ASK1 Inhibitor NQDI‑1 ลดความเครียดออกซิเดทีฟและเซลล์ประสาทผ่าน ASK1/p38 และ JNK Signaling Pathway ในการบาดเจ็บของสมองส่วนต้นหลังการตกเลือดใต้เยื่อหุ้มสมองในหนู ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม. ความเครียดออกซิเดทีฟและเซลล์ประสาทเป็นกระบวนการทางพยาธิวิทยาที่สำคัญหลังจากการตกเลือดใน subarachnoid (SAH) การศึกษานี้ประเมินฤทธิ์ต้านออกซิเดชันและต้านการตายของเซลล์ประสาทของอะพอพโทซิส สัญญาณควบคุมไคเนส 1 (ASK1) ที่ยับยั้งเอธิล-2,7-ไดออกโซ-2,7-ไดไฮโดร-3H-แนฟโท(1,2, 3-de) quinoline1-carboxylate (NQDI-1) ในการบาดเจ็บของสมองระยะแรก (EBI) ตาม SAH ในแบบจำลองหนู ใช้หนูทั้งหมด 191 ตัวและจำลองแบบ SAH โดยใช้การเจาะเส้นใยเดี่ยว ต่อมามีการใช้ Western blotting เพื่อตรวจหาระดับการแสดงออกภายนอกของโปรตีน จากนั้นจึงใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เพื่อยืนยันการแปลเซลล์ประสาทของ ASK1 การทำงานของระบบประสาทในระยะสั้นได้รับการประเมินโดยใช้คะแนน Garcia ที่ปรับปรุงแล้วและการทดสอบความสมดุลของลำแสง 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH ในขณะที่การทำงานของระบบประสาทในระยะยาวได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ rotarod และการทดสอบ Morris water maze การประเมินการตายของเซลล์ประสาทโดยการย้อมสี TUNEL และการประเมินความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นโดยการย้อมสีไดไฮโดรเอทิเดียม 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ phosphorylated (p‑)ASK1 และ ASK1 เพิ่มขึ้นตาม SAH NQDI‑1 ถูกฉีดเข้าภายในหลอดเลือดหัวใจ 1 ชั่วโมงหลังจาก SAH และแสดงให้เห็นถึงการปรับปรุงที่สำคัญในการทำงานของระบบประสาททั้งในระยะสั้นและระยะยาว และลดความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ประสาทอย่างมีนัยสำคัญ การฉีด NQDI‑1 ทำให้ระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4 hydroxynonenal และ Bax ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และเพิ่มระดับการแสดงออกของโปรตีนของ heme oxygenase 1 และ Bcl‑2 อย่างมีนัยสำคัญ การใช้ตัวยับยั้ง p38 BMS‑582949 หรือตัวยับยั้ง JNK SP600125 ทำให้ระดับการแสดงออกของโปรตีนลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ p‑p38 หรือ p‑JNK ตามลำดับ และลดความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ประสาทได้อย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม สารยับยั้งเหล่านี้ไม่ได้แสดงผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑ASK1 หรือ ASK1 โดยสรุป การรักษาด้วย NQDI‑1 ปรับปรุงการทำงานของระบบประสาทและลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ประสาทใน EBI ตามหลัง SAH ในหนู ซึ่งอาจผ่านการยับยั้ง ASK1 phosphorylation และเส้นทางการส่งสัญญาณ ASK1/p38 และ JNK NQDI‑1 อาจได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวแทนที่มีศักยภาพสำหรับการรักษาผู้ป่วยที่มี SAH

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และสามารถกำจัดสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา ป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่ Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

คำหลัก: เลือดออกใน subarachnoid, NQDI-1, apoptosis signal-regulating kinase 1, ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน, apoptosis, การบาดเจ็บของสมองในระยะเริ่มต้น

การแนะนำ

Subarachnoid hemorrhage (SAH) เป็นโรคหลอดเลือดสมองเฉียบพลันร้ายแรงที่เกิดจากการไหลเวียนของเลือดไปยังพื้นที่ subarachnoid ของสมอง (1) อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบันยังไม่มียาที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงความเสียหายของเนื้อเยื่อสมองหลังจาก SAH ตามการป้องกันเลือดออกซ้ำ (2) ดังนั้นการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกของการบาดเจ็บที่สมองหลังจาก SAH และการสำรวจทางเลือกการรักษาที่เหมาะสมเพื่อปรับปรุงการพยากรณ์โรคของ SAH เป็นสิ่งจำเป็นอย่างเร่งด่วน

การบาดเจ็บของสมองในระยะเริ่มต้น (EBI) หมายถึงความเสียหายของเนื้อเยื่อสมองทุติยภูมิที่เกิดจากการรบกวนทางสรีรวิทยาหลายอย่างและการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาหลายอย่างที่เกิดขึ้นภายใน 72 ชั่วโมงหลังจากเริ่มมีอาการของ SAH (3) ในระยะการตอบสนองแบบเฉียบพลันหลังจาก SAH การบาดเจ็บจะเริ่มต้นด้วยการป้อนเลือดจำนวนมากเข้าไปในช่องว่างใต้อะแรคนอยด์ และตามมาด้วยการบาดเจ็บทางพยาธิสภาพ (4) เนื่องจากไมโทคอนเดรียมีความอ่อนไหวเป็นพิเศษต่อภาวะขาดออกซิเจนและการบาดเจ็บจากการขาดเลือด ความผิดปกติของไมโทคอนเดรียจึงเป็นหนึ่งในการบาดเจ็บทางพยาธิวิทยาหลักที่ได้รับหลังจาก SAH (5) รีแอคทีฟออกซิเจน (ROS) จำนวนมากถูกปล่อยออกมา ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มประสิทธิภาพของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการกระตุ้นของวิถีอะพอพโทติคของไมโทคอนเดรีย ทำให้เกิดการบาดเจ็บและการทำงานของไมโตคอนเดรียผิดปกติ (6) ดังนั้น วิธีการรักษาที่ลดความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์จึงเป็นกุญแจสำคัญสำหรับการปรับปรุงการพยากรณ์โรคของ SAH

ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณอะพอพโทซิส 1 (ASK1) ซึ่งเป็นสมาชิกของตระกูลไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจน 3 (MAP3K) ถูกกระตุ้นโดยความเครียดระดับเซลล์ประเภทต่างๆ มากมาย และมีบทบาทสำคัญในความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและอะพอพโทซิส (7) ในวัฒนธรรมปฐมภูมิของเซลล์ประสาทฮิปโปแคมปัสของหนู Rho kinase inhibitor fasudil จะย้อนกลับการยกระดับ ‑amyloid ของ phosphorylated (p‑)ASK1 ซึ่งลดการตายของเซลล์ประสาทในโรคอัลไซเมอร์ (8) อย่างไรก็ตาม เท่าที่ทราบของเรา ตัวเลือกการรักษาที่กำหนดเป้าหมาย ASK1 ตามหลัง SAH ยังไม่ได้รับการประเมิน

Ethyl‑2,7‑dioxo‑2,7‑dihydro-3H-naphtho(1,2,3-de)quinoline1-carboxylate (NQDI‑1) มีรายงานว่าเป็น ตัวยับยั้งเฉพาะของ ASK1 และได้รับการตรวจสอบโดยใช้การทดสอบไคเนสในหลอดทดลอง (9,10) การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่า NQDI‑1 อาจมีประสิทธิผลในการรักษาโรคต่างๆ ผ่านการยับยั้งการทำงานของ ASK1 (11,12) NQDI‑1 บรรเทาความเสียหายของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก microcystin‑LR และการตายของเซลล์ในเซลล์แกรนูโลซาของรังไข่ผ่านการยับยั้งการกระตุ้นของ ASK1 (13) นอกจากนี้ อินโดเมธาซินยังสามารถกระตุ้นการตอบสนองของอะพอพโทติคในเซลล์เกลียผ่านการกระตุ้น ASK1 ของเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมความเครียด (14) ดังนั้น ตัวยับยั้งเฉพาะ ASK1 NQDI-1 อาจออกฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทตาม SAH ผ่านการยับยั้งการทำงานของ ASK1 p38 และ JNK ได้รับการพิจารณาให้เป็นเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมของ ASK1; เปิดใช้งาน p38 และ JNK สามารถเปิดใช้งานสารตั้งต้นที่หลากหลายรวมถึงปัจจัยการถอดรหัสนิวเคลียร์รวมถึงโปรตีนไคเนสและโปรตีนเชิงหน้าที่อื่น ๆ ซึ่งนำไปสู่การเริ่มต้นของความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ (15)

มีการตั้งสมมติฐานว่าสารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ออกฤทธิ์ป้องกันระบบประสาท และลดความเครียดออกซิเดชันและนิวโรอะพอพโทซิสผ่านทางเส้นทางการส่งสัญญาณ ASK1/p38 และ JNK ใน EBI ตาม SAH ในหนู

วัสดุและวิธีการ

สัตว์ทดลอง.การทดลองในสัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมสำหรับสัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัย Central South (หมายเลขอนุมัติ 2019sydw0104) หนู Sprague‑Dawley (SD) เพศผู้ทั้งหมด 191 ตัวน้ำหนัก 280–320 กรัม ถูกเลี้ยงในสภาพแวดล้อมที่มีอุณหภูมิคงที่ (21–23˚C) และความชื้น (45–50 เปอร์เซ็นต์) โดยมีรอบแสง/มืด 12/12 ชั่วโมง และสามารถเข้าถึงน้ำและอาหารได้ฟรี การทดลองในสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการวิจัยในสัตว์: การรายงานในการทดลอง Vivo (16) และดำเนินการโดยแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH) (17) เมื่อหนูถึงจุดเวลาที่ตั้งไว้ล่วงหน้าของการทดลองหรือผ่านเกณฑ์บางประการสำหรับนาเซียเซีย [เบื่ออาหารทั้งหมดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือเบื่ออาหาร (ต่ำกว่าปกติร้อยละ 50) เป็นเวลา 3 วัน ไม่สามารถกินหรือดื่มได้ หรือพวกมันได้รับการประเมินว่าเป็น ใกล้ตาย (พฤติกรรมทำร้ายตนเอง ท่าทางผิดปกติ หายใจลำบาก ฯลฯ)] หนูถูกใส่ในอุปกรณ์การุณยฆาตด้วยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์โดยมีอัตราการกำจัดปริมาตร CO2 ที่ 30 เปอร์เซ็นต์/นาที (18) ความตายได้รับการยืนยันโดยการหยุดหายใจและการเต้นของหัวใจและรูม่านตาขยาย ซากหนูทั้งหมดถูกบรรจุถุงและแช่แข็งเพื่อการกำจัดที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม

รุ่น SAH The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 โดยการประเมิน SAH grading score ได้รับการพิจารณาว่าเป็นไปตามข้อกำหนดการทดลองและเป็นแบบจำลองที่ประสบความสำเร็จ ขั้นตอนสำหรับกลุ่มแสมนั้นคล้ายกับกลุ่ม SAH ยกเว้นว่าลวดโพรไลน์ 4-0 เส้นไม่เจาะผนังหลอดเลือดแดง การหายใจ อัตราการเต้นของหัวใจ สีผิว และแป้นเหยียบได้รับการตรวจสอบทุก 5 นาทีตลอดระยะพักฟื้นของการผ่าตัดและการใช้ยาสลบ ในจำนวนนี้ หนู 23 ตัวตายและหนู 8 ตัวไม่ได้รับการยกเว้น และการตายและการยกเว้นเหล่านี้ได้รับการเสริมด้วยหนูจำลอง SAH ใหม่

ความรุนแรงของ SAHความรุนแรงของ SAH ได้รับการประเมินโดยใช้ SAH grading score 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH (20) เนื้อเยื่อสมองด้านข้างช่องท้องแบ่งออกเป็น 6 ส่วน แต่ละส่วนมีค่า 0-3 ขึ้นอยู่กับปริมาณของลิ่มเลือดและความสามารถในการบดบังของหลอดเลือด: คะแนน 0 หมายถึงไม่มีลิ่มเลือด 1 บ่งชี้ว่ามีก้อนเป็นก้อนเล็กน้อย 2 บ่งชี้ว่ามีก้อนเป็นก้อนปานกลางแต่เส้นเลือดขนาดใหญ่ที่ฐานกะโหลกศีรษะยังคงระบุได้ และ 3 บ่งชี้ว่ามีก้อนจำนวนมากและเส้นเลือดที่ไม่สามารถระบุได้ที่บริเวณฐานของกะโหลกศีรษะ นำคะแนนระดับภูมิภาคทั้ง 6 รายการมารวมกันเพื่อคำนวณคะแนนรวม (0-18) โดยที่คะแนนที่สูงกว่าบ่งชี้ถึงภาวะตกเลือดที่รุนแรงกว่า หนูที่มีคะแนนรวม SAH น้อยกว่าหรือเท่ากับ 8 ถือว่ามี SAH น้อย ซึ่งไม่รวมอยู่ในการทดลองที่ตามมา และแทนที่ด้วยหนูที่สร้างแบบจำลองใหม่

การบริหารยา.เพื่อให้ความเข้มข้นของยาในเนื้อเยื่อสมองได้รับการควบคุมอย่างแม่นยำมากขึ้นโดยไม่ขึ้นกับตับและปัจจัยอื่นๆ จึงมีการบริหาร siRNAs และ NQDI‑1 โดยการฉีดเข้าทางหลอดเลือดหัวใจ (21) หลังจากการดมยาสลบ (การเหนี่ยวนำ, ไอโซฟลูเรน 3 เปอร์เซ็นต์; การบำรุงรักษา, ไอโซฟลูเรน 2 เปอร์เซ็นต์) หนูได้รับการแก้ไขด้วยเครื่องมือ stereotaxic ในสมอง ไมโครอินเจ็กเตอร์ได้รับการแก้ไขที่ bregma ที่ด้านหลัง 1.0 ด้านขวา 1.5 และลึก 3.3 มม. ASK1 siRNA (cat. no. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) หรือ Scr siRNA control (cat. no. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ถูกละลายในน้ำปราศจากไอออนปราศจากนิวคลีเอส 5 µl ที่ความเข้มข้น 500 pmol และบริหาร 48 ชั่วโมงก่อน SAH ลำดับของ ASK1 siRNA มีดังต่อไปนี้: Sense 5'‑CGG CAGACAUUGUUAUCAAt‑3' และ antisense 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3' ความเข้มข้นและขนาดยาที่รายงานในการศึกษาที่คล้ายกัน (22) และความสามารถในการละลายของ NQDI‑1 ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่ใช้ในการศึกษานี้ ฉีด NQDI‑1 สามขนาด (1, 3 และ 10 ไมโครกรัม/กก.; Selleck Chemicals) หรือสารละลายสำหรับยานพาหนะในปริมาตรรวม 5 ไมโครลิตร/หนู 1 ชั่วโมงหลังจาก SAH BMS‑582949 (100 มก./กก.; Selleck Chemicals), SP600125 (30 มก./กก.; Selleck Chemicals) และสารละลายที่เป็นพาหะนำสารสามารถข้ามสิ่งกีดขวางของเลือดสมองและถูกบริหารทางช่องท้อง 1 ชั่วโมงหลังจาก SAH (23,24)

การทำงานของระบบประสาทในระยะสั้นคะแนน Garcia ที่ปรับปรุงแล้วและคะแนนความสมดุลของลำแสงถูกนำมาใช้เพื่อประเมินการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้น 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH คะแนนการ์เซียที่แก้ไขแล้วแบ่งออกเป็น 6 ประเภทดังต่อไปนี้: การเคลื่อนไหวโดยสมัครใจ การเคลื่อนไหวแขนขาโดยสมัครใจ การยืดอุ้งเท้าหน้า ความสามารถในการปีนเขา การตอบสนองทางประสาทสัมผัสทางร่างกาย และการตอบสนองของหนวด โดยแต่ละประเภทจะให้คะแนนเป็นรายบุคคลและสรุปรวมเป็นคะแนนรวมตั้งแต่ 3-18 (25). คะแนนที่สูงขึ้นได้รับการพิจารณาเพื่อบ่งชี้ถึงการทำงานของระบบประสาทที่ดีขึ้น สำหรับคะแนนความสมดุลของคาน หนูถูกวางไว้บนคานเป็นเวลา 1 นาที และประเมินคะแนนตั้งแต่ 0-4 ตามระยะทางที่เดิน (26) คะแนนที่สูงขึ้นได้รับการพิจารณาเพื่อบ่งชี้ถึงการทำงานของระบบประสาทที่ดีขึ้น

การทำงานของระบบประสาทในระยะยาวการทดลองก่อนการปรับตัวของ Rotarod ดำเนินการกับหนูโดยใช้ความเร็วและความเร่งเริ่มต้นที่เท่ากันก่อนการสร้างแบบจำลอง SAH หนูถูกวางไว้บนเครื่องทดสอบแท่งหมุน Rotamex (Columbus Instruments) สำหรับการทดสอบ Rotarod ในวันที่ 7, 14 และ 21 หลังจาก SAH (27) ประการแรก ความเร็วเริ่มต้นของ Rotarod ถูกตั้งค่าเป็น 5 รอบต่อนาที และความเร่งเป็น 2 รอบต่อ 5 วินาที หลังจากใส่หนูแล้ว เวลาแฝงของการหกล้มของหนูจะถูกบันทึกไว้ จากนั้นหนูได้รับอนุญาตให้พักผ่อนเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในที่สุด เวลาแฝงในการตกของหนูได้รับการทดสอบอีกครั้งที่ความเร็วเริ่มต้น 5 รอบต่อนาที และความเร่ง 2 รอบต่อ 5 วินาที เวลาแฝงที่นานขึ้นได้รับการพิจารณาเพื่อบ่งชี้ถึงการประสานงานของมอเตอร์ที่ดีขึ้นในหนู ในสัปดาห์ที่ 4 หลังจากการสร้างแบบจำลอง SAH การทดสอบเขาวงกตน้ำของ Morris ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความจำในการเรียนรู้และการวางแนวเชิงพื้นที่ของหนู (27) แบบฝึกหัดการว่ายน้ำและค้นหาแพลตฟอร์มที่อยู่ใต้ผิวน้ำได้ดำเนินการตั้งแต่วันที่ 1 ถึงวันที่ 5 ในสัปดาห์ที่ 4 (วันที่ 28-33 หลังวัน SAH) และบันทึกวิถีการว่ายน้ำ เวลาแฝงในการหลบหนี และระยะทางในการว่ายน้ำ ในวันสุดท้าย แท่นถูกถอดออกสำหรับการทดสอบ และบันทึกวิถีการว่ายน้ำ ระยะการว่ายน้ำ และระยะเวลาของโพรบควอดแดรนต์เป็นเวลา 60 วินาที

ถ้าย้อมสี.หลังจากการไหลเวียนของน้ำเกลือ 4˚C และ 4˚C อย่างต่อเนื่อง พาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์จากหัวใจเพื่อขจัดเลือดออกจากเนื้อเยื่อสมอง ทำให้ได้เนื้อเยื่อสมองที่สมบูรณ์ หลังจากการคายน้ำด้วยน้ำตาลซูโครส เนื้อเยื่อสมองจะถูกตัดออกเป็นส่วนๆ ขนาด 10 µm ในตำแหน่งโคโรนา และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ −20˚C การย้อมสี IF ใช้เพื่อประเมินการระบุตำแหน่งร่วมของ ASK1 กับเซลล์ประสาท ส่วนเนื้อเยื่อที่แช่แข็งถูกปิดกั้นโดยใช้ซีรั่มของลา 5 เปอร์เซ็นต์ (แมวหมายเลข G1217‑5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและบ่มข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4˚C ด้วยแอนติบอดีหลักดังต่อไปนี้: Anti‑ASK1 (เมาส์ 1:200; cat. no. 67072‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti‑NeuN (rabbit; 1:200; cat. no. 26975‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.) , โมเลกุลอะแด็ปเตอร์จับแคลเซียมที่ต้านการแตกตัวเป็นไอออน‑1 (Iba‑1; กระต่าย; 1:200; cat. no. 10904‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.) และโปรตีนกรดไฟบริลลารีที่ต้านการเกลีย (GFAP; ไก่ ; 1:200; cat. no. ab4674; Abcam). จากนั้น ส่วนของเนื้อเยื่อจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเรืองแสงที่สอดคล้องกันดังต่อไปนี้: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti‑Mouse IgG (H บวก L) (cat. no. 715‑585‑150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H บวก L) (cat. no. 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) และ Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Chicken IgY (IgG) (H บวก L) (cat. no. 703‑545‑155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) ต่อจากนั้น นำไปย้อมนิวเคลียสของเซลล์โดยใช้ DAPI 2 µg/ml (cat. no. G1012‑100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ส่วนนี้ได้รับการประเมินโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Olympus BX53 (Olympus Corporation) และจับภาพ

การย้อมสีไดไฮโดรเอทิเดียม (DHE)ทำการย้อมสี DHE เพื่อประเมินความเครียดออกซิเดชันของสมอง (28) ส่วนเนื้อเยื่อสมองที่แช่แข็งถูกบ่มด้วย 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 30 นาทีในที่มืด หลังจากการย้อมสีนิวเคลียสของเซลล์โดยใช้ DAPI 2 µg/ml เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ส่วนต่างๆ ได้รับการประเมินโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Olympus BX53 สุ่มเลือกทั้งหมดหกส่วนจากเนื้อเยื่อสมองแต่ละส่วน และสุ่มเลือกพื้นที่หกส่วนในแต่ละส่วนสำหรับการถ่ายภาพ จำนวนเซลล์ที่มี DHE-positive ถูกนับโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ 1.4 (National Institutes of Health) และคำนวณค่าเฉลี่ยเป็นเปอร์เซ็นต์สุดท้ายสำหรับแต่ละส่วนของเนื้อเยื่อสมอง

การย้อมสี TUNELการย้อมสี TUNEL ใช้เพื่อประเมินเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ประสาท apoptotic (29) ส่วนของเนื้อเยื่อที่แช่แข็งถูกปิดกั้นโดยใช้ซีรั่มของลา 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและบ่มข้ามคืนที่ 4˚C ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ anti‑NeuN (กระต่าย; 1:200; cat. no. 26975‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc. .). จากนั้น ส่วนของเนื้อเยื่อจะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเรืองแสง Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H บวก L) (cat. no. 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง การย้อมสี TUNEL ดำเนินการโดยใช้ชุด One Step TUNEL Apoptosis Assay (cat. no. C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ในที่สุด ส่วนของเนื้อเยื่อถูกย้อมสีสำหรับนิวเคลียสของเซลล์โดยใช้ DAPI 2 µg/ml เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การเลือกตำแหน่งการนับ TUNEL แบบสุ่มและการคำนวณเซลล์ประสาทบวก TUNEL สำหรับแต่ละส่วนดำเนินการโดยใช้วิธีการดังกล่าวข้างต้นสำหรับการนับ DHE

การซับแบบตะวันตก (WB)WB ถูกใช้เพื่อหาระดับการแสดงออกของโปรตีนแบบกึ่งปริมาณ หลังจากการไหลเวียนของน้ำเกลือ 4˚C จากหัวใจเพื่อขจัดเลือดออกจากเนื้อเยื่อสมอง จะได้เนื้อเยื่อสมองที่สมบูรณ์ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่าแบบจำลอง SAH ซึ่งกระตุ้นโดยการเจาะหลอดเลือดด้านซ้าย ส่งผลให้เกิดอคติต่อเหตุการณ์เลือดออก และอาจรุนแรงในแง่ของความเสียหายต่อเนื้อเยื่อสมองด้านซ้าย (30) ดังนั้น เนื้อเยื่อสมองซีกซ้ายจึงถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความเสียหายทางพยาธิสภาพตามแบบจำลอง SAH สกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อสมองโดยใช้ RIPA lysis solution (cat. no. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ความเข้มข้นของโปรตีนของตัวอย่างถูกกำหนดโดยการทดสอบ BCA (cat. no. P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) และต่อมาปรับเป็น 5 µg/µl โดยการเติมน้ำกลั่นสองเท่าในปริมาณที่แตกต่างกัน ตัวอย่างโปรตีน 5 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร 5 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละช่องทาง และตัวอย่างโปรตีนเหล่านี้ถูกแยกออกจากกันบนเจล 10 เปอร์เซ็นต์โดยอิเล็กโตรโฟรีซิส SDS‑PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้นมผงไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ (cat. no. P0216‑300g; Beyotime Institute of Biotechnology) เยื่อถูกบ่มข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4˚C ด้วยแอนติบอดีหลักดังต่อไปนี้: Anti‑p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1,000; cat. no. MA5‑28020; Thermo Fisher Scientific, Inc .), anti‑ASK1 (1:1,000; cat. no. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; cat. no. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p38 MAPK (1:1,000; cat. no. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), ไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นปฏิกิริยาฟอสโฟความเครียด/ไคเนสของ Jun-amino-terminal (phospho‑SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; cat. no. 9255; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; cat. no. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑4 hydroxynonenal (4‑HNE; 1:1 ,000; cat. no. ab46545; Abcam), anti‑heme oxygenase 1 (HO‑1; 1:1,000; cat. no. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑Bcl‑2 (1:1,000; cat. no. 26593‑1‑AP; ProteinTech Group, Inc.), anti‑Bax (1,1000; cat. no. 60267‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) และแอนติแอกติน (1:2,000; cat. no. 4970; Cell Signaling Technology, Inc.) ตามด้วยการฟักตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตเตอออกซิเดสมะรุมที่เหมาะสมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง: Goat anti‑mouse IgG‑HRP (cat. no. sc‑2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) หรือ IgG‑HRP ต้านกระต่ายจากแพะ (cat. no. sc‑2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) และแถบเฉพาะถูกแสดงภาพโดยใช้ชุด ECL (cat. no. P0018AS; สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) และถ่ายภาพโดยใช้ระบบ UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH) การวิเคราะห์ความหนาแน่นสัมพัทธ์ของแถบ WB ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ 1.4 (NIH) และระดับการแสดงออกของโปรตีนได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานเมื่อเทียบกับ ‑actin

การออกแบบการทดลอง

การเปลี่ยนแปลงนิพจน์และการแปลเซลลูล่าร์ของ ASK1 ตาม SAH หนูทั้งหมด 36 ตัวได้รับการสุ่มให้เป็นหกกลุ่ม (n=6/กลุ่ม) ดังนี้: i) Sham‑operated (sham), ii) 3 ชั่วโมงหลัง SAH, iii) 6 ชั่วโมงหลัง SAH, iv ) 12 ชม. หลัง SAH, v) 24 ชม. หลัง SAH และ vi) 72 ชม. หลัง SAH WB ใช้เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงของระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1 และ p‑ASK1 ภายในร่างกาย หนูเพิ่มเติมทั้งหมด 4 ตัวถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มแสม (n=2) และกลุ่ม SAH 24 ชั่วโมง (n=2) และใช้การย้อมสี IF เพื่อประเมินการแปลร่วมของ ASK1

ผลการรักษาของสารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ต่อการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้นและระยะยาวตาม SAH หนูทั้งหมด 30 ตัวถูกแบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม (n=6/กลุ่ม) ดังนี้: i) แชม, ii) SAH บวกพาหนะ, iii) SAH บวก 1.0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH บวก 3.0 µg/kg NQDI‑1 และ v) SAH บวก 10.0 µg/kg NQDI‑1 คะแนนการทรงตัวของการ์เซียและคานที่แก้ไขแล้วถูกนำมาใช้เพื่อประเมินการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้น 24 ชั่วโมงหลัง SAH ตามขอบเขตของการปรับปรุงระบบประสาทในระยะสั้น 3.0 µg/kg NQDI‑1 ได้รับการประเมินว่าเป็นกลุ่มขนาดยาที่เหมาะสมที่สุด และขนาดยาของ NQDI‑1 นี้ถูกนำมาใช้ในการทดลองที่ตามมา หนูทั้งหมด 30 ตัวถูกแบ่งออกเป็น 3 กลุ่ม (n=10) ดังนี้: i) Sham, ii) SAH บวกพาหนะ และ iii) SAH บวก NQDI‑1 การทดลองของโรทาร็อดใช้เพื่อประเมินการทำงานของระบบประสาทในระยะยาวในวันที่ 7, 14 และ 21 หลังจาก SAH และทำการทดสอบทางวงกตน้ำมอร์ริสในสัปดาห์ที่ 4 หลังจาก SAH เพื่อประเมินการทำงานของระบบประสาทในระยะยาว

ผลการรักษาของสารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ต่อความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ หนูทั้งหมด 12 ตัวถูกแบ่งออกเป็น 3 กลุ่ม (n=4/กลุ่ม) ดังนี้: i) Sham, ii) SAH บวกพาหนะ และ iii) SAH บวก NQDI‑1 การย้อมสี (THE) ดำเนินการเพื่อประเมินความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการย้อมสี TUNEL ใช้เพื่อประเมินการตายของเซลล์ประสาท 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH

บทบาทของเส้นทางการส่งสัญญาณ ASK1/p38 และ JNK ในผลการรักษาของ NQDI‑1 หนูทั้งหมด 48 ตัวถูกแบ่งออกเป็น 8 กลุ่ม (n=6/กลุ่ม) ดังนี้: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH บวกพาหนะ iv) SAH บวก NQDI‑1, v) SAH บวกสัญญาณรบกวน (Scr) การรบกวนระยะสั้น (si)RNA, vi) SAH บวก ASK1 siRNA, vii) SAH บวก BMS‑582949 และ viii) SAH บวก SP600125 กลุ่ม ASK1 siRNA, ตัวยับยั้ง p38 BMS‑582949 และตัวยับยั้ง JNK SP600125 ถูกฉีดเพื่อประเมินว่า ASK1, p38 และ JNK เกี่ยวข้องกับผลการป้องกันระบบประสาทของ NQDI‑1 หรือไม่

การวิเคราะห์ทางสถิติ. ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และข้อมูลการทดลองของ WB ได้รับในการจำลองแบบอิสระ 6 แบบ ในขณะที่การย้อมสี DHE และการย้อมสีแบบ TUNEL ดำเนินการเป็นการจำลองแบบอิสระ 4 แบบ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ SPSS เวอร์ชัน 17 (SPSS, Inc.) ข้อมูลจากการทดสอบเขาวงกตของน้ำ Morris ได้รับการประเมินโดยใช้ ANOVA แบบผสม/การวัด ANOVA แบบสองทางซ้ำ ตามด้วยการทดสอบ LSD หลังเฉพาะกิจ ข้อมูลจากการทดลองที่เหลือได้รับการทดสอบสำหรับการแจกแจงแบบปกติโดยใช้การทดสอบการแจกแจงแบบปกติของ Shapiro‑Wilk ตามด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบพหุคูณภายหลังของ Tukey กราฟถูกลงจุดโดยใช้ GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.) พี<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ผลลัพธ์

การเสียชีวิตและความรุนแรงของ SAH ในการศึกษานี้ใช้หนู SD ทั้งหมด 191 ตัว โดยหนู 8 ตัวถูกแยกออกเนื่องจาก SAH ที่ไม่รุนแรงเท่านั้น (คะแนน SAH ให้คะแนนน้อยกว่าหรือเท่ากับ 8) จากหนู SD ที่ใช้ในการทดลอง หนู 34 ตัวอยู่ในกลุ่มหลอก และหนู 149 ตัวได้รับการสร้างแบบจำลอง SAH ไม่มีหนูในกลุ่มหลอกลวงตาย อย่างไรก็ตาม หนู 23 ตัวเสียชีวิตหลังจากสร้างแบบจำลอง SAH (อัตราการตาย 15.4 เปอร์เซ็นต์ ) (ตาราง SI‑V) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเสแสร้ง ก้อนเนื้อใน subarachnoid space ส่วนใหญ่อยู่ใกล้วงแหวน Willis และทั้งสองด้านของหลอดเลือดแดง basilar ตามแบบจำลอง SAH (รูปที่ 1A) คะแนนการจัดระดับ SAH 24 ชั่วโมงหลังการสร้างแบบจำลอง SAH แสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความรุนแรงของการตกเลือดระหว่างกลุ่มที่ไม่ใช่กลุ่มหลอกลวงทั้งหมด และความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มหลอกลวงและกลุ่มที่ไม่ใช่กลุ่มหลอกลวงทั้งหมด (รูปที่ 1B)

การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของโปรตีนและการแปลเซลล์ของ ASK1 ตาม SAH ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1 เพิ่มขึ้นและถึงจุดสูงสุดที่ 24 ชั่วโมงในสมองตาม SAH (รูปที่ 1C และ D) อย่างไรก็ตาม อัตราส่วนของการแสดงออกของโปรตีนของ p‑ASK1/ASK1 นั้นไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1C และ E) การแปลระดับเซลล์ของ ASK1 ด้วย NeuN-positive neuron, Iba-1-positive microglia และ GFAP-positive astrocytes แสดงให้เห็นทั้งในกลุ่ม Sham และ SAH 24 ชั่วโมง (รูปที่ 1F-H)

สารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ปรับปรุงการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้น 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH NQDI‑1 (1, 3 และ 10 ไมโครกรัม/กก.) ถูกฉีดเข้าในช่องท้อง 1 ชั่วโมงหลังจาก SAH หนูที่อยู่ระหว่างการสร้างแบบจำลอง SAH มีคะแนนการ์เซียและสมดุลของลำแสงที่แก้ไขแล้วต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญ 24 ชั่วโมงหลังจากการสร้างแบบจำลอง SAH; อย่างไรก็ตาม ปริมาณ NQDI‑1 ทั้งสามขนาดทำให้การทำงานของระบบประสาทในระยะสั้นดีขึ้นบางส่วน (รูปที่ 2A และ B) คะแนน Garcia ที่ปรับปรุงแล้วนั้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม SAH บวก NQDI‑1 (3.0 µg/kg) เมื่อเทียบกับกลุ่ม SAH บวก NQDI‑1 (1.0 µg/kg) อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH บวก NQDI‑1 (10.0 µg/kg) (รูปที่ 2A และ B) ซึ่งแนะนำว่าการเพิ่มความเข้มข้นของ NQDI‑1 ต่อไปนั้นทำได้ ไม่กระตุ้นให้มีการปรับปรุงการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้นเพิ่มเติมหลังจาก SAH ดังนั้น NQDI‑1 (3.0 µg/kg) จึงได้รับการพิจารณาว่าเป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดที่มีประสิทธิผลและถูกนำมาใช้ในการทดลองครั้งต่อๆ ไป

สารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ปรับปรุงการทำงานของระบบประสาทในระยะยาวหลังจาก SAH เมื่อใช้ความเร็วเริ่มต้นที่ 5 หรือ 10 รอบต่อนาทีสำหรับการทดสอบ Rotarod เวลาแฝงในการตกลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มยานพาหนะ SAH บวกเมื่อเทียบกับกลุ่มหลอก ในขณะที่เวลาแฝงในการตกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการฉีด NQDI‑1 เข้าในช่องท้องเมื่อเทียบกับยานพาหนะ SAH บวก กลุ่ม (รูปที่ 2C และ D) นอกจากนี้ ในช่วงวันที่ 1-5 ของขั้นตอนการฝึกอบรมของการทดสอบเขาวงกตน้ำ Morris ในสัปดาห์ที่ 4 หลัง SAH กลุ่มยานพาหนะ SAH บวกแสดงเวลาแฝงในการหลบหนีและระยะการว่ายน้ำที่ยาวนานขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มแสม ในขณะที่การรักษา NQDI-1 แสดงให้เห็นถึง ลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับกลุ่มยานพาหนะ SAH บวก (รูปที่ 2E‑G) ในขั้นตอนการทดสอบโดยถอดแท่นวงกลมใต้น้ำออก ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในความเร็วในการว่ายระหว่างทั้งสามกลุ่ม (รูปที่ 2H) ระยะเวลาของโพรบควอแดรนท์สั้นลงอย่างมากในกลุ่มยานพาหนะ SAH บวกเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแสม และการบำบัดด้วย NQDI‑1 ทำให้เวลาในการสำรวจนานขึ้นอย่างมากเมื่อเทียบกับกลุ่มยานพาหนะ SAH บวก (รูปที่ 2I)

สารยับยั้ง ASK1 NQDI‑1 ลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ประสาทใน 24 ชั่วโมงหลัง SAH ระดับของความเครียดออกซิเดชันถูกวัดโดยใช้การย้อมสี DHE และประเมินสัดส่วนของเซลล์ประสาทที่ตายแล้วได้รับการประเมินโดยใช้เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ประสาทที่ให้ผลบวก TUNEL 24 ชั่วโมงหลังจาก SAH เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่เป็นบวกของ DHE นั้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม SAH บวกกับกระสายยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มหลอกและการบำบัดด้วย NQDI‑1 ซึ่งลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับกลุ่มของ SAH บวกกับกระสายยา (รูปที่ 3A และ) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ประสาทที่เป็นบวกของ TUNEL นั้นสูงกว่าในกลุ่ม SAH บวกกระสายยาอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเสแสร้ง อย่างไรก็ตาม เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ประสาทที่ให้ผลบวก TUNEL ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วย NQDI‑1 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH และกระสายยา (รูปที่ 3B และ D)

ASK1 siRNA, BMS‑582949 และ SP600125 ปรับปรุงการทำงานของระบบประสาทในระยะสั้น 24 ชั่วโมงหลัง SAH เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH บวก Scr siRNA หรือกลุ่มกระสายยา SAH บวก การบริหารให้ ASK1 siRNA, BMS‑582949 หรือ SP600125 แสดงให้เห็นถึงการปรับปรุงที่สำคัญในคะแนนสมดุลการ์เซียและลำแสงที่ปรับเปลี่ยนแล้ว (รูปที่ 4A และ B)

NQDI‑1 ลดทอนความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์หลังจาก SAH ผ่านการลดระดับฟอสโฟรีเลชันของ ASK1, p38 และ JNK ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE, HO‑1, Bax และ Bcl‑2 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก SAH เมื่อเทียบกับกลุ่มหลอก อย่างไรก็ตาม อัตราส่วนของ p‑ASK1/ASK1 ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5A‑M) การฉีดกระสายยาหรือ Scr siRNA ไม่ก่อให้เกิดความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกของโปรตีนเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มกระสายยา SAH บวก การบำบัดโดยใช้ NQDI‑1 ทำให้ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ p‑ASK1/ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE และ Bax ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ H O ‑1 และ Bcl‑2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH บวก Scr siRNA ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการฉีด ASK1 siRNA การรักษาด้วย ASK1 siRNA ยังส่งผลให้ระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE และ Bax ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และการแสดงออกของ HO‑1 และ Bcl‑2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ SAH บวก Scr siRNA กลุ่ม.

ตัวยับยั้ง p38 BMS‑582949 ลดระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑p38 แต่ไม่ส่งผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑ASK1, ASK1 หรือ p‑JNK การรักษาด้วยตัวยับยั้ง p38 BMS‑582949 แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของระดับการแสดงออกของโปรตีนของ p‑p38, 4‑HNE และ Bax และยังเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนของ HO‑1 และ Bcl‑2 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มกระสายยา SAH บวก; อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1, p‑ASK1/ASK1 และ p‑JNK ไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 6A‑M) ตัวยับยั้ง JNK SP600125 ลดระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑JNK แต่ไม่ส่งผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีน p‑ASK1, ASK1 หรือ p‑p38 การรักษาด้วยสารยับยั้ง JNK SP600125 ทำให้ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ p‑JNK, 4‑HNE และ Bax ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และระดับการแสดงออกของโปรตีน HO‑1 และ Bcl‑2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม SAH บวกกับกระสายยา อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ ASK1, p‑ASK1/ASK1 และ p‑p38 ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 7A‑M)

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】