Atriplex Canescens: โฮสต์ใหม่สำหรับ Cistanche Deserticola

ติดต่อ:tina.xiang@wecistanche.com

Fangming Wang a, Bingyu Zhuo b, Shuai Wang c, Jin Lou c, Yuan Zhang b, Qingliang Chen a, Ziyi Shi a, Yuelin Song b, Pengfei Tu a,*

a State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs and Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing, 100191, China

b School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 102488, China

c Quheng Foundation, Asia Sci-Tech Center, 4760 Jiangnan Avenue, Binjiang, Hangzhou, Zhejiang, 310053, China

A B S T R A C T

Cistanche ทะเลทรายในอดีตมีการใช้ในการแพทย์แผนจีนเพื่อเสริมการทำงานของไต (หยาง) ให้ประโยชน์แก่เลือดและสารสำคัญ และบำรุงลำไส้เพื่อขับถ่าย โฮสต์ของมัน Haloxylon ammodendron เป็นโรงงานบุกเบิกที่สำคัญที่ใช้สำหรับการกันลมและการตรึงเนินทราย ซึ่งเป็นกลยุทธ์ที่ใช้ในการควบคุมการแปรสภาพเป็นทะเลทราย เป็นเวลานานแล้วที่ C.deserticola สามารถปรสิต H. ammodendron ได้เท่านั้น ในการศึกษานี้ ได้ทำการจำแนกลักษณะทางสัณฐานวิทยา การระบุบาร์โค้ดของยีน และการทดลองสร้างเชื้อ ในที่สุดเราก็พบว่าค. ทะเลทรายิโคลาสามารถทำให้เป็นกาฝาก Atriplex canescens ได้เช่นกัน A.canescens เป็นสายพันธุ์ของ Chenopodiaceae ที่มีการปรับตัวได้หลากหลาย เมื่อเปรียบเทียบกับ H. ammodendron แล้ว มันมีชีวมวลมากกว่าและความหลากหลายของการปรับตัวทางนิเวศวิทยา ทำให้เหมาะสำหรับการผลิตทางอุตสาหกรรมของ C. deserticola นอกจากนี้ เรายังพบว่าความเข้มข้นของส่วนประกอบออกฤทธิ์ใน C. deserticola parasitized บน A. canescens นั้นสูงกว่าในเชื้อ H. ammodendron; การค้นพบนี้แนะนำเพิ่มเติมว่าการประยุกต์ใช้ C. deserticola ในระดับที่ใหญ่กว่านั้นรับประกันการสำรวจเพิ่มเติม

คำสำคัญ: Cistanche deserticola Parasitism DNA การระบุบาร์โค้ด ยาจีนโบราณ Cistanche salsa

1. บทนำ

การใช้ Cistanche ในการแพทย์แผนจีนได้รับการบันทึกครั้งแรกใน Shennong Herbal Scripture สำหรับผลของการปรับสีไตหยาง ส่งเสริมสาระสำคัญของเลือด และทำให้ลำไส้ชุ่มชื้นเพื่อให้ทางเดินของอุจจาระ มันยังได้รับการบันทึกไว้ในผลงานของยาสมุนไพรโบราณว่า 'โสมทะเลทราย' ลำต้นเนื้อแห้งและใบเป็นสะเก็ดของCistanche ทะเลทรายYC Ma และ Cistanche tubulosa (Schenk) Wight เป็นข้อต่อแรกที่อธิบายไว้ในปี 2548 ในตำรับยาจีน Cistanche ส่วนใหญ่ปลูกใน Xingjiang มองโกเลียใน และกานซู่ของจีน และทั่วโลก พบได้ในพื้นที่กึ่งแห้งแล้งและแห้งแล้งทั่วคาบสมุทรไอบีเรียยุโรป แอฟริกาเหนือ อาระเบีย อิหร่าน อัฟกานิสถาน ปากีสถาน อินเดียเหนือ มองโกเลีย และ อัล [1]. ทนทานต่อสภาวะแวดล้อมที่รุนแรง เช่น สภาพอากาศที่แห้งแล้ง อุณหภูมิผันแปรอย่างรุนแรง และดินที่เสื่อมสภาพ [2] ตามดัชนีอนุกรมวิธานของพืชชั้นสูงของจีน มี Cistanche หกชนิดในประเทศจีน อย่างไรก็ตาม จากการศึกษาเพิ่มเติมยืนยันการมีอยู่ของเพียงสี่ชนิดและหนึ่งตัวแปรของ Cistanche กล่าวคือค. ทะเลทรายิโคลาYC Ma, C. tubulosa (Schenk)R. Wight, C. salsa(CAMey.)G.Beck, C.sinensis G.Beck และ C. salsa var. albiflora PF Tu et al,[3].

ค. ทะเลทรายิโคลาถือได้ว่าเป็นแหล่งกำเนิดดั้งเดิมแห่งเดียวของ Cistanche และมีประวัติการใช้ยามาอย่างยาวนานตั้งแต่ราชวงศ์ฮั่นตะวันออก (25 AD-220 AD)[4] ในบทสรุปของ Materia Medica (เขียนโดย Li Shizhen ราชวงศ์หมิง) ได้รับการบันทึกไว้เพื่อปรับสภาพหยางอย่างราบรื่น (ตรงกันข้ามกับสมุนไพรอื่น ๆ ที่มีฤทธิ์รุนแรงกว่า) อาร์เรย์ขององค์ประกอบทางเคมีที่มีประสิทธิภาพ ได้แก่ phenylethanoid glycosides, iridoids, lignans, alditols, oligosaccharides, polysaccharides และ alkaloids ได้ถูกแยกได้จากค. ทะเลทรายิโคลาโดยวิธีพฤกษเคมีสมัยใหม่ [5] การศึกษาทางเภสัชวิทยาแสดงให้เห็นว่าฟีนอลไกลโคไซด์เป็นส่วนประกอบหลัก และมีรายงานถึงการปรับปรุงสมรรถภาพทางเพศ ออกฤทธิ์ต่อระบบประสาท ปรับปรุงการเรียนรู้และความจำ และปกป้องตับ นอกจากนี้ยังให้ผลการรักษาต่อภาวะสมองเสื่อม โรคอัลไซเมอร์ โรคพาร์กินสัน ความเหนื่อยล้า และเนื้องอกตามที่แสดงคุณสมบัติต้านการอักเสบและภูมิคุ้มกัน [6, 7]

ค. ทะเลทรายิโคลาเป็นพืชกาฝากบังคับที่อาศัยอยู่เฉพาะบนรากของ Haloxylon ammodendron [8] การศึกษารายงานว่าไม่พบ C.deserticola ใน Haloxylon persicum [9] ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา C, deserticola ได้รับความสนใจเพิ่มมากขึ้น เนื่องจากไม่เพียงแต่เป็นแหล่งของส่วนประกอบที่มีคุณค่าทางยาเท่านั้น แต่ยังมีส่วนอย่างมากในการควบคุมการทำให้เป็นทะเลทราย [10].H. แอมโมเดนดรอนเป็นเพียงโฮสต์เดียวที่ใช้ในการศึกษาเกี่ยวกับ C. deserticola ในเดือนเมษายน 2017 Wang Shuai พนักงานของกองทุนสวัสดิการสาธารณะ Zhejiang Ouheng ได้เพาะเชื้อเมล็ดพันธุ์ C. deserticola บนต้นอ้อย Atriplex ในสวนพฤกษศาสตร์ทะเลทราย Mingin มณฑลกานซู่ และ C. deserticola บานในเดือนพฤษภาคม 2018 และดำเนินต่อไป ที่จะออกดอกจนถึงเดือนพฤษภาคม 2019 อย่างไรก็ตาม เมล็ดที่ซื้อมาจากตลาด และสงสัยว่าเป็นเมล็ดพันธุ์ของ C. deserticola จริงหรือไม่ นอกจากนี้ ปรากฏการณ์นี้ทำลายความรู้ดั้งเดิมและจำเป็นต้องศึกษาเพิ่มเติม

A. canescens เป็นไม้พุ่มยืนต้น C4 ที่มีถิ่นกำเนิดในทะเลทรายทางตะวันตกเฉียงใต้ของอเมริกา และปรับตัวให้เข้ากับสภาพความเค็ม โลหะหนัก ภัยแล้ง และอุณหภูมิสูงได้อย่างรวดเร็ว เนื่องจากมีความน่ากินสูงและอุดมไปด้วยสารอาหาร จึงใช้เป็นอาหารสัตว์สำหรับปศุสัตว์และสัตว์ขนาดใหญ่ส่วนใหญ่ [12] ยิ่งไปกว่านั้น มันมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการควบคุมการกัดเซาะและการถมที่ดินชายขอบเนื่องจากความสามารถในการปรับตัวที่ยอดเยี่ยมและระบบรากที่กว้างขวาง เปิดตัวครั้งแรกในประเทศจีนจากสหรัฐอเมริกาในปี 1989 และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการอนุรักษ์ดินและน้ำ การตรึงทราย และการฟื้นฟูดินเค็ม [13] แม้ว่าการศึกษารายงานการเติบโตของC.deserticolaบน A. canescens ล้มล้างความเข้าใจเกี่ยวกับปรสิตของ C. deserticola แต่เพียงผู้เดียว สิ่งนี้อาจกลายเป็นการค้นพบที่ปฏิวัติวงการ เนื่องจาก A. canescens เหมาะสมสำหรับการเติบโตของ C. deserticola มากกว่า เนื่องจากมีชีวมวลมากกว่าและปรับตัวได้หลากหลายทางนิเวศวิทยา เมื่อเทียบกับ H. ammodendron

เพื่อให้มั่นใจในความถูกต้องของการค้นพบโดยบังเอิญ ได้มีการทำการทดสอบการระบุพืชและการทดลองเพาะเชื้อเทียม การระบุพืชแบบดั้งเดิมรวมถึงการประเมินทางประสาทสัมผัส (เช่น การสัมผัส กลิ่น การมองเห็น และรสชาติ) การวิเคราะห์ลักษณะทางสัณฐานวิทยา (เช่น กล้องจุลทรรศน์และกล้องจุลทรรศน์) และการทำโปรไฟล์ทางเคมี (เช่น โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง และก๊าซ โครมาโตกราฟี)[14]. มันค่อนข้างง่ายที่จะแยก C. tubulosa และ C. Sinensis เนื่องจากความแตกต่างของขนาด สี และการจัดเรียงของมัดของหลอดเลือดในก้าน ความท้าทายที่แท้จริงคือการแยกแยะระหว่าง C. deserticola และ C. salsa ตามรายงานของ Flora of China ความยาวของกาบของ C. salsa นั้นอยู่ที่ประมาณ 1/3 ของกลีบดอก ในขณะที่ C. deserticola จะเท่ากัน การเปลี่ยนแปลงของลำต้นเนื้อมีความคล้ายคลึงกันระหว่าง C. deserticola และ C. salsa และประกอบด้วยผิวหนังชั้นนอก เยื่อหุ้มสมอง มัดของหลอดเลือด และส่วนปลาย ข้อแตกต่างที่สำคัญอยู่ในปลอกหุ้มหลอดเลือดเนื่องจากเป็นหางสำหรับ C. deserticola และรูปสามเหลี่ยมหรือครึ่งวงกลมสำหรับ C. salsa

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา เทคโนโลยีบาร์โค้ดของ DNA มักถูกใช้เพื่อระบุชนิดพันธุ์ เป็นกระบวนการที่ใช้ลำดับดีเอ็นเอสั้นๆ จากจีโนมมาตรฐาน ซึ่งโดยทั่วไปแล้วจะอนุรักษ์ไว้และไม่ได้รับผลกระทบจากปัจจัยภายนอก เช่น อายุและประเภทของเนื้อเยื่อพืช ลำดับที่ได้รับความนิยมสำหรับบาร์โค้ด DNA ของพืช ได้แก่ rbcL, matK, psbA-trnH, ITS และ ITS2 [15] จากการศึกษาหลายชิ้นระบุว่า ITS/ITS2 เป็นเครื่องมือในการจำแนกพืชที่มีประสิทธิภาพสูงสุด นอกจากนี้ยังมีข้อเสนอแนะว่าควรรวมภูมิภาค ITS2 เข้ากับบาร์โค้ดหลักเนื่องจากมีอำนาจในการเลือกปฏิบัติที่สูงกว่าบาร์โค้ดแบบพลาสติด เป็นที่ยอมรับว่า ITS2 สามารถใช้เป็นบาร์โค้ดสากลแบบใหม่สำหรับการระบุแท็กซ่าพืชได้หลากหลาย [16, 17,18, 19,20,21] แม้ว่าการศึกษาจำนวนมากได้พยายามระบุบาร์โค้ดพืชแบบสากล แต่ไม่มี loci ใดที่ใช้ได้กับทุกสายพันธุ์ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้วิธีการหลายตำแหน่งเพื่อแยกแยะระหว่างสายพันธุ์พืช [22,23,24,25,26,27, 28].ในการศึกษานี้ ITS2, rbcL,psbA-trnL ถูกใช้เป็นบาร์โค้ด

นอกจากเทคนิคการระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุลแล้ว หลักฐานโดยตรงยังมาจากการทดลองการเพาะเชื้อ จำเป็นต้องมีการทดลองฉีดวัคซีนเพื่อแสดงให้เห็นว่า C. deserticola สามารถทำให้เกิดปรสิต A. canescens ได้ นอกเหนือจากการระบุแล้ว การควบคุมคุณภาพยังเป็นข้อพิจารณาหลักอีกด้วย จำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อยืนยันความแตกต่างระหว่างคุณภาพของ C.deserticolaparasitized บนราก H. ammodendron และปรสิตบน A. canescent

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. วัสดุปลูก

Cistanche เติบโตบนดินปนทรายอ่อนที่มีความเค็มเล็กน้อย โดยทั่วไปแล้วจะเป็นกาฝากบนรากด้านลึก 30-100 ซม. ของโฮสต์ สภาพภูมิอากาศในพื้นที่ปลูกที่เหมาะสมคือ แห้งแล้ง มีฝนตกน้อย มีการระเหยเป็นไอมาก ชั่วโมงแสงแดดยาวนาน และอุณหภูมิแตกต่างกันมากระหว่างกลางวันและกลางคืน เขต Minqin และเมือง Baiving เป็นสถานที่รวบรวมตัวอย่างเหล่านี้ โดยอยู่ใกล้กันทางภูมิศาสตร์ และมีภูมิอากาศแบบภาคพื้นทวีปที่แห้งแล้ง โดยมีปริมาณน้ำฝนเฉลี่ยต่อปี 113.2 มม. และความชื้นสัมพัทธ์เฉลี่ยต่อปี 44 เปอร์เซ็นต์ ข้อมูลการเก็บตัวอย่างเฉพาะและรายละเอียดแสดงในตารางที่ 1 ตัวอย่างทั้งหมดถูกแช่แข็งและเก็บรักษาไว้ที่ -20 องศาใน State Key Laboratory of Natural and Bio-mimetic Drugs Lab กรุงปักกิ่ง ประเทศจีน

2.2. การย้อมสีและการสังเกตเนื้อเยื่อ

เก็บตัวอย่างสดและเก็บไว้ในสารละลายที่ประกอบด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ กรดอะซิติกน้ำแข็ง และฟอร์มัลดีไฮด์ในอัตราส่วน 90:5:5 และถูกทำให้แห้งโดยใช้เกรเดียนต์ของเอทานอล (75 เปอร์เซ็นต์ , 95 เปอร์เซ็นต์ , 100 เปอร์เซ็นต์ , 100 เปอร์เซ็นต์ ) เป็นเวลา 1 ชม. ส่วนที่แห้งแล้วถูกไล่ระดับด้วยไซลีน (25 เปอร์เซ็นต์ ,50 เปอร์เซ็นต์ ,75 เปอร์เซ็นต์ ,100 เปอร์เซ็นต์ ,100 เปอร์เซ็นต์ ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้ได้ส่วนที่โปร่งใส ส่วนที่โปร่งใสอยู่ภายใต้การแทรกซึมของพาราฟิน ที่ซึ่งปริมาตรของพาราฟินที่เท่ากับปริมาตรของไซลีนถูกเติมไปยังไซลีนที่มีตัวอย่าง จากนั้นครึ่งหนึ่งของสารละลายที่เป็นผลลัพธ์ถูกดูดออกมา และปริมาตรที่เท่ากันของพาราฟินถูกเติมอีกครั้ง กระบวนการนี้ซ้ำแล้วซ้ำอีก 10 ครั้ง และในที่สุด สารละลายทั้งหมดถูกดึงออกมาและแทนที่ด้วยพาราฟินในปริมาณที่เท่ากัน ขั้นตอนสุดท้ายนี้ทำซ้ำสองครั้ง และสารละลายที่เป็นผลลัพธ์หลังจากแต่ละขั้นตอนถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 75 องศา หลังจากการแทรกซึมของพาราฟิน ส่วนต่างๆ ถูกฝัง ที่ซึ่งตัวอย่างถูกวางในถังเหล็กที่มีพาราฟินเหลวและพาราฟินเหลวเพิ่มเติมถูกเติมอย่างรวดเร็วเพื่อเติมทั้งถังและปล่อยทิ้งไว้ให้แข็งตัว บล็อกแว็กซ์ที่เป็นผลลัพธ์ถูกตัดแต่งและแบ่งส่วน ส่วนที่ฝังอยู่ในน้ำอุ่น จับปลา วางบนสไลด์ และฟักที่อุณหภูมิ 45 องศาเป็นเวลา 30 นาที ส่วนที่อยู่บนสไลด์ถูกล้างออกโดยการแช่ในไซลีน 100 เปอร์เซ็นต์ ไซลีน 100 เปอร์เซ็นต์ ไซลีน 50 เปอร์เซ็นต์ ไซลีน 50 เปอร์เซ็นต์ เอธานอล 100 เปอร์เซ็นต์ เอทานอล 100 เปอร์เซ็นต์ เอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ และเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นแช่ในซาฟรานีน O เป็นเวลา 40 ปี นาที ตามมาด้วยการแช่เอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์และเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์อย่างรวดเร็วต่อเนื่องอีกรอบ จากนั้นสไลด์จะถูกแช่ในสีเขียวอย่างรวดเร็วเป็นเวลา 1 นาที สุดท้าย ชิ้นส่วนต่างๆ ถูกแช่ในเอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์ เอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์ เอธานอล 100 เปอร์เซ็นต์ เอธานอล 100 เปอร์เซ็นต์ ไซลีน 50 เปอร์เซ็นต์ ไซลีน 50 เปอร์เซ็นต์ และไซลีน 100 เปอร์เซ็นต์ หลังจากที่ส่วนต่างๆ ถูกย้อมแล้ว วางกาวเรซินหนึ่งหยดบนสไลด์ และวางแก้วครอบทับไว้ ภาพนิ่งถูกปล่อยทิ้งไว้โดยไม่ถูกรบกวนเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ และส่วนเนื้อเยื่อถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลของโอลิมปัสและถ่ายภาพ

2.3. การสกัดดีเอ็นเอและการขยาย PCR

DNA จีโนมทั้งหมดถูกสกัดจากตัวอย่างดอกไม้โดยใช้ชุดสกัด DNA จีโนมของพืช (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., ปักกิ่ง, จีน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ไพรเมอร์สำหรับการขยายและจัดลำดับยีนและสภาวะของปฏิกิริยาแสดงไว้ในตารางที่ 2 การขยายยีนแต่ละครั้งจะถูกทำซ้ำสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง

2.4. การวิเคราะห์ลำดับ

เพื่อให้ได้ลำดับที่ถูกต้อง ผลิตภัณฑ์ PCR ขั้นสุดท้ายหลังจากการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ Transgene Quick Gel Extraction Kits จะถูกโคลนแยกเป็น pEASY-Blunt Cloning Vectors ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากการโคลนนิ่ง พวกมันถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์ Trans5a ที่มีคุณสมบัติทางเคมี สามโคโลนีของแต่ละตัวอย่างถูกสุ่มเลือกและจัดลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ M13 โคโลนีเหล่านี้ถูกจัดลำดับแบบสองทิศทางโดยการจัดลำดับ Sanger โดยใช้ BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kits บนเครื่องวิเคราะห์ DNA ABI Prism 3700 ลำดับที่ได้รับถูกจัดเรียงโดยใช้ Clustal X(v1.8.7) [29] และซิงโครไนซ์ด้วยตนเองใน BioEdit(v.1.3.0)[30.Utilizing ข้อมูลลำดับที่จัดชิด เราสร้างสายวิวัฒนาการใหม่โดยใช้ซอฟต์แวร์ MEGA 7 โดยใช้การเข้าร่วมเพื่อนบ้าน (NJ) วิธีการ ใช้โมเดลพารามิเตอร์ Kimura 2-พารามิเตอร์ (K2P) และบูตสแตรปซ้ำ 1,000 ครั้ง [31]

2.5. การฉีดวัคซีน C. deserticola

ใส่เมล็ด C. deserticola สามกรัมลงในกระถาง (เส้นผ่านศูนย์กลาง × สูง× เส้นผ่านศูนย์กลางด้านล่าง=20 ซม.×20 ซม.×12 ซม.) ที่ใส่ดินปนทรายและคนให้เข้ากันเพื่อให้กระจายตัวสม่ำเสมอ กลุ่มควบคุมประกอบด้วยเมล็ด C. salsa 3 กรัม เติมลงในกระถางที่คล้ายกันซึ่งมีดินปนทราย ในที่สุด ก. canescens ถูกปลูกในกระถางแต่ละใบ และวางกระถางไว้กลางแจ้ง เมื่อความชื้นในดินน้อยกว่าร้อยละ 13 (g/g) ให้รดน้ำในกระถาง การทดลองได้ดำเนินการที่อุทยานวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต Zhongguancun กรุงปักกิ่ง ประเทศจีน (ละติจูด 39 องศา 56'N ลองจิจูด 116 องศา 20'E;20 ​​เมตรเหนือระดับน้ำทะเล) ตั้งแต่เดือนพฤษภาคมถึงกรกฎาคม อุณหภูมิกลางวันแปรผันระหว่าง 16 ถึง 35 องศา อุณหภูมิกลางคืนระหว่าง 12 ถึง 16 องศา ความชื้นสัมพัทธ์ของอากาศมากกว่าร้อยละ 50 แสงแดดมีมากมาย ประมาณ 80 วันต่อมา ดินจะถูกลบออกจากกระถางและกำหนดอัตราการเพาะเชื้อ

2.6. การกำหนดความเข้มข้นของส่วนประกอบยา

การกำหนดความเข้มข้นของส่วนประกอบทางยาประกอบด้วยสองส่วน ส่วนหนึ่งคือขั้นตอนสำหรับโครมาโตกราฟีเหลว และอีกส่วนคือการเตรียมสารอ้างอิงและสารทดสอบ โดยมีรายละเอียดเพิ่มเติมดังนี้

ผม). การหาค่าเอไคนาโคไซด์และเวอร์บาสโคไซด์

Echinacoside และ verbascoside ถูกชั่งน้ำหนักและเติมใน 50 เปอร์เซ็นต์เมทานอลเพื่อให้ผลผลิตเป็นสารละลาย 0.2 มก./มล. ซึ่งถูกใช้เป็นสารละลายอ้างอิง ขั้นแรกให้บด C. deserticola แห้งให้เป็นผง จากนั้นผสมผงลงใน 50 มล. ของเมทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ ในขวดปริมาตรสีน้ำตาล 100 มล. และรับของเหลวทดสอบหลังจากนำส่วนผสมไปเขย่า แช่ sonication ยืน และการกรอง คอลัมน์โครมาโตกราฟีคือคอลัมน์ Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 มม. ×150 มม.,5um) โดยมีเมธานอล(A)-0.1 เปอร์เซ็นต์ สารละลายกรดฟอร์มิก (B) เป็นเฟสเคลื่อนที่, การชะด้วยเกรเดียนต์ ({{14} } นาที 26.5 เปอร์เซ็นต์ A;17-20 นาที 26.5 เปอร์เซ็นต์ →29.5 เปอร์เซ็นต์ A; 20-27 นาที,29.5 เปอร์เซ็นต์ A) อัตราการไหล 1.0 มล./นาที อุณหภูมิคอลัมน์ 35·C ความยาวคลื่นที่ตรวจจับ คือ 330 นาโนเมตร ปริมาตรการฉีดคือ 10μul

ii) การหาค่าเบทาอีน แมนนิทอล ฟรุกโตส กลูโคส และซูโครส

เบทาอีน แมนนิทอล ฟรุกโตส กลูโคส และซูโครสถูกชั่งน้ำหนักอย่างแม่นยำและเติมลงในน้ำเพื่อทำเป็นสารละลาย {{0}}.25 มก./มล. ซึ่งถูกใช้เป็นสารละลายอ้างอิง สารละลายทดสอบ Cistanche ที่กล่าวถึงข้างต้น 5 มิลลิลิตรผสมกับเมทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ในขวดปริมาตร 25 มล. เขย่าให้เข้ากัน และกรองด้วยเมมเบรนที่มีรูพรุนขนาด 0.2um คอลัมน์โครมาโตกราฟีคือ SHODEXASHAIPAK NH2P-50 4E polymerized gel column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) เฟสเคลื่อนที่ถูกปรสิตบน A. canescens เราพบว่ามีปลอกหุ้มหลอดเลือดรูปหาง คล้ายกับของ C. deserticola(รูปที่ 2).

acetonitrile-water (77:23) อัตราการไหล 0 .7 mL/min อุณหภูมิของคอลัมน์คือ 25 องศา โดยใช้เครื่องตรวจจับการกระเจิงของแสงระเหย (ELSD) อุณหภูมิของท่อลอยคือ 100 องศา ตัวพา อัตราการไหลของก๊าซเท่ากับ 3 ลิตร/นาที ปริมาตรการฉีดของสารอ้างอิงและตัวอย่างเท่ากับ5ul

3. ผลลัพธ์

3.1. การระบุสัณฐานวิทยาของดอกไม้

เพื่อยืนยันชนิดของ Cistanche ที่เป็นปรสิตของ A. canescens ได้ทำการวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาของตัวอย่างดอกไม้ (รูปที่ 1 และรูปที่ S1) สัณฐานวิทยาโดยรวมของดอกไม้ของพืชกาฝากมีความคล้ายคลึงกับของ C. deserticola นอกจากนี้ กลีบยังหนากว่าของ C.salsa ในแต่ละโฮสต์

ตามรายงานของ Flora of China C. deserticola และ C.salsa มีความแตกต่างที่ชัดเจนในกาบของดอกไม้ ใน C. deserticola กาบจะมีขนาดเท่ากับกลีบ ขณะที่กาบของ C. salsa จะมีความยาว 1/3 ของกลีบ จากการวิเคราะห์ทางสถิติของเรา ใบประดับของ Cistanche ปรสิตบน A. canescens และของ C. deserticola เท่ากับกลีบย่อย (รูปที่ S2) Cistanche บน A. canescens มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ C. deserticola โดยบอกว่า C. deserticola อาจเป็นปรสิตใน A. canescens

3.2. การระบุตัวอย่างเนื้อเยื่อสีด้วยกล้องจุลทรรศน์

การตัดขวางของลำต้นที่เป็นเนื้อของ C. deserticola นั้นคล้ายกับของ C. salsa และทั้งคู่ประกอบด้วยผิวหนังชั้นนอก คอร์เทกซ์ มัดของหลอดเลือด และส่วนปลาย มัดของหลอดเลือดของพืชทั้งสองนั้นจัดเรียงเป็นวงหยักหรือเป็นคลื่นลึกและมองเห็นส่วนปลายได้ชัดเจน ความแตกต่างหลักอยู่ที่รูปร่างด้านข้างของปลอกหุ้มหลอดเลือด มีหางใน C. deserticola และรูปสามเหลี่ยมหรือครึ่งวงกลมใน C. salsa เมื่อทำการวิเคราะห์โครงสร้างจุลภาคบน Cistanche

3.3. การระบุโมเลกุล

นอกจากการระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาแล้ว เรายังดำเนินการระบุโมเลกุลและเลือกชิ้นส่วนยีนสามชิ้น ได้แก่ ITS2, rbcL และ psbA-trnL ต้นไม้วิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นโดยใช้ข้อมูลลำดับของแต่ละส่วน (รูปที่ 3) และต้นไม้สายวิวัฒนาการทั้งสามต้นแสดงให้เห็นว่า Cistanche parasitized บน A.canescens มีความสัมพันธ์สายวิวัฒนาการอย่างใกล้ชิดกับ C. deserticola ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า C. deserticola อาจเป็นปรสิตบน A. canescens

ความแตกต่างของยีนโดยละเอียดระหว่างสปีชีส์ Cistanche ที่ต่างกันถูกสังเกตจากการเรียงตัวแบบหลายลำดับ (รูปที่ 4) เราพบความแตกต่างของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNPs) สามตัวในร่างกายของยีน ITS2 ระหว่าง C. deserticola และ C.salsa ที่ฐาน 139,295 และ 472 ในร่างกายของยีน rbcL มียีนที่แตกต่างกันสี่ตัวระหว่าง C. deserticola และ C. salsa มี SNP สองรายการและการกลายพันธุ์ของการแทรกและการลบ (indel) สองครั้ง เมื่อเปรียบเทียบกับ ITS2 และ rbL ความแตกต่างในร่างกายของยีน psbA-trnL ระหว่าง C. deserticola และ C. salsa นั้นชัดเจนกว่า โดยมีความแตกต่างของลำดับเจ็ดลำดับ โดยที่สี่คือ SNP และสามรายการเป็นการกลายพันธุ์ของ InDel โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ชุดของไทมีนที่ทำซ้ำ โดยเริ่มต้นที่ฐาน 414 ของลำดับที่จัดแนว สามารถใช้เพื่อพัฒนาตัวทำเครื่องหมายการทำซ้ำของลำดับอย่างง่าย (SSR) สำหรับการแยกความแตกต่างของ C. deserticola และ C. salsa

3.4. การฉีดวัคซีน C. deserticola

เพื่อทดสอบว่า C. deserticola หรือ C. salsa สามารถทำให้เกิดพยาธิ A.canescens ได้หรือไม่ ได้ทำการทดลองฉีดวัคซีน และเราพบหลักฐานของปรสิตในหม้อที่ฉีดวัคซีน C.deserticola ทั้งหมดที่มีอัตราการสร้างเชื้อเกือบ 100 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 5) ไม่พบพยาธิในกลุ่มควบคุม ผลลัพธ์นี้พิสูจน์ได้โดยตรงว่า C. deserticola ปรสิต A. canescens ได้ง่าย ในขณะที่ C. salsa ไม่สามารถทำได้

3.5. การหาความเข้มข้นของส่วนประกอบทางยาที่สำคัญ

เราประมาณความเข้มข้นของส่วนประกอบทางยาที่สำคัญใน C.deserticola ที่ปรสิต A. canescens โครมาโตแกรมเฉพาะจะแสดงในวัสดุเสริม เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำ มีการตั้งค่าการทดลองอิสระสี่ครั้ง จากการวัดของเรา (ตารางที่ 3) เราพบว่าความเข้มข้นของ verbascoside และ echinacoside สูงกว่าที่รายงานในเภสัชตำรับจีน 20 เท่า (ตามตำรับยาจีน เปอร์เซ็นต์ของผลรวมของความเข้มข้นของ echinacoside และ verbascoside ใน C. deserticola ควรน้อยกว่า 0.30 เปอร์เซ็นต์ ) ความเข้มข้นยังสูงกว่าใน C. deserticola parasitized บน H. ammodendron อย่างมีนัยสำคัญ (โดยทั่วไป 0.2-1.5 เปอร์เซ็นต์ )[32] ความเข้มข้นของแมนนิทอล เบทาอีน ฟรุกโตส และส่วนประกอบคาร์โบไฮเดรตอื่นๆ ก็สูงมากเช่นกัน และคุณภาพโดยรวมดีกว่าใน C. deserticola parasitized บน H. ammodendron ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า A. canescens สามารถใช้ในการปลูก C. deserticola ในระดับอุตสาหกรรมและปกป้องทรัพยากรป่าที่ใกล้สูญพันธุ์

4. การอภิปราย

ก่อนหน้านี้ C. deserticola ได้รับการพิจารณาว่าเป็นปรสิต H. ammodendron โดยเฉพาะ อย่างไรก็ตาม ในการศึกษานี้ โดยใช้เทคนิคการจำแนกทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุล เราแสดงให้เห็นว่า C. deserticola สามารถทำให้เป็นพยาธิ A. canescens ได้เช่นกัน แม้ว่า H. ammodendron, A. canescens และ H. persicum ทั้งหมดเป็นของตระกูล Chenopodiaceae แต่ก็เป็นเรื่องที่น่าสนใจและแปลกประหลาดที่ C. deserticola มีการคัดเลือกสายพันธุ์ ซึ่งอาจควบคุมโดยโมเลกุลส่งสัญญาณที่โฮสต์ออกมา A. canescens ซึ่งมีต้นกำเนิดจากประเทศสหรัฐอเมริกา มีความทนทานต่อการรบกวนสิ่งแวดล้อมและมีชีวมวลที่ค่อนข้างใหญ่ A. canescens เป็นโฮสต์ที่เหมาะสมสำหรับ C. deserticola ด้วยเหตุผลหลายประการ ประการแรก มันสามารถอยู่รอดได้ในสภาวะแวดล้อมที่หลากหลาย ประการที่สอง ชีวมวลและอัตราการเติบโตของ C. deserticola อาจใหญ่กว่าและเร็วกว่าตามลำดับ บน A. canescens มากกว่า H. ammodendron ประการที่สาม เนื่องจากความสามารถในการปรับตัวของ A. canescens ที่หลากหลาย ทำให้พื้นที่ปลูกสามารถขยายได้อีก ดังนั้น A. canescens จึงมีข้อได้เปรียบที่โดดเด่นเหนือ H. ammodendron ในฐานะเจ้าบ้าน และจะช่วยในการผลิตทางอุตสาหกรรมของ C. deserticola C. deserticola และ C. salsa นั้นแยกแยะได้ยาก และการระบุทางสัณฐานวิทยาในอดีตได้ให้ผลลัพธ์ที่น่าสับสน ด้วยความก้าวหน้าในด้านอณูชีววิทยา เทคนิคการระบุตามโมเลกุลจึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในยาสมุนไพรจีน เนื่องจากยาสมุนไพรจีนส่วนใหญ่ให้ข้อมูลจีโนมเพียงเล็กน้อย เทคโนโลยีบาร์โค้ดของดีเอ็นเอจึงกลายเป็นเทคนิคการระบุตัวตนที่ล้ำสมัย ในการศึกษานี้ เทคโนโลยีบาร์โค้ดและสัณฐานวิทยาถูกนำมาใช้อย่างครอบคลุมเพื่อระบุสายพันธุ์ Cistanche ที่ไม่รู้จัก สิ่งนี้ไม่เคยเกิดขึ้นมาก่อน และผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าแนวทางนี้เป็นไปได้ เนื่องจาก C. deserticola parasitizes A. canescens สิ่งสำคัญคือต้องกำหนดความแตกต่างในคุณภาพของ C. deserticola บนรากของ A. canescens และบนรากของ H. ammodendron จากผลลัพธ์ของเรา ความเข้มข้นของส่วนประกอบออกฤทธิ์ใน C. deserticola parasitized บน A. canescens นั้นสูงกว่าในเชื้อ H. ammodendron ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงวางรากฐานทางทฤษฎีที่มั่นคงสำหรับการผลิต C. deserticola ขนาดใหญ่ที่ปรสิตบน A. canescens

5. สรุปผลการวิจัย

เป็นเวลานาน C. deserticola ได้รับการพิจารณาว่าเป็นปรสิต H. ammodendron โดยเฉพาะ ก่อนหน้านี้ พบว่าเมล็ด C. deserticola ที่ซื้อจากตลาดสามารถทำให้เกิดปรสิต A. canescens ซึ่งเป็นพืช Chenopodiaceae อีกชนิดหนึ่งได้ โดยใช้วิธีการระบุทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุล เรายืนยันว่าสปีชีส์ Cistanche ที่เป็นปรสิต A. canescens คือ C. deserticola ผลลัพธ์นี้ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมจากการทดลองการเพาะเชื้อ เรากำหนดความเข้มข้นของส่วนประกอบทางยาที่สำคัญ และผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าความเข้มข้นและคุณภาพของส่วนประกอบมีมากกว่าใน C,deserticola parasitized บน A.canescens มากกว่าในเชื้อ H. ammodendron การค้นพบโฮสต์ใหม่สามารถส่งเสริมการผลิตทางอุตสาหกรรมของ C. deserticola และยังสามารถปกป้องทรัพยากรป่าและสภาพแวดล้อมทางนิเวศวิทยาได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ประกาศ

คำชี้แจงผลงานของผู้เขียน

Fangming Wang: คิดและออกแบบการทดลอง ทำการทดลอง; วิเคราะห์และตีความข้อมูล เขียนกระดาษ

Bingyu Zhuo, Yuan Zhang, Qingliang Chen, Ziyi Shi& Yuelin Song: ทำการทดลอง

Shuai Wang & Jin Lou: รีเอเจนต์ วัสดุ เครื่องมือวิเคราะห์ หรือข้อมูลที่สนับสนุน

เผิงเฟยตู่: คิดและออกแบบการทดลอง

งบลงทุน

Fangming Wang ได้รับการสนับสนุนจากโครงการวิจัยและพัฒนาหลักแห่งชาติของจีน (2019YFC1710903)

Dr.Pengfei Tu ได้รับการสนับสนุนจาก National Natural Science Foundation of China (8177140819)

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล

ข้อมูลจะถูกจัดให้ตามคำขอ

ถ้อยแถลงผลประโยชน์

ผู้เขียนประกาศไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

อ้างอิง

[1] DY Tan, QS Guo, CL Wang, ศึกษาสภาพที่เป็นอยู่ของ Cistanche Deserticola และการใช้ประโยชน์และการใช้ประโยชน์ในประเทศจีน, For. ทรัพยากร จัดการ. 33 (2004) 29–32. [2] XY Qiao, HL Wang, YH Guo, ศึกษาเงื่อนไขการงอกของเมล็ด Cistanche, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32 (2007) 1848–1850

[3] PF Tu, YP He, ZC Lou, การสำรวจแหล่งที่มาและการปกป้องทรัพยากรของ Cistanche, Chin ตราด. สมุนไพร. ยา 25 (1994) 205–208

[4] LD Karalliedde, CT Kappagoda, ความท้าทายของยาจีนโบราณสำหรับผู้ปฏิบัติงาน allopathic, Am. เจ. ฟิสิออล. การเต้นของหัวใจ ฟิสิออล 297 (2009) 1967–1969.

[5] Y. Jiang, PF Tu, การวิเคราะห์องค์ประกอบทางเคมีในสายพันธุ์ Cistanche, J. Chromatogr 1216 (2552) 2513-2522

[6] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "dessert ginseng": บทวิจารณ์, Am. เจ. ชิน. เมดิ. 40 (2012) 1123–1141.

[7] Pharmacopoeia NCOC, Pharmacopoeia of the People's Republic of China, The Chemical Industry Press, Beijing, 2020.

[8] GX Meng, XS Cui, Y. Wu, YH Guo, ผลของ Leveillula saxaouli ต่อการเจริญเติบโต, คลอโรฟิลล์และคาร์โบไฮเดรตของ Haloxylon ammodendron, North พืชสวน 14 (2012) 141–143.

[9] YC Chen, M. Li, MZ Wu, YX Song, โครงสร้างและองค์ประกอบของรากใน Haloxylon Bunge สองสายพันธุ์ Plant Physiol จ. 49 (2013) 1273–1276.

[10] PF Tu, Y. Jiang, YH Guo, YZ Tian, ​​et al., การพัฒนาอุตสาหกรรมเชิงนิเวศวิทยาของ Cistanches herba เพื่อส่งเสริมอารยธรรมนิเวศวิทยาของภูมิภาคทะเลทรายตะวันตก, Mod. คาง. เมดิ. 4 (2015) 297–301.

[11] SC Sanderson, HC Stutz, หมายเลขโครโมโซมสูงในทะเลทราย Mojavean และ Sonoran Atriplex canescens (Chenopodiaceae), Am. เจ บอท. 81 (1994) 1045–1053.

[12] JL Peterson, DN Ueckert, RL Potter, JE Huston, Ecotypic การเปลี่ยนแปลงในประชากร Saltbush สี่ปีกที่เลือกไว้ทางตะวันตกของ Texas, J. Range Manag 40 (1987) 361–366.

[13] DS Kong ลักษณะทางสัณฐานวิทยาและการปรับตัวทางสรีรวิทยาเชิงนิเวศของ Atriplex canescens a review, Chin เจ. อีคอล. 32 (2013) 210–216.

[14] MA Bashir, MS Faezah, SSO Mohd, W. Alina, รีวิว: ลายนิ้วมือบาร์โค้ดและโครมาโตกราฟีของ DNA สำหรับการรับรองความถูกต้องของพฤกษศาสตร์ในผลิตภัณฑ์ยาสมุนไพร ชัดเจน ส่วนประกอบพื้นฐาน ทางเลือก เมดิ. 2017 (2017) 1-28.

[15] XW Li, Y. Yang, et al., บาร์โค้ด DNA ของพืช: จากยีนสู่จีโนม, Biol. รายได้ 90 (2015) 157–166

[16] SL Chen, H. Yao, JP Han, et al., การตรวจสอบความถูกต้องของภูมิภาค ITS2 เป็นบาร์โค้ด DNA แบบใหม่สำหรับการระบุชนิดของพืชสมุนไพร, PloS One 5 (2010), e8613

[17] K. Luo, SL Chen, KL Chen, et al., การประเมินบาร์โค้ด DNA ของพืชที่สมัครสอบโดยใช้ตระกูล Rutaceae, Sci. วิทยาศาสตร์ชีวิตจีน. 53 (2010) 701–708.

[18] T. Gao, H. Yao, JY Song, et al., การระบุพืชสมุนไพรในตระกูล Fabaceae โดยใช้บาร์โค้ด DNA ที่มีศักยภาพ ITS2, J. Ethnopharmacol 130 (2010) 116–121.

[19] T. Gao, H. Yao, JY Song, et al., การประเมินความเป็นไปได้ของการใช้บาร์โค้ด DNA ของผู้สมัครในการเลือกปฏิบัติของตระกูล Asteraceae ขนาดใหญ่ BMC Evol ไบโอล. 10 (2010) 324.

[20] XH Pang, JY Song, YJ Zhu, et al., การใช้บาร์โค้ดของ DNA เพื่อระบุสายพันธุ์ภายใน Euphorbiaceae, Planta Med 76 (2010) 1784–1786.

[21] XH Pang, JY Song, YJ Zhu, et al., การใช้บาร์โค้ด DNA ของพืชเพื่อระบุสายพันธุ์ Rosaceae, Cladistics 27 (2011) 165–170

[22] PD Hebert, EH Penton, JM Burns, DH Janzen, W. Hallwachs, 10 สปีชีส์ในหนึ่งเดียว: DNA barcoding เผยให้เห็นสปีชีส์ที่คลุมเครือในผีเสื้อสกิปเปอร์ neotropical Astraptes fulguration, Proc. แนท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 101 (2004) 14812–14817

[23] MW Chase, RS Cowan, et al., A offer for a standardized protocol to barcode all land plants, Taxon 56 (2007) 295–299.

[24] WJ Kress, DL Erickson, บาร์โค้ด DNA ระดับโลกสองตำแหน่งสำหรับพืชบนบก: ยีนเข้ารหัส rbcL เติมเต็มพื้นที่เว้นวรรค trnH-psbA ที่ไม่ได้เข้ารหัส, PloS One 2 (2007) e508

[25] DL Erickson, J. Spouge, A. Resch, et al., บาร์โค้ด DNA ในพืชบก: การพัฒนามาตรฐานเพื่อหาปริมาณความสำเร็จสูงสุด Taxon 57 (2008) 1304–1316 [26] NC Kane, Q. Cronk, พฤกษศาสตร์ไร้พรมแดน: โฟกัสบาร์โค้ด, โมล อีโคล. 17 (2008) 5175–5176.

[27] R. Lahaye, M. van der Bank, D. Bogarin, et al., DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots, Proc. (26) แนท อคาเด วิทย์. สหรัฐอเมริกา 105 (2008) 2923–2928

[28] N. Kane, S. Sveinsson, H. Dempewolf, et al., Ultra-barcoding ในโกโก้ (Theobroma spp.; Malvaceae) โดยใช้จีโนมคลอโรพลาสต์ทั้งหมดและ DNA ไรโบโซมนิวเคลียร์ Am. เจ บอท. 99 (2012) 320–329.

[29] JD Thompson, TJ Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, DG Higgins, อินเทอร์เฟซหน้าต่าง CLUSTAL_X: กลยุทธ์ที่ยืดหยุ่นสำหรับการจัดตำแหน่งหลายลำดับซึ่งได้รับความช่วยเหลือจากเครื่องมือวิเคราะห์คุณภาพ, ความละเอียดของกรดนิวคลีอิก 25 (1997) 4876–4882.

[30] TA Hall, BioEdit: โปรแกรมแก้ไขการจัดลำดับทางชีวภาพที่เป็นมิตรกับผู้ใช้และโปรแกรมวิเคราะห์สำหรับ windows 95/98/NT, Nucl. อาการกรด เซอร์ 41 (1999) 95–98. [31] S. Kumar, M. Nei, J. Dudley, K. Tamura, MEGA: ซอฟต์แวร์ที่เน้นนักชีววิทยาเป็นศูนย์กลางสำหรับการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการของลำดับดีเอ็นเอและโปรตีน, บทสรุป ไบโออินฟอร์ม 9 (2008) 299–306.

[32] PF Tu, B. Wang, T. Deyama, ZG Zhang, ZC Lou, การวิเคราะห์ phenylethanoid glycosides ของ Herba cistanche โดย RP-HPLC, Acta Pharm ซินิก้า. 32 (1997) 294–300.