ผลประโยชน์ของเศษส่วนฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ทั้งหมดที่แยกได้จาก Cistanche Deserticola ต่อโครงสร้างจุลภาคของกระดูกในหนูที่ตัดรังไข่ออก

1. บทนำ

โรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน ซึ่ง 1 ใน 3 ของผู้หญิงที่มีอายุมากกว่า 50 ปีจะต้องทนทุกข์ทรมาน กำลังกลายเป็นอันตรายต่อสุขภาพที่สำคัญที่กระทบต่อผู้หญิงมากกว่า 200 ล้านคนทั่วโลก [1] ในวัยหมดประจำเดือน ระดับฮอร์โมนเอสโตรเจนที่ลดลงอย่างรวดเร็วมักจะนำไปสู่การสลายของกระดูกที่มากเกินไปซึ่งเกิดจากการสร้างกระดูกเพิ่มขึ้น จากนั้นความสมดุลระหว่างการสร้างกระดูกที่เกิดจากเซลล์สร้างกระดูกและการสลายของกระดูกที่เกิดจากเซลล์สร้างกระดูกจะหยุดชะงัก และการสลายของกระดูกทำให้เกิดโรคกระดูกพรุนและแม้แต่สะโพกหรือกระดูกสันหลังหักในที่สุด [2] เชื่อกันว่าความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกจะถูกกระตุ้นเมื่อตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์คัปปา B (RANK) จับกับ RANKL ซึ่งเป็นลิแกนด์ของ RANK อย่างไรก็ตาม การรวมกันของ RANK กับ RANKL ไม่สามารถเปิดใช้งานได้เว้นแต่ว่าโปรตีนเนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับ 6 (TRAF6) จะเข้าร่วมด้วย [3] ตามด้วยการกระตุ้นของเส้นทางการส่งสัญญาณขั้นปลายซึ่งรวมถึง PI3K/AKT และ NF-κB ในที่สุด การแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น c2 (NFAT2) และ c-Fos ได้รับการควบคุม [4] เพื่อปรับความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกและการสลายของกระดูก ดังนั้นปัจจัยและหน่วยงานกำกับดูแลที่เกี่ยวข้องโดยตรงหรือโดยอ้อมกับการกระตุ้นและความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกจึงเชื่อว่าเป็นเป้าหมายสำคัญในการป้องกันการสูญเสียมวลกระดูก มียาบำบัดทดแทนฮอร์โมนทางคลินิกและยาสังเคราะห์บางชนิด เช่น เอสตราไดออล วาเลเรต ซึ่งมีประสิทธิภาพในการรักษาโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน น่าเสียดายที่สิ่งเหล่านี้บางส่วนเพิ่มความเสี่ยงของโรคมะเร็งร้ายแรง รวมถึงมะเร็งเต้านมและมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูก [5] ซึ่งจำกัดการใช้งานทางคลินิก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องเลือกทางเลือกอื่นที่มีทั้งประสิทธิภาพและผลข้างเคียงน้อยที่สุด ยาแผนจีน (TCM) รวมถึงสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพและเศษส่วน [6-9] ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพในการรักษาโรคต่างๆ รวมถึงโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน ในบรรดาส่วนประกอบและเศษส่วนที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพเหล่านี้ เชื่อว่าสารประกอบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ (PhG) ที่มีศักยภาพด้านประสิทธิภาพถือเป็นสารที่มีแนวโน้มในการรักษาโรคกระดูกพรุน [10–12] โครงสร้างของ PhGs ประกอบด้วยกรดซินนามิกอะไกลโคน, กลุ่มไฮดรอกซิลฟีนิลเอทิลซึ่งรวมกับ -กลูโคปาราโนส, เอพิโอส, กาแลคโตส, แรมโนสหรือไซโลสผ่านพันธะไกลโคซิดิก มีแพร่หลายในสกุล Cistanche [13] Cistanche Deserticola YC Ma เป็นยา TCM อย่างเป็นทางการที่ได้รับการบันทึกไว้ในตำรับยาจีน และนอกจากจะเป็น TCM ที่สำคัญแล้ว [14] แล้ว C .deserticola ยังเป็นสมุนไพรบำรุงการต่อต้านวัยซึ่งมีผลข้างเคียงเพียงเล็กน้อย ซึ่งได้รับการพัฒนาเป็นสุราสมุนไพรและสารอาหารเหลวที่ได้รับการอนุมัติจาก สำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาแห่งรัฐ ตามบันทึกตำรายาจีน C. Deserticola ถูกใช้โดยคนพื้นเมืองเพื่อจัดการกับปัญหาการขาดสาระสำคัญของไต เช่น กล้ามเนื้ออ่อนแรงและเอวอ่อนแรง และสารประกอบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ รวมทั้งเอชินาโคไซด์และแอคทีโอไซด์เป็นองค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลักในสมุนไพรนี้ ตามทฤษฎี TCM เรื่อง "กระดูกที่ควบคุมไต" ระบบกระดูกถูกควบคุมโดยสาระสำคัญของไต [15] และปัญหาที่เกี่ยวข้องกับกระดูก เช่น โรคกระดูกพรุน สามารถรักษาให้หายขาดได้ด้วยสมุนไพรหรือสารประกอบที่มีฤทธิ์ในการบำรุงสาระสำคัญของไต ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าเศษส่วนของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ทั้งหมดที่แยกได้จาก C. Deserticola อย่างน้อยก็บางส่วนมีประโยชน์ในการรักษาโรคกระดูกพรุน การทดลองปัจจุบันจึงถูกคิดค้นขึ้นเพื่อตรวจสอบสมมติฐานของเราโดยใช้แบบจำลองหนูที่ตัดรังไข่ (OVX) นอกจากเครื่องหมายการสลายและการก่อตัวของกระดูกซึ่งต้องประมาณค่าแล้ว ดัชนีการต้านอนุมูลอิสระตลอดจนวิถีการส่งสัญญาณ PI3K/AKT และ NF-κB ที่เหนี่ยวนำโดย RANKL/RANK/TRAF6- ยังถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบกลไกหลักของฤทธิ์ทางชีวภาพต้านโรคกระดูกพรุน .

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. วัสดุพืชและการเตรียม

ลำต้นของ Cistanche Deserticola YC Ma จำนวน 30 กิโลกรัมถูกรวบรวมจากเทศมณฑลหยงหนิงในวันที่ 2 กันยายน015 ด้วยพิกัด 106.026597 และ 38.262816 มณฑลหนิงเซี่ย ประเทศจีน สมุนไพรนี้ถูกระบุโดยดร. Lin Dong (ภาควิชาเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์ Ningxia) และตัวอย่างที่เกี่ยวข้อง (#20150901) ได้รับการเก็บรักษาไว้ในภาควิชา การวิเคราะห์ทางเภสัชกรรม ประการแรก สกัด C. Deserticola แบบผงจำนวน 30.0 กิโลกรัมโดยใช้วิธีไหลย้อนโดยใช้เอทานอล 70% เป็นตัวทำละลาย อัตราส่วนของวัสดุต่อตัวทำละลายถูกกำหนดเป็น 1:10 และเวลาในการไหลย้อนคือ 2 ชั่วโมงเป็นเวลา 3 ครั้ง จากนั้น สารกรองทั้งหมดถูกรวมและควบแน่นภายใต้ความดันลดลงที่ 60 องศาเซลเซียส ประการที่สอง คอลัมน์เรซินที่มีรูพรุนขนาดใหญ่ AB-8 ถูกนำมาใช้สำหรับการแยกเบื้องต้น และอัตราส่วนที่แตกต่างกันของเอทานอลในน้ำ (0%, 20%, 30%, 40%, 50%, และ 60%, แต่ละ 60 ลิตร) ถูกใช้สำหรับการชะ ประการที่สาม ตัวชะ 40% และ 50% ถูกนำมารวมกันและทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมโดยใช้คอลัมน์เรซินที่มีรูพรุนขนาดใหญ่ AB-8 ซ้ำๆ โดยมีตัวชะเป็นเอทานอล 0%, 20%, 30%, 40% และ 50% ในน้ำ และ สารชะแต่ละตัวคือ 12 ลิตร ในที่สุด เศษส่วน 40% ถูกรวบรวมและควบแน่นภายใต้ความดันที่ลดลงเพื่อให้ได้เศษส่วนฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ตะกอนสีเหลืองอ่อน 150 กรัมของ C. Deserticola (CDP, ผลผลิตคือ 0.5%) สำหรับการทดลอง ในสัตว์ทดลอง จะใช้ตัวทำละลาย CMC-Na 0.5% เพื่อละลาย CDP; การบริหารให้ทางปากแก่สัตว์ถูกกำหนดไว้ที่ 1 มล./100 กรัมของน้ำหนักตัว; สำหรับการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต ในหลอดทดลอง CDP ถูกละลายด้วย DMSO แล้วเจือจางด้วย DMEM เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายคือ 0.1 มก./มล., 0.01 มก./มล. และ 0.001 มก./มล. 

สารสกัดจาก CISTANCHE ธรรมชาติเพื่อการเจริญเติบโตของกระดูกฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ 75% เอไคนาโคไซด์ 30% แอกทีโอไซด์ 12%

2.2. เคมีภัณฑ์และตัวทำละลาย

Estradiol valerate (EV) มาจาก Delpharm Lille SAS ประเทศฝรั่งเศส; อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP), กลาโปรตีนกระดูก (BGP), ฟอสฟาเตสกรดที่ทนต่อทาร์เตรต (TRAP) และชุด ELISA ครอสลิงก์ deoxypyridinoline (DPD) จาก Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., เซี่ยงไฮ้, จีน, 201605; malondialdehyde (MDA, 20181221), ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase (SOD, 20121218) และกลูตาไธโอน (GSH, 20181221) ชุดรีเอเจนต์จากสถาบันวิศวกรรมชีวภาพ Nanjing Jiancheng เมืองหนานจิง ประเทศจีน; lntact parathormone (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonin (2L9ISN7AIU) และตัวรับอัลฟ่าที่เกี่ยวข้องกับฮอร์โมนเอสโตรเจน (ERR, Y3AY8QEWB3) ชุด crosslink ELISA จาก Elabscience Biotechnology Co. Ltd., หวู่ฮั่น, จีน; ชุดรีเอเจนต์ cathepsin K ELISA จาก BioVision, อเมริกา, 1l300141; แอนติบอดีปฐมภูมิของ RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kinase p85 alpha (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -actin (17AV0411) และแอนติบอดีทุติยภูมิของแพะต่อต้านกระต่าย IgG จากมะรุมเปอร์ออกซิเดสจาก ZSGB-BIO, จีน, 136080; ชุดทดสอบ BCA pro tein ทั้งหมดและชุดเชิงพาณิชย์สำหรับการตรวจหาการก่อตัวของ oste oclast และซีรั่มของวัวในครรภ์และสื่อ Eagle's (DMEM) ดัดแปลงของ Dulbecco จาก HyClone, Logan, UT, USA; เมมเบรนโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) จาก Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; เพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซินจาก Gibco, Rockville, MD, USA สารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดที่ใช้เป็นเกรด AR

2.3. การหาปริมาณ HPLC ของ CDP

เครื่องมือ HPLC ของ Agilent 1220 ถูกใช้เพื่อระบุและหาปริมาณองค์ประกอบของ CDP เงื่อนไขโครมาโตกราฟีมีดังนี้: คอลัมน์ C18 (TSK-GEL, 4.6.id × 25 0 มม., 5 μm); การชะแบบไล่ระดับมีตัวทำละลาย A (อะซีโตไนไตรล์) และ B (น้ำที่มีกรดอะซิติก 0.5%) (0-10 นาที: 17-20% A; 10-30 นาที: 20-25% A; และ 30-40 นาที: 25-30% A); ความยาวคลื่นการตรวจจับคือ 333 นาโนเมตร; อุณหภูมิโดยรอบ; อัตราการไหลคือ 1.0 มล./นาที; ปริมาตรการฉีดตัวอย่างคือ 5 ไมโครลิตร ระบุสารประกอบ PhG แปดชนิด ได้แก่ ซิสตาโนไซด์ F, เอชินาโคไซด์, 6′-acetylacteoside, ซิสตาโนไซด์ C, ซิสตาโนไซด์ A, แอกทีโอไซด์, 2′-acetylacteoside และไอโซแอคทีโอไซด์ โดยการใช้สารอ้างอิงที่เกี่ยวข้องและวิธีการมาตรฐานภายนอก เนื้อหาของ PhG 8 รายการข้างต้นจะถูกวัดปริมาณโดยการวิเคราะห์ HPLC (รูปที่ 1)

รูปที่ 1: ลายนิ้วมือ HPLC ของ CDP พบสารประกอบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์แปดชนิดในส่วนนี้ และปริมาณทั้งหมดมีปริมาณเป็น 50.7% สารประกอบและเนื้อหามีดังนี้: (1) แอกทีโอไซด์ F (3.6%), (2) เอไคนาโคไซด์ (8.8%), (3) ซิสตาโนไซด์ A (5.0%), (4) แอกทีโอไซด์ (13.3%), (5) isoacteoside (3.3%), (6) acteoside C (3.6%), (7) 2′-acetylacteoside (9.9%) และ (8) 6′-acetylacteoside (3.2%)

2.4. พิธีสารการทดลองกับสัตว์

หนูพันธุ์ Sprague-Dawley ที่โตเต็มวัยเพศเมียจำนวน 60 ตัวอายุ 3 เดือนมีวัตถุประสงค์จากศูนย์กลางการทดสอบในสัตว์ของ Ningxia Medical University โดยมีน้ำหนักตัวเริ่มต้นเฉลี่ยประมาณ 234 ± 25 กรัม หนูถูกเลี้ยงในสภาพแวดล้อมปลอดเชื้อโรคที่เป็นมาตรฐานโดยเฉพาะเพื่อปรับตัวเป็นเวลา 1 สัปดาห์ จากนั้น หนูทุกตัวได้รับการดมยาสลบ (คลอราลไฮเดรต 100 มก./กก. ip) เท่านั้น หรือตัดรังไข่เสแสร้ง (SHAM) หรือถอดรังไข่ทั้งสองออกแล้วสุ่มแบ่งออกเป็น 5 กลุ่มย่อย: รักษาทางปากด้วยพาหนะ (0.5% CMC- Na) ถูกตั้งค่าเป็นกลุ่มแบบจำลอง (OVX), เอสตราไดออล วาเลเรต (1 มก./กก./วัน) เป็นกลุ่มเชิงบวก (EV) และ 60, 120 และ 240 มก./กก./วัน ของ CDP ที่ต่ำ (CDPL) กลุ่มขนาดยาปานกลาง (CDPM) และสูง (CDPH) ตามลำดับ หนูทุกตัวได้รับการบริหารให้ทางปากทุกวันและกินเวลาเป็นเวลา 3 เดือน โดยปรับขนาดยาทุกๆ 2 สัปดาห์ ซึ่งขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงของน้ำหนักตัวทั้งหมด ในวันสุดท้ายของการทดลองกับสัตว์ ได้รับปัสสาวะ 24- ชั่วโมงโดยการใช้กรงเมตาบอลิซึม เซรั่มถูกรวบรวมจากหลอดเลือดแดงต้นขาของหนูที่ถูกดมยาสลบ กระดูกต้นขาขวา กระดูกหน้าแข้ง และอวัยวะทั้งหมดถูกผ่าและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80 องศา C เพื่อการวิเคราะห์เพิ่มเติม การทดลองกับสัตว์ที่เราดำเนินการได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของ Ningxia Medical University

2.5. การกำหนดความหนาแน่นของแร่ธาตุกระดูกและการวิเคราะห์ Micro-CT

ประการแรก มีการใช้เครื่องเอ็กซ์เรย์ดูดกลืนรังสีเอกซ์พลังงานคู่ (ลูนาร์ สหรัฐอเมริกา) เพื่อประเมินความหนาแน่นของกระดูกรวมของกระดูกโคนขาขวาของหนูแต่ละตัว ประการที่สอง กระดูกโคนขาเดียวกันนั้นถูกใช้เพื่อประมาณภาพ 3 มิติของสถาปัตยกรรมไมโครกระดูก trabecular โดยใช้เครื่องสแกน micro-CT (GE, อเมริกา) ความละเอียดไอโซโทรปิกตั้งไว้ที่ 14 μm เพื่อให้ได้ภาพ 3 มิติในอุดมคติ เลือกภูมิภาคที่สนใจ (ROI) โดยการตั้งค่าพิกัดเดียวกันในแผ่นการเติบโตของกระดูกโคนขาของแต่ละตัวอย่าง และพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาของกระดูก รวมถึงการแยกเนื้อโปร่ง (Tb.Sp) จำนวนเนื้อโปร่ง (Tb.N) ความหนาของเนื้อโปร่ง (Tb.Th) ปริมาณแร่ธาตุในกระดูก (BMC) ความหนาแน่นของแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMD) และปริมาณแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMC ) ได้มาจากการวิเคราะห์ ROI

รูปที่ 2: ผลของ OVX และการรักษาด้วย CDP หรือ EV เป็นเวลา 12 สัปดาห์ต่อความหนาแน่นของกระดูกรวมในโคนขาขวาของหนู ซึ่งประเมินโดยใช้การดูดกลืนรังสีเอกซ์พลังงานคู่ (n=10/กลุ่ม) ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม OVX; ###p < 0 001 กับกลุ่ม SHAM

รูปที่ 3: ภาพสแกน Micro-CT ของสถาปัตยกรรมไมโครของกระดูกโคนขาขวาของหนูที่ได้รับ CDP ภาพถ่ายที่แสดงเป็นตัวแทนของหนู 4 ตัวที่แตกต่างกันในแต่ละกลุ่ม: (A) กลุ่ม OVX; (B) กลุ่มเสแสร้ง; (C) กลุ่ม EV; (D) กลุ่ม CDPH; (E) กลุ่ม CDPM; (F) กลุ่ม CDPL พารามิเตอร์ที่วัดได้ประกอบด้วยปริมาณแร่ธาตุกระดูก(BMC) ปริมาณแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMC) ความหนาแน่นของแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMD) การแยกเนื้อโปร่ง (Tb.Sp) จำนวนเนื้อโปร่ง (Tb.N) และความหนาของเนื้อเนื้อโปร่ง (Tb.Th) หนู OVX แสดงให้เห็นถึงการลดลงอย่างเห็นได้ชัดของพื้นที่สถาปัตยกรรมจุลภาคและจำนวนกระดูกเนื้อโปร่ง หนูที่ได้รับ CDP และหนูที่ได้รับ EV บางส่วนกลับรายการการค้นพบข้างต้นในระดับเดียวกันหลังจากการรักษา 12 สัปดาห์ ค่าทั้งหมดถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม OVX; ###p < 0 001 กับกลุ่ม SHAM

รูปที่ 4: ผลของ OVX และการรักษาด้วย CDP หรือ EV เป็นเวลา 12 สัปดาห์ต่อปัสสาวะและ Ca และ P ในซีรัม ตลอดจน PTH และแคลซิโทนินของหนู (n=10/กลุ่ม) ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 และ ###p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม SHAM

2.6. การทดสอบทางชีวเคมีในเซรั่มและปัสสาวะ

กิจกรรมของซีรัม cathepsin K, TRAP, SOD และ GSH รวมถึงเนื้อหาของ PTH, แคลซิโทนิน, ERR, MDA, BGP และปัสสาวะ DPD ในซีรั่ม ถูกกำหนดโดยการใช้ชุดรีเอเจนต์ที่เกี่ยวข้องตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ ระดับของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และเนื้อหาของแคลเซียมในซีรั่มและปัสสาวะ (Ca) และฟอสฟอรัส (P) ถูกประเมินโดยใช้เครื่องอัตโนมัติ (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA)

2.7. การวิเคราะห์แบบ Western Blot

เซลล์สร้างกระดูกถูกกระตุ้นโดยการใช้เซลล์ RAW 264.7 ที่เติมด้วยปัจจัยกระตุ้นโคโลนีมาโครฟาจ (MCSF) และ RANKL โดยสรุป เซลล์ RAW 264.7 จำนวน 7 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานหลุม 6- โดยมี MCSF 30 ng/mL และ RANKL 25 ng/mL หลังจากการปฐมนิเทศเป็นเวลา 6 วัน เซลล์สร้างกระดูกที่เจริญเต็มที่จะถูกระบุโดยใช้วิธีการย้อมสี TRAP ด้วยชุดอุปกรณ์ที่เกี่ยวข้อง จากนั้นจึงบำบัดด้วย CDP (0.1, 0.01 และ 0.001 มก./มล. ตามลำดับ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง; จากนั้นเซลล์จะถูก lysed ด้วยบัฟเฟอร์ lysis ที่ประกอบด้วยฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ 0.5 มิลลิโมล โปรตีเอส และสารยับยั้งฟอสฟาเตส จากนั้นไลซีนจะถูกแยกออกโดยใช้ SDS-PAGE 10% และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ซึ่งถูกตรวจสอบด้วย AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos และ -actin ( 1 : 400) หลังจากบล็อกด้วยนมไม่มีไขมัน 5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เมมเบรนเดียวกันนั้นถูกลอกออกและตรวจสอบอีกครั้งด้วยแอนติบอดีที่เกี่ยวข้อง 9 ตัวข้างต้น ตามลำดับ จากนั้นถูกตรวจพบโดยซอฟต์แวร์ Image Lab ในตอนท้าย การทดลองซ้ำสามครั้ง

2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลทั้งหมดที่ได้รับจากการทดลอง ในหลอดทดลอง และในหลอดทดลอง ซึ่งอธิบายว่าเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบของ Dunnett (ซอฟต์แวร์ SPSS 22.0, SPSS, USA); p < 0 05 มีนัยสำคัญทางสถิติ

3. ผลลัพธ์

3.1. องค์ประกอบทางเคมีของ CDP

ใช้วิธี HPLC แปดสารประกอบฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์พบได้ในเศษส่วนนี้ ดังรูปที่ 1 แสดง โดยใช้การอ้างอิงมาตรฐานและวิธีการมาตรฐานภายนอก สารประกอบและปริมาณของสารประกอบเหล่านี้ได้รับการระบุและวัดปริมาณดังนี้: (1) แอกทีโอไซด์ F (3.6%), (2) เอชินาโคไซด์ (8.8%), (3)ซิสตาโนไซด์A (5.0%), (4) แอกทีโอไซด์ (13.3%), (5) ไอโซแอคทีโอไซด์ (3.3%), (6) แอกทีโอไซด์ C (3.6%), (7) 2′-อะซิติแลกทีโอไซด์ (9.9% ) และ (8) 6′-อะซิติแลกทีโอไซด์ (3.2%) เนื้อหาทั้งหมดขององค์ประกอบทั้งแปดนี้มีค่าเป็น 50.7%

สารสกัดจากกระบองเพชรธรรมชาติเพื่อการเจริญเติบโตของกระดูกฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ 75% เอไคนาโคไซด์ 30% แอกทีโอไซด์ 12%

3.2. ผลของ CDP ต่อความหนาแน่นของแร่ธาตุกระดูกและสถาปัตยกรรมจุลภาคของ Trabecula

ความหนาแน่นของมวลกระดูกรวมของหนูในกลุ่มย่อยต่างๆ แสดงในรูปที่ 2 แนวโน้มที่ลดลงในเนื้อหาของความหนาแน่นของกระดูกถูกพบในหนูของการดำเนินการแบบจำลอง OVX เมื่อเปรียบเทียบกับหนูของกลุ่ม SHAM (p < {{ 1}}) หนูที่ได้รับ CDP ทั้งหมดมีความหนาแน่นของกระดูกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ 11.2%, 12.0% และ 10.7% (p < 0 01) ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX นอกจากนี้ สอดคล้องกับข้อมูลความหนาแน่นของมวลกระดูกทั้งหมด การสร้าง micro-CT ใหม่ ตลอดจนการตรวจฮิสโตมอร์โฟเมตริกของกระดูกโคนขา แสดงให้เห็นว่าหนูในกลุ่ม OVX มีการเสื่อมสภาพอย่างเห็นได้ชัดในสถาปัตยกรรม trabecular ซึ่งเห็นได้จากจำนวนและพื้นที่ของ trabecula ที่ลดลงอย่างเห็นได้ชัด รวมถึง Tb.Sp เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับหนูกลุ่ม SHAM การรักษาด้วย CDP ป้องกันการเสื่อมสภาพที่เกิดจาก OVX ในสถาปัตยกรรม trabecular; ดังรูปที่ 3 แสดงให้เห็นว่าค่า BMC, TMC และ Tb.N เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และพื้นที่ของ Tb.Sp ลดลงอย่างเห็นได้ชัด ในขณะที่ค่าของ TMD และ Tb.Th ดูเหมือนจะไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากการดำเนินการ OVX และของเรา การแทรกแซงของ CDP

รูปที่ 5: ผลของการรักษาด้วย OVX และ 12- สัปดาห์ด้วย CDP หรือ EV ต่อกิจกรรมของ TRAP ในซีรัม, cathepsin K, DPD, ALP และ BGP ของหนู OVX (n=10/กลุ่ม) ค่าทั้งหมดถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 และ ###p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม SHAM

3.3. ผลของ CDP ต่อพารามิเตอร์ทางชีวเคมีของปัสสาวะและซีรั่ม

ดังรูปที่ 4 แสดงให้เห็น แนวโน้มการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของระดับปัสสาวะของ P และปริมาณแคลซิโทนินในซีรั่มในหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX ถูกตรวจพบ ซึ่งน้อยกว่าหนู SHAM เกือบ 30% และ 60% (p < 0 001 ) ตามลำดับ ในขณะที่ไม่มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นหรือลดลงอย่างเห็นได้ชัดในระดับปัสสาวะของ Ca และซีรั่ม Ca รวมถึงซีรั่ม P และซีรั่ม PTH ระหว่างกลุ่ม OVX และ SHAM การรักษาด้วย CDP ป้องกันการสูญเสียซีรั่ม P และ Ca ในหนู OVX อย่างมีนัยสำคัญ โดยเห็นได้จากระดับของซีรั่ม P และ Ca ที่ควบคุมได้อย่างโดดเด่น (p < 0 05) เมื่อเปรียบเทียบกับหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX นอกจากนี้ มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นแต่ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติของแคลซิโทนินถูกพบในกลุ่ม CDP ทั้งที่มีขนาดต่ำและสูง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง OVX

รูปที่ 6: ผลของการรักษาด้วย OVX และ 12- สัปดาห์ด้วย CDP หรือ EV ต่อการแสดงออกของ ERR น้ำหนักตัว และน้ำหนักมดลูกและช่องคลอดของหนู (n=10/กลุ่ม) ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่ม OVX; ###p < 0 001 กับกลุ่ม SHAM

3.4. ผลของ CDP ต่อการสร้างกระดูกและเครื่องหมายการสลายของกระดูก

ผลประโยชน์ของ CDP ต่อดัชนีการสร้างกระดูกตลอดจนอิทธิพลของการยับยั้งการสลายของกระดูกเครื่องหมายถูกอธิบายไว้ในรูปที่ 5 เกี่ยวกับเครื่องหมายการสร้างกระดูก ระดับของ BGP ในซีรั่มแทบจะไม่ได้รับอิทธิพลจากการผ่าตัดตัดรังไข่ ซึ่งเห็นได้จากการเปลี่ยนแปลงที่ไม่มีนัยสำคัญที่สังเกตได้ในทุกกลุ่มที่ได้รับการรักษา ในขณะที่การปรับปรุงที่มีนัยสำคัญทางสถิติของ ALP ในซีรัมได้รับทั้งในระดับต่ำ (6 ขนาดยา 0 มก./กก.) และปานกลาง (120 มก./กก.) ของกลุ่มการแทรกแซง CDP เมื่อเปรียบเทียบกับหนูของกลุ่ม SHAM (p < 0 01) เกี่ยวกับดัชนีการสลายของกระดูก ระดับของ cathepsin K และ DPD ในซีรั่ม รวมถึง TRAP ในหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญประมาณ 75.0%, 41.4% และ 21.0% ตามลำดับ เมื่อเทียบกับหนู SHAM และเมื่อรักษาด้วย CDP โดยเฉพาะขนาดยาต่ำที่ 60 มก./กก. คุณสมบัติของ cathepsin K และ DPD รวมถึง TRAP ในกลุ่มแบบจำลอง OVX ถูกยับยั้งอย่างเห็นได้ชัดถึง 67.3%, 41.4% และ 25.9% ตามลำดับ เนื่องจาก เปรียบเทียบกับหนูในกลุ่มแบบจำลอง OVX

ถังเก็บน้ำธรรมชาติเพื่อการเจริญเติบโตของกระดูกฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ 75% เอไคนาโคไซด์ 30% แอกทีโอไซด์ 12%

3.5. ผลของ CDP ต่อช่องคลอดและมดลูก รวมถึงน้ำหนักตัวทั้งหมด

ความแตกต่างที่ไม่มีนัยสำคัญในน้ำหนักตัวเริ่มต้นของหนูถูกสังเกตก่อนการรักษาในหกกลุ่ม (รูปที่ 6) อย่างไรก็ตาม การผ่าตัดตัดรังไข่ทำให้น้ำหนักตัวสุดท้ายของหนูในกลุ่มแบบจำลอง OVX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเกือบ 36.0% ในขณะที่น้ำหนักเปียกของมดลูกและช่องคลอดลดลงอย่างมากเกือบ 9{{4} }.0% และ 60.0% ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับหนู SHAM (p < 0 001) แม้ว่าเนื้อหาของ ERR จะไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม OVX และ SHAM แต่กลุ่มการรักษาทั้งหมด รวมถึง CDP และ EV ก็เพิ่มระดับของ ERR อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ เมื่อรักษาด้วย EV น้ำหนักตัวข้างต้นเพิ่มขึ้นตลอดจนการสูญเสียช่องคลอดและน้ำหนักมดลูกของหนู OVX กลับคืนบางส่วน (p < 0 001) ​​แต่ไม่ได้รับผลกระทบจากการแทรกแซงของ CDP

3.6. ผลของ CDP ต่อระดับ MDA, SOD และ GSH ในซีรั่ม

ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในคุณสมบัติของซีรั่ม SOD และ GSH ระหว่างกลุ่มแบบจำลอง SHAM และ OVX; ดังรูปที่ 7 อธิบาย แนวโน้มที่เพิ่มขึ้นใน GSH สามารถสังเกตได้ระหว่างสองกลุ่มข้างต้น นอกจากนี้ ระดับของ MDA ในซีรั่มยังได้รับการควบคุมอย่างรวดเร็วเกือบ 50% ในหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX เมื่อเปรียบเทียบกับหนู SHAM กิจกรรมของ SOD ไม่ได้รับอิทธิพลจากการรักษาด้วย CDP ในขณะที่คุณสมบัติของ GSH ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยการแทรกแซงของ CDP และ CDP ลดระดับ MDA ลงอย่างเห็นได้ชัด 33.9% และ 42.4% ในขนาด 60 และ 240 มก./กก. ตามลำดับ ( พี < 0 001)

3.7. ผลของ CDP ต่อระดับการแสดงออกของโปรตีน

ข้อมูลของเรา ดังแสดงในรูปที่ 8 ชี้ให้เห็นว่าการรักษา CDP ลดระดับโปรตีนของ TRAF6, RANK และ RANKL อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม เส้นทางสัญญาณดาวน์สตรีมรวมถึง NF-κBถูกระงับและ PI3K / AKT ถูกกระตุ้นโดยการแทรกแซง CDP ซึ่งเห็นได้จากการแสดงออกของการลดลงของ NF-κB-p65 ในขณะที่ PI3K p85 และ AKT1 ได้รับการควบคุม ด้วยเหตุนี้ การแสดงออกของ NFAT2 จึงลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และ c Fos เพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย CDP ที่ความเข้มข้น 0.001-0.1 มก./มล. กลไกที่แนะนำมีการอธิบายไว้ในรูปที่ 9 โดยที่ CDP ลดระดับของ RANKL และ RANK ลง โดยจะลดปริมาณการจับของลิแกนด์นี้ด้วยตัวรับของมัน การเชื่อมต่อของ RANKL กับ RANK นั้นลดลงอีกโดยการลดลงของ TRAF6 ตามด้วยการปราบปรามของเส้นทางปลายน้ำรวมถึงเส้นทาง NF-κB ในทางตรงกันข้าม ทางเดินสัญญาณ PI3K/AKT ถูกกระตุ้น ซึ่งในที่สุดก็นำไปสู่การลดลงของการแสดงออกของ NFAT2 และการเพิ่มขึ้นของระดับ c-Fos

4. การอภิปราย

ฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์เป็นส่วนประกอบที่ละลายน้ำได้ตามธรรมชาติซึ่งมีอยู่ทั่วไปในอาณาจักรพืชสมุนไพร [11] จนถึงขณะนี้ สารประกอบของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ดึงดูดนักวิจัยมากขึ้นเรื่อยๆ เนื่องจากมีบทบาทที่ชัดเจนในการจัดการกับอาการเจ็บป่วยและความผิดปกติต่างๆ ของมนุษย์ [13] จำนวนเศษส่วนและสารประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพต้านโรคกระดูกพรุน รวมถึงโพลีฟีนอลและฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ ได้รับการระบุและแยกได้จากสมุนไพรธรรมชาติหลายสิบชนิด [5, 10, 12, 16, 17]

รูปที่ 8: ผลกระทบของความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP ต่อการแสดงออกของโปรตีนของ TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF- κBIA (f), NFAT2 (g) และ c-Fos (h) (n=3/กลุ่ม); การแสดงออกของโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานถึง -แอกติน และข้อมูลเชิงปริมาณของโปรตีนสัญญาณทุกตัวถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของค่าของตัวควบคุม ข้อมูลถูกอธิบายว่าเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 และ ∗∗∗p < 0 001 เทียบกับกลุ่มควบคุม

C. Deserticola เป็นที่รู้จักกันดีในชื่อ "โสมแห่งทะเลทราย" ซึ่งแสดงถึงความปลอดภัยในการใช้ยา TCM ที่รับประทานได้นี้ [18, 19] เนื่องจากเป็นสมุนไพรโทนิคและอาหารเพื่อสุขภาพตามธรรมชาติที่ใช้กันมานานในประเทศแถบเอเชีย C. Deserticola จึงมีประโยชน์ในการเพิ่มความแข็งแรงของไต พบว่า TCM ซึ่งแต่เดิมใช้เพื่อเติมพลังและรักษาสาระสำคัญของไต มักจะใช้ในการรักษาโรคกระดูกพรุน ข้อมูลที่เผยแพร่ทั้ง ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ได้พิสูจน์ฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนของ C. Deserticola [20–23] และองค์ประกอบของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ รวมถึงเอไคนาโคไซด์และแอคทีโอไซด์เป็นส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลักที่มีอยู่ในพืชสมุนไพรที่กินได้นี้ ทั้งหมดนี้ชี้ให้เห็นว่าไม่เพียงแต่ echinacoside และ acteoside เท่านั้น แต่ยังรวมถึงส่วนประกอบ phenylethanoid glycoside อื่น ๆ ที่มีอยู่ใน C. Deserticola อีกด้วย ซึ่งถือว่ามีความรับผิดชอบต่อคุณสมบัติต้านโรคกระดูกพรุนของสมุนไพรนี้ ในการศึกษาปัจจุบันของเรา มีการใช้เรซินที่มีรูพรุนขนาดมหึมาที่มีความปลอดภัยสูงเพื่อแยกและเพิ่มคุณค่าให้กับเศษส่วนของฟีนิเลธานอยด์ไกลโคไซด์จาก C. Deserticola และโดยการใช้วิธีการ HPLC ส่วนประกอบหลักแปดประการของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ ได้แก่ แอกทีโอไซด์ F, เอชินาโคไซด์, ซิสตาโนไซด์ A พบ acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2′-acetylacteoside และ 6′-acetylacteoside ในส่วนของ pheny lethanoid glycoside ที่แยกได้ และมีเนื้อหาอยู่ที่ 3.6%, 8.8%, 5.0%, 13.3%, 3.3%, 3.6%, 9.9% และ 3.2% ตามลำดับ Echinacoside หนึ่งในสารประกอบออกฤทธิ์หลักที่บันทึกไว้ใน C. Deserticola [14] ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุน อย่างไรก็ตาม ขนาดยา 270 มก./กก. สูงมากจนจำกัดการใช้ทางคลินิกต่อไป [24] ในการทดลองปัจจุบัน เศษส่วนของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ทั้งหมดที่มีขนาดยาต่ำกว่า 60-240 มก./กก. น้ำหนักตัว/- วัน ถูกใช้กับหนู OVX และเนื้อหาขององค์ประกอบที่ระบุมีความบริสุทธิ์เกือบ 50% ในส่วนนี้โดยการใช้ วิธี HPLC

เป็นที่ทราบกันดีว่า OVX สามารถทำให้เกิดโรคกระดูกพรุนได้ และเชื่อกันว่าหนู OVX เป็นแบบจำลองคลาสสิกและเหมาะสมในการจำลองโรคกระดูกพรุนของมนุษย์ในวัยหมดประจำเดือน ในเวลาเดียวกัน มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความหนาแน่นของมวลกระดูก โครงสร้างจุลภาคของกระดูก trabecular น้ำหนักเปียกของมดลูกและช่องคลอด และระดับฮอร์โมนเอสโตรเจน ตลอดจนการเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในการสลายของกระดูกและน้ำหนักตัว ถูกสังเกตหลังการผ่าตัดรังไข่ ซึ่งอยู่ใน ส่วนหนึ่งเกิดจากการสูญเสียฮอร์โมนเอสโตรเจน [25] จนถึงขณะนี้ ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่า OVX กระตุ้นให้เกิดโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน และมักจะมาพร้อมกับคุณภาพกระดูกที่ลดลงอย่างรวดเร็ว สถาปัตยกรรมจุลภาคของกระดูก และน้ำหนักเปียกของมดลูกและช่องคลอด เนื่องจาก EV เป็นตัวแทนทดแทนฮอร์โมนทั่วไปที่ใช้ในการปฏิบัติทางคลินิก จึงถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกในการทดลอง ในสัตว์ทดลอง ของเรา และน้ำหนักตัวที่เพิ่มขึ้นและน้ำหนักมดลูกฝ่อ ตลอดจนความหนาแน่นของกระดูกที่เสื่อมลงและสถาปัตยกรรมไมโครกระดูก trabecular คาดว่าจะกลับรายการด้วยการเสริม EV แตกต่างจากกลุ่มควบคุมเชิงบวก น้ำหนักช่องคลอดและมดลูกที่ลดลง รวมถึงน้ำหนักตัวที่เพิ่มขึ้นของหนูในกลุ่มแบบจำลอง OVX ไม่ได้รับผลกระทบจากการรักษาด้วย CDP ซึ่งบอกเป็นนัยว่า CDP สามารถเพิ่มการสร้างกระดูกโดยไม่ทำให้เกิดผลข้างเคียง บนเนื้อเยื่ออินทรีย์ในร่างกายและมดลูก แม้ว่าระดับของ ERR จะถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญโดยการรักษาด้วย CDP แต่ก็เหมือนกับผลของไฟโตเอสโตรเจนที่ไม่มีผลข้างเคียงต่อเนื้อเยื่ออินทรีย์ในมดลูกและช่องคลอด นอกจากนี้ การรักษา CDP ยังช่วยเพิ่มความแข็งแกร่งให้กับคุณภาพของกระดูกในหนู OVX ที่ได้รับการเสื่อมสภาพจากการผ่าตัดรังไข่อย่างมีนัยสำคัญ

นอกจากนี้ ระดับของ P และ Ca ในปัสสาวะและซีรัมของหนู OVX ยังใช้เพื่อสะท้อนถึงฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุน และความเข้มข้นของ Ca และ P อนินทรีย์มักจะขึ้นอยู่กับระดับของ calcitonin และ PTH [26] ในการศึกษาปัจจุบัน แม้ว่าไม่มีการลดลงหรือแนวโน้มเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในระดับการขับถ่ายของ Ca ในปัสสาวะ

รูปที่ 9: กลไกระดับโมเลกุลที่ตั้งสมมุติฐาน: CDP สามารถป้องกันการสูญเสียมวลกระดูกของหนู OVX ผ่านการยับยั้ง RANKL/RANK/TRAF6- ของ NF-κB และการกระตุ้นวิถีทาง PI3K/AKT เช่นเดียวกับการกระตุ้น c-Fos และการปราบปราม NFAT2 ซึ่งเห็นได้จากการลดระดับการแสดงออกของ TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA และ NFAT2 ในขณะที่ c-Fos, AKT และ PI3K ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญโดยการรักษา CDP เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม

ได้รับซีรั่ม P, ซีรั่ม Ca และ PTH ในหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX และสังเกตระดับ P และแคลซิโทนินในปัสสาวะอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0 001) สอดคล้องกับข้อมูลที่ตีพิมพ์ว่าการขาดฮอร์โมนเอสโตรเจนที่เกิดจากการผ่าตัดรังไข่มักจะทำให้ระดับแคลซิโทนินในเลือดลดลง แคลซิโทนินในเลือดที่ลดลงนี้นำไปสู่ระดับ PTH ที่เพิ่มขึ้นในที่สุด โดยเชื่อว่า Ca เป็นตัวควบคุมหลักของการหลั่ง PTH เนื่องจากความเข้มข้นของ PTH ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม OVX และ SHAM ในการศึกษานี้ ระดับของ Ca ทั้งในซีรั่มและปัสสาวะจึงไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนระหว่างสองกลุ่มข้างต้น อย่างไรก็ตาม มีแนวโน้มลดลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับแคลซิโทนินระหว่างกลุ่ม OVX และ SHAM และด้วยเหตุนี้ เนื้อหาของ P ในปัสสาวะของ OVX จึงลดลงอย่างมาก เราเชื่อว่าข้อมูลข้างต้นอาจอธิบายปรากฏการณ์ที่ขัดแย้งว่าทำไมการขับถ่ายของระดับ Ca ในหนู OVX ทางปัสสาวะจึงไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนเมื่อเทียบกับหนู SHAM และปรากฏการณ์นี้อาจเกี่ยวข้องกับอัตราการหมุนเวียนกระดูกที่เพิ่มขึ้น [27] . หลังการรักษาด้วย CDP ระดับของ P และ Ca ในซีรัมเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด และปริมาณของ P ในปัสสาวะลดลงในหนู OVX ซึ่งสะท้อนให้เห็นว่า CDP ไม่เพียงแต่ป้องกันการขับถ่ายของแร่ธาตุในกระดูกเท่านั้น แต่ยังช่วยเพิ่มปริมาณในซีรั่มของสารเหล่านั้นด้วย องค์ประกอบจึงไประงับการสูญเสียมวลกระดูกทางอ้อม

นอกจากนี้ เครื่องหมายการสร้างกระดูกและการสลายตัวตลอดจนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระซึ่งรวมถึง SOD และ GSH ยังถูกนำมาใช้เพื่ออธิบายกลไกการต้านออสตีโอปอโรติกพื้นฐานของ CDP เช่นเดียวกับข้อมูลที่เผยแพร่ ระดับของ ALP ในหนูของกลุ่มแบบจำลอง OVX มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นที่ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ ซึ่งบ่งชี้ถึงอัตราการหมุนเวียนของกระดูกที่เร่งขึ้นในโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน [10] อย่างไรก็ตาม หลังการรักษาด้วย CDP (60, 120 และ 240 มก./กก./วัน) คุณสมบัติของ ALP ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ เป็นที่ทราบกันดีว่า OVX ทำให้ระดับฮอร์โมนเอสโตรเจนลดลงอย่างรวดเร็ว ซึ่งมักจะนำไปสู่การสลายของกระดูกมากเกินไปและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่น [28] เห็นได้จากระดับ TRAP, cathepsin K และ DPD เช่นเดียวกับ MDA ที่ควบคุมอย่างเด่นชัดในหนูแรท กลุ่มโมเดล OVX อย่างไรก็ตาม การเสื่อมสภาพเหล่านั้นได้รับการปรับปรุงบางส่วนโดยการแทรกแซงของ CDP นอกจากนี้ การบำบัดหนู OVX ด้วย CDP (60 และ 240 มก./กก.) แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของ GSH (p < 0 05) ผลลัพธ์ข้างต้นบอกเป็นนัยว่า CDP แสดงผลการรักษาโรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX และผลกระทบเหล่านี้เกิดจากการเสริมสร้างการสร้างกระดูกและการยับยั้งการสลายของกระดูก ตลอดจนการปรับปรุงระบบต่อต้านอนุมูลอิสระของกระดูก

การเปิดใช้งาน RANK โดยลิแกนด์ RANKL ของมันกระตุ้นการแสดงออกของ NFAT2 และ c-Fos ผ่านการส่งสัญญาณ PI3K/AKT และการส่งสัญญาณ NF-κB [29] NF-κBได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีความจำเป็นสำหรับการสร้างกระดูก (osteoclastogenesis) เนื่องจากการหยุดชะงักของ NF-κBอาจนำไปสู่ความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกที่บกพร่องด้วยฟีโนไทป์ของกระดูกพรุน และ NF-κB ควบคุม c-Fos และการแสดงออกของ NFAT2 ที่ลดลงในระหว่างการสร้างกระดูก RANKL / RANK / TRAF เพื่อประเมินอิทธิพลที่เป็นประโยชน์ของ CDP ต่อ NFAT2 และการสร้างกระดูกแบบพึ่งพิง c-Fos ระดับการแสดงออกของ RANKL และ RANK ได้รับการวิเคราะห์ คาดว่า CDP จะยับยั้ง NFAT2 อย่างมีนัยสำคัญและกระตุ้นระดับ c-Fos โดยการลดการแสดงออกของ RANKL และ RANK ในขณะเดียวกัน RANK เองก็ขาดคุณสมบัติไคเนสที่แท้จริงเว้นแต่จะเข้าร่วมโดย TRAF6 เพื่อกระตุ้นการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม [3] CDP ยังควบคุมการแสดงออกของ TRAF6 ซึ่งทำให้ปริมาณการจับของ RANKL และ RANK ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ กลไกการต่อต้านกระดูกพรุนที่ตั้งสมมติฐานของ CDP บนหนู OVX ครอบคลุมเส้นทางการส่งสัญญาณข้างต้น และหน่วยงานกำกับดูแลได้อธิบายไว้ในรูปที่ 9 โดยสรุป CDP ปฏิเสธระดับ TRAF6, RANKL และ RANK ดังนั้นจึงระงับเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมรวมถึง PI3K / AKT และ NF-κB ซึ่ง ถูกกระตุ้นโดย RANKL/RANK และในที่สุดก็ลดการแสดงออกและกิจกรรมของโปรตีนสร้างกระดูกที่สำคัญ NFAT2 และ c-Fos ดังนั้น ข้อมูลที่มีเบาะแสหลายประการจึงบอกเป็นนัยถึงผลประโยชน์ของ CDP ต่อการเผาผลาญของกระดูกของหนู OVX โดยหลักๆ ผ่านวิถีทาง RANKL/RANK/TRAF6-ของ PI3K/AKT และ NF-κB ที่เป็นสื่อกลาง

5. สรุป

โดยสรุป ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ทั้งหมดที่แยกได้จาก C. Deserticola แสดงผลที่เป็นประโยชน์อย่างมีนัยสำคัญต่อโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือนของหนู OVX และศักยภาพในการรักษาในการระงับการสูญเสียมวลกระดูกส่วนใหญ่ผ่านการกระตุ้นการสร้างกระดูกและการยับยั้งการสลายของกระดูก ตลอดจนการปรับปรุงสารต้านอนุมูลอิสระของกระดูก ระบบ; กลไกอาจเกี่ยวข้องกับการกระตุ้น RANKL/RANK/TRAF6- การเปิดใช้งาน NF-κB และการปิดใช้งาน PI3K/AKT เช่นเดียวกับการกระตุ้น c-Fos และการปราบปราม NFAT2 และสุดท้าย การแยกความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกก็ถูกยับยั้ง

ถังเก็บน้ำธรรมชาติเพื่อการเจริญเติบโตของกระดูกฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ 75% เอไคนาโคไซด์ 30% แอกทีโอไซด์ 12%