เบต้ากลูแคนช่วยเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อวัคซีนโรคนิวคาสเซิลและเปลี่ยนการแสดงออกของ MRNA ของม้ามในไก่

เชิงนามธรรม

การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลของการให้บี-กลูแคน (G70) ทางปาก ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่ได้จากผนังเซลล์ของยีสต์ ต่อไทเทอร์ยับยั้งการสร้างเม็ดเลือดแดงชนิดจำเพาะ (HI) ของไวรัสโรคนิวคาสเซิล (NDV) การแพร่กระจายของเม็ดเลือดขาว และ บทบาทของประชากรย่อยของ T lymphocyte ในไก่ที่ได้รับวัคซีน NDV ที่มีชีวิต นอกจากนี้ อิทธิพลของบี-กลูแคนต่อการแสดงออกของยีนม้ามถูกตรวจสอบโดยการจัดลำดับการถอดเสียง ผลการวิจัยพบว่าการเสริมบี-กลูแคนช่วยเพิ่มไทเตอร์ของซีรั่ม NDV HI เพิ่มดัชนีการกระตุ้น NDV ของลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลายและทางเดินลำไส้ และส่งเสริมการแยกความแตกต่างของทีลิมโฟไซต์ไปเป็นเซลล์ CD4+ ที การวิเคราะห์ลำดับ RNA (RNA-seq) แสดงให้เห็นว่า G70 ควบคุมการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ G-โปรตีนควบคู่กับรีเซพเตอร์และโพลีเปปไทด์คลาส I ของ MHC และลดระดับการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับคาเทลิซิดินและเบตาเดเฟนซิน ฤทธิ์ปรับภูมิคุ้มกันของ G70 อาจทำงานผ่านวิถีการส่งสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจน โดยสรุป G70 สามารถเพิ่มประสิทธิภาพภูมิคุ้มกันของวัคซีน NDV ที่มีชีวิตในไก่ และสามารถนำไปใช้เป็นตัวเลือกเสริมที่มีศักยภาพในอุตสาหกรรมสัตว์ปีก

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ: วัคซีนโรคนิวคาสเซิล เบต้ากลูแคน สารเสริม ไก่กระดูกดำ อาร์เอ็นเอซีคิว

การแนะนำ

โพลีแซ็กคาไรด์ผนังเซลล์ของยีสต์ถูกแข็งตัวโดยตรงจากผนังเซลล์ของ Saccharomyces cerevisiae และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะโปรโมเตอร์การเจริญเติบโต สารต้านจุลชีพ หรือสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันในสัตว์ปีกเพื่อปรับปรุงการผลิตและสุขภาพ (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021) ก่อนหน้านี้ ผลิตภัณฑ์ชื่อ PW220 ซึ่งมีโพลีแซ็กคาไรด์ที่ผนังเซลล์ยีสต์ ได้รับการสาธิตเพื่อเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากไวรัสโรคนิวคาสเซิล (NDV) และเพื่อเปลี่ยนแปลงชุมชนจุลินทรีย์ในลำไส้ใหญ่ส่วนต้นของไก่โดยการบริหารช่องปาก (Bi et al., 2020 ). ผนังเซลล์ยีสต์โพลีแซ็กคาไรด์ส่วนใหญ่ประกอบด้วยบี-กลูแคนและแมนแนน-โอลิโกแซ็กคาไรด์ (Wang et al., 2018) ในการศึกษาครั้งนี้ ได้มีการศึกษาผลของบี-กลูแคนต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อวัคซีน NDV ในไก่ ม้ามเป็นอวัยวะสำคัญในการเริ่มต้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน การศึกษาล่าสุดระบุว่า PW220 ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ผนังเซลล์ของยีสต์ ควบคุมการแสดงออกของ mRNA ของ TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 และ T-bet ในม้ามของไก่ ( บิ และคณะ, 2022) อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการอธิบายกลไกเฉพาะให้ชัดเจน การจัดลำดับ RNA (RNA-seq) เป็นหนึ่งในเทคโนโลยีปริมาณงานสูงที่สามารถนำไปใช้กับการทดสอบการแสดงออกของยีนเชิงปริมาณและให้การวิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกันในระดับของการถอดเสียงทั้งหมด (Zhao et al., 2018) ด้วยข้อดีของความไวสูงและต้นทุนต่ำ RNA-seq จึงถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการศึกษาปศุสัตว์และสัตว์ปีก (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020) ดังนั้นในการศึกษานี้ จึงมีการประเมินผลของการให้บี-กลูแคนต่อไทเทอร์การยับยั้งการสร้างเม็ดเลือดแดงที่จำเพาะต่อ NDV (HI) การแพร่กระจายของเซลล์เม็ดเลือดขาว และจำนวนประชากรย่อยของที-ลิมโฟไซต์ในไก่ที่ได้รับการฉีดวัคซีน NDV ทางปาก นอกจากนี้ การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมยังใช้เพื่อประเมินผลของบี-กลูแคนต่อการแสดงออกของยีนและวิถีการถ่ายทอดสัญญาณในม้ามของไก่

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

สัตว์

ไก่กระดูกดำเชิงพาณิชย์อายุหนึ่งวัน (ตัวผู้) ได้มาจาก Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (อันชุน ประเทศจีน) ไก่ถูกแบ่งออกเป็นกรงลวดเพื่อให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี ในช่วง 7 วันแรก อุณหภูมิห้องจะคงที่อยู่ที่ 33 องศา C ถึง 35 องศา Can จากนั้นค่อยๆ ลดลง 1 องศา C ทุกๆ 2 วัน จนถึง 27 องศา C ไก่ทั้งหมดได้รับการประมวลผลตามมาตรฐานที่กำหนดโดย Southwest University Animal Care และ ใช้คณะกรรมการ (หมายเลขใบรับรองจริยธรรม: IAC-2021-0057) นกทดลองทั้งหมดถูกการุณยฆาตด้วย CO2 เมื่อสิ้นสุดการศึกษา

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

วัคซีน

วัคซีนเชื้อเป็นของ NDV (Strain La Sota) จัดทำโดย Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (ชิงเต่า จีน)

รีเอเจนต์ 

ผลิตภัณฑ์ผนังเซลล์ยีสต์ (YP) G70 ได้มาจากผนังเซลล์ยีสต์ (Saccharomyces cerevisiae) ซึ่งมีบีกลูแคน (มากกว่าหรือเท่ากับ 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, China) ทั้งแอนติเจนและซีรั่มควบคุมเชิงบวกสำหรับการวัดไทเตอร์ HI เฉพาะ NDV ถูกซื้อจากศูนย์พัฒนาการวินิจฉัย Regen ชิงเต่า (ชิงเต่า จีน) ซีดีต่อต้านไก่3-APC (C2818-T9580), ซีดี4-FITC (D0117-WA78E) และซีดี8- PE (L{{14 }}TH49T) ในหนูถูกนำเสนอโดย Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (หนานจิง, จีน)

การออกแบบการทดลอง

ไก่กระดูกดำสี่สิบแปดตัวเมื่ออายุ 5 วัน ได้รับการสุ่มแบ่งออกเป็น 3 กลุ่ม (ตารางที่ 1) และได้รับอาหารพื้นฐาน (ตารางที่ 2) หรืออาหารพื้นฐานที่มี 0.1% G7{{10} } (บี-กลูแคน 0.7 ก./กก.) ตลอดระยะเวลาการวิจัยปัจจุบัน วัคซีนกลุ่ม H (G70 +) และ C (วัคซีน) ได้รับการฉีดวัคซีน NDV ทางปากในวันที่ 14 และ 28 วันตามลำดับ กลุ่ม S (Sailne) ได้รับการบำบัดด้วยน้ำเกลือในปริมาณเท่ากัน เก็บตัวอย่างเลือดโดยการเจาะเลือดที่ปีกเมื่ออายุ 5, 7, 14, 21, 28, 35 และ 42 วัน เพื่อทดสอบค่า HI titer เจ็ดวันหลังการฉีดวัคซีนกระตุ้น ไก่ 8 ตัวในแต่ละคอลัมน์จะถูกสุ่มเลือกและเสียสละโดยภาวะขาดอากาศหายใจโดยใช้คาร์บอนไดออกไซด์ ลิมโฟไซต์ถูกแยกออกจากทั้งเลือดส่วนปลายและลำไส้เล็กส่วนต้นเพื่อดำเนินการเพิ่มจำนวนลิมโฟไซต์และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี ในกรณีของการสุ่มตัวอย่างลำไส้เล็กส่วนต้น เอ็นยึดดูโอดีนัลเป็นจุดเริ่มต้นของลำไส้เล็กส่วนต้น และเก็บส่วนที่ยาว 5 ซม. จากจุดเริ่มต้นของลำไส้เล็กส่วนต้น ม้ามถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลวและจากนั้นเก็บไว้ที่ระดับ -80 สำหรับ RT-qPCR และการทำโปรไฟล์ลำดับ

ตารางที่ 1 การออกแบบการทดลอง

ตารางที่ 2. 1 องค์ประกอบและปริมาณสารอาหารของอาหารพื้นฐานสำหรับไก่เนื้อทดลอง

สวัสดีการศึกษา

การทดสอบไทเตอร์ HI เฉพาะ NDV ในซีรั่มดำเนินการตามคำอธิบายก่อนหน้า (Ball et al., 2019) โดยสรุป ซีรั่มถูกเจือจางด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) จาก 1:2 ถึง 1:1,024 ในเพลตไมโครไทเทอร์ของหลุม 96- ที่อยู่ด้านล่างรูป V จากนั้น เติมการเจือจาง NDV 25 มล. ต่อหลุมและบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 30 นาที หลังจากนั้น สารแขวนลอยของเม็ดเลือดแดงไก่ 25 มล. 1% ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการทดสอบสองครั้งและมีการควบคุมทั้งเชิงบวกและเชิงลบรวมอยู่ในแต่ละจาน ไทเตอร์ของ HI ขึ้นอยู่กับการเจือจางมากที่สุดซึ่งส่งผลให้เกิดการยับยั้งการเกิดเม็ดเลือดแดงแตกอย่างสมบูรณ์ วัดไทเทอร์ HI เฉลี่ยและข้อผิดพลาดมาตรฐาน (SE) ต่อกลุ่ม

การแยกลิมโฟไซต์ออกจากเลือดส่วนปลาย

ลิมโฟไซต์ถูกแยกและรวบรวมจากลิมโฟไซต์ในเลือดโดยใช้ชุดอุปกรณ์แยกลิมโฟไซต์ (Tianjin Haoyang Biological Manufacturing Co. Ltd., เทียนจิน, จีน) จากนั้น ลิมโฟไซต์ถูกเก็บไว้ในสารแขวนลอยด้วยตัวกลาง RPMI 1640 (โซลาร์ไบโอ, ปักกิ่ง, จีน) ซึ่งรวมถึงซีรั่มของทารกในครรภ์ 5% และ HEPES 25 มิลลิโมลาร์ (pH 7.0)

การแยกลิมโฟไซต์จากเจจูนัม

กระบวนการมอบหมายดำเนินการตามคำอธิบายก่อนหน้า และมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (Yuan et al., 2020) กล่าวโดยสรุป ให้ใช้ตัวกรองเซลล์ขนาด 70 มม. เพื่อแยกลำไส้ออกเป็น PBS เย็น 4 มล. หลังจากนั้น สารแขวนลอยของเซลล์ตัวอย่างถูกปั่นแยกที่ 4,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 12 นาทีโดยนำส่วนลอยเหนือตะกอนออก จากนั้น แขวนเซลล์ลำไส้ใหม่บนอาหารเลี้ยงเชื้อเต็มรูปแบบ (Solarbio Co., ปักกิ่ง, จีน) ที่ประกอบด้วย 5% ของซีรั่มของวัวในครรภ์ (FBS) ใน RPMI 1640 (Sijiqing Co., หางโจว, จีน) ในท้ายที่สุด ชุดแยกลิมโฟไซต์ไก่ (Tianjin Haoyang Biological Manufacturing Co. Ltd.) เพื่อแยกลิมโฟไซต์ เนื้อเยื่อลำไส้ถูกแบ่งออกเป็น PBS เย็น 4 มิลลิลิตรโดยใช้ตัวกรองเซลล์ 70 มิลลิเมตร ต่อไป สารแขวนลอยของเซลล์ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 12 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งไป หลังจากนั้น เซลล์ในลำไส้จะถูกแขวนลอยอีกครั้งใน RPMI 1640 (Solarbio Co.) ที่มี 5% FBS (Sijiqing Co.) ในที่สุด ลิมโฟไซต์ถูกแยกออกโดยใช้ชุดแยกลิมโฟไซต์ไก่ (Tianjin Haoyang Biological Manufacturing Co. Ltd.)

การแพร่กระจายของเม็ดเลือดขาว 

เซลล์ถูกเพาะในเพลตหลุม 96- (5 ปอนด์ 105 ปอนด์ต่อหลุม) กระตุ้นโดยแอนติเจนของ NDV ที่ไม่ทำงานสำหรับฮีแม็กกลูติเนชัน 4 หน่วยหรือน้ำเกลือในปริมาณที่เท่ากัน แต่ละตัวอย่างได้รับการทดสอบใน 3 ซ้ำ เซลล์และแอนติเจนถูกบ่มเป็นเวลา 44 ชั่วโมงที่ 37 องศาใน 5% CO2 และจากนั้น 50 มิลลิลิตร เมทิล ไทอะโซลิล เตตราโซเลียม (MTT) (2 มก./มล.) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มต่อไปอีก 4 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกปั่นแยกที่ 1,200 ปอนด์ กรัม เป็นเวลา 8 นาทีที่อุณหภูมิภายในอาคาร หลังจากนั้น ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเอาออกอย่างระมัดระวังและ DMSO 100 มิลลิลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกเขย่าเป็นเวลา 8 นาทีเพื่อทำให้ผลึกละลายได้เต็มที่ สุดท้าย ความหนาแน่นของแสงเฉลี่ย (OD) ถูกบันทึกที่ 570 นาโนเมตร ได้ดัชนีการกระตุ้น (SI) โดยใช้สมการ: ค่า OD ของหลุมกระตุ้น/ค่า OD ของหลุมที่ไม่ถูกกระตุ้น (Cui et al., 2020)

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของประชากรย่อยของที-ลิมโฟไซต์

สารแขวนลอยของเซลล์น้ำเหลืองถูกแยกออกและล้างสองครั้งด้วย PBS ความเข้มข้นของเซลล์ถูกดัดแปลงเป็น 106 /มิลลิลิตร และจากนั้นจึงเก็บไว้บนน้ำแข็ง แต่ละตัวอย่างถูกย้อมด้วย CD3-APC, CD4- FITC ของหนูป้องกันไก่หนู 2 มล. และ CD ป้องกันไก่ของหนู8- PE ภายใต้สภาวะกันแสงเป็นเวลา 30 นาที ตามด้วย โดยการล้าง 2 ครั้งด้วย PBS เซลล์ได้รับการตรวจสอบผ่านการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีบนโฟลไซโตมิเตอร์ (BD Bioscience, San Jose, CA)

การวิเคราะห์ RT-qPCR

RNA ทั้งหมดได้มาจากม้ามโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Takara, Shiga, Japan) ตามหลักเกณฑ์ของผู้ผลิต จากนั้นแปลงเป็น cDNA โดยใช้ PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, China) บนเครื่องหมุนเวียนความร้อน T100 (Bio-Rad, เฮอร์คิวลีส แคลิฟอร์เนีย) ใช้เบต้าแอคตินไก่เป็นยีนควบคุมภายใน RT-qPCR ของยีนที่เลือกดำเนินการบนระบบ PCR แบบเรียลไทม์หลายระบบ (AB, Carlsbad, CA) ด้วย SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara) ดำเนินการวิธีเชิงปริมาณสัมพัทธ์ (244CT) เพื่อประเมินความแปรผันเชิงปริมาณ (Bi et al., 2022) ลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางที่ 3

การสกัดอาร์เอ็นเอ

ตัวอย่างม้าม 3 ตัวอย่างจากกลุ่ม H (G70 +วัคซีน) และกลุ่ม C (วัคซีน) ถูกใช้สำหรับ RNA-seq ด้วยรีเอเจนต์ TRIzol (Takara) หลังจากนั้น RNA ได้รับการทดสอบการปนเปื้อนและการย่อยสลายด้วยเจลอะกาโรส 1% และวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ของ RNA โดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA) ความเข้มข้นของ RNA ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบ Qubit RNA ใน Qubit 20 ฟลูออโรมิเตอร์ (Life Technologies, Carlsbad, CA) ความสมบูรณ์ของ RNA ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบ RNA Nano 6000 ของระบบ Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า RNA นั้นสมบูรณ์และไม่มีการปนเปื้อนของ DNA

การวิเคราะห์ถอดเสียง

การจัดลำดับการถอดเสียง การประกอบลำดับ และการวิเคราะห์ข้อมูลจัดทำโดย Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (ปักกิ่ง, จีน) ขั้นตอนหลักสำหรับการถอดเสียงมีการระบุไว้ดังต่อไปนี้: 1) การทำให้บริสุทธิ์ของ mRNA จาก RNA ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เม็ดแม่เหล็กที่ติดกับโพลี-T โอลิโก การแยกส่วนถูกดำเนินการด้วยไดเวเลนต์แคตไอออนในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาการสังเคราะห์เกลียวเส้นที่หนึ่งของ NEB Next First (5X) ที่อุณหภูมิสูง 2) cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์ตามขนาดโดยใช้ไพรเมอร์เฮกซาเมอร์แบบสุ่มและ Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) แบบย้อนกลับ จากนั้นการสังเคราะห์ cDNA สายที่สองถูกสังเคราะห์โดยใช้ DNA Polymerase I และ RNase H 3) ส่วนยื่นที่เหลือถูกเปลี่ยนให้เป็นปลายทู่ผ่านกิจกรรมของเอ็กโซนิวคลีเอส/โพลีเมอเรส จากนั้นจึงผูกโครงสร้างแฮร์พินลูป NEB Next Adapter เพื่อเตรียมสำหรับการผสมพันธุ์หลังจากการอะดีนิเลชันของส่วนปลาย 3 ฟุตของชิ้นส่วน DNA 4) ได้รับชิ้นส่วน cDNA ประมาณ 250 ถึง 300 bp และห้องสมุดได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ระบบ AMPure XP ของ Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA) จากนั้นใส่เอนไซม์ NEBU SER 3 มล. (เทอร์โมฟิชเชอร์, ฮิลส์โบโร, OR) กับ cDNA ที่ถูกยึดด้วยอะแด็ปเตอร์ที่เลือกขนาดที่ 37 องศา C เป็นเวลา 15 นาที และตามด้วย 5 นาทีที่ 95 องศา การขยาย PCR ดำเนินการด้วย Phusion High-Fidelity DNA polymerase ในท้ายที่สุด ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ (ระบบ AMPure XP) และประเมินคุณภาพของห้องสมุดโดยใช้ระบบ Agilent Bioanalyzer 2100 การจัดกลุ่มตัวอย่างที่เข้ารหัสดัชนีดำเนินการบน TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA) จากนั้น ดำเนินการจัดลำดับบนแพลตฟอร์ม Illumina Novaseq และสร้างการอ่านแบบปลายคู่ 150 bp ไฟล์อ้างอิงจีโนมและคำอธิบายประกอบแบบจำลองยีนถูกดาวน์โหลดจากเว็บไซต์จีโนม (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ และ ftp://ftp ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/) ดัชนีของจีโนมอ้างอิงถูกสร้างขึ้นโดยใช้ HISAT2 (v2.0.5) และการอ่านแบบคลีนคู่จบถูกจัดแนวให้สอดคล้องกับจีโนมอ้างอิง จำนวนการอ่านที่แมปกับแต่ละยีนและแฟรกเมนต์ต่อกิโลเบสต่อล้าน (FPKM) สำหรับแต่ละยีนตามความยาวของยีนและจำนวนการอ่านที่แมปกับยีนได้รับการคำนวณโดยใช้จำนวนคุณลักษณะ v1.5{{38} }หน้า3 การแสดงออกที่แตกต่างระหว่างวัคซีนกลุ่ม H (G70 +) และกลุ่ม C (วัคซีน) ได้รับมาโดยใช้แพ็คเกจ DESeq2 R (1.16.1) ยีนที่มี P <0.05 และ |log2 (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ)| > 1 ถูกกำหนดให้เป็นยีนการแสดงออกที่แตกต่างกัน (DEG)

ตารางที่ 3. ลำดับของไพรเมอร์สำหรับ RT-qPCR

การตรวจสอบ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ 

DEG ที่ควบคุมขึ้นสองอันและ DEG ที่ควบคุมลง 4 อันในการเปรียบเทียบวัคซีนกลุ่ม H ( G 70 +) กับกลุ่ม C (วัคซีน) ได้รับเลือกเพื่อยืนยันผลการจัดลำดับการถอดเสียงโดย RT-qPCR RNA ถูกแปลงเป็น cDNA โดยใช้ PrimeScript RT Master Mix (Takara) บนเครื่องหมุนเวียนความร้อน T100 (Bio-Rad) ลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางที่ 3 ไก่ b-actin ถูกใช้เป็นยีนควบคุมภายใน RT-qPCR ของยีนที่เลือกดำเนินการบนระบบ PCR แบบเรียลไทม์หลายระบบ (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ด้วย SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara) ใช้วิธีการเชิงปริมาณสัมพัทธ์ (244CT) ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความแปรผันในปริมาณ ตัวอย่างทั้งหมดถูกดำเนินการเป็นสามเท่าเพื่อการวิเคราะห์

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวกับการทดสอบหลังการทดสอบของ Duncan ใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการระหว่างกลุ่มโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE ค่า P < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

ผลลัพธ์ ผลของบี-กลูแคนต่อระดับไทเตอร์ของแอนติบอดีในซีรั่ม

ดังที่แสดงในรูปที่ 1 ค่าไตเตอร์ของ HI เฉพาะ NDV ลดลงในทุกกลุ่มก่อนการฉีดวัคซีนและเพิ่มขึ้นในกลุ่ม H (G70+วัคซีน) และ C (วัคซีน) หลังการฉีดวัคซีน สิ่งที่น่าสนใจคือ การสังเกตระดับไทเตอร์ของ HI ที่สูงขึ้นในกลุ่ม H (G70+วัคซีน) ที่ 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0.05) และ 42 (P > 0.05) d ที่มีอายุมากกว่าในกลุ่ม C (วัคซีน)

ผลของบี-กลูแคนต่อการแพร่กระจายของเม็ดเลือดขาว

ผลของ G70 ต่อการแพร่กระจายของลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลายถูกแสดงไว้ในรูปที่ 2A SI ในลิมโฟไซต์ในเลือดได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นในนกที่เสริมด้วยวัคซีน G70 (G70 +) ที่ 7 วัน (P < 0.05) ภูมิคุ้มกันแบบบูสเตอร์ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มวัคซีน นอกจากนี้ SI ในเซลล์เม็ดเลือดขาว jejunal เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 7 วัน (P <0.05) การสร้างภูมิคุ้มกันหลังการกระตุ้นเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มวัคซีน (รูปที่ 2B)

ผลของบี-กลูแคนต่ออัตราส่วนของ CD4 + / CD8 + ทีเซลล์ในเลือดส่วนปลาย 

รูปที่ 3A และ 3B บ่งชี้การเข้าออกของลิมโฟไซต์และเซลล์ CD3 + และรูปที่ 3C ต่อ 3E แสดงอัตราส่วนของทีเซลล์ CD4 + /CD8 + ใน G70 วัคซีนและกลุ่มน้ำเกลือตามลำดับ ดังที่แสดงในรูปที่ 3F ไม่มีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างกลุ่มวัคซีนและกลุ่มน้ำเกลือหลังการฉีดวัคซีนกระตุ้น (P > 0.05) ในขณะที่สัดส่วนของ CD4 + /CD{{12} } ทีเซลล์ในกลุ่ม G70 (G{14}} วัคซีน) สูงกว่ากลุ่มวัคซีน (P < 0.05) อย่างเห็นได้ชัด

รูปที่ 1 ผลของการให้บี-กลูแคนในช่องปากต่อระดับไทเทอร์แอนติบอดีในซีรั่มต่อวัคซีน NDV ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้อง

ดังที่แสดงในรูปที่ 4 การแสดงออก mRNA ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) และ TLR5 (P < 0.05) ถูกตรวจพบในม้ามของไก่ที่รักษาด้วยวัคซีน G70 (G70 +) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มวัคซีน ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกของ mRNA ของ IFN-g (P > 0.05), TLR4 (P > 0.05) และ TLR3 (P > 0.05) ในม้ามระหว่างวัคซีน G70 (G70 +) และวัคซีน กลุ่ม

การวิเคราะห์ข้อมูลลำดับ RNA 

การจัดลำดับ RNA จากห้องสมุดม้าม 8 แห่งให้ผลลัพธ์ข้อมูลดิบ 24.1 G ดังที่แสดงในตาราง S1 ของวัสดุเสริม CN หมายถึงวัคซีนกลุ่ม และ HN หมายถึงวัคซีนกลุ่ม G70 + ห้องสมุด C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 และ H4 ตามลำดับ ประกอบด้วย 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 45,899,262, 45,841,884, และ 45,504,43 อ่านต้นฉบับ 8 รายการ หลังจากตรวจสอบ aptamer ลำดับที่ไม่ชัดเจนและลำดับคุณภาพต่ำจะถูกลบออก เหลือ 44,050,198, 45,449,884, 44,261,112, 52,097,846, 45,542,404, 44,566,290, 44,113,172 และ 44,026,960 อ่านสะอาด การอ่านทั้งหมดมากกว่า 96% อยู่ในการอ่านต้นฉบับ และห้องสมุด 8 แห่งได้รับการจับคู่โดยใช้ HISAT2 เพื่อจัดลำดับการอ่านกับฐานข้อมูลอ้างอิงที่ประกอบด้วยจีโนม Gallus นอกจากนี้ การอ่านทั้งหมดยังถูกแมปกับฐานข้อมูลนี้ในกรณีมากกว่า 95% เฉพาะห้องสมุดตั้งแต่ C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 และ H4 มีจำนวน 40,921,384 (92.9%), 41,302,100 (90.87%), 40,771,075 (92.11%), 46,905,784 (90.03%), 42,444,112 (93. 2 %), การอ่าน 40,213,444 (90.23%), 40,922,895 (92.77%) และ 40,971,972 (93.06%) ถูกกำหนดให้กับฐานข้อมูลอ้างอิงโดยไม่ซ้ำกัน ตามลำดับ

ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน

ดังที่ระบุไว้ในรูปที่ 5A มีการระบุยีนที่แสดงออกแตกต่างกันทั้งหมด 198 ยีน ซึ่งรวมถึงยีนที่ได้รับการควบคุมด้านบน 47 ยีน และยีนที่ได้รับการควบคุมด้านล่าง 151 ยีน DEG ได้รับการอธิบายโดยละเอียดในเอกสารเสริมตาราง S2 รูปที่ 5B บ่งชี้ว่า DEG มีความสามารถในการทำซ้ำของการบำบัดได้ดี

การวิเคราะห์การจำแนกประเภทของยีนอภิปรัชญาและสารานุกรมเกียวโตเกี่ยวกับการเสริมคุณค่าของยีนและจีโนม

ยีนที่มีการแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนถูกจำแนกออกเป็น 3 ประเภทการทำงานหลักตามระบบการจำแนกยีน Ontology (GO) ได้แก่ กระบวนการทางชีววิทยา ส่วนประกอบของเซลล์ และการทำงานของโมเลกุล คำศัพท์ GO 10 อันดับแรกใน 3 หมวดหมู่แสดงไว้ในรูปที่ 6 มีความเด่นของยีนที่เกี่ยวข้องกับ "การตอบสนองต่อภูมิคุ้มกันของร่างกาย" "การตอบสนองของเคมีบำบัด" "การตอบสนองต่อฮอร์โมนต้านจุลชีพในร่างกาย" "การตอบสนองต่อการป้องกันแบคทีเรีย " "การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่ออารมณ์ขันต้านจุลชีพที่อาศัยเปปไทด์ต้านจุลชีพ" "การตอบสนองการป้องกันต่อแบคทีเรียแกรมลบ" และ "การตอบสนองการป้องกันต่อแบคทีเรียแกรมบวก" ในหมวดหมู่ของกระบวนการทางชีวภาพ นอกจากนี้ ในหมวดหมู่ของการทำงานของโมเลกุล อัตราส่วนที่น่าทึ่งของยีนมีความสัมพันธ์กับ "การจับกับตัวรับเคมีของ CC motif chemokine receptor (CCR)" "การจับกับตัวรับคีโมไคน์" และ "การจับกับไลโปโพลีแซ็กคาไรด์" นอกจากนี้ "คอมเพล็กซ์ระบบทางเดินหายใจแบบไมโตคอนเดรีย I" "คอมเพล็กซ์ NADH ดีไฮโดรจีเนส" และ "ระบบทางเดินหายใจ" ยังเป็นคำที่ได้รับการเสริมสมรรถนะที่โดดเด่นที่สุดในประเภทส่วนประกอบของเซลล์ การวิเคราะห์วิถีทางของยีนและจีโนมของเกียวโตยังดำเนินการกับยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่ายีนส่วนใหญ่ถูกจัดกลุ่มเป็น 7 วิถีทาง ได้แก่ "ปฏิสัมพันธ์ระหว่างลิแกนด์กับตัวรับที่ออกฤทธิ์ทางประสาท" "จุดเชื่อมต่อช่องว่าง" "วิถีการส่งสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโทเจน (MAPK)" "ตัวขนส่ง ABC" "การสังเคราะห์กรดอะมิโน" "การเผาผลาญยา" และ "การส่งออกโปรตีน"

รูปที่ 2 ผลของการบริหารช่องปากของบีกลูแคนต่อดัชนีการกระตุ้นเม็ดเลือดขาว (SI) (A) ลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลาย; (B) ลิมโฟไซต์ในลำไส้ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

รูปที่ 3 ผลของการให้บี-กลูแคนทางปากต่ออัตราส่วนเซลล์ CD4+/ CD8+ ของเลือดส่วนปลาย (A) ประตูบนลิมโฟไซต์ (B) ประตูบนเซลล์ CD3+ ที; (C) ความถี่ของทีเซลล์ CD3+ CD4 + CD8 + ในกลุ่มวัคซีน G70+; (D) ความถี่ของทีเซลล์ CD3+ CD4 + CD8 + ในกลุ่มวัคซีน; (E) ความถี่ของทีเซลล์ CD3+ CD4 + CD8 + ในกลุ่มน้ำเกลือ; (F) แผนภาพบาร์ที่แสดงถึงอัตราส่วน CD4+/CD8+ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

รูปที่ 4 ผลของการให้บี-กลูแคนทางปากต่อการแสดงออกของ mRNA ในม้ามของไก่ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

รูปที่ 5 สรุปข้อมูล RNA-Seq ( A ) รายชื่อยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน ( B ) แผนที่การจัดกลุ่มของ DEG

การตรวจสอบยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างโดย RT-qPCR

6 DEG ที่ควบคุมขึ้นหรือลงได้รับการยืนยันโดย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นว่าข้อมูล RT-qPCR โดยทั่วไปสอดคล้องกับข้อมูล RNA-seq โดยทั่วไป ซึ่งบ่งชี้ผลลัพธ์การจัดลำดับที่เชื่อถือได้ (รูปที่ 7) การแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับ MAPK Pathway ดังแสดงในรูปที่ 8 การแสดงออก mRNA ของ FAS (P < 0.05) และ CACNA2 (P < 0.05) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ตรวจพบในม้ามของไก่ในกลุ่ม G70 (วัคซีน G70 +) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มวัคซีน นอกจากนี้ ตรวจพบการแสดงออก mRNA ที่เพิ่มขึ้นเชิงตัวเลขของ DUSP5 และ DUSP4 และการแสดงออก mRNA ที่ลดลงเชิงตัวเลขของ p38, JNK และ ERK ถูกตรวจพบในกลุ่ม G70 (วัคซีน G70 +) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มวัคซีน (P > 0.05) .

การอภิปราย

วัคซีน ND เชื้อเป็นได้รับการฉีดวัคซีนอย่างกว้างขวางในฟาร์มเลี้ยงไก่ แต่ยังคงมีการระบาดของโรคนิวคาสเซิลเป็นระยะๆ ในฝูงสัตว์ปีกที่ได้รับวัคซีน (Zhang et al., 2022) วัคซีนที่เหมาะสมที่สุดได้รับการกำหนดไว้เพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันของเซลล์และเยื่อเมือก รวมถึงภูมิคุ้มกันทางร่างกายที่มีประสิทธิผล (Shan et al., 2019) ดังนั้นจึงให้ความสนใจกับ adjuvants มากขึ้นเรื่อย ๆ ซึ่งสามารถให้เยื่อเมือกและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015) เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการฉีด การบริหารช่องปากเป็นวิธีที่ง่ายกว่าซึ่งช่วยลดต้นทุนและทำให้ไก่เนื้อเกิดความเครียดน้อยลง (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008) ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าอาหารที่เสริมด้วยบีกลูแคนช่วยเพิ่มระดับไทเตอร์ของ HI ที่จำเพาะต่อ NDV ในซีรั่มของไก่ได้อย่างน่าทึ่ง ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ (Horst et al., 2019) แอนติบอดีจำเพาะ NDV เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายเพื่อปกป้องไก่จากการติดเชื้อ NDV (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020) B lymphocytes ผลิตแอนติบอดีและ T lymphocytes จะขยายตัวเพื่อตอบสนองต่อ mitogen (Bohacova et al., 2021) ในการศึกษานี้ ดัชนีการกระตุ้นของลิมโฟไซต์ในเลือดไก่ต่อ NDV ของกลุ่ม G70 นั้นสูงกว่ากลุ่มวัคซีนอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการกระตุ้นของทีลิมโฟไซต์มากขึ้น ประชากรย่อยที่โดดเด่นของ T ลิมโฟไซต์คือเซลล์ T CD4 + และ CD8 + (Cui et al., 2020) CD4 + ทีเซลล์ส่วนใหญ่สร้างไซโตไคน์และส่งเสริมการเจริญเต็มที่ของบีเซลล์ ในขณะที่ CD8 + ทีเซลล์มีความเกี่ยวข้องกับการฆ่าเซลล์เป้าหมาย (Zhang et al., 2021b) ในการวิจัยนี้ อัตราส่วนของทีเซลล์ CD4 +/CD8 + ที่ตรวจพบในกลุ่ม G70 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งบ่งชี้ว่า G70 สามารถกระตุ้นทีเซลล์ CD4 + จากเลือดส่วนปลายได้มากขึ้น นอกจากนี้ เราสังเกตเห็นดัชนีการกระตุ้นลิมโฟไซต์ในลำไส้ในกลุ่ม G70 สูงกว่าในกลุ่มวัคซีนอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งยืนยันว่าบี-กลูแคนสามารถกระตุ้นลิมโฟไซต์ในลำไส้ได้เช่นกัน การทดลองก่อนหน้าของเรายืนยันว่าผนังเซลล์ยีสต์สกัด PW220 เพิ่มเซลล์ sIgA และ IgA + เฉพาะลำไส้อย่างมีนัยสำคัญ (Bi et al., 2020) กล่าวคือ ทั้งบี-กลูแคน G70 และ PW220 มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกในลำไส้

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

มีรายงานการปรับปรุงภูมิคุ้มกันของสัตว์โดยการให้บีกลูแคนก่อนหน้านี้ กัว และคณะ (2003) ยืนยันว่าการให้บี-กลูแคนช่วยปรับปรุงดัชนีของแอนติบอดีจำเพาะเบอร์ซาและ NDV ในไก่ เลวีนและคณะ (2018) แนะนำว่าการเสริมบี-กลูแคนสามารถควบคุม MHC Ⅱ ในลำไส้ และเพิ่มจำนวนเซลล์ CD45 + เพื่อบรรเทาอาการบาดเจ็บในลำไส้

หลี่และคณะ (2005) เปิดเผยว่าบี-กลูแคนในอาหารสามารถเพิ่มระดับการแสดงออกของ mRNA ของ IL-8 และ TGF-b ในลำไส้ของสุกร กลไกการออกฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันของบีกลูแคนยังไม่ชัดเจน คิม และคณะ (2010) แสดงให้เห็นว่าบี-กลูแคนส่งเสริมการเจริญเติบโตของเซลล์เดนไดรต์โดยควบคุมการแสดงออกของ CD40, CD80 และ CD86 นอกจากนี้ Lee and Kim (2014) และ Su และคณะ (2020) รายงานว่าบี-กลูแคนกระตุ้นตัวรับการจดจำรูปแบบ เช่น Dectin-1 receptor, Toll-like receptor และ CR3 (Baert et al., 2015) ม้ามเป็นอวัยวะสำคัญในการเริ่มต้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันและมีบทบาทสำคัญในภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันที่ได้รับ (Bronte และ Pittet, 2013) อย่างไรก็ตาม มีงานวิจัยเพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่อิงจากการวิเคราะห์ RNA-seq ของการแสดงออกของ mRNA ในการบริหารม้ามหลังรับประทานโพลีแซ็กคาไรด์ของยีสต์ ในการศึกษาปัจจุบัน สารานุกรมเกียวโตว่าด้วยการวิเคราะห์วิถีทางยีนและจีโนมแนะนำว่ายีนเหล่านี้ส่วนใหญ่ถูกจัดกลุ่มออกเป็น 2 เส้นทาง ได้แก่ "ปฏิสัมพันธ์ระหว่างลิแกนด์กับตัวรับทางประสาท" และ "วิถีการส่งสัญญาณ MAPK" ตัวรับสำหรับการจดจำรูปแบบที่กำหนดเป้าหมายไปที่ b-glucan ได้รับการเสริมสมรรถนะบนพื้นผิวของเซลล์ภูมิคุ้มกัน (Goodridge et al., 2009) หลังจากการรับรู้ของ b-glucan ไทโรซีนไคเนสและปัจจัยนิวเคลียร์คัปปาบี (NF-kappaB) ถูกกระตุ้นโดยตัวรับเหล่านี้ ส่งผลให้มีการหลั่งไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบและกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu และคณะ, 2016; Bode และคณะ, 2019) MAPK ซึ่งเป็นกลุ่มของไคเนสโปรตีนซีรีน-ทรีโอนีน มีบทบาทสำคัญในการอักเสบและการผลิตไซโตไคน์ในไก่ บยอน และคณะ (2016) แสดงให้เห็นว่าบี-กลูแคนเพิ่มการผลิตอินเตอร์เฟอรอน-g และอินเตอร์ลิวคิน-2 และกระตุ้นระดับฟอสโฟรีเลชั่นของ MAPK p38 ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในมาโครฟาจทางช่องท้อง วังและคณะ (2014) รายงานว่าบี-กลูแคนลดการตอบสนองการอักเสบในเซลล์ THP-1 โดยการยับยั้งการกระตุ้น p38 MAPK ในการศึกษานี้ มีการระบุ 13 DEGs รวมถึง DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB และ EGFR ในเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ซึ่งชี้ให้เห็นว่าบี-กลูแคนอาจควบคุมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน ของม้ามผ่านทาง MAPK ในไก่ MAPK เป็นคลาสอนุรักษ์ของไคเนส Ser/Thr ในเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของเซลล์เป็นหลัก เช่น การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน การตายของเซลล์ และการแพร่กระจาย ตระกูล MAPK ประกอบด้วยตระกูลย่อยอย่างน้อย 3 ตระกูล: c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 MAPK และไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a) DUSP4 และ DUSP5 เป็นฟอสฟาเตสแบบจำเพาะแบบคู่ที่ยับยั้งกิจกรรมของสมาชิกในครอบครัว MAPK เช่น p38, JNK และ ERK โดยเฉพาะ ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการกำกับดูแลที่สำคัญในการป้องกันปฏิกิริยาการอักเสบมากเกินไป และส่งเสริมการถดถอยของการอักเสบในร่างกาย (Imasato et al ., 2002; Talreja และคณะ 2021) นอกจากนี้ มีการรายงาน RNA ขนาดเล็กที่ไม่ได้เข้ารหัสชื่อ gga-miR-200a-3p เพื่อระงับการแสดงออกของปัจจัยที่ทำให้เกิดการอักเสบ และควบคุมการตอบสนองภูมิต้านตนเองของโฮสต์โดยการควบคุมวิถีทางลบของ MAPK และโมเลกุลส่งสัญญาณปลายน้ำ (Pham et al., 2017) ในการศึกษานี้ การวิเคราะห์ RT-qPCR แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ mRNA ของ P38, JNK และ ERK ลดลง และการแสดงออกของ mRNA ของ DUSP4 และ DUSP5 เพิ่มขึ้นในไก่ที่เลี้ยงด้วย b-glucan (G70) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลการเสริมภูมิคุ้มกันของบี-กลูแคน (G70) ต่อวัคซีนโรคนิวคาสเซิลอาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมผลตอบรับเชิงลบของปัจจัยที่ทำให้เกิดการอักเสบที่อาศัยผ่าน MAPK นอกจากนี้ FAS ยังเป็นสารสำคัญที่เป็นสื่อกลางในการตายของเซลล์และมีความสำคัญต่อสภาวะสมดุลของภูมิคุ้มกัน (Krueger et al., 2003; Guegan และ Legembre, 2018) ในขณะเดียวกัน CACNA2 เป็นหน่วยย่อยของช่องแคลเซียมที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้า ซึ่งมีผลส่งเสริมการขายต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ การย้ายถิ่น และการบุกรุก (Sun et al., 2020) ในการศึกษานี้ FAS และ CACNA2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในไก่ที่เสริมด้วยบี-กลูแคน (G70) ซึ่งบ่งชี้ว่าบี-กลูแคน (G70) ออกฤทธิ์เสริมภูมิคุ้มกันโดยส่วนใหญ่โดยการยับยั้งการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันและปรับสมดุลภูมิต้านทานตนเอง การค้นพบนี้ให้ข้อมูลอ้างอิงทางทฤษฎีสำหรับการใช้บี-กลูแคน (G70) เพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกันในคลินิก อย่างไรก็ตาม กลไกของบี-กลูแคนในการเพิ่มการตอบสนองของภูมิคุ้มกันผ่านผลตอบรับเชิงลบของวิถีทาง MAPK จำเป็นต้องมีการพิสูจน์เพิ่มเติม เป็นที่น่าสนใจที่จะทราบว่ายีนที่เข้ารหัส cathelicidin ซึ่งประกอบด้วย CATH3, CATH1, CATH2 และยีนที่เข้ารหัส b-defensin ซึ่งรวมถึง AvBD6, AvBD7, AvBD1 และ AvBD4 ได้รับการควบคุมลดลงอย่างเห็นได้ชัดในการเปรียบเทียบ H (วัคซีนกลุ่ม G70 +) เทียบกับกลุ่มควบคุม (วัคซีนกลุ่ม) Host Defense Peptides (HDPs) เป็นโมเลกุลเอฟเฟกต์ที่มีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (Cuperus et al., 2013) เปปไทด์เหล่านี้ถูกค้นพบในสัตว์หลากหลายสายพันธุ์ตั้งแต่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไปจนถึงนก ลูกไก่มีสารคาเทลิซิดินอยู่ 4 ชนิด ได้แก่ CATH1, CATH2, CATH3 และ CATHB1 ซึ่งฆ่าเชื้อแบคทีเรียต่างๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (Hamad et al., 2017) Avian beta-defensins (AvBDs) หรืออีกชื่อหนึ่งว่า gallinacean เป็นเปปไทด์ประจุบวกขนาดเล็กที่มีพันธะซิสเทอีนไดซัลไฟด์ 3 พันธะระหว่างซีสเตอีนที่ตกค้างและมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (Yoshimura, 2015) การลดลงของการแสดงออกของ cathelicidins และ beta-defensin อาจอธิบายได้โดยการควบคุมผลป้อนกลับ โดยที่ประชากรแบคทีเรียและพาราแบคทีเรียลดลงโดยโพลีแซ็กคาไรด์ผนังเซลล์ยีสต์ (Bi et al., 2020) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันถูกเปิดเผยในการศึกษาอื่นๆ เชา และคณะ (2016) แสดงให้เห็นว่าการเสริมยีสต์บีกลูแคนในไก่เนื้อยับยั้งการติดเชื้อซัลโมเนลลา และลดการแสดงออกของ HDP ผ่านการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ ในการศึกษานี้ ผลิตภัณฑ์ G70 ที่ส่วนใหญ่ประกอบด้วยบี-กลูแคนช่วยเพิ่มระดับของแอนติบอดีจำเพาะ NDV ในซีรั่ม เพิ่มดัชนีการกระตุ้น NDV ของเซลล์เม็ดเลือดขาวในเลือดส่วนปลายและเซลล์เม็ดเลือดขาวในลำไส้ และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของทีลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลายให้เป็น CD{{ 123}} ทีเซลล์ นอกจากนี้ การวิเคราะห์ RNA-seq แสดงให้เห็นว่า G70 ควบคุมการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ G-protein ควบคู่ไปกับตัวรับเซโรโทนินและโพลีเปปไทด์ MHC คลาส I และลดระดับการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ cathelicidin และ beta-defensin เมื่อพิจารณาถึงผลที่เพิ่มขึ้นของ G70 ต่อวัคซีน ND ในไก่ สามารถศึกษาผลของ G70 ต่อวัคซีนสัตว์ปีกอื่นๆ เช่น วัคซีนป้องกันไข้หวัดนกได้

รูปที่ 6 การวิเคราะห์วิถี KEGG

รูปที่ 7 การยืนยัน RT-qPCR ของผู้สมัคร DEG ที่เลือก ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

รูปที่ 8 การแสดงออก mRNA สัมพัทธ์ในม้าม Total RNA ถูกสกัดจากม้าม บี-แอคตินของไก่ทำหน้าที่เป็นยีนควบคุมภายใน ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย § SE

ข้อมูลอ้างอิง

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt และ E. Cox 2558 ความแตกต่างเฉพาะประเภทเซลล์ในการรับรู้และการส่งสัญญาณของบี-กลูแคนในเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของสุกร นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 48:192–203.

บอล, ซี., เอ. ฟอร์เรสเตอร์, เอ. แฮร์มันน์, เอส. เลเมียร์ และเค. กานาปาธี 2562. ภูมิคุ้มกันเชิงป้องกันโดยเปรียบเทียบจากวัคซีนที่มีชีวิตของไวรัสโรคนิวคาสเซิลหรือเมตานิวโมไวรัสในสัตว์ปีก เมื่อฉีดร่วมกันควบคู่ไปกับไวรัสหลอดลมอักเสบติดเชื้อสายพันธุ์คลาสสิกและสายพันธุ์ในลูกไก่เนื้ออายุ 1 วัน วัคซีน. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He และ J. Ni 2020. ผลิตภัณฑ์ผนังเซลล์ของยีสต์ช่วยเพิ่มการตอบสนองของ IgA ในลำไส้ และเปลี่ยนสายพันธุ์ของจุลินทรีย์ในลำไส้ใหญ่หลังการฉีดวัคซีนทางปากในไก่ โพล วิทยาศาสตร์ 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li และ L. Cao 2022 ผนังเซลล์ยีสต์เพิ่มการควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยอาศัยเซลล์เป็นสื่อกลางต่อวัคซีนไวรัสโรคนิวคาสเซิล โพล วิทยาศาสตร์ 101:101712–101721.

ลาง, K. , F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd และ PH Krammer 2019. Dectin-1 จับกับแอนเนกซินบนเซลล์อะพอพโทติกทำให้เกิดความทนทานต่อระบบภูมิคุ้มกันส่วนปลายผ่าน NADPH ออกซิเดส-2 เซลล์ ตัวแทน 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan และ E. Javorkova 2021. ความแตกต่างระหว่างเซลล์ B และ T ที่กระตุ้นด้วยไมโทเจนในการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจงของแอนติบอดีที่ผันด้วย R-phycoerythrin เจ. อิมมูนอล. วิธีการ 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo และ JR McGhee 2546. การจัดการรักษาระบบภูมิคุ้มกัน: การเพิ่มประสิทธิภาพภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกโดยธรรมชาติและการปรับตัว. สกุลเงิน เภสัช ออกแบบ. 9:1965–1972.

บรอนเต้, วี. และเอ็มเจ พิตต์. 2556. ม้ามในการควบคุมภูมิคุ้มกันในท้องถิ่นและเป็นระบบ. ภูมิคุ้มกัน 39:806–818.

บยอน, อี., เอส. ปาร์ค, บี. จาง, เอ็น. ซอง และอี. บยอน 2016 บี-กลูแคนที่ได้รับรังสีแกมมากระตุ้นภูมิคุ้มกันและฤทธิ์ต้านมะเร็งผ่านวิถีทาง MAPK และ NF-kB เจ. วิทย์. อาหาร. เกษตร 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z . Gao, R. Hou และ X. Li 2557. ผลของของเหลวในช่องปากอีพิมีเดียม พอลิแซ็กคาไรด์-โพลิส ฟลาโวน ต่อภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกในไก่. นานาชาติ เจ. ไบโอล. แมคโครมอล. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu และ S. Hu. 2020. ปรับปรุงการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยการวิเคราะห์โปรตีโอมิกในซีรั่มของแกะหูต่อวัคซีนโรคปากและเท้าเปื่อยที่ผสมอยู่ในสารเสริมน้ำมันพืช วัคซีน. 8:180–197

คูเปรัส, ที., เอ็ม. คูเรนส์, เอ. ฟาน ไดจ์ค และเอชพี ฮากส์แมน 2013. เปปไทด์ป้องกันโฮสต์ของนก. นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf และ DM Underhill 2552. การรับรู้เบต้ากลูแคนโดยระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ. อิมมูนอล. วิ. 230:38– 50.

กูแกน เจ. และพี. เลเจมเบร. 2018. การทำงานแบบ nonapoptotic ของ Fas/ CD95 ในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน. ก.พ. ย 285:809–827

กัว, วาย., รา อาลี และ เอ็ม.เอ. กูเรชิ 2546. อิทธิพลของเบต้ากลูแคนต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในลูกไก่เนื้อ. ภูมิคุ้มกัน อิมมูนอล. 25:461–472.

ฮาหมัด, SK, เอส. คิม, SW El-Kadi, EA Wong และ RA Dalloulul 2017. การแสดงออกเชิงเปรียบเทียบของเปปไทด์ป้องกันโฮสต์ในสัตว์ปีกไก่งวง โพล วิทยาศาสตร์ 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin และ MS Diarra 2564. ศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของผลไม้และสารสกัดในสัตว์ปีก. ด้านหน้า. อิมมูนอล. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj และ YH Hong 2020 ไก่ b-defensin 8 ปรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจนในเซลล์ไลน์เซลล์แมคโครฟาจของไก่ โพล วิทยาศาสตร์ 99:4174–4182.

ฮอร์สต์, จี., อาร์. เลวีน, อาร์. ชิก และซี. โฮฟาเคอร์ 2019. ผลของเบต้า- 1,3-กลูแคน (AletaTM) ต่อการตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนในไก่เนื้อ โพล วิทยาศาสตร์ 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira และ J. Li. 2002 การยับยั้ง p38 MAPK โดยกลูโคคอร์ติคอยด์ผ่านการเหนี่ยวนำของ MAPK phosphatase-1 ช่วยเพิ่มการแสดงออกที่เกิดจากอิทธิพลของ Haemophilus ที่ไม่สามารถพิมพ์ได้ของตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง 2 J. Biol เคมี. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff และ S. Matikainen 2010. (1,3)-เบต้า-กลูแคนกระตุ้นทั้งเดคติน-1 และการอักเสบของ NLRP3 ในมาโครฟาจของมนุษย์ เจ. อิมมูนอล. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim และ S. Han 2553. การกระตุ้นเซลล์เดนไดรต์โดยกลูแคนที่แยกได้จากสะดือเอสคิวเลนตา มีภูมิคุ้มกัน. เน็ต 10:188–197.

ครูเกอร์, เอ., เอสซี ฟาส, เอส. เบามันน์ และพีเอช แครมเมอร์ 2546. บทบาทของ CD95 ในการควบคุมการตายของเซลล์ T-cell ส่วนปลาย อิมมูนอล. วิ. 193:58–69.