้งานได้เมื่อเทียบกับผลลัพธ์ที่น่าพอใจซึ่งมักจะได้รับจากสารสกัดจากพืช 43–45 สิ่งนี้สามารถอธิบายได้ด้วยองค์ประกอบทางเคมีของโพลิสซึ่งขึ้นอยู่กับอย่างมาก บนพืชในท้องถิ่น ทำให้ไม่สามารถสร้าง chemotaxonomic DB ได้ ดังนั้น เพื่อถอดรหัสสารประกอบหลักจากโพรโพลิสของเบนินีสและคองโก ในงานปัจจุบัน เราได้ทำโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงควบคู่กับแมสสเปกโตรเมทรีตรวจจับการกระเจิงของแสงอัลตราไวโอเลตและการระเหย (HPLC-UV-ELSD-MS) และแก๊สโครมาโตกราฟีควบคู่กับแมสสเปกโตรเมทรี ( GC-MS) วิเคราะห์สารสกัดโพลิสหยาบเพื่อระบุลักษณะโครงสร้างหลักและสร้าง DBs ที่สอดคล้องกันของ NPs ซึ่งเหมาะสำหรับซอฟต์แวร์ MixONat46 จากนั้น หลังจากการคัดแยกตัวอย่างโพลิสอย่างหยาบที่เลือกตามโปรไฟล์ทางเคมีของพวกมัน อนุญาตให้มีการทำซ้ำตาม 13C NMR การระบุ NP ที่สำคัญโดยไม่ต้องทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติม ได้ทำการตรวจสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านวัยด้วย

2. ขั้นตอนการทดลอง

2.1 สารเคมี

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin–Ciocalteu reagent, formic acid, and gallic acid, all analytical grade ซื้อจาก Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, ฝรั่งเศส) 6-ไฮดรอกซี-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox®) และ 50 - caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) ได้รับจาก Acros Organics (Geel ประเทศเบลเยียม)

2.2 ตัวอย่างโพลิส

ตัวอย่างโพลิส Beninese แปดตัวอย่างถูกเก็บโดยการขูดจากรังผึ้งในเขตพฤกษศาสตร์สามโซน (ตารางที่ 1 และรูปที่ SI-1) ตัวอย่างของพรอพอลิสคองโกถูกเก็บในป่าประดิษฐ์ของต้นอะคาเซียในที่ราบสูง Bateke ใจกลางสาธารณรัฐคองโก (ตารางที่ 1)

2.3 การสกัดโพลิส

สารสกัดเอทานอลของโพลิส (EEPs) ถูกเตรียมในขั้นต้นโดยใช้โปรโตคอลการสกัดต่อไปนี้ 19 โพรโพลิสดิบถูกบดให้เป็นเนื้อเดียวกันในครั้งแรกที่มีไนโตรเจนเหลว สำหรับตัวอย่างทั้งหมด ผงโพลิส 1 กรัมถูกบดใน 20 มล. ของ EtOH 95 เปอร์เซ็นต์ หลังจากกวนเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ของผสมถูกกรองโดยใช้ตัวกรองช่องทางแบบจานแก้วซินเตอร์ (ขนาดรูพรุน 16–40 ไมโครเมตร) สิ่งตกค้างถูกสกัดซ้ำสองครั้งโดยใช้ขั้นตอนเดียวกัน จากนั้น ตัวกรองที่รวบรวมทั้งสามถูกคงไว้ที่อุณหภูมิ 18 องศาเซลเซียสข้ามคืน กรองเพื่อขจัดแว็กซ์ และระเหยภายใต้ความดันลดลง (40 องศาเซลเซียส, 10 บาร์) เพื่อให้ EEPs

ปริมาณ 8.0 กรัมของผงโพลิสของ BC1 (1) และ BC2 (2) หรือ 10.3 กรัมของ CG (3) ถูกสกัดอีกครั้งด้วย EtOH 95 เปอร์เซ็นต์ (UAE, 4 80 มล., 15 นาที) เพื่อเพิ่มเติม แฟลชโครมาโตกราฟี

2.4 การหาปริมาณฟีนอลทั้งหมด

ปริมาณฟีนอลทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิธี Folin– Ciocalteu colorimetric ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้19 และเพิ่งปรับให้เข้ากับการใช้งานโดยตรงในไมโครเพลท โดยสังเขป 10 ul ของสารสกัดโพลิสแต่ละชนิดใน MeOH (3.5 มก./มล. สำหรับ BC1, 5 มก./มล. สำหรับ BN2, BC2 และ CG, 7.5 มก./มล. สำหรับ BN1, BS1a, BS1b และ BS2 และ 10 มก./มล. สำหรับ BS3) ผสมกับน้ำกลั่น 20 ul และ 10 ul ของสารทำปฏิกิริยา Folin–Ciocalteu ใน 96-แผ่นไมโครเพลท หลังจากผ่านไป 3 นาที น้ำกลั่น 120 ul และโซเดียมคาร์บอเนตในน้ำ 20 เปอร์เซ็นต์ 40 ul ถูกเติม วัดค่าการดูดกลืนแสงบนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครเพลท TECAN® (V6.5) ที่ 760 นาโนเมตรหลังจากผ่านไป 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง ช่องว่างถูกเตรียมด้วยวิธีเดียวกันโดยใช้ MeOH แทนสารละลายสกัด และใช้กรดแกลลิกในการคำนวณเส้นโค้งการสอบเทียบ (0.04–0.328 มก./มล.; y=2.7241x 0.0039; r2=0 .9982). แต่ละตัวอย่างได้รับการวิเคราะห์เป็นสามเท่า ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดแสดงในรูปของกรดแกลลิกเทียบเท่า (มก.) ต่อกรัมของสารสกัด (มก. GAE/ก.)

2.5 การวิเคราะห์ทางโครมาโตกราฟีเบื้องต้น

2.5.1 การวิเคราะห์ TLC

ทำการวิเคราะห์โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) บน TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, เยอรมนี) โดยใช้ส่วนผสมของไซโคลเฮกเซน: AcOEt เป็นตัวชะ มองเห็นจุดในโครมาโตแกรมก่อนภายใต้แสงยูวี (254 นาโนเมตร) จากนั้นจึงฉีดพ่นด้วยวานิลลิน–สารทำปฏิกิริยากรดซัลฟิวริก (กรดซัลฟิวริกเข้มข้น 2 มล. ใน 98 มล. ของสารละลายวานิลลิน 1:99 w/v:เอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์) และ ให้ความร้อนแก่โครมาโตกราฟีที่อุณหภูมิ 110 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที

2.5.2 ขั้นตอน GC-MS

การวิเคราะห์ GC-MS ดำเนินการกับตัวอย่างที่ไม่ได้ดัดแปลงโดยใช้ Shimadzu Gas Chromatograph GCMS-QP2010 SE (Noisiel, ฝรั่งเศส) ที่มีแรงดันไอออไนเซชัน 70 eV (อิเล็กทรอนิกส์ ผลกระทบ). ตัวอย่างถูกเตรียมในไดคลอโรมีเทน (DCM) ที่ 2 มก./มล. สำหรับสารสกัด และ 1 มก./มล. สำหรับเศษส่วน การแยกดำเนินการโดยใช้คอลัมน์ Phenomenex ZB5 (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 30 ม. * 0.250 มม. ความหนาของฟิล์ม 0.25 มม. Phenomenex, Le Pecq, ฝรั่งเศส) อุณหภูมิถูกตั้งโปรแกรมไว้ดังนี้: 180 องศาเซลเซียส (3 นาที), 180–280 องศาเซลเซียส ที่อัตรา 10 องศาเซลเซียส/นาที และ 280 องศาเซลเซียส (27 นาที) ฮีเลียมถูกใช้เป็นก๊าซพาหะที่อัตราการไหล 2.0 มล./นาที อุณหภูมิหัวฉีดและตัวตรวจจับตั้งไว้ที่ 250 องศาเซลเซียส และ 280 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เมตาโบไลต์ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบเวลากักเก็บ (Rt) มวลเล็กน้อย และ/หรือรูปแบบการแยกส่วนกับตัวอย่างจริงและ/หรือที่มีอยู่ในไลบรารีรูปแบบการกระจายตัวของอุปกรณ์ (NIST11, NIST11s และ FFNSC2)

2.5.3 ขั้นตอน HPLC-DAD-ELSD

การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีดำเนินการโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลว 3 มิติ Shimadzu 2030C (Noisiel, ฝรั่งเศส) ที่ติดตั้งไดโอดอาร์เรย์เครื่องตรวจจับ (DAD) และ ELSD (Sedere®) ที่มีคอลัมน์ Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 มม. * 4 มม. id, 5 μm, เมอร์ค, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี ) ป้องกันด้วยตลับป้องกัน Lichrocart® 4–4 (4 มม.*4 มม.) โดยใช้อัตราการไหล 1 มล./นาที เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำ (ตัวทำละลาย A) และเมทานอล (ตัวทำละลาย B) และทำการแยกโดยการไล่ระดับสีเชิงเส้นต่อไปนี้: 25–100 เปอร์เซ็นต์ B (0–40 นาที), 100 เปอร์เซ็นต์ (40–45) นาที). UV–vis spectra ถูกบันทึกในช่วง 190–600 นาโนเมตร และได้มาโครมาโตแกรมที่ 254 และ 280 นาโนเมตร ELSD ถูกทำให้ร้อนที่ 30ระดับC และอัตราขยาย 4 ถูกนำไปใช้กับสัญญาณ ตัวอย่างถูกเตรียมที่ความเข้มข้น 10 มก./มล. ใน MeOH และปั่นแยกที่ 13,000 g เป็นเวลา 10 นาทีก่อนฉีด (10 ul) เพื่อขจัดร่องรอยของสารแขวนลอย

2.5.4 ขั้นตอน HPLC-UV-MS

การวิเคราะห์ HPLC-UV-MS ดำเนินการโดยใช้โมดูลการแยกน้ำ 2795 (เมืองกายองคอร์ต ประเทศฝรั่งเศส) ที่ติดตั้งเครื่องตรวจจับน้ำ Dual λ 2487 คอลัมน์ เฟสการเคลื่อนที่ และการไล่ระดับสีเหมือนกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับ HPLC-DAD-ELSD ได้รับโครมาโตแกรมที่ 254 และ 280 นาโนเมตร การวิเคราะห์มวลดำเนินการกับ Bruker (เบรเมิน เยอรมนี) อิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนเซชัน/เคมีไอออไนเซชันความดันบรรยากาศ (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 บวกทั้งในโหมดบวกและลบดังต่อไปนี้: แก๊สชน, He; แอมพลิจูดของพลังงานการชน 1.3 V; เครื่องพ่นฝอยละอองและก๊าซทำให้แห้ง N2, 7 ลิตร/นาที; ความดันของก๊าซพ่นฝอย 30 psi; อุณหภูมิแห้ง 340 C; อัตราการไหล 1.0 มล./นาที; อัตราส่วนการแยกตัวทำละลาย 1:9; ระยะการสแกน m/z 100–1,000 ตัวอย่างถูกเตรียมที่ความเข้มข้น 10 มก./มล. ใน MeOH หมุนเหวี่ยงที่ 13,000 กรัม เป็นเวลา 10 นาที และกรองผ่านเยื่อกรองเยื่อกรองโพลีเตตระฟลูออโรเอทิลีน (PTFE) 0.45-μm ก่อนฉีด (20 ul) เพื่อลบร่องรอย ของวัสดุแขวนลอย

2.6 การแยก EEP โดยแฟลชโครมาโตกราฟี

อย่างแรก 3.8 กรัมของ BC1 (1), 3.5 กรัมของ BC2 (2) หรือ 4.0 กรัมของ CG (3) EEPs ถูกละลายในปริมาตรขั้นต่ำของ DCM และอะซีโตน และผสมกับซิลิกาเจล (ซิลิกา เจล: อัตราส่วนสารสกัด 2:1) สำหรับสารเหล่านี้ทั้งหมด ตัวทำละลายถูกปล่อยให้ระเหยจนได้ผงแห้งละเอียด สำหรับ EEP แต่ละรายการ การแยกส่วนจะดำเนินการโดยใช้เครื่องมือ CombiFlash Teledyne ISCO (ลินคอล์น เนบราสเซีย สหรัฐอเมริกา) กับคอลัมน์ซิลิกาเจล (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, ฝรั่งเศส) ที่อัตราการไหล 25 มล./นาที ด้วยไซโคลเฮกเซน (ตัวทำละลาย A) และเอทิลอะซีเตต (EtOAc) (ตัวทำละลาย B) โดยใช้การชะไล่ระดับสีต่อไปนี้: (1) สำหรับ BC1 EEP, 5 เปอร์เซ็นต์ B (0–10 นาที), 5–20 เปอร์เซ็นต์ B (10–30 นาที), 20–30 เปอร์เซ็นต์ B (30–60 นาที), 30–50 เปอร์เซ็นต์ B (60–85 นาที) และ 50–100 เปอร์เซ็นต์ B (85–110 นาที); หลอดขนาด 20 มล. จำนวน 160 หลอดถูกรวบรวมและรวมกันเป็นเศษส่วน 14 ชิ้น (BC1_F1 ถึง BC1_F14) บนพื้นฐานของโปรไฟล์โครมาโตกราฟี TLC (อัตราส่วนไซโคลเฮกเซน:EtOAc, 90:10 ถึง 50:50 ); (2) สำหรับ BC2 EEP, 5 เปอร์เซ็นต์ B (0–10 นาที), 5–10 เปอร์เซ็นต์ B (10–20 นาที), 10–30 เปอร์เซ็นต์ B (20–40 นาที), 30–40 เปอร์เซ็นต์ B (40–55 นาที) และ 40–100 เปอร์เซ็นต์ B (55–70 นาที); หลอดขนาด 20 มล. จำนวน 100 หลอดถูกรวบรวมและรวมกันเป็น 8 เศษส่วน (BC2_F1 ถึง BC2_F8) บนพื้นฐานของโปรไฟล์โครมาโตกราฟี TLC (อัตราส่วนไซโคลเฮกเซน:EtOAc, 90:10 ถึง 60:40 ); (3) สำหรับ CG EEP, 5 เปอร์เซ็นต์ B (0–10 นาที), 5–10 เปอร์เซ็นต์ B (10–30 นาที), 10–20 เปอร์เซ็นต์ B (30–50 นาที), 20–40 เปอร์เซ็นต์ B (50–70 นาที), 40–60 เปอร์เซ็นต์ B (70–80 นาที) และ 60–100 เปอร์เซ็นต์ B (80–90 นาที); หลอดขนาด 20 มล. จำนวน 135 หลอดถูกรวบรวมและรวมกันเป็น 23 ส่วน (CG_F1 ถึง CG_F23) บนพื้นฐานของโปรไฟล์โครมาโตกราฟี TLC (อัตราส่วนไซโคลเฮกเซน:EtOAc, 80:20 ถึง 60:40 ).

มีการดำเนินการขั้นตอนการแยกส่วนเพิ่มเติมในเศษส่วน BC{{0}} F7: 200 มก. ถูกละลายในปริมาตรน้อยที่สุดของ MeOH และผสมกับ C18-ซิลิกาเจล (C18-ซิลิกา เจล: อัตราส่วนสารสกัด 2:1) การแยกเกิดขึ้นที่คอลัมน์ C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, ฝรั่งเศส) ที่อัตราการไหล 15 มล./นาที ด้วยน้ำ (ตัวทำละลาย A) และ MeOH (ตัวทำละลาย B) โดยใช้การชะไล่ระดับสีต่อไปนี้: 50– 70 เปอร์เซ็นต์ B (0–30 นาที) และ 70–100 เปอร์เซ็นต์ B (30–40 นาที); หลอดขนาด 8 มล. จำนวน 80 หลอดถูกรวบรวมและรวมกันเป็น 5 ส่วน (BC2_F7-1 ถึง BC2_F7-5) ตามโปรไฟล์ HPLC-UV (280 นาโนเมตร) .

2.7 1 การวิเคราะห์ H และ 13C NMR

NMR spectra (1D และ 2D) ของเศษส่วนโพลิส (7–58 มก.) หรือบางครั้ง NPs ถูกบันทึกในดิวเทอเรเต็ดคลอโรฟอร์ม (CDCl3) หรือดิวเทอเรตเมทานอล (CD3OD) (500 ul) บนสเปกโตรมิเตอร์ JEOL NMR ที่ 400 MHz เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ 100 MHz สำหรับ 13C การทดลอง NMR (1 H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 และ 2D NMR) บนเศษส่วนและ NPs บริสุทธิ์ได้ดำเนินการที่ 298 K บนสเปกโตรมิเตอร์ JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, ฝรั่งเศส) พร้อมกับโพรบ 5-mm แบบผกผัน (ROYAL RO5) การเปลี่ยนแปลงทางเคมี (δH และ δC) แสดงเป็นค่า ppm และ J ในหน่วย Hz

สำหรับสเปกตรัม 13C NMR (100 MHz) จะใช้ลำดับการแยกส่วน WALTZ-16 โดยมีเวลาในการรวบรวม 1.04 วินาที (จุดข้อมูลเชิงซ้อน 32,768 จุด) และความล่าช้าในการผ่อนคลาย 2 วินาที ระหว่าง 1,500 ถึง 11000 การสแกนถูกรวบรวมเพื่อให้ได้อัตราส่วน S/N ที่น่าพอใจ ตัวกรองการขยายเส้นเอกซ์โปเนนเชียล 1 Hz ถูกนำไปใช้กับแต่ละการสลายตัวแบบเหนี่ยวนำอิสระ (FID) ก่อนการแปลงฟูริเยร์ Spectra ถูกแบ่งขั้นตอนด้วยตนเองและแก้ไขค่าพื้นฐานโดยใช้ซอฟต์แวร์ MestReNova (การวิจัยของ Mestrelab, Santiago de Compostela, สเปน) และอ้างอิงกับเสียงสะท้อนกลางของตัวทำละลาย deuterated ที่ δC 77.16 ppm (CDCl3) และ δC 49.00 ppm (CD3OD) สำหรับการปรับปรุงที่ไม่มีการผิดเพี้ยนโดยการทดลองการถ่ายโอนโพลาไรเซชัน (DEPT) จำเป็นต้องมีการสแกนระหว่าง 512 ถึง 5,500 ครั้ง และจัดแนวด้วยสเปกตรัม 13C โดยใช้ δC ที่กำหนด จากนั้นจึงใช้เกณฑ์ความเข้มขั้นต่ำเพื่อรวบรวมสัญญาณบวก 13C NMR และ DEPT-90 และสัญญาณ DEPT บวกและลบ-135 ด้วยตนเองในขณะที่หลีกเลี่ยงสัญญาณรบกวนที่อาจเกิดขึ้น

Propolis DB1 ถูกสร้างขึ้นครั้งแรกโดยการค้นหาสารประกอบที่อธิบายไว้ใน Propolis บน SciFindern, 47 ส่งผลให้ DB 1,471 NPs; ทำนายค่า δC โดยใช้ Advanced Chemistry Development (ACD) NMR ตัวทำนาย (C, H) จากฐานข้อมูลดังกล่าวที่มี NP ร่วมกับค่า δC-SDF รูทีน CTypeGen ที่รวมอยู่ใน MixONat จะสร้างฐานข้อมูลที่เหมาะสม: โดยจะอ่านไฟล์ข้อมูลเชิงพื้นที่ (SDF) และจัดเรียงการเปลี่ยนแปลงทางเคมีตามประเภทคาร์บอน จากนั้นจึงสร้าง SDF ชนิด c ที่ต้องการ เช่น c-type Propolis DB1.43,44

สติลเบนอยด์_ฟีแนนทรีนอยด์ DB2 ถูกสร้างขึ้น การค้นหาสารโดยใช้คำสำคัญ stilbenoids และ phenanthrenes ใน LOTUS DB ที่มี 276,518 NPs48 (LOTUS, 2022) ทำให้ได้รับ Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 จำนวน 2,681 NPs เป็น SDF จากนั้นจึงสร้าง Flavanones DB3: การค้นหาใน SciFindern47 โดยใช้ 2-phenylchroman-4- หนึ่งโครงสร้างย่อยที่อนุญาตให้เลือกจาก 56,679 โมเลกุล พวกเขาลดลงเหลือ 2,893 โดยอ้างถึง "การเกิดผลิตภัณฑ์ตามธรรมชาติ" โดยใช้การวิเคราะห์สารด้วยตัวกรอง "บทบาทอ้างอิง" ที่เสนอโดย SciFindern หลังจากการกลั่นเพิ่มเติมโดยขั้นตอนการกรองตามน้ำหนักโมเลกุล (MW) ที่คาดไว้ (เช่น 340 ถึง 424 Da) ฟลาวาโนนที่เกี่ยวข้องทั้งหมดจะถูกส่งออกในภายหลังเป็น SDF เพื่อรับ NPs จาก Flavanones DB3 (684 NPs) สำหรับแต่ละ NPs ของ DB2 และ DB3 ค่า δC-SDF ถูกทำนายโดยใช้ซอฟต์แวร์ ACD NMR ตัวทำนาย (C, H) รวมถึงวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Nuzillard46 เพื่อให้ได้ C-type SDF ที่พร้อมใช้งานโดย MixONat โดยตรง ส่วนหลังประกอบด้วยค่า δC ที่ทำนายไว้สำหรับสารประกอบแต่ละชนิดใน DB ซึ่งจัดเป็นเมทิล เมทิลีน เมทีน หรือควอเทอร์นารีคาร์บอน

Triterpenes DB4 สร้างขึ้นจาก PNMRNP3 DB49,50 ที่อิมพอร์ตเป็น SDF ในซอฟต์แวร์ทำนาย ACD NMR (C, H) โดยค้นหา triterpenes ด้วย MW ระหว่าง 100 ถึง 500 Da (เช่น ข้อมูลการค้นหา: triterpenes; ค้นหา MW: 100 ถึง 500) เพื่อรับ DB 6,623 triterpenes โดยตรงในรูปแบบไฟล์ c-type ที่ต้องการ

Alk(en)yl resorcinol และอนุพันธ์ฟีนอล DB5 ถูกสร้างขึ้นจาก PNMRNP3 DB49,50 ที่อิมพอร์ตเป็น SDF ในซอฟต์แวร์ทำนาย ACD NMR (C, H) โดยค้นหา NPs ด้วย m-alk(en)yl phenol scaffold และจัดประเภทเป็นฟีนอล (เช่น 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Substructure search; Search Classyfire class: phenol) เพื่อรับ DB 44 NPs โดยตรงในรูปแบบไฟล์ c-type ที่ต้องการ

2.8 13C ถอดแบบตาม NMR โดยใช้ซอฟต์แวร์ MixONat

รายการสูงสุดและข้อมูลความเข้มที่ได้รับจากสเปกตรัมการทดลองแต่ละรายการ (13C NMR, DEPT-135 และ DEPT-90) ถูกส่งออกเป็นไฟล์ . csv โดยใช้ซอฟต์แวร์ Microsoft Excel (Microsoft 16.45) และใช้เป็นไฟล์อินพุตในซอฟต์แวร์ MixONat ไฟล์ดังกล่าวประกอบด้วยรายการค่า δC ที่เรียงลำดับจากมากไปน้อยซึ่งสัมพันธ์กับความเข้มของค่าในบรรทัดเดียวกัน โดยคั่นด้วยเครื่องหมายจุลภาค

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. จากนั้นนำข้อมูลการทดลองของ NP ที่มีคะแนนดีที่สุดมาเปรียบเทียบกับวรรณกรรม

2.9 การทำให้บริสุทธิ์

2.9.1 การเตรียม HPLC

การทำให้บริสุทธิ์ของเศษส่วน BC{{0}}F6 และ BC1_F8 (40 มก. ใน 2 มล. ของ MeOH) ดำเนินการโดยใช้ Shimadzu LC-20สารเตรียม AP โครมาโตกราฟีของเหลวที่ติดตั้งเครื่องตรวจ UV–vis detector SPD-40 (Noisiel, ฝรั่งเศส) วงฉีดขนาด 2 มล. และเครื่องเก็บเศษส่วน FRC-10A โดยใช้คอลัมน์เตรียม C18 (25{{39 }} มม. 21.2 มม. id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, ฝรั่งเศส) ที่อัตราการไหล 21.24 มล./นาที เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำ (ตัวทำละลาย A) และเมทานอล (ตัวทำละลาย B) และแยกโดยใช้เกรเดียนต์ต่อไปนี้: (1) สำหรับ BC1_F6, 40 เปอร์เซ็นต์ B (0–5 นาที), 40–70 เปอร์เซ็นต์ B (5–20 นาที) และ 70–90 เปอร์เซ็นต์ (20–30 นาที); (2) สำหรับ BC1_F8, 40–70 เปอร์เซ็นต์ B (0– 15 นาที) และ 70–90 เปอร์เซ็นต์ (15-25 นาที) ได้รับโครมาโตแกรมที่ 254 และ 280 นาโนเมตร

2.9.2 การสกัดเฟสของแข็ง (SPE)

เพื่อให้ได้ส่วนที่มีขั้วมากที่สุดของ BC2-EPP (200 มก. ใน 5 มล. ของ MeOH ผสมกับ 350 มก. ของ C18-ซิลิกาเจลหลังการระเหย) การทำให้บริสุทธิ์ดำเนินการโดยใช้คอลัมน์สกัดของแข็ง C18 (2 กรัม/15 มล., Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, ฝรั่งเศส) กับน้ำ: MeOH 7:3 (10 มล.) และน้ำ: MeOH 6:4 (10 มล.) หลอด 4–10 ถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างเศษส่วนเชิงขั้วของ BC2 (BC2_SPE) ตามโปรไฟล์ HPLC-UV (330 นาโนเมตร)

2.10 การทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านวัย

2.10.1 การกำจัดอนุมูล DPPH

การประเมินการขจัดอนุมูล DPPH ของ EEPs ของเบนินดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 51 โดยสังเขป ตัวอย่างที่ทดสอบถูกเจือจางใน EtOH สัมบูรณ์ที่ 0.02 มก./มล. จากสารละลายสต็อกที่ 1 มก./มล. ในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (สพม.). ส่วนลงตัว (100 ul) ของสารละลายที่เจือจางเหล่านี้ถูกใส่ใน 96-จานหลุมเป็นสามเท่า สารละลาย DPPH ที่เตรียมใหม่ประมาณ 25 ul (1 มิลลิโมลาร์) ถูกเติมลงใน EtOH สัมบูรณ์ 75 ul โดยใช้หัวฉีดของเครื่องอ่านไมโครเพลท (Infinite® 200, Tecan, ฝรั่งเศส) เพื่อให้ได้ปริมาตรสุดท้ายที่ 200 ul ต่อหลุม หลังจากผ่านไป 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง ค่าการดูดกลืนแสงถูกกำหนดไว้ที่ 517 นาโนเมตร EtOH ถูกใช้เป็นช่องว่างในขณะที่ใช้สารละลาย Trolox (อะนาล็อกโทโคฟีรอลที่ชอบน้ำ) 10, 25, 50 และ 75 μM สำหรับเส้นโค้งการสอบเทียบ ใช้ตัวอย่างสารละลายกรดคลอโรเจนิกเอทานอล (0.02 มก./มล.) เป็นมาตรฐานควบคุมคุณภาพ ผลลัพธ์แสดงเป็น Trolox เทียบเท่า (ไมโครโมลของ TE ต่อกรัมของสารสกัด)

2.10.2 การทดสอบการต่อต้านวัย

ผลของสารสกัดโพลิสและอนุพันธ์ของนาริงเจนินที่สำคัญ 5 ชนิดต่อการก่อตัวของ AGE ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 51 กล่าวโดยสังเขป โบวีนซีรั่มอัลบูมิน (BSA) (10 มก./มล.) ถูกบ่มด้วย D-ไรโบส ({{ 13}}.5 โมลาร์) ร่วมกับสารประกอบที่ทดสอบ (3 ไมโครโมลาร์ถึง 3 มิลลิโมลาร์) หรือสารสกัด (1 ไมโครกรัมถึง 1 มก.) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 50 มิลลิโมลาร์ที่ pH 7.4 (NaN3, 0.02 เปอร์เซ็นต์ ) สารละลายถูกบ่มใน 96-หลุมไมโครไทเทอร์เพลตที่ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในระบบปิดก่อนการวัดการเรืองแสงของ AGE การเรืองแสงจากตัวอย่างที่บ่มในสภาวะที่เหมือนกันโดยไม่มี D-ribose ถูกหักออกสำหรับการวัดแต่ละครั้ง Pentosidine-like (การกระตุ้นที่ 335 นาโนเมตร, การปล่อยที่ 385 นาโนเมตร) การเรืองแสงของ AGE ถูกวัดโดยฟลูออโรเมทรี ค่า IC50 ถูกกำหนดเป็นปริมาณของสารสกัด (ug/ml) หรือการควบคุมเชิงบวก (μM) ที่จำเป็นเพื่อลดการก่อตัวของ AGE ลง 50 เปอร์เซ็นต์ สัมพันธ์กับการควบคุมเชิงลบ ตามการทดสอบความถูกต้องทางสถิติ 53 การวิเคราะห์เพียงครั้งเดียวเพียงพอสำหรับการกำหนด IC50 ที่แม่นยำ

3. ผลลัพธ์และการสนทนา

3.1 การทำโปรไฟล์โครมาโตกราฟี

การทำโปรไฟล์ LC ทั่วไปของ EPP ชาวเบนินและคองโกทั้งแปดโดยใช้เครื่องตรวจจับ ELSD แบบกึ่งสากลแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างทั้งหมดมีสารประกอบที่ไม่มีขั้วซึ่งถูกชะออกที่ส่วนท้ายของโครมาโตแกรม (รูปที่ 1) BC1 แสดงสารประกอบที่มีขั้วมากขึ้นจำนวนมาก และ BC2 แสดงสารประกอบที่มีขั้วปานกลางในปริมาณที่น้อยกว่า สารประกอบไม่มีขั้วใน CG EEP นั้นค่อนข้างแตกต่างจากสารประกอบของเบนินส์

ดังนั้น การทำโปรไฟล์ ELSD จึงนำไปสู่การสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันสามตัวอย่างซึ่งมีการตรวจสอบองค์ประกอบเพิ่มเติม: BC1, BC2 และ CG

ขั้นแรก วิเคราะห์ GC-MS โดยเปรียบเทียบการแยกส่วน MS กับ NIST DB เพื่อกำหนดลักษณะของคลาสเคมี และเมื่อเป็นไปได้ เพื่อระบุส่วนประกอบ การระบุสมมุติฐาน (ขึ้นอยู่กับเปอร์เซ็นต์ของการจับคู่กับ NIST DB) และประเภททางเคมีของสารประกอบแสดงในตารางที่ 2 (ข้อมูลการทำโปรไฟล์ GC–total ionic current [TIC] แสดงในรูปที่ SI-2)

EEPs ของเบนินทั้งหมดแสดงโปรไฟล์เดียวกันของสารประกอบที่ไม่มีขั้ว โดยมีป้ายกำกับเป็นตัวอักษร A ถึง F แต่ปริมาณอาจแตกต่างกันไป พวกเขาถูกระบุโดยสมมุติว่าเป็น - หรือ -amrinone (A), -amyrin (B), lupenone (C), -amyrin (D), - หรือ -amyrin acetate (E) และ lupeol acetate (F) (เปรียบเทียบ รูปที่ SI -3) ซึ่งอธิบายไว้แล้วว่าเป็น NP ที่สำคัญในโพลิสของเม็กซิโก 54 Zhang et al. (2014) และทัมฟูและคณะ (2020) ยังอธิบายไตรเทอร์พีนอยด์เป็น amyrin/lupeol และ amyrin/lupeol acetates ในตัวอย่างโพลิสแอฟริกาต่างๆ41,55 มีเพียง BC1 เท่านั้นที่แสดง NPs เพิ่มเติมที่ชะระหว่าง Rt 10 และ 15 นาทีที่แนะนำเป็น methoxylated stilbenoids หรือ phenanthrenes ตามรูปแบบการกระจายตัวของพวกมัน EEP ของคองโกแสดงโปรไฟล์ที่แตกต่างจากของชาวเบนินโดยมีเอทิลเอสเทอร์ของกรด C16 และ C18 เป็นสารประกอบที่ระเหยง่ายมากกว่าซึ่งมีคะแนนการจับคู่ที่ดีที่ 94 เปอร์เซ็นต์ อนุพันธ์ฟีนอลที่ Rt 13.1 นาที อนุพันธ์ของรีซอร์ซินอลสามตัวในช่วง 14– 17 นาที และอนุพันธ์ไตรเทอร์พีนประเภทต่างๆ หลังจาก Rt 21 นาที

นอกจากนี้ EPP ยังได้รับการวิเคราะห์โดย HPLC-DAD-MS เพื่อแสดงภาพ NPs ที่ไม่ลบเลือน (cf. รูปที่ SI-4) การทำโปรไฟล์ที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่า BC1 EEP แสดงสารประกอบที่มีขั้วปานกลางจำนวนมากโดยมีการดูดซับโครโมฟอร์ที่ 280 นาโนเมตร เช่นเดียวกับ BC2 ในสัดส่วนที่น้อยกว่า และ CG มีโปรไฟล์รังสียูวีที่ต่ำมากที่ 280 นาโนเมตร

3.2 องค์ประกอบทางเคมีของ BC1 และ BC2

ในการระบุ NPs ที่สำคัญโดยใช้ 13C NMR dereplication ตาม MixONat และ DBs ที่เหมาะสม การแยกส่วนหยาบของ BC1 และ BC2 EEP ทำได้โดยใช้แฟลชโครมาโตกราฟี แท้จริงแล้ว สำหรับ BC1 การวิเคราะห์ GC-MS เผยให้เห็นการมีอยู่ของเมทอกซีเลตสเตลเบนอยด์หรือฟีแนนทรีน ซึ่งแนะนำเราให้สร้างสทิลเบนอยด์_ฟีแนนทรีนอยด์ DB2 ที่เฉพาะเจาะจง สำหรับ BC2 ยกเว้นสารประกอบที่มีขั้วมากกว่าที่ Rt 3.8 นาที สารประกอบทั้งหมดแสดง UV spectra ของฟลาวาโนน-ไดไฮโดรฟลาโวนอล ซึ่งแนะนำให้สร้างฟลาวาโนน DB3

ดังที่แสดงไว้ในตารางที่ 3 ไดไฮโดรฟีแนนทรีน 1 และ 3–5 ฟีแนนทรีน 2 และ 6 และไดไฮโดร สติลบีน 7 (รูปที่ 2) ถูกแนะนำใน BC1 EEP โดย MixONat และตรวจสอบความถูกต้องโดยเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรม (เปรียบเทียบข้อมูลสนับสนุน) เมื่อจำเป็น ตัวกรอง MW จะถูกนำมาใช้ตามข้อมูล HPLC-MS

แม่นยำยิ่งขึ้น จาก 9 อนุพันธ์ของไดไฮโดรฟีแนนทรีนจาก 2,681 NPs ใน DB2 MixONat แนะนำ 6-methoxycoelonin (2,7-dihydroxy-3,5-dimethoxy{ {10}},10-dihydrophenanthrene; 3, อันดับ 1, คะแนน 0.75, เลข SI-13 และ SI-14) ใน BC{{ 18}}F5 และการมีอยู่ของมันได้รับการยืนยันโดยเปรียบเทียบกับข้อมูล NMR ที่เผยแพร่ ยังไม่ได้รับการระบุจากสายพันธุ์ Combretaceae56 และในกล้วยไม้ Bulbophyllum vaginatum; 57 และ 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrophenanthrene (4, rank 1, คะแนน 0.88, ตัวเลข SI{{33 }} และ SI-16) ตั้งสมมติฐานใน BC1_F2 สารประกอบ 4 ได้รับการอธิบายแล้วใน Senegalese propolis58 และการมีอยู่ของมันถูกตรวจสอบตามข้อมูลที่รายงานโดย Pettit et al จากต้นไม้แอฟริกา Combretum caffrum59 และโดย Lu et al. จาก Dioscorea nipponica Makino.60

กระบวนการถอดแบบตาม 13C NMR ยังทำนาย 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene (5, อันดับ 8, คะแนน 0.76, รูป SI-15 และ SI-16) ใน BC1_F2 และ 2,6,7-ไตรไฮดรอกซี{{20 }},4-ไดเมทอกซี-9,10-ไดไฮโดรฟีแนนทรีน (1, อันดับ 2, คะแนน 0.5, เลข SI-5 และ SI-6 ) ใน BC{{30}}F6-1 เมื่อใช้ตัวกรองโมเลกุลที่ MW 288 Da สำหรับ 1 คะแนนค่อนข้างต่ำ (0.5); ดังนั้น การทดลอง 2D NMR เพิ่มเติม (สหสัมพันธ์เชิงควอนตัมเชิงควอนตัมแบบเฮเทอโรนิวเคลียร์ [HMQC], การเชื่อมต่อแบบหลายพันธะแบบเฮเทอโรนิวเคลียร์ [HMBC], นิวเคลียร์โอเวอร์เฮาเซอร์เอฟเฟ็กต์สเปกโทรสโกปี [NOESY], เปรียบเทียบตัวเลข SI-7–SI-10) ดำเนินการเพื่อยืนยันโครงสร้าง สำหรับ 5 คะแนนคือ 0.76 นั่นคือสูงกว่า 0.70 NP ทั้งสองนี้ (1 และ 5) ถูกกล่าวถึงเป็นครั้งแรกโดย Letcher และคณะ ในสายพันธุ์ Combretum61,62 และ 1 ได้ถูกค้นพบแล้วใน Senegalese propolis.58

ในบรรดาอนุพันธ์ของฟีแนนทรีน MixONat ตั้งสมมติฐาน 2,6,7-ไตรไฮดรอกซี-3,4-ไดเมทอกซีฟีแนนทรีน (2, อันดับ 1, คะแนน 0.88, ตัวเลข SI-11 และ SI{{10}}) ใน BC1_F8-1 ซึ่งได้รับการยืนยันโดยเปรียบเทียบกับข้อมูลสเปกตรัมที่อธิบายโดย Letcher และคณะ ใน Combretum apiculatum 61 2,7-Dihydroxy-3,4,6-trimethoxyphenanthrene (6 อันดับ 5 คะแนน 0.94 ตัวเลข SI-17 และ SI-18) ก่อนหน้านี้แยกได้จาก Photolida Chinensis63 ได้รับการแนะนำใน BC1_F4

Combretastatin B{{0}} (7) ซึ่งเป็น dihydro stilbene ได้รับการแนะนำโดย MixONat ในอันดับแรก (คะแนน 1.0, ตัวเลข SI-17 และ SI-19) ใน BC1 EPP เมื่อใช้ ตัวกรอง MW (MW 304 Da) และตรวจสอบโดยเปรียบเทียบกับข้อมูล NMR ที่อธิบายโดย Pettit และคณะ ใน Combretum caffrum 59

สารประกอบ 2, 6 และ 7 ได้รับการระบุแล้วใน Senegalese propolis.58

ข้อมูล 1 H และ 13C NMR ของ 1–7 มีอยู่ในข้อมูลสนับสนุน

สำหรับ BC2 มีการระบุสารประกอบเจ็ดชนิดที่เป็นของโครงสร้างสองชั้นของโพลีฟีนอล โครโมน-ซี-กลูโคไซด์ และอนุพันธ์ของพรีนิลฟลาวาโนน (8-14) ซึ่งบางส่วนถูกอธิบายเป็นครั้งแรกในโพลิส (รูปที่ 3)

กระบวนการที่ใช้ 13C NMR โดยใช้ MixONat และ DB1 ถึง DB5 ไม่ได้ให้ผลลัพธ์ที่เกี่ยวข้องซึ่งแนะนำ NP ดั้งเดิม ผลิตภัณฑ์หลักสองรายการ (8–9) มีลักษณะเฉพาะอย่างสมบูรณ์โดยใช้แมสสเปกตรัมและข้อมูล 1D และ 2D NMR (1 H, 13C, HMQC, HMBC, cf. รูปที่ SI-20–SI-23) และระบุว่าเป็นฟลอริน (8) และไอโซบิฟลอริน (9) ซึ่งเป็นโครมาโนน-ซีกลูโคไซด์ 2 ชนิดที่อธิบายใหม่ในโพลิส ซึ่งเคยอธิบายไว้ใน Pancratium biflorum64 และกานพลูของ Eugenia caryophyllata ตามลำดับ 65

เกี่ยวกับอนุพันธ์ฟลาวาโนน จาก 688 NPs ใน DB3 MixONat เสนอ 6-prenylnaringenin (10, อันดับ 1, คะแนน 0.95, ตัวเลข SI- 24 และ SI{{8 }}) ได้อธิบายไว้แล้วใน Nigerian red propolis66 ใน BC{{10}}F7-1 6,8-Diprenylaromadendrin (12, อันดับ 1, คะแนน 1.0, ตัวเลข SI-28 และ SI-29) และ 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13 อันดับ 10 คะแนน 0.84 ตัวเลข SI-30 และ SI-31) ก่อนหน้านี้พบในตัวอย่างแคเมอรูนโพลิส 42 ได้รับการตรวจสอบใน BC2_F{ {30}} และ BC2_F5 ตามลำดับ 6-Geranylnaringenin (อันดับ 14, อันดับ 1, คะแนน 0.84, ตัวเลข SI-32 และ SI-33) ซึ่งอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในโพลิสจากหมู่เกาะโซโลมอน67 ได้รับการตั้งสมมติฐานและยืนยันในคริสตศักราช{{41 }}ฉ7-5. ในที่สุด 6-dimethylallyl naringenin (11) ได้รับการแนะนำในตำแหน่งที่สองโดย MixONat ใน BC2_F6 (อันดับ 2, คะแนน 0.65, ตัวเลข SI-26 และ SI- 27) ไอโซเมอร์ในตำแหน่งที่ 8 ถูกเสนอในตำแหน่งที่ 1 แต่การเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรม 68,69 แสดงว่าเป็นไอโซเมอร์ในตำแหน่งที่ 6 สารประกอบ 11 เป็นสารใหม่ในโพลิสแต่ได้อธิบายไว้แล้วในสารสกัดอินทรีย์ของโมโนเทสแอฟริกัน 70 1 ข้อมูล H และ 13C NMR ของ 8–14 มีอยู่ในข้อมูลสนับสนุน

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】