การหาลักษณะเฉพาะของกรด Caffeoylquinic จาก Lepisorus Thunbergianus และกิจกรรมการยับยั้งการสร้างเม็ดสี

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* และ Kooyeon Lee*

บทคัดย่อ:รอยดำที่เกิดจากการทำงานที่มากเกินไปของไทโรซิเนสทำให้เกิดจุดด่างดำหรือรอยด่างบนผิวหนังมนุษย์ แม้ว่าปรากฏการณ์เหล่านี้จะไม่เป็นอันตราย แต่ก็ยังมีความต้องการอย่างมากสำหรับสารยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดรอยดำมากเกินไปโดยการยับยั้งไทโรซิเนส ซึ่งเป็นเอ็นไซม์จำกัดอัตราในการสร้างเมลาโนเจเนซิส แม้ว่า Lepisorus thunbergianus จะถูกนำมาใช้ในการเยียวยาชาวบ้านในฐานะยาขับปัสสาวะและการห้ามเลือด แต่ก็ยังไม่มีรายงานผลกระทบต่อการสร้างเม็ดสี ในการศึกษานี้ เราเตรียมสารสกัด L.thunbergianus และเศษส่วนของตัวทำละลาย และประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัดต่อการสังเคราะห์อนุมูลอิสระและเมลานิน สารสกัดของ L. thunbergianus ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสของเห็ดได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าและมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่คล้ายคลึงกันกับอาร์บูตินในหลอดทดลอง การประเมินเปรียบเทียบฤทธิ์ต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสและฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสของ L. thunbergianus ตัวทำละลายเศษส่วนแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส เศษบิวทานอลมีศักยภาพสูงสุดในการยับยั้งเซลล์เมลาโนเจเนซิซินเมลาโนมา เราพบโดยการวิเคราะห์โครงสร้างโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) และ NMR spectroscopy ว่าสารประกอบหลักในส่วนของบิวทานอลเป็นอนุพันธ์ของกรดคาเฟโออิลควินิกสามชนิด อนุพันธ์ทั้งสามชนิดมีฤทธิ์ในการขจัดอนุมูลอิสระและต่อต้านไทโรซิเนสที่คล้ายคลึงกันในหลอดทดลอง ในขณะที่กรดคาเฟอีนเพียง 5- ชนิดเท่านั้นที่มีผลยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เกิดจาก -MSH ผลการยับยั้งของกรด 5-caffeoylquinic ได้รับการยืนยันโดยการกำหนดปริมาณเมลานินและการทำงานของไทโรซิเนสในมะเร็งผิวหนังหลังจากทำการรักษาเซลล์ด้วยสารประกอบเชิงพาณิชย์ นอกจากนี้ เราพบว่า 5-กรด caffeoylquinic ยับยั้งการสร้างเม็ดสีโดยการทำคีเลตไอออนบวกของทองแดงจากสารเชิงซ้อนของคอปเปอร์−ไทโรซิเนส ดังนั้น 5-กรด caffeoylquinic หรือ butanol Fraction ที่แยกได้จาก L. thunbergianus อาจมีประโยชน์ในเครื่องสำอางในฐานะตัวแทนในการทำให้ผิวขาว

Cistanche tubulosa: สารปรับผิวขาว

การแนะนำ

เมลานิน ซึ่งเป็นกลุ่มของเม็ดสีธรรมชาติที่พบในสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ มีบทบาทสำคัญในการทำให้เป็นสีน้ำตาลของผลไม้ เชื้อรา และผัก และการสร้างเม็ดสีในผิวหนังมนุษย์1 เมลานินีผลิตจากกรดอะมิโนไทโรซีนผ่านกระบวนการหลายขั้นตอนซึ่งรวมถึงออกซิเดชันของเอนไซม์และโพลีเมอไรเซชัน 2 Inhumans เม็ดสีเมลานินถูกสังเคราะห์โดยเซลล์เมลาโนไซต์เฉพาะเดนไดรต์ซึ่งอยู่ที่จุดเชื่อมต่อระหว่างผิวหนังชั้นนอกกับผิวหนังชั้นหนังแท้ ซึ่งการสังเคราะห์เกิดขึ้นจากการสัมผัสกับรังสีอัลตราไวโอเลต (UV)3 เม็ดสีเมลานินถูกลำเลียงไปยังเคราติโนไซต์เพื่อปกป้องผิวจากรังสียูวีและอนุมูลอิสระ ดังนั้น สีผิวจึงถูกกำหนดโดยรูปแบบการกระจายตัวของเม็ดสีเมลานิน2 การสังเคราะห์อินเมลานินที่ผิดปกติทำให้เกิดรอยดำในหลายรูปแบบ เช่น ฝ้า กระ จุดด่างอายุ เลนทิโก้จากแสงอาทิตย์ รอยดำหลังการอักเสบ และอาการที่เกิดจากรอยดำอื่นๆ4 มากกว่า โปรตีนหลายร้อยชนิดเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โทเมลานิน และในหมู่พวกมัน ไทโรซิเนสเป็นเอนไซม์จำกัดอัตราที่ได้รับการยอมรับว่าเป็นการสังเคราะห์ฟอร์เมลานินที่รับผิดชอบ5 ดังนั้น งานวิจัยส่วนใหญ่ในการป้องกันการสร้างเม็ดสีมากเกินไปจึงมุ่งเน้นไปที่การระบุ การแยก การสังเคราะห์ และการกำหนดคุณลักษณะของศักยภาพใหม่ สารยับยั้งไทโรซิเนสเพื่อป้องกันการสร้างเมลาโนเจเนซิส 1,6 สารยับยั้งไทโรซิเนสจำนวนหนึ่ง เช่น กรดโคจิก อาร์บูติน ไฮโดรควิโนน กรดอะเซลาอิก กรดเอลลาจิก และกรดทราเนซามิก ได้รับความนิยมอย่างมากในอุตสาหกรรมเครื่องสำอางในฐานะสารต่อต้านการสร้างเม็ดสี อย่างไรก็ตาม เนื่องจากข้อจำกัดของยาเคมี ซึ่งรวมถึงความเป็นพิษต่อเซลล์และผลข้างเคียง ยังคงมีความต้องการวัสดุใหม่ที่เพิ่มความปลอดภัย ความเสถียร และประสิทธิภาพ7

ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ รวมทั้งพืช แบคทีเรีย และเชื้อรา ได้กลายเป็นแหล่งทางเลือกสำหรับการค้นพบส่วนผสมที่ทำให้ผิวขาวอย่างมีประสิทธิภาพ เนื่องจากมีความเป็นพิษน้อยกว่าและความเข้ากันได้ทางชีวภาพและการดูดซึมที่ดีขึ้น1,8 Lepisorus thunbergianusis เฟิร์นที่เป็นของ Polypodiaceae ซึ่งเติบโตติดกับหินเก่า หรือเปลือกไม้และกระจายอยู่ทั่วไปในเขตอบอุ่นของเอเชียตะวันออก เช่น เกาหลี ญี่ปุ่น จีน ฟิลิปปินส์ และอินโดจีน L. thunbergianus ถูกใช้เป็นยาขับปัสสาวะ ยาห้ามเลือด และเป็นยาแก้ไอในการเยียวยาพื้นบ้านของเกาหลี การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าสารสกัด L. thunbergianustract มีฤทธิ์ต้านไขมันเปอร์ออกซิเดชันเฉพาะที่ในกิจกรรมและสารต้านอนุมูลอิสระเฉพาะที่ 9 นอกจากนี้ สารสกัด L. thunbergianus ยังแสดงการยับยั้งการเจริญที่ขึ้นกับความเข้มข้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์มะเร็งช่องปากและมะเร็งลำไส้10 สารสกัด L. thunbergianustract อาจมีการใช้งานที่เป็นไปได้ ในอุตสาหกรรมเครื่องสำอางเพราะพืชชนิดนี้ประกอบด้วยสารประกอบฟลาโวนอยด์หลายชนิดและโมเลกุลที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพจำนวนมาก ซึ่งรวมถึงเควอซิทิน 3-เมทิลอีเทอร์-กลูโคไซด์, ไวเทซิน, ตะวันออก, วารสารกลูโคไซด์, ไอโซวิเทกซิน, โอเรียนติน, โคเรนติน และคาเฟอีน 9a อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของ L. thunbergianus สกัดการสังเคราะห์เมลานินในเมลาโนไซต์ยังไม่สามารถอธิบายได้ชัดเจน

รูปที่ 1 การวิเคราะห์สารสกัด L. thunbergianus สำหรับ (A) ABTS การกำจัดอนุมูลอิสระ (B) การต่อต้านไทโรซิเนส และ (C) กิจกรรมการขับ ROS ภายในเซลล์

ในการศึกษานี้ เราได้เตรียมสารสกัด L. thunbergianus และเศษส่วนของตัวทำละลายผ่านการแยกส่วนแบบอนุกรม และตรวจสอบผลการยับยั้งของเศษส่วนของตัวทำละลายต่อการสังเคราะห์เมลานินทางชีวภาพในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 เราระบุเศษส่วนของ thebutanol (n-BuOH) เป็นส่วนสำคัญที่มีสารยับยั้งตามธรรมชาติและแสดงลักษณะพิเศษเพิ่มเติมของอนุพันธ์ของกรด caffeoylquinic ที่แยกได้จากสารสกัด L. thunbergianus ต่อการยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน

รีวิว cistanche: ต่อต้านอนุมูลอิสระ

ผลลัพธ์และการอภิปราย

สารสกัดเอทานอลของ L. thunbergianus Scavenges 2,2′-Azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)Radical and Inhibits Tyrosinase Activity.

การสกัด L. thunbergianus ที่มีเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ (EtOH) ถูกดำเนินการเพื่อประเมินฤทธิ์ในการยับยั้งศักยภาพของสารประกอบธรรมชาติในพืช กิจกรรมการไล่ระดับรุนแรงของสารสกัด L.thunbergianus ถูกกำหนดหาในช่วงความเข้มข้น 2−200 ug/mL สารสกัดเอธานอลแสดงฤทธิ์การขจัดอนุมูลอิสระที่ขึ้นกับความเข้มข้นโดยให้ผลสูงสุดที่ 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งผลลัพธ์นั้นสอดคล้องกับของอาร์บูตินที่ใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก (รูปที่ 1A)

นอกจากนี้เรายังประเมินผลการยับยั้งของสารสกัดต่อกิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ดโดยการวัดอัตราการสังเคราะห์โดปาโครมที่เร่งปฏิกิริยาด้วยไทโรซิเนส สารสกัดเอธานอลยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส 87% ที่ 500 ไมโครกรัม/มล. ในขณะที่อาร์บูตินยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสเพียง 38 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้นเท่ากัน (รูปที่ 1B) จากนั้น เราประเมินกิจกรรมการขจัดของสารสกัดบน ROS ภายในเซลล์ที่เพิ่มขึ้นโดยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 100 ไมโครโมลาร์ การบำบัดด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มขึ้นประมาณ 2.1-เท่าในระดับ ROS ภายในเซลล์ของเซลล์ B16F10 (รูปที่ 1C) เราพบว่าการเพิ่มขึ้นของ ROS ภายในเซลล์ที่มีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสื่อกลางถูกกำจัดโดยสารสกัดในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา: กิจกรรมการกำจัดสูงสุดที่ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรคือ 78 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 1C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสารสกัดเอธานอลของ L. thunbergianus มีสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสเช่นเดียวกับการขจัดอนุมูล ABTS และ ROS ภายในเซลล์

cistanche deserticola extract: ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส

ศักยภาพในการยับยั้งของ L. thunbergianus Fractions กับ Melanogenesis

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้10bนอกจากนี้ ผลการยับยั้งการทำงานของเศษส่วนตัวทำละลายที่แตกต่างกันของกิจกรรมบนไทโรซิเนสเพิ่มขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น: กิจกรรมการยับยั้งสูงสุดของ n-Hex และ CH2Cl2fractions ต่ำกว่า 65 เปอร์เซ็นต์ แต่ของ EtOAc และ n-BuOHfractions มีค่ามากกว่า 70 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 2B) กิจกรรมการยับยั้งอยู่ในลำดับของ n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเศษส่วนที่ชอบน้ำมากขึ้น รวมทั้งเศษส่วน n-BuOH และ EtOAc แสดงกิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระที่สูงกว่าและกิจกรรมการยับยั้งได้ดีกว่าเศษส่วน n-Hex และ CH2Cl2 ของ thelipophilic .

ต่อมา ผลของการแยกส่วนของตัวทำละลาย L. thunbergianus ต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งถูกตรวจสอบโดยการบำบัดเซลล์ B16F10 ที่มี 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของเศษส่วนที่แตกต่างกันหรือ 2 มก./มล. อาร์บูตินใน การปรากฏตัวของ -melanocyte-stimulatinghormone ( -MSH) ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในการส่งเสริมการสร้างเมลาโนเจเนซิสผ่านการเหนี่ยวนำปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF) 11 ผลการศึกษาพบว่าไม่มีเศษส่วนใดมีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งผิวหนัง (รูปที่ 2C) จากนั้นเราได้ตรวจสอบผลการยับยั้งผลกระทบของเศษส่วนของตัวทำละลายต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่ถูกกระตุ้นโดย -MSH ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง การบำบัดด้วย -MSH ชักนำให้เพิ่มขึ้นประมาณ 2.0-เท่าของปริมาณเมลานินภายในเซลล์ของเซลล์ B16F10 เท่า (รูปที่ 2D) เราพบว่าการสร้างเม็ดสีที่เป็นสื่อกลาง -MSH ถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์โดยเศษส่วนของ n-BuOH (p < 0.01)="" และถูกยับยั้งบางส่วนโดย="" etoacfraction="" (40="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" p="">< 0.01)="" ในขณะที่การสร้างเม็ดสีที่อาศัย="" -msh="" ไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญโดย="" n-hex="" และ="" ch2cl2เศษส่วน="" (รูปที่="" 2d)="" นอกจากนี้="" ผลการยับยั้งของการแยกส่วนของตัวทำละลายต่อการกระตุ้นไทโรซิเนสโดยอาศัย="" -msh="" ถูกกำหนดเนื่องจากไทโรซิเนสมีบทบาทสำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิส="" n-buoh="" (95="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" p="">< 0.001)="" และ="" etoac="" (66="" เปอร์เซ็นต์="" ,="" p="">< 0.001)="" เศษส่วนกลับเป็นสื่อกลางในการเปิดใช้งานไทโรซิเนส="" โดย="" -msh,ในขณะที่เศษส่วน="" n-hex="" และ="" ch2cl2="" ไม่เป็นไปตามที่แสดงในรูปที่="" 2e="" นอกจากนี้="" ผลการขจัดของการแยกส่วนของตัวทำละลายต่างๆ="" ต่อการเพิ่มขึ้นของ="" ros="" ภายในเซลล์ยังถูกกระตุ้นโดยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์="" เศษส่วนของตัวทำละลายทั้งหมดกลับค่า="" ros="" ภายในเซลล์ที่เพิ่มขึ้นซึ่งมีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสื่อกลาง="" ดังที่แสดงไว้ในรูปที่="" 2f="" ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า="" buohfraction="" ของ="" l.="" thunbergianus="" ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก="" msh="" โดยการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสภายในเซลล์ในเซลล์="" b16f10="" นอกจากนี้="" ผลลัพธ์เหล่านี้ยังชี้ให้เห็นว่าส่วนผสมออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินมีคุณสมบัติที่ชอบน้ำ="" และส่วนใหญ่พบในเศษส่วนของ="">

รูปที่ 2 ผลของเศษส่วนของตัวทำละลายต่อกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS การต่อต้านไทโรซิเนสและการต่อต้านการสร้างเม็ดสี

การระบุและการกำหนดคุณลักษณะของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัด L. thunbergianus

เพื่อระบุและแสดงคุณลักษณะของส่วนผสมที่ยับยั้งการสร้างเม็ดสี การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) สำหรับเศษส่วนของตัวทำละลายทั้งหมดถูกดำเนินการ การวิเคราะห์ HPLC ของการแยกส่วนของตัวทำละลายเปิดเผยว่าเศษส่วนทั้งหมดมีสารประกอบหลักสามตัวที่เวลาการคงอยู่ที่ 21, 28 และ 29 นาทีสำหรับสารประกอบ 1, 2 และ 3 ตามลำดับ (รูปที่ 3A−D) สารประกอบหลักสามชนิดเหล่านี้ถูกแยกออกเพิ่มเติมโดยการเตรียม HPLC ให้บริสุทธิ์ ปริมาณของสารประกอบหลักสามชนิดในส่วนของ n-BuOH ถูกกำหนดโดยใช้อนุพันธ์ของกรด caffeoylquinic เชิงพาณิชย์เป็นโมเลกุลมาตรฐานภายใน ตามรายงานก่อนหน้านี้12

จากนั้นจึงระบุสารประกอบที่แยกได้โดยการเปรียบเทียบข้อมูล 1H และ 13C NMR ของพวกมันกับเอกสารประกอบและพบว่าสอดคล้องกับโครงสร้างที่เสนอ (รูปที่ 4)13 รูปที่ 3E แสดงโครงสร้างโมเลกุลของสารประกอบสามชนิด สารประกอบ 1 (ผลผลิต, 3.2 ± 0.1 มก./100 มก. n ส่วนย่อยของ BuOH) ได้รับมาในรูปของผงสีเหลืองซีด 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.66 (1H, brs), 9.20 (1H, brs),7.49 (1H, d, J=15.9 Hz), 7.04 (1H, s), 6.99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1H, m), 5.08 (1H, brs), 4.89 (1H, brs) 4.13 (1H, m), 3.84 (1H, m), 3.56 (1H, s), 3.35 (1H, s), 1.99 (1H, ม.), 1.92 (1 ชม., ม.), 1.89 (1 ชม. ม.), 1.79 (1 ชม. ม.) 13C{1H} NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65,121.07, 115.75, 114.71, 114.22, 72.88, 71.01, 70.85, 69.49,35.22, 33.75) สารประกอบ 1 ถูกระบุเป็น 3-caffeoylquinicacid โดยการวิเคราะห์ NMR และโดยการเปรียบเทียบกับเอกสารก่อนหน้า.13b

สารประกอบ 2 (ผลผลิต, 14.1 ± 0.1 มก./100 มก. ของเศษส่วน n-BuOH) ได้รับมาในรูปของผงสีเหลืองซีด 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97(2H, m), 1.88 (1H, m), 1.83 (1H, ม.). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 66.05,64.31, 48.57, 38.20) สารประกอบ 2 ถูกระบุเป็น5-กรดคาเฟโออิลควินิกโดยการวิเคราะห์ NMR และโดยการเปรียบเทียบกับเอกสารก่อนหน้า13c

สารประกอบ 3 (ผลผลิต, 3.9 ± 0.2 มก./100 มก. ของเศษส่วน n-BuOH) ได้รับมาในรูปของผงสีเหลืองซีด 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97(2H, m), 1.88 (1H, m), 1.83 (1H, ม.). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 66.05,64.31, 48.57, 38.20) สารประกอบ 3 ถูกระบุเป็น4-กรดคาเฟโออิลควินิกโดยการวิเคราะห์ NMR และโดยการเปรียบเทียบกับเอกสารก่อนหน้า13a

รูปที่ 3 โครมาโตแกรมของ HPLC ของ (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc และ (D) เศษส่วนของ n-BuOH ของ L. thunbergianus และ (E) ของสารประกอบหลักสามชนิด

ศักยภาพในการยับยั้งของอนุพันธ์ Caffeoylquinic Acid ที่แยกได้จาก L. thunbergianus ต่อการเกิดเมลาโนเจเนซิส

ต่อไป เพื่อระบุส่วนผสมที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพซึ่งอยู่ภายใต้การต่อต้านการสร้างเม็ดสีที่มีศักยภาพ เราได้กำหนดกิจกรรมการยับยั้งของอนุพันธ์ของกรด caffeoylquinic สามชนิดที่แยกจาก L. thunbergianus ต่อการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง ขั้นแรก ศึกษาผลกระทบของอนุพันธ์ทั้งสามต่อการกำจัดหัวรุนแรงของ ABTS ผลการศึกษาพบว่าอนุพันธ์ทั้ง 3 ตัวมี ABTS radical scavengingactivity ที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 5A) จากนั้นเราได้ตรวจสอบผลกระทบของสารยับยั้งของอนุพันธ์สามชนิดที่แยกได้จากกิจกรรมของ L. thunbergianus ontyrosinase อนุพันธ์ทั้งสามแสดงการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสที่ขึ้นกับความเข้มข้นด้วยการยับยั้งสูงสุดที่ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ (รูปที่ 5B) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบผลการยับยั้งของอนุพันธ์สามชนิดต่อการสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก -MSH ใน B16F10cells การบำบัดด้วย -MSH ชักนำให้เพิ่มขึ้นประมาณ 2.{11}}เท่าของปริมาณเมลานินภายในเซลล์ของ B16F10cells (รูปที่ 5C) ที่น่าสนใจคือ สารประกอบ 1 (3-caffeoylquinicacid) และ 3 (4-caffeoylquinic acid) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการสังเคราะห์เมลานิน 25 และ 23 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (รูปที่ 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

รูปที่ 4 1H NMR สเปกตรัมของ (A) 3-กรดคาเฟอีนิก, (B) 4-กรดคาเฟอีนิกและ (C) 5-กรดคาเฟอีนควินิกและ 13C NMR สเปกตรัมของ (D) {{ 6}}กรด caffeoylquinic, (E) 4-กรด caffeoylquinic และ (F) 5-กรด caffeoylquinic

การตรวจสอบประสิทธิภาพการต่อต้านการสร้างเม็ดสีของ 5-กรดคาเฟอีนควินิก

เพื่อตรวจสอบผลการยับยั้งของ {{0}}กรด caffeoylquinic ต่อการสร้างเม็ดสี เราได้พิจารณาผลการยับยั้งของการสังเคราะห์5-กรด caffeoylquinic onmelanin ในเชิงพาณิชย์โดยอาศัย -MSH การบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ต่ำกว่าของ 0.1 และ 0.2 mM 5-caffeoylquinicacid ช่วยเพิ่มการสังเคราะห์เมลานินและกิจกรรมในเซลล์ของไทโรซิเนสในเซลล์เล็กน้อย ในขณะที่ความเข้มข้นที่สูงกว่า 0.5 และ 1 มม. ของสารประกอบกลับกัน -การสร้างเม็ดสีที่เป็นสื่อกลางของ MSH และกิจกรรมของไทโรซิเนสภายในเซลล์ (รูปที่ 6A, B) ซึ่งผลลัพธ์สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้14

กรด Caffeoylquinic เป็นสารประกอบฟีนอลิกที่เกิดขึ้นจากพันธะเอสเทอร์ระหว่างกรดคาเฟอีนกับกรด L-quinic อนุพันธ์ของกรด Caffeoylquinic เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่ามีฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีและต่อต้านไทโรซิเนส เช่นเดียวกับกิจกรรมการขจัด ROS ไทโรซิเนสเป็นเมทัลโลเอนไซม์ที่ประกอบด้วยทองแดงแบบมัลติฟังก์ชั่น โดยมีไอออนบวกของทองแดง divalent 1 อนุพันธ์ของกรด Caffeoylquinic อาจยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสโดยการคีเลตไอออนบวกของทองแดงที่ทำหน้าที่รักษาสถานะการทำงานของไทโรซิเนส ในการทำนายปฏิสัมพันธ์ระหว่าง 5-กรด caffeoylquinic และไทโรซิเนส ได้ทำการศึกษาการเทียบท่าด้วยคอมพิวเตอร์โดยใช้โปรแกรม Maestrogram ท่าที่ดีที่สุดสำหรับสารประกอบโทไทโรซิเนสที่เทียบท่านั้นแสดงไว้ในรูปที่ 6C, D การศึกษาการเทียบท่าระดับโมเลกุลเปิดเผยว่า 5-กรด caffeoylquinic ทำปฏิกิริยากับทองแดงที่ระยะ 2.43 Å และสร้างชุดของ π−πซ้อนกับ His 259, Asn 260, 85 ของเขา, และ 263 เรซิดิวของเขาและพันธะ H ที่มี Arg 268 นอกจากนี้ พลังงานการจับระหว่างไทโรซิเนสกับ 5-กรดคาเฟอีนควินิกคือ−4.425 kJ/โมล ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า 5-กรด caffeoylquinic สามารถยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสโดยการทำคีเลชั่นทองแดง ในการตรวจสอบกลไกการยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดย 5-caffeoylquinicacid เราได้พิจารณาความสามารถในการคีเลตของทองแดงของกรด caffeoylquinic 5- ความสามารถในการคีเลตทองแดงของ 5-กรด caffeoylquinic เพิ่มขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น (รูปที่ 6E) ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นว่า 5-caffeoylquinicacid ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินผ่านคีเลตไอออนของทองแดงที่ทำปฏิกิริยากับไทโรซิเนส

รูปที่ 5. ผลของอนุพันธ์ของกรด caffeoylquinic สามชนิดต่อการกำจัดอนุมูลอิสระ ฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสในหลอดทดลอง และฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

L. thunbergianus ถูกซื้อจากตลาดออนไลน์ www.jirisangol.com (เกาหลี) และทำให้แห้งภายใต้สภาวะแวดล้อมก่อนใช้ในการศึกษานี้ รีเอเจนต์ เช่น 2,2′- ซิงค์ บิส(3-เอทิล-เบนโซไทอะโซลีน-6-กรดซัลโฟนิก (ABTS) และ 3-(4,5-ไดเมทิลไทอะโซล-2- อิล)-2,5-ไดฟีนิลเตตราโซเลียม โบรไมด์(MTT), -ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH)และเอ็นไซม์ เช่น ไทโรซิเนสของเห็ด ได้รับมาจากซิกมา-อัลดริช (เซนต์หลุยส์, MO, สหรัฐอเมริกา) โพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต (K2S2O8) ไพโรคาเทชอลไวโอเลตและ 3,4-dihydroxy-L phenylalanine (L-DOPA) ซื้อมาจาก Alfa Aesar(Haverhill, MA, USA)

การสกัดและการแยกส่วนของ L. thunbergianus.

L. thunbergianus แห้ง (80 ก.) ถูกบดให้เป็นผงโดยใช้เครื่องบด (HBL-3500S, Samyang Electronics, เกาหลี) และสกัดด้วย EtOH 70 เปอร์เซ็นต์ สามครั้ง (800 มล. ในแต่ละครั้ง ) ที่ 70 องศา เป็นเวลา 3 วัน สารสกัดที่เป็นผลลัพธ์ถูกกรองด้วยสุญญากาศโดยใช้กระดาษ Advantecfilter 1 และ 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., โตเกียว, ญี่ปุ่น) และเข้มข้นโดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน Hei-Vap Advantage (ไฮดอล์ฟ เยอรมนี) เพื่อให้ได้สารสกัด EtOHcrude 17.2 กรัม สารสกัดที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ ถูกแขวนลอยใน dH2O (180 มล.) และแยกส่วนอย่างต่อเนื่องด้วย Hex, CH2Cl2, EtOAc และ n-BuOH เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เป็น Hex (1.51 ก., 8.8 เปอร์เซ็นต์ ), CH2Cl2 (0.88 ก., 5.1 เปอร์เซ็นต์ ), EtOAc (3.95 ก., 23.0 เปอร์เซ็นต์ ) และ n-BuOH (3.02 ก., 17.6 เปอร์เซ็นต์ ) ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้15 สารสกัดและเศษส่วนที่เป็นผลลัพธ์ถูกนำไปแช่เยือกแข็งและเก็บไว้ที่ −80 องศาก่อนใช้งาน

ความมุ่งมั่นของ ABTS Free Radical ScavengingActivity

ในการประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด L.thunbergianus และเศษส่วนของตัวทำละลาย ได้มีการกำหนดกิจกรรมการไล่อนุมูล ABTSradical ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 16 เพื่อสร้างอนุมูล ABTS 10 mL 7 mMABTS ผสมกับ 176 μL ที่ 140 mM โพแทสเซียมเปอร์ออกไซด์ไดซัลเฟตใน dH2O และฟักในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง (RT) เป็นเวลา 16 ชั่วโมงก่อนใช้ สารละลายเรดิคัลของ ABTS ถูกเจือจางด้วยเมทานอลสัมบูรณ์เพื่อให้ได้ความสามารถในการดูดซับที่ใกล้ 0.7 ที่ 734 นาโนเมตร อะลิควอตที่ 100 ไมโครลิตรของแต่ละสารสกัดหรือเศษส่วนในช่วงความเข้มข้นที่ระบุ 2−200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกเติมลงใน 100 ไมโครลิตรของสารละลายเรดิคัล ABTS ที่เจือจางและบ่มเป็นเวลา 10 นาทีในความมืดที่ RT จากนั้นจึงวัดการดูดซับที่ 732 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบมัลติโหมด SpectraMaxM5 (Molecular Devices,Sunnyvale, CA, USA) กิจกรรมการกวาดล้างของ ABTS คำนวณได้ดังนี้

กิจกรรมการกวาดล้างอย่างรุนแรงของ ABTS ( เปอร์เซ็นต์ ) =1−(ตัวอย่าง/Acontrol)×100 (1)

การยับยั้งไทโรซิเนสในหลอดทดลอง

ผลการยับยั้งของสารสกัด L.thunbergianus และเศษส่วนของตัวทำละลายต่อ tyrosinaseactivity ได้รับการประเมินโดยปริมาณของ dopachromesyntheized จากปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาของ tyrosinase.2a, 17 โดยย่อ, 50 μL ของแต่ละสารสกัดหรือเศษส่วนในช่วงความเข้มข้นที่ระบุถูกผสมกับ 50 μL ที่ 50 ไทโรซิเนส U/mLmushroom ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ (PBS; 8.1 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7 mMKCl และ 138 mM NaCl) ในจานหลุม 96- หลุมและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ RT จากนั้น 100 ไมโครลิตรของ 1 มิลลิโมลาร์ L-DOPA ถูกเติมลงแต่ละหลุมตามด้วยการฟักตัวเป็นเวลา 10 นาทีเพิ่มเติมที่ 37 องศา การดูดกลืนแสงของสารละลายที่เป็นผลลัพธ์ถูกวัดที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทรีดเดอร์แบบมัลติโหมด SpectraMax M5

การเพาะเลี้ยงเซลล์.

เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู B16F10 ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's ดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของเซรุ่มโคลีนในครรภ์ (Gibco), 100 หน่วย/มล. เพนิซิลลิน และ 100ug/mL streptomycin (Gibco) ที่ 37 องศา ภายใต้ความชื้น 5 เปอร์เซ็นต์ CO2

ความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ B16F10 ถูกกำหนดหาโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยสังเขป B16F10cells ถูกเพาะในจาน 24- หลุมที่ความหนาแน่น 1 × 104 เซลล์ต่อหลุม หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ระบุของสารสกัด L. thunbergianus หรือเศษส่วนเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ถูกบ่มด้วยสารละลาย MTT เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และผลึกฟอร์มาซานที่รีดิวซ์ถูกละลายใน DMSO สารละลายที่ได้ถูกถ่ายโอนไปยังเพลต 96-หลุม และวัดการดูดซับที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax M5multimode

การหาปริมาณออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาภายในเซลล์ (ROS)

วัดระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ชุดทดสอบ ROS แบบเซลลูลาร์ DCF/H2DCFDA (ab113851,Abcam) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยย่อ เซลล์ B16F10 ถูกเพาะในจาน 48-หลุมที่ความหนาแน่น 2 ×104 เซลล์ต่อหลุม หลังจากการเพาะเลี้ยง 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยความเข้มข้นที่ระบุของ L. thunbergianus extractsor ตัวทำละลายที่เป็นเศษส่วนใน 0.1 เปอร์เซ็นต์ของ bovine serum albumin (BSA) ที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีฟีนอลแดง จากนั้นเซลล์ถูกบ่มด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 100 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 30 นาที หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกบำบัดด้วย 25 ไมโครโมลาร์ใน PBS เป็นเวลา 45 นาที ระดับ ROS ถูกวิเคราะห์โดยเครื่องอ่านไมโครเพลท (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) ที่ติดตั้งฟิลเตอร์เรืองแสงที่ 485/545 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นของการกระตุ้น/การปล่อยรังสี) ความเข้มของการเรืองแสงสัมพัทธ์เฉลี่ยของกลุ่มควบคุมเท่ากับ 100 เปอร์เซ็นต์ โดยมีเงื่อนไขการรักษาคำนวณตามสัดส่วน

การกำหนดปริมาณเมลานิน

เนื้อหาเมลานินถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงบางอย่าง 19 เซลล์มะเร็งผิวหนังถูกเพาะเลี้ยงในจานหกหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง พวกเขาได้รับการรักษาด้วยความเข้มข้นที่ระบุของสารสกัด L. thunbergianus หรือการแยกส่วนของตัวทำละลายเป็นเวลา 48 ชั่วโมงต่อหน้า 100 nM -MSH หลังจากล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตของ Dulbecco แช่เย็นเสริมด้วยแคลเซียมคลอไรด์และแมกนีเซียมคลอไรด์ (D-PBS, Gibco) เซลล์ที่เป็นผลลัพธ์ถูกแยกออกโดยการฟักไข่ด้วยสารละลายทริปซิน−EDTA หลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 1000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3 นาที เม็ดเซลล์ถูกละลายใน 150 ไมโครลิตรของ 1 โมลาร์ NaOH ที่มี DMSO 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 60 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปริมาณเมลานินถูกกำหนดโดยค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท

สารสกัดจาก Cistanche ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานิน

การหาค่ากิจกรรมของเซลล์ไทโรซิเนสในเซลล์มะเร็งผิวหนัง

กิจกรรมของไทโรซิเนสในเซลล์ B16F10 คือตรวจสอบโดยพิจารณาจากปริมาณของโดปาโครมที่เกิดจากปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาของไทโรซิเนสภายในเซลล์ 20 โดยสรุป เซลล์มะเร็งผิวหนังได้รับการเพาะเลี้ยงในจานหกหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงตามด้วยการบำบัดด้วยสารสกัด L.thunbergianus หรือตัวทำละลายที่มีความเข้มข้นต่างกัน เศษส่วนอีก 48 ฮิน การปรากฏตัวของ 100 นาโนโมลาร์ -MSH หลังจากล้างสองครั้งด้วย D-PBS ที่เย็นจัด เซลล์ถูกสลายใน 200 ไมโครลิตรของการทดสอบด้วยกัมมันตภาพรังสีภูมิคุ้มกัน (RIPA) บัฟเฟอร์ (Sigma-Aldrich) ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตส ภายหลังการหมุนเหวี่ยงของเซลล์ไลเซตที่รวบรวมจากแต่ละหลุมที่ 15,000ก. เป็นเวลา 15 นาที, 100 ไมโครลิตรของส่วนลอยเหนือตะกอนถูกผสมกับ 100 ไมโครลิตรของ 1 มิลลิโมลาร์ L-DOPA ใน PBS (pH 6.8) ตามด้วยการบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 องศา . วัดค่าการดูดกลืนแสงของโดปาโครมที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทรีดเดอร์ ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยความเข้มข้นของโปรตีนที่กำหนดโดยการสอบวิเคราะห์กรดบิซินโชนินิก

การแยกตัวและการแสดงคุณลักษณะของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพโดยใช้ HPLC

HPLC ถูกดำเนินการบน YL{{0}}(Young Lin Instrument, Korea) ที่มีคอลัมน์ TC-C18 (4.6 มม., 250 มม. และ 5 μm, Agilent, USA), inconjunction ด้วยระบบเกรเดียนต์ที่ประกอบด้วยตัวทำละลาย A(0.2 เปอร์เซ็นต์ของกรดฟอร์มิก) และตัวทำละลาย B (MeOH) อัตราส่วนตัวทำละลายความชันถูกกำหนดเป็น 0−5 นาที, 15 เปอร์เซ็นต์ B; 5-10 นาที 15−20 เปอร์เซ็นต์ B; 10–15 นาที 20–30 เปอร์เซ็นต์ B; 15−30 นาที, 30−40 เปอร์เซ็นต์ B; 30−37 นาที, 40−60 เปอร์เซ็นต์ B; 37−40 นาที, 60−100 เปอร์เซ็นต์ B; 40−45 นาที 100 เปอร์เซ็นต์ B; 45-50 นาที 100-15 เปอร์เซ็นต์ B; และ 50−55 นาที, 15 เปอร์เซ็นต์ B. เพื่อระบุส่วนผสมในเศษส่วนของตัวทำละลาย เฟสเคลื่อนที่ถูกนำส่งที่อัตราการไหล 1 มล./นาที และการตรวจจับการชะถูกดำเนินการที่ 330 นาโนเมตร ในการรวบรวมเศษส่วนของตัวทำละลายที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ เฟสเคลื่อนที่ถูกนำส่งที่อัตราการไหล 15.0 มล./นาที และการตรวจจับการชะถูกดำเนินการที่330 นาโนเมตร โดยใช้ prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea ) ติดตั้งคอลัมน์ prep-C18 (4.6 มม., 212 มม.,10 ไมโครเมตร, Agilent, USA) ร่วมกับระบบเกรเดียนต์ซึ่งประกอบด้วยตัวทำละลาย A (กรดฟอร์มิก 0.2 เปอร์เซ็นต์) และตัวทำละลาย B(MeOH) อัตราส่วนตัวทำละลายความชันถูกกำหนดเป็น 0-10 นาที, 10 เปอร์เซ็นต์ B; 10-20 นาที, 10-15 เปอร์เซ็นต์ B; 20-40 นาที, 15 เปอร์เซ็นต์ B; 40−60 นาที, 15–20 เปอร์เซ็นต์ B; และ 60−70 นาที, 30 เปอร์เซ็นต์ B.

การสร้างแบบจำลองโมเลกุล

โครงสร้างผลึกของเห็ดไทโรซิเนสสำหรับการสร้างแบบจำลองโมเลกุลคือ Agaricustyrosinase (PDB ทำ: 2Y9X) ที่ได้จากโปรตีน DataBank (PDB) เอนไซม์นี้จัดทำขึ้นโดยใช้เวิร์กโฟลว์การเตรียมโปรตีนวิซาร์ดที่ฝังอยู่ในโปรแกรมมาสโทร (Maestro เวอร์ชัน 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019) น้ำและโมเลกุลอื่น ๆ ทั้งหมดที่มีอยู่ในไฟล์ PDB ถูกลบออก การเทียบท่าระดับโมเลกุลดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลการเทียบท่าพอดี (IFD) ที่เหนี่ยวนำ (โปรโตคอล Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking) ตามที่ได้รายงานไว้21

ความสามารถในการคีเลตทองแดง

ความสามารถในการคีเลตทองแดงของสารประกอบที่แยกได้จาก L. thunbergianus ถูกกำหนดตามรายงานก่อนหน้านี้ 22 อนุพันธ์ของกรดคาเฟอีนควินิก (10 ไมโครลิตร) ในความเข้มข้นที่ระบุถูกผสมกับโซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ 50 มิลลิโมลาร์ (pH 6.0) 280 ไมโครลิตร 6 ไมโครลิตรของสารละลายไพโรคาเทคอลไวโอเลต 4 มิลลิโมลาร์ที่เตรียมในบัฟเฟอร์เดียวกัน และ 10 ไมโครลิตรของ 1 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร CuSO4·5H2O การหายไปของสีน้ำเงินนั้นสังเกตได้จากการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 632 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบมัลติโหมด SpectraMax M5 น้ำถูกใช้เป็นตัวควบคุมแทนตัวอย่าง เปอร์เซ็นต์การออกฤทธิ์ของคีเลตทองแดงคำนวณจากการดูดกลืนแสงที่632 นาโนเมตร ซึ่งเป็นดังนี้

ความสามารถในการคีเลตทองแดง ( เปอร์เซ็นต์ )=1− (ตัวอย่าง/การควบคุม)×100 (2)

การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลทั้งหมดในการศึกษานี้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) จากการทดลองอิสระสามครั้ง ทำการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้ GraphPad Prism 80 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) ความแตกต่างระหว่างค่าเฉลี่ยของกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่สัมผัสถูกวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยโพสต์ฮอคเทสของดันเนตต์ เกณฑ์สำหรับนัยสำคัญทางสถิติสำหรับการวิเคราะห์ทั้งหมดคือ p < 0.05="">

บทสรุป

ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่า L. thunbergianus สกัดสารอนุมูล ABTS และแสดงฤทธิ์ยับยั้งการสังเคราะห์ทางเมลานินของเมลานินที่มีฤทธิ์ยับยั้งได้โดยไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ สารออกฤทธิ์ออกฤทธิ์ในสมองที่มีอยู่ใน L. thunbergianus และยับยั้งการสร้างเม็ดสีถูกแยกออกได้ในส่วน n-BuOH นอกจากนี้ เราพบว่าอนุพันธ์ของกรดคาเฟอีนควินิกสามชนิดเป็นสารประกอบหลักที่มีอยู่ในเศษส่วน n-BuOH และกรด 5-กรดคาเฟอีนควินิกเป็นส่วนประกอบสำคัญสำหรับ ยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนมาโดยการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสในเซลล์ ในที่นี้ เราแยกสารยับยั้งสารก่อมะเร็ง 5-กรด caffeoylquinic ออกจากสารสกัด L.thunbergianus เพื่อป้องกันการสร้างเม็ดสีมากเกินไป และเผยให้เห็นกลไกการยับยั้งที่รองรับการสร้างเม็ดสี ดังนั้น การค้นพบของเราแนะนำว่า 5-กรด caffeoylquinic และส่วน n-BuOH ที่แยกได้จาก L. thunbergianus อาจมีประโยชน์ในเครื่องสำอางในฐานะตัวแทนในการฟอกสีผิว

cistanche ชิ้น