Apical Shear stress Enhanced Organic Cation Transport in Human OCT2/MATE1-Transfected Madin-Darby Canine Kidney Cells เกี่ยวข้องกับ Ciliary Sensing

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz และ Shuvo Roy

แผนกวิศวกรรมชีวภาพและวิทยาศาสตร์บำบัด (AJ, PS, DLK, SR) และกุมารเวชศาสตร์ (PRB)

มหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานฟรานซิสโก (UCSF), ซานฟรานซิสโก, แคลิฟอร์เนีย;

และ Department of Medicine, Division of Nephrology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee (NF, WF)

บทคัดย่อ

Active ขนส่งโดยไตหลอดใกล้เคียงมีบทบาทสำคัญในการจำหน่ายยา ในระหว่างการพัฒนายา ประมาณการของไตการขับถ่ายมีความสำคัญต่อการกำหนดขนาดยา เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพในไตที่สร้างญาติทางสรีรวิทยาของไต เช่น ความเครียดเฉือนที่เกิดจากกระแส อาจคาดการณ์พฤติกรรมของยาในร่างกายได้ดีกว่าแบบจำลองในหลอดทดลองในปัจจุบัน ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบบทบาทของแรงเฉือนต่อการขนส่งเชิงรุกของ 4-(4-(dimethylamino)-styryl)-N-methyl pyridinium iodide (ASP plus ) โดย Madin-Darby canineไตเซลล์การแสดงออกภายนอกของสารขนส่งไอออนบวกที่เป็นสารอินทรีย์ของมนุษย์ที่ขนส่งสารขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ 2(OCT2) และโปรตีนการอัดรีดแบบมัลติดรักและทอกซิน 1(MATE1) เซลล์ที่เพาะเลี้ยงในจานคู่ขนานภายใต้การแพร่กระจายของสื่ออย่างต่อเนื่องทำให้เกิดชั้นเดียวที่แน่นหนาและมีอุปสรรคต่ออินนูลินสูง ในการตอบสนองต่อระดับความเค้นเฉือนที่เพิ่มขึ้น (0.2-2 dynes/cm) เซลล์แสดงการเพิ่มขึ้นที่สอดคล้องกันในการขนส่งของ ASP plus ถึง 4 สูงสุด2-เพิ่มขึ้นเท่าที่ 2 dynes/cm² เทียบกับเซลล์ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ การขนส่งนี้ถูกยับยั้งด้วยอิมิพรามีน ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการขนส่งแบบแอคทีฟภายใต้สภาวะความเค้นเฉือน เซลล์ที่สัมผัสกับความเค้นเฉือน 2 ไดน์/ซม² ยังแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของอาร์เอ็นเอของทั้งมนุษย์ที่ทรานส์เฟกและ OCT2 ภายนอก (3.7- และ 2.0- เท่า ตามลำดับ) การกำจัด cilia โดยแอมโมเนียมซัลเฟตกำจัดผลกระทบของแรงเฉือนต่อ ASP บวกการขนส่งที่ 0.5 dynes/cm² โดยไม่มีผลกระทบต่อ ASP บวกการขนส่งภายใต้สภาวะคงที่ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแรงเฉือนส่งผลต่อการขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ในไตท่อเซลล์เยื่อบุผิวในลักษณะที่ขึ้นกับ cilia

Cistanche ดีต่อการทำงานของไต

บทนำ

แม้จะมีความก้าวหน้าที่สำคัญในวิธีการพรีคลินิกสำหรับการเลือกตัวยาที่เหมาะสมที่สุด การพัฒนายายังคงเป็นกระบวนการที่ใช้เวลานานและมีราคาแพง ซึ่งให้ผลตอบแทนต่ำมากของเอนทิตีโมเลกุลใหม่ที่วางตลาด (Watkins,2011) การขาดแคลนแบบจำลองพรีคลินิกที่สำคัญคือการไม่สามารถคาดการณ์การกวาดล้างและความเป็นพิษในมนุษย์ ประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ของยาที่ประสบความสำเร็จในการศึกษาพรีคลินิกล้มเหลวในมนุษย์อันเป็นผลมาจากค่าการกวาดล้างที่ไม่คาดคิดหรือความเป็นพิษ (Kola and Landis, 2004)

ไตเป็นเป้าหมายที่สำคัญอย่างยิ่งสำหรับการสร้างแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ในหลอดทดลอง เนื่องจากมีหน้าที่ในการกำจัดยามากกว่าหนึ่งในสามและสารเมแทบอไลต์ส่วนใหญ่ (Morrissey et al.,2013) ดิไตProximal tubule มีความสำคัญสำหรับการทดสอบยาในระหว่างการพัฒนา เนื่องจากมันทำหน้าที่ขนส่งผู้สมัครยาส่วนใหญ่ และมีความไวต่อการบาดเจ็บที่เป็นพิษเป็นพิเศษ (Giacominiet al.,2010) ดิไตท่อเป็นชั้นเดียวของเซลล์เยื่อบุผิวที่มีสารกรองไหลผ่านผิวปลายยอด เมมเบรนชั้นใต้ดินรองรับเยื่อบุผิวท่อ และเส้นเลือดฝอยในช่องท้องที่อยู่ติดกันช่วยให้ดูดซึมน้ำและคำทักทายกลับคืนมาได้ สภาพแวดล้อมจุลภาคของ tubule ใกล้เคียง โดยเฉพาะอย่างยิ่งความเครียดเฉือนของไหลและการไล่ระดับเนื้องอก apicobasal ถูกทำซ้ำอย่างไม่สมบูรณ์โดยเทคนิคการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบธรรมดา เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพของเซลล์เยื่อบุผิวที่จับสรีรวิทยาที่สำคัญในร่างกาย อาจปรับปรุงความแม่นยำของการกวาดล้างและการทำนายความเป็นพิษที่ได้จากการทดสอบในหลอดทดลอง (Pfaller and Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al.,2012)

หลักฐานที่เพิ่มขึ้นบ่งชี้ว่าสัณฐานวิทยาและหน้าที่การทำงานของเซลล์ทูบูลใกล้เคียงอาจแตกต่างกันไปตามสภาพแวดล้อมของการเจริญเติบโต เช่น ความพรุนของพื้นผิวการเจริญเติบโต การสัมผัสกับของเหลวทั้งสองด้าน และ/หรือความเค้นเฉือนของของเหลว งานก่อนหน้านี้จาก Essig และ Friedlander (2003) รวมทั้งจากห้องปฏิบัติการของเรา (Ferrell et al.2010) ได้แสดงให้เห็นว่าการจัดเรียงตัวของของเหลวที่เกิดจากการไหลของของเหลวในท่อในโครงร่างโครงร่างของแอคตินส่วนปลายของเซลล์ท่อใกล้เคียง (Ferrell et al.,2010) . ต่อจากนั้น การศึกษาหลายชิ้นได้แสดงให้เห็นว่าแรงเฉือนส่งผลต่อระดับการแสดงออกและการแปลของการรับหลายตัวและตัวขนส่งที่ไหลออก ซึ่งรวมถึงตัวต้านโซเดียม-ไฮโดรเจน 3 Na/K-ATPase สารขนส่งกลูโคส เยื่อบุผิวโซเดียม แชนเนล และตัวรับเอนโดไซโทซิส เมกาลิน และทูบูลิน (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). งานอื่น ๆ ได้แสดงให้เห็นว่าการไหลของแรงเฉือนในระบบปฏิกรณ์ชีวภาพแบบท่อจะปรับทิศทางและยืดออกไตท่อเซลล์ตามเส้นทางการไหล(Venzac et al. 2018) หลักฐานในหลอดทดลองบ่งชี้ว่าการเปลี่ยนแปลงบางอย่างในโครงสร้างโครงร่างเซลล์และหน้าที่การขนส่งนั้นน่าจะเกี่ยวข้องกับฟังก์ชันการรับความรู้สึกทางกลของตา (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่พิจารณาถึงผลกระทบของแรงเฉือนที่มีต่อการขนส่งยาในเซลล์ไต นอกจากนี้ ยังไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับผลกระทบของอัตราเฉือนที่แตกต่างกันต่อการทำงานของเซลล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อสัมผัสกับความเครียดเฉือนอย่างต่อเนื่อง การศึกษาส่วนใหญ่พิจารณาอัตราความเครียดเฉือนเดียวและทำการทดลองในระยะสั้นเท่านั้น (1-6 ชั่วโมง) ทำให้ยากต่อการแยกความแตกต่างระหว่างผลกระทบที่แท้จริงของแรงเฉือนกับการตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์ต่อการเปลี่ยนแปลงอย่างฉับพลันในสภาพแวดล้อมจุลภาค (Duan et al.2010; Jang et al2013: Maggioran et al.2015).

ในที่นี้ ใช้เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบไมโครฟลูอิดิกเพื่อตรวจสอบผลกระทบของระดับความเค้นเฉือนแบบค่อยเป็นค่อยไปต่อไตตัวขนส่งยาในเซลล์แบบท่อใกล้เคียง ตัวขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ 2(OCT2) และโปรตีนอัดขึ้นรูปหลายตัวและทอกซิน 1(MATE1) เราแสดงให้เห็นว่าความเค้นเฉือนจุดยอดที่เพิ่มขึ้นนำไปสู่การขนส่งไอออนบวกอินทรีย์และการแสดงออกของตัวขนส่งที่เพิ่มขึ้น และตานั้นมีส่วนเกี่ยวข้องในการตอบสนองของเซลล์ต่อความเครียดเฉือน

วัสดุและวิธีการ

การผลิตและการประกอบอุปกรณ์ ก่อนหน้านี้เราได้เผยแพร่การออกแบบของเราสำหรับเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบแผ่นขนานที่ให้เส้นทางการไหลของของเหลวที่สามารถปรับความสูงได้ตลอดด้านปลายของเซลล์และอ่างเก็บน้ำแบบคงที่ที่ด้านฐาน (Brakeman et al.,2016) สำหรับงานที่นำเสนอนี้ เราได้ปรับการออกแบบก่อนหน้านี้ของเราเพื่อสร้างอุปกรณ์มัลติเพล็กซ์ที่มีเส้นทางการไหลแยกกันสี่เส้นทาง เพื่อให้สามารถทดสอบสภาวะทางชีววิทยาสี่อย่างพร้อมกันได้ (รูปที่ 1) อุปกรณ์แต่ละชิ้นประกอบด้วยสามชั้น: ฐานที่มีอ่างเก็บน้ำปลายยอด 5-มล. แผ่นตรงกลางสำหรับยึดเม็ดมีด Snapwell (Costar, Corning, Corning, NY) ที่มีพื้นที่เซลล์ 1.12 ซม² และแผ่นด้านบนประกอบด้วย อ่างเก็บน้ำข้างเบส 1-ถึง 2-มล. จาน

ถูกกลึงจากโพลีซัลโฟนเพื่อให้สามารถฆ่าเชื้อได้โดยการนึ่งฆ่าเชื้อ ปะเก็นซิลิโคนตัดด้วยเลเซอร์ที่มีความสูง 500- ถึง 1000-um ถูกประกบไว้ระหว่างแผ่นแต่ละชุดเพื่อปิดผนึกช่องของเหลวและด้านปลายเพื่อกำหนดความสูงของช่อง เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพประกอบขึ้นโดยใช้สกรู อ่างเก็บน้ำสื่อและกับดักฟองอากาศมีคอลัมน์ในตัว ทางเข้าและทางออกเชื่อมต่อโดยใช้ขั้วต่อแบบมีหนามกับท่อซิลิโคน Masterflex LS14 ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 1.6- มม. (อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ Cole Parmer, Vernon Hills, IL) การไหลของของไหลและความเค้นเฉือนปลายจึงถูกตั้งค่าและควบคุมโดยปั๊มรีดท่อ (Cole Parmer)

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการไหล เซลล์ MDCK ที่ทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์เปล่าหรือคู่ของตัวขนส่งการดูดซึมและการไหลออก (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) จัดทำโดย Dr. Martin Fromm (เออร์ลังเงิน เยอรมนี) และเพาะเลี้ยงใน สื่อจำเป็นขั้นต่ำด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของ Earle (UCSF Cell Culture Facility) พร้อมเซรั่มจากวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin-streptomycin (UCSF Cell Culture Facility) ไฮโกรมัยซินห้าร้อยไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (UCSF Cell Culture Facility) และสารพันธุกรรม 100 มก./ชม. (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) ถูกเติมลงในสื่อสำหรับเซลล์ที่ทรานส์เฟกสองครั้ง สำหรับการทดลองการไหล เซลล์ hOCT2/hMATE1 MDCK ถูกชุบที่ด้านล่างของเม็ดมีด Snapwell (Corning) ที่ความหนาแน่น 300,000 เซลล์/หลุม(250,000 เซลล์/ซม.") ที่ปลูกภายใต้สภาวะคงที่จนกระทั่งเกิดการบรรจบกัน แล้ววางลงใน เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ การไหลของสื่อปลายยอดเพิ่มขึ้นในช่วง 7 วันจาก 0.1 เป็น 1-6ml นาทีจนกว่าจะบรรลุความเค้นเฉือนที่ต้องการและปล่อยให้คงที่เป็นเวลา 72 ชั่วโมงก่อนการทดลอง เซลล์เติบโตภายใต้สภาวะคงที่ในระยะเวลาเท่ากันกับกลุ่มควบคุม .

อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (Thermo Fisher Scientific) ดูดซึมด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton-Xin PBS(Sigma-Aldrich) และบล็อกด้วยเซรั่มอัลบูมินจากวัว (Sigma-Aldrich) ในเวลาต่อมา พวกมันถูกบ่มด้วยการเจือจาง 1:50 ของ zonula ที่ติดฉลาก Alexa 488 ปิดกั้น-1 โมโนโคลนัลแอนติบอดีของหนูเมาส์ (Life Technologies, Carlsbad, CA) หรือโมโนโคลนัลแอนติบอดีของหนูเมาส์ที่มีอะซีติเลต - ทูบูลินปฐมภูมิ (Life Technologies) เป็นเวลา 60 นาที จากนั้นเซลล์ที่บำบัดด้วยแอนติบอดี a-tubulin ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต่อแพะต้านเมาส์ 561 ตัว (Life Technologies) และ phalloidin (Thermo Fisher Scientific) สำหรับการย้อมสี F-actin การถ่ายภาพดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแบบสเปกตรัมของ Nikon (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) โดยมีวัตถุประสงค์ด้านน้ำมัน 40 เท่า

ประสิทธิภาพของสิ่งกีดขวาง อินนูลิน โพลีเมอร์ 5000 Da เป็นเครื่องหมายที่รู้จักกันดีของอัตราการกรองไตและเป็นเครื่องหมายของการรั่วไหลของท่อใกล้เคียงในร่างกาย (Sohtell et al,1983):

อินนูลินที่ติดฉลาก FITC (Sigma-Aldrich) ถูกเติมลงในสื่อปลายยอดและปล่อยให้ไหลผ่านอุปกรณ์ต่างๆ เก็บตัวอย่างจากอ่างเก็บน้ำพื้นฐานทุก 24 ชั่วโมง และวิเคราะห์หาปริมาณอินนูลินโดยใช้เครื่องอ่านเพลทเรืองแสง Genios Pro (เทแคน แมนเนดอร์ฟ สวิตเซอร์แลนด์) ฟังก์ชันกั้นของโมโนเลเยอร์ของเซลล์คำนวณจากระดับอินนูลินที่วัดในช่องปลายและส่วนฐานตามที่อธิบายไว้ในสมการที่ 1 ในที่นี้ ตัวพิมพ์ใหญ่คือความเข้มข้นของอินนูลินในช่องส่วนปลาย และ C Mal คือความเข้มข้นในช่องฐาน Inulinleak คำนวณโดยความเข้มข้นในช่องเบส (ผู้ให้) หารด้วยพื้นที่เซลล์หลังจาก 24 ชั่วโมง

ASP บวกการขนส่ง ยีนทรานสดิวเซอร์ของทรานสดิวเซอร์ถูกเหนี่ยวนำด้วย 10 มิลลิโมลาร์ Na-butyrate (Sigma-Aldrich) 24 ชั่วโมงก่อนการทดลองการขนส่ง ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Konig et al,2011) เมื่อเหมาะสม เซลล์ถูกบ่มด้วยตัวยับยั้ง （500μM imipramine หรือ 1 mM cimetidine(Sigma-Aldrich)) ที่ด้านที่เป็นเบสเป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการเติม 25μM 4-（4-dimethylamino)- สไตริล-N-เมทิล ไพริดิเนียม (ASP plus )(Life Technologies) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เก็บตัวอย่างจากสื่อปลายยอดและฐาน จากนั้นเซลล์ถูกล้างด้วยน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟตที่เย็นจัด 3 ครั้ง และแยกสลายเพื่อวัดค่า ASP บวกกับการสะสมและการขนส่ง ทำการทดลองการขนส่งพร้อมกันในเซลล์ภายใต้ความเค้นเฉือนและเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ ความเข้มข้นของ ASP บวกถูกหาปริมาณบนเครื่องอ่านเพลทเรืองแสง Genios Pro (เทแคน) ที่ความยาวคลื่นกระตุ้นที่ 485 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อย 590 นาโนเมตร

ปริมาณโปรตีน เซลล์ถูกสลายด้วยบัฟเฟอร์การสลาย SDS-10 M NaOH 1 เปอร์เซ็นต์ในขณะที่เขย่าข้ามคืน ปริมาณโปรตีนถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA มาตรฐาน (Thermo Fisher) ตามความเหมาะสม ปริมาณโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานไปยังพื้นที่การเจริญเติบโตของเซลล์

การแสดงออกของอาร์เอ็นเอ RNA ถูกสกัดจากเซลล์โดยใช้ RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) และสร้าง cDNA โดยใช้ชุดสคริปต์ (Bio-Rad, Hercules, CA) cDNA ใช้สำหรับตรวจจับ OCT2 และ MATE1 ของมนุษย์และสุนัขและ P-glycoprotein ของสุนัข (P-GP) โดยปฏิกิริยาลูกโซ่ reverse transcriptase-polymerase เชิงปริมาณโดยใช้การทดสอบ Tagman และหัววัด (Applied Biosystems) บนเครื่องมือ Fast Realtime PCR (Applied Biosystems) โปรตีนไรโบโซม S18 (RS-18) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการดูแลทำความสะอาด ผลของความเค้นเฉือนต่อการแสดงออกของผู้ขนส่งได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธี 4ACt โดยใช้ระดับของตัวขนส่งที่สัมพันธ์กับ RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen และ Livak, 2008) P-GP ถูกใช้เป็นตัวชี้วัดผลกระทบระดับโลกของความเค้นเฉือนต่อการแสดงออกของผู้ขนส่ง

การสลายตัว เซลล์ถูกทำให้เติบโตเพื่อมาบรรจบกัน จากนั้นจึงฟักไข่ในกรณีที่ไม่มีอยู่หรือมีแอมโมเนียมซัลเฟต 30 มิลลิโมลาร์ (Fluka AG) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนการวัด ASP บวกการขนส่ง (Oxergard et al 2009) การมีอยู่ของ cilia ถูกกำหนดโดยการถ่ายภาพของ a-tubulin ตามที่อธิบายไว้แล้วในที่นี้

สถิติ. การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่าโดยมีการจำลองทางเทคนิคอย่างน้อยสองครั้งภายในการทดสอบแต่ละครั้ง ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD และแสดงกราฟเป็นแผนภาพกล่องและมัสสุ การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวหรือสองทางที่ไม่จับคู่ และค่า P ของ<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

ผลลัพธ์

สัณฐานวิทยาของเซลล์และหน้าที่ของสิ่งกีดขวาง การวิเคราะห์เซลล์ที่วางอยู่ใต้โฟลว์ของ Immunofluo เมื่อเร็ว ๆ นี้เผยให้เห็นการก่อตัวของชั้นเดียวที่เหมือนกันกับโปรตีนที่มีการแยกแน่น zonula occludens-1 ซึ่งแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังรอยต่อที่แน่นหนาระหว่างเซลล์ภายใต้สภาวะสถิตและการไหล (รูปที่ 2, A–C) การหาปริมาณของปริมาณโปรตีนทั้งหมดแสดงให้เห็นได้ถึง 1.6-การเพิ่มขึ้นของปริมาณโปรตีนต่อตารางเซนติเมตรของโมโนเลเยอร์ในการตอบสนองต่อความเครียดเฉือน (รูปที่ 2D) ต่อไป เราวัดการซึมผ่านของอินนูลิน ซึ่งเป็นเครื่องหมายของการรั่วไหลของท่อใกล้เคียงทั่วโมโนเลเยอร์ อุปกรณ์รักษาอัตราประสิทธิภาพของอุปสรรคที่ 97.9 เปอร์เซ็นต์ 6 1.42 เปอร์เซ็นต์ในช่วง 7 วันของการเพาะเลี้ยงภายใต้แรงเฉือนสูงสุด 2 ไดน์/ซม2 (รูปที่ 2E) ส่งผลให้อัตราการรั่วไหลของอินนูลินสุดท้ายในวันที่ 6 ของ { {15}}.13–0.69 มก./ซม.2 ต่อวัน

ผลของความเค้นเฉือนต่อการขนส่งไอออนบวกอินทรีย์. การขนส่งของ ASP plus ซึ่งเป็นซับสเตรตฟลูออเรสเซนต์อัตโนมัติของ OCT2 และ MATE1 ถูกวัดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ระดับความเค้นเฉือนที่แตกต่างกัน（02-2 dynes/cm²） เซลล์ MDCK ที่แสดง hOCT2 และ hMATE1 จากภายนอกแสดงการเพิ่มขึ้น 4.2-เท่าใน ASP บวกกับการขนส่งเพื่อตอบสนองต่อความเครียดเฉือน 2 ไดน์/ซม²ซึ่งสะท้อนให้เห็นในการวัดทั้งการสะสมของเซลล์ (รูปที่ 3A) และการขนส่งข้ามเซลล์ (รูปที่ 3B). ผลของความเค้นเฉือนต่อ ASP บวกกับการสะสมหรือการขนส่งข้ามเซลล์มีความคล้ายคลึงกันภายใต้ความเค้นเฉือนที่ 0.5 และ 2 ไดน์/ซม² เพื่อตรวจสอบว่าการขนส่ง ASP บวกเพิ่มขึ้นหรือไม่ ทรานส์พอร์ตของ ASP plus โดยเซลล์ที่สัมผัสกับ 0.2 dynes/cm ของความเค้นเฉือนถูกวัดโดยมีหรือไม่มีการปรับสภาพด้วยอิมิพรามีน 500 uM ซึ่งเป็น OCT{{20} } และ MATE1-ตัวยับยั้งจำเพาะ ASP บวกการขนส่งถูกยับยั้งโดย imipramine 60.3 เปอร์เซ็นต์ ± 15.8 เปอร์เซ็นต์ ภายใต้สภาวะความเครียดเฉือน เทียบกับ 47.6 เปอร์เซ็นต์ ± 19.7 เปอร์เซ็นต์ ภายใต้สภาวะคงที่ (รูปที่ 3C)

เพื่อทำความเข้าใจการสังเกตนี้เพิ่มเติม ผลของแรงเฉือนต่อการแสดงออกของ OCT2 ของมนุษย์ (ถ่ายยีน), OCT2 ของสุนัข (ภายในร่างกาย) และ P-GP ของสุนัข (ภายในร่างกาย) ถูกวัดในเซลล์ที่สัมผัสกับระดับแรงเฉือนที่แตกต่างกันเป็นเวลา 72 ชั่วโมงหลังจาก แรงเฉือนเพิ่มขึ้นช้ากว่า 7 วัน (รูปที่ 4) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ เซลล์ MDCK ที่สัมผัสกับแรงเฉือนแสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ OCT2 ของมนุษย์และภายในร่างกายที่ทรานส์เฟก (มากถึง 3.7- และ 2.0- เท่า ตามลำดับ) โดยไม่มีผลกระทบที่มีนัยสำคัญ ในการแสดงออกของ MATE1 ที่ถ่ายหรือ P-GP ภายนอก

บทบาทของ Cilia ในการตอบสนองต่อแรงเฉือน การถ่ายภาพแสดงให้เห็นว่าเซลล์ MDCK ที่ทรานส์เฟกสองครั้งแสดง cilia ภายใต้สภาวะคงที่และการไหล (รูปที่ 5, A และ E) การเผยเซลล์สู่แอมโมเนียมซัลเฟต 30 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงทำให้ตาสูญเสียอย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 5, C และ G) ที่สำคัญ การสลายตัวไม่มีผลกระทบอย่างร้ายแรงต่อรอยต่อระหว่างเซลล์และเมมเบรน ตามที่วัดโดยการถ่ายภาพของ F-actin ซึ่งยึดโปรตีนที่รอยต่อแน่นที่จุดเชื่อมต่อของเซลล์-เมมเบรนในเซลล์เยื่อบุผิว (รูปที่ 5.D และ HD (รูปที่ 5.D และ HD (Stevenson and Begg. พ.ศ. 2537) แม้ว่าจะมีการย้อมสี F-actin หนาขึ้นบ้างในภาพเหล่านี้ การค้นพบนี้ไม่สอดคล้องกัน ดังนั้นเราจึงไม่ได้หาปริมาณผลกระทบนี้ การเสื่อมสภาพไม่มีผลต่อการขนส่งโดยเซลล์ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่คงที่ แต่สมบูรณ์ ขจัดผลกระทบของความเค้นเฉือนต่อ ASP บวกการขนส่งในเซลล์ที่สัมผัสกับแรงเฉือน 0.5 ไดน์/ซม² (รูปที่ 6)

การอภิปราย

ไตมีบทบาทสำคัญในการกำจัดยาในร่างกายมนุษย์ สิ่งสำคัญคือต้องเลียนแบบความซับซ้อนของสรีรวิทยาของไตอย่างแม่นยำสำหรับการทดสอบยาในหลอดทดลอง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในส่วนที่เกี่ยวกับการไหลของของเหลว ความเค้นเฉือนจากการไหลของของเหลวได้แสดงให้เห็นแล้วว่าส่งผลต่อสัณฐานวิทยาของเซลล์และการขนส่งไอออนในหลอดทดลอง แต่ยังไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับผลกระทบต่อการขนส่งยา (Duan et al.,2010; Ferrell et al.,2012; Jansen et al.,2016) . นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ส่วนใหญ่ได้วัดเฉพาะผลของแรงเฉือนระยะสั้น (1-6 ชั่วโมง) ซึ่งไม่น่าจะแยกผลกระทบของความเครียดเฉือนออกจากการตอบสนองความเครียดของเซลล์อื่นๆ (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015) ในการศึกษาเหล่านี้ เรามุ่งเน้นไปที่ผลกระทบของความเครียดเฉือนอย่างยั่งยืน (7 วัน) จากการไหลของของเหลวในการขนส่งยาเพื่อเลียนแบบความเครียดเฉือนที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องซึ่งพบโดยไตท่อเซลล์ในร่างกาย

การทำความเข้าใจว่าผู้ขนส่งยาตอบสนองต่อแรงเฉือนอย่างต่อเนื่องสามารถปรับปรุงการคาดการณ์ในหลอดทดลองของการจัดการยาในร่างกายโดยไตได้อย่างไร แบบจำลองไตที่ออกแบบมาอย่างแม่นยำอาจทำให้การทดสอบพรีคลินิกเป็นมาตรฐานและลดอัตราความล้มเหลวของยาได้

ในงานนี้ ใช้เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพไมโครฟลูอิดิกแผ่นคู่ขนานเพื่อกำหนดผลกระทบของความเครียดเฉือนที่ยั่งยืนต่อการขนส่งไอออนบวกอินทรีย์โดย OCT2 และ MATE1 ในไตท่อสายเซลล์ เซลล์หลายสายพันธุ์ได้รับการพิจารณาสำหรับการศึกษาเหล่านี้ รวมถึงสายพันธุ์ของเซลล์ของมนุษย์ เช่น เซลล์ทูบูลส่วนต้นของมนุษย์จากกลุ่มฮอปเฟอร์ (Orosz et al,2004) และ RPTECs(CRL-4031:American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al.,2008) แต่เซลล์ hOCT2/hMATE1 MDCK ที่ทรานส์เฟกสองครั้งถือเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการศึกษานี้ด้วยเหตุผลหลายประการ อย่างแรก เซลล์ MDCK แสดงให้เห็นการยึดเกาะที่แข็งแกร่งกับส่วนแทรกแบบทรานสเวลล์อย่างสม่ำเสมอ ซึ่งช่วยให้เซลล์เหล่านี้ทนต่อความเค้นเริ่มต้นของการไหลของของเหลวได้ ประการที่สอง เซลล์เหล่านี้ก่อตัวเป็นชั้นเดียวที่แน่น ซึ่งป้องกันการรั่วไหลและจำเป็นสำหรับการศึกษาการขนส่งข้ามเซลล์ของสารตั้งต้นของเครื่องหมาย สุดท้าย การแสดงออกภายนอกของผู้ขนส่งช่วยให้สามารถตรวจจับการขนส่งที่ใช้งานอยู่และผลกระทบของการรบกวนได้ดีขึ้น

เซลล์ที่วางอยู่ใต้กระแสน้ำก่อตัวเป็นชั้นเดียวที่ไหลมาบรรจบกันและกำหนดโปรตีนที่มีจุดเชื่อมต่อแน่นไปยังขอบของเซลล์ พวกเขายังรักษาฟังก์ชันกั้นที่สูงโดยวัดจากการซึมผ่านของอินนูลิน ความสามารถของเซลล์เยื่อบุผิวในการสร้างชั้นเดียวที่ป้องกันการรั่วไหลของของเหลวและโปรตีนเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการทำงานที่เหมาะสมของท่อ ที่นี่ การรั่วไหลผ่านเซลล์ MDCK น้อยที่สุดที่น้อยกว่า 1 ไมโครกรัม/ตารางเซนติเมตรต่อวัน และต่ำกว่าที่ผ่านเซลล์ของมนุษย์อย่างมีนัยสำคัญ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าโมโนเลเยอร์ในเซลล์ไตของมนุษย์มีการรั่วไหลของอินนูลิน 10-20 ug/cm² ต่อวัน (Brakeman et al.,2016) ซึ่งสนับสนุนข้อสรุปที่ว่าเซลล์ hOCT2/hMATE1 MDCK ก่อตัวเป็นชั้นเดียวที่ทนทาน

การขนส่งของ ASP plus เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ hOCT2/hMATE1 MDCK ที่สัมผัสกับความเค้นเฉือนในระดับต่างๆ เป็นเวลา 72 ชั่วโมงเมื่อเทียบกับการควบคุมแบบสถิต ASP plus ถูกนำไปใช้โดย OCT2 (SLC22A2) และไหลออกโดย MATE1 (SLC47A1) ซึ่งเป็นตัวขนส่งไอออนบวกอินทรีย์สองตัวที่ทำงานประสานกันเพื่ออำนวยความสะดวกไตการหลั่งของยาที่ใช้กันทั่วไป เช่น เมตฟอร์มินและซิสพลาติน (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013) มีรายงานผลกระทบที่คล้ายคลึงกันของความเค้นเฉือนสำหรับตัวขนส่งไอออนแบบท่อใกล้เคียง มีการรายงานการเพิ่มขึ้นของการดูดซึมอัลบูมิน การดูดกลับของไอออน และการแสดงออกของเมกาลินและทูบูลินในการตอบสนองต่อแรงเฉือนที่เพิ่มขึ้น (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2557). การรับสัมผัสเชื้อของไตเซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียงกับความเค้นเฉือนยังสัมพันธ์กับการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสที่ลดลงและการฟื้นตัวเร็วขึ้นจากความเป็นพิษเฉียบพลันของซิสพลาตินและการยับยั้งการขนส่งประจุลบแบบอินทรีย์ที่เพิ่มขึ้น (Jang et al.2013) เนื่องจากความเค้นเฉือนจากการไหลของของไหลมีอยู่ตลอดเวลาในท่อใกล้เคียง การค้นพบนี้จึงสนับสนุนการใช้ระบบแบบจำลองในหลอดทดลองทางสรีรวิทยาที่มากขึ้นเพื่อทำนายการจำหน่ายยาในไตและความเป็นพิษ เป็นที่น่าสังเกตว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในหน้าที่การขนส่งระหว่าง 0.5 และ 2.0 dynes/cm² ของความเค้นเฉือน การศึกษาก่อนหน้านี้โดย Essig และ Friedlander (2003) พบว่าระดับแรงเฉือนขั้นต่ำที่ 0.17 ไดน์/ซม2 เป็นสิ่งจำเป็นเพื่อกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของเซลล์ และการศึกษาอื่นๆ ได้วัดผลกระทบต่อ สรีรวิทยาสูงถึง 1 dyne/cm² (Duan et al.,2010). นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่สำรวจผลกระทบของช่วงของระดับความเค้นเฉือนที่สูงขึ้นและยั่งยืนต่อการทำงานของผู้ขนส่งยาในไต และอาจเป็นไปได้ว่าขนาดของความแตกต่างทางชีววิทยาระหว่าง 0.5 และ 2.0 ไดน์/ซม² ของความเค้นเฉือนที่เรา การประเมินมีขนาดไม่ใหญ่พอที่จะระบุความแตกต่างระหว่างระดับความเค้นเฉือนเหล่านี้ในการทดสอบของเรา แม้ว่าจะต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม แต่ผลลัพธ์ของเราให้ความกระจ่างเกี่ยวกับสภาวะที่จำเป็นสำหรับแบบจำลองที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาและผลกระทบของระดับความเครียดเฉือนที่เพิ่มขึ้นอันเนื่องมาจากโรคในการจัดการกับยารักษาไต

ข้อจำกัดอย่างหนึ่งของวิธีการทดลองของเราคือ เราจัดการการขนส่งที่ pH 7.4 เท่านั้นโดยใช้สื่อที่มีค่า pH 7.4 ทั้งด้านยอดและด้านฐาน โดยเลียนแบบวิธีการทดลองที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับเซลล์ hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011) การไล่ระดับ pH จากยอดถึงฐานอาจส่งผลต่อฟังก์ชัน OCT2 และ MATE1 และโดยทั่วไปจะมีการไล่ระดับ pH ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา (Muller et al.,2013) ดังนั้น วิธีการของเราจึงจำกัดความสามารถของเราในการประเมินการทำงานร่วมกันระหว่างการไล่ระดับ pH ที่ปลายถึงฐานและความเค้นเฉือนในฟังก์ชัน OCT2 และ MATE1 เนื่องจากเราใช้ pH 7.4 ที่สม่ำเสมอตลอดสภาวะการทดลองทั้งหมด การขาดความลาดชันของ pH นี้ไม่น่าจะส่งผลกระทบต่อการค้นพบของเรา แต่อาจจำกัดการบังคับใช้ของการค้นพบของเรากับการขนส่ง OCT2 และ MATE1 ในการปรากฏตัวของการไล่ระดับ pH บนยอดถึงฐาน

น่าแปลกที่การแสดงออกของ mRNA ของ OCT2 ที่ถ่ายจากมนุษย์และภายนอกร่างกายเพิ่มขึ้นในเซลล์ที่สัมผัสกับความเครียดเฉือนทุกระดับเมื่อเทียบกับการควบคุมแบบสถิต การปรับขึ้นของการแสดงออกของผู้ขนส่งมีความเฉพาะเจาะจง โดยไม่มีผลที่วัดได้ต่อการแสดงออกของ P-GP ภายนอกหรือ MATE1 ที่ทรานส์เฟก การควบคุมการแสดงออกของผู้ขนส่งช่วยให้เข้าใจกลไกเบื้องหลังการขนส่งที่เพิ่มขึ้นและอาจเป็นผลมาจากความเสถียรของ mRNA ที่เพิ่มขึ้นหรือการถอดรหัส mRNA ที่เพิ่มขึ้น เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตว่าทั้งผู้ขนส่งที่ถ่ายและภายนอกได้รับการควบคุมซึ่งเป็นสิ่งที่ไม่คาดคิดเนื่องจาก OCT2 ที่ทรานส์เฟกนั้นแสดงออกภายใต้โปรโมเตอร์ cytomegalovirus และไม่ควรอยู่ภายใต้กลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนภายนอก แม้ว่าจะน่าแปลกใจ แต่การสังเกตนี้ไม่เคยเกิดขึ้นมาก่อน มีรายงานผลกระทบที่คล้ายคลึงกันกับ OAT1 ที่ถ่ายเซลล์ท่อใกล้เคียงที่สัมผัสกับการแพร่กระจาย แต่กลไกสำหรับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นยังคงไม่ชัดเจน (Jansen et al., 2016) ในการศึกษาอื่นพบว่าการส่งสัญญาณ Nrf2 มีบทบาทในการเพิ่มการแสดงออกของ MATE2-K ภายในร่างกายเพื่อตอบสนองต่อความเครียดเฉือน (Fukuda et al., 2017) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับเรื่องนี้ และจะเป็นเรื่องของการสอบสวนในอนาคต

นอกจากนี้เรายังระบุด้วยว่าการนำกระแสเฉือนปลายยอดเพิ่มปริมาณโปรตีนต่อตารางเซนติเมตรของเซลล์ ผลกระทบนี้มีขนาดเท่ากันสำหรับทั้ง 0.5 และ 2 ไดน์/ซม²ของแรงเฉือน คล้ายกับผลที่เห็นสำหรับการแสดงออกของ mRNA และ ASP บวกการขนส่ง มีหลักฐานว่าแรงเฉือนทำให้ตัวสูงขึ้นไตเซลล์เยื่อบุผิวซึ่งจะส่งผลให้มีปริมาตรของเซลล์ต่อตารางเซนติเมตรมากขึ้นและทำให้โปรตีนมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นต่อตารางเซนติเมตร อย่างไรก็ตาม ปรากฏการณ์ที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้เป็นเพียงข้อสังเกตเล็กน้อยในกลุ่มข้อมูลที่ใหญ่ขึ้นและไม่ได้หาปริมาณ (Long et al., 2017) การเพิ่มขึ้นของโปรตีนทั้งหมดในเซลล์ที่เติบโตต่อหน้ากระแสเฉือนที่ปลายอาจแสดงถึงปริมาณโปรตีนปกติเพื่อสุขภาพไตท่อเซลล์เยื่อบุผิวที่สามารถทำได้โดยการสัมผัสเซลล์ต่อกระแสเฉือนปลาย ดังนั้น ปริมาณโปรตีนในระดับที่ต่ำกว่าในเซลล์ที่เติบโตในการเพาะเลี้ยงแบบสถิตอาจแสดงถึงสถานะของเซลล์ที่ผิดปกติ ซึ่งอาจเกิดขึ้นทางคลินิกในสถานการณ์ที่มีการไหลของน้ำกรองที่ปลายยอดต่ำ เช่น การบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน ปรากฏการณ์นี้สมควรได้รับการศึกษาเพิ่มเติม

เป็นที่ทราบกันดีว่าซีเลียมีบทบาททางประสาทสัมผัสทางกลในท่อใกล้เคียง (Raghavan และ Weisz,2016) ดังนั้น เพื่อตรวจสอบว่าพวกมันมีบทบาทสำคัญในการขนส่งที่เป็นสื่อกลางของ OCT2 และ MATE1-ที่รายงานที่นี่หรือไม่ ผลของการกำจัด cilia ต่อการทำงานของตัวขนส่งจึงถูกวัด การปิดกั้นโดยสมบูรณ์ของการเพิ่มขึ้นตามแรงเฉือนใน ASP บวกกับการขนส่งโดยการกำจัด cilia ในการศึกษาของเรานั้นคล้ายคลึงกับผลที่พบในการศึกษาโดย Raghavan et al (2014) ซึ่งแสดงให้เห็นการปรับเพิ่มที่ขึ้นกับตาในเอนโดไซโตซิสเพื่อตอบสนองต่อการไหลของของไหล แอมโมเนียมซัลเฟตน่าจะมีผลกระทบอื่นๆ ที่ไม่เคยมีมาก่อนต่อพฤติกรรมและการทำงานของเซลล์ที่อาจส่งผลกระทบทางอ้อมต่อการขนส่งตัวถูกละลาย แม้จะมีผลกระทบนอกเป้าหมาย แต่วิธีการลดทอนนี้จะทดสอบบทบาทของการตรวจวัดเลนส์ปรับเลนส์ในการเคลื่อนที่ของตัวทำละลายอินทรีย์โดยอาศัยผู้ขนส่ง กลไกการส่งสัญญาณระหว่างโปรตีนประสาทสัมผัสทางกลในตาและขนย้ายยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด สมมติฐานหนึ่งคือหน้าที่ของตัวขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ถูกเปลี่ยนโดยการขนส่งไอออนที่เปลี่ยนแปลง การกำจัด cilia เป็นที่ทราบกันดีว่าเปลี่ยนการเคลื่อนที่ของตัวละลายในเซลล์หลอดอาหารส่วนต้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งโดยการลด Nat/K plus การแปลเมมเบรน ATPase และการปรับเปลี่ยนการขนส่งพาราเซลลูลาร์ (Overgaard et al..,2009). เป็นไปได้ว่าสิ่งนี้ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในฟังก์ชัน MATE1 ซึ่งเป็นตัวป้องกันที่ขึ้นอยู่กับการไล่ระดับสี H สมมติฐานอีกประการหนึ่งคือ การตรวจจับความเค้นเฉือนส่งผลต่อการแสดงออกของสารขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ ความเค้นเฉือนปรับฟังก์ชัน MATE2-K ผ่านการส่งสัญญาณ Nrf2 (Fukuda et al.,2017) สารขนส่งไอออนบวกอินทรีย์อื่นๆ อาจตอบสนองในทำนองเดียวกันกับความเค้นเฉือน ซึ่งจะถูกกำจัดออกไปเมื่อซีเลียที่รับสัมผัสทางกลถูกกำจัดออก สิ่งนี้ไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดและรับประกันการศึกษาเพิ่มเติม ที่น่าสนใจ การกำจัด cilia ไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อ ASP บวกการขนส่งโดยเซลล์ที่สัมผัส 0.2 ไดน์/ซม² ของความเครียดเฉือน แต่สังเกตพบผลกระทบที่แข็งแกร่งเมื่อความเค้นเฉือนเพิ่มขึ้นเป็น 0.5 ไดน์/ซม2 นี่แสดงให้เห็นว่า cilia รู้สึกถึงระดับความเครียดเฉือนที่ธรณีประตู ในทางกลับกัน สัญญาณ cilia จะเปลี่ยนไปในการแสดงออกและหน้าที่ของผู้ขนส่งก่อนที่จะคาดว่าจะมีผลกระทบที่วัดได้ต่อการขนส่ง โดยรวมแล้ว การพึ่งพาการขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ในการตรวจจับเลนส์ปรับเลนส์ของความเค้นเฉือนช่วยให้เข้าใจถึงเส้นทางการส่งสัญญาณทางกลไกที่เกี่ยวข้องและระดับความเครียดขั้นต่ำที่อาจจำเป็นต้องกระตุ้นการตอบสนองที่แข็งแกร่งต่อแรงเฉือน

โดยสรุป ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความเค้นเฉือนจากการไหลของของไหลมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อหน้าที่และการแสดงออกของตัวขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ในเซลล์ MDCK นอกจากนี้ การควบคุมการขนส่งไอออนบวกของสารอินทรีย์ยังขึ้นกับการปรากฏตัวของ cilia เราขอเสนอว่าความเค้นเฉือนที่ปลายยอดเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของการสร้างแบบจำลองในหลอดทดลองของไตท่อเซลล์และมีแนวโน้มที่จะเป็นองค์ประกอบที่สำคัญในการสร้างแบบจำลองการขจัดสารคัดหลั่งของไตและความเป็นพิษต่อไตของยา กลไกเฉพาะที่สัญญาณความเค้นเชิงกลเพิ่มกิจกรรมและการแสดงออกของผู้ขนส่งยังไม่ชัดเจนและต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม

อ้างอิง

Astashkina A, Mann B และ Grainger DW (2012) การประเมินที่สำคัญของแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ในหลอดทดลองสำหรับการคัดกรองยาในปริมาณมากและความเป็นพิษ Pharmacol เธอ 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E และ Ciarimboli G (2006) การกำหนดลักษณะของกลไกการกำกับดูแลและสถานะของการขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ของมนุษย์ 2. Am J Physiol Cell ฟิสิออล 290:C1521–C1531

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH และ Ferrell N (2016) เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบไมโครฟลูอิดิกแบบโมดูลาร์พร้อมปริมาณงานที่ได้รับการปรับปรุงสำหรับการประเมินเซลล์เยื่อบุผิวโพลาไรซ์ของไต ไบโอไมโครฟลูอิดิกส์ 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S และ Wang T (2010) การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากแรงเฉือนที่เกิดจากแรงเฉือนของการแปลและการแสดงออกของตัวขนส่งเมมเบรนในเซลล์หลอดใกล้เคียงของเมาส์ Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 107:21860–21865

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY และ Feraille E (2018) การตัดไตแบบยูเนี่ยนและความเครียดเฉือนของของเหลวที่ปลายยอดช่วยลดความอุดมสมบูรณ์ของ ENaC ในการรวบรวมเซลล์หลักของท่อ Am J Physiol ไต Physiol 314:F763–F772

Essig M และ Friedlander G (2003) ความเค้นเฉือนของท่อและฟีโนไทป์ของเซลล์ท่อไตใกล้เคียง J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD และ Fissell WH (2010) เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบไมโครฟลูอิดิกที่มีอิเล็กโทรดการวัดค่าความต้านทานไฟฟ้าผ่านเยื่อบุผิว (TEER) แบบบูรณาการสำหรับการประเมินเซลล์เยื่อบุผิวของไต เทคโนโลยีชีวภาพ Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT และ Fissell WH (2012) การจัดการอัลบูมินโดยเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพไมโครฟลูอิดิก เทคโนโลยีชีวภาพ Bioeng 109:797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT และ Fissell WH (2012) เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบไมโครฟลูอิดิกสำหรับการศึกษาเซลล์เยื่อบุผิวภายใต้ความเค้นเฉือนของของเหลว ฟาเส็บ เจ 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M และ Kawamata Y (2017) ความเครียดเฉือนของของไหลช่วยกระตุ้นการแสดงออกของ MATE2-K ผ่านการเปิดใช้งานเส้นทาง Nrf2 ชุมชน Biochem Biophys Res 484:358–364

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, และคณะ; International Transporter Consortium (2010) ผู้ขนส่งเมมเบรนในการพัฒนายา Nat Rev Drug Discov 9: 215–236

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY และ Ingber DE (2013) ท่อไตที่ใกล้เคียงของมนุษย์สำหรับการขนส่งยาและการประเมินความเป็นพิษต่อไต Integr ไบโอล 5:1119–1129

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, และคณะ (2016) ท่อไตที่ออกแบบทางวิศวกรรมชีวภาพขับสารพิษในปัสสาวะได้อย่างมีประสิทธิภาพ ตัวแทนวิทย์ 6:26715.

Kola I และ Landis J (2004) อุตสาหกรรมยาสามารถลดอัตราการออกจากงานได้หรือไม่? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C และ Fromm MF (2011) เซลล์ MDCK ที่ถ่ายสองครั้งที่แสดง OCT1 / MATE1 หรือ OCT2 / MATE1 ของมนุษย์: ตัวกำหนดการดูดซึมและการเคลื่อนย้ายข้ามเซลล์ของไอออนบวกอินทรีย์ บร. เจ ฟาร์มาคอล 163:546–555.

KR แบบยาว, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ และ Weisz OA (2017) เอ็นโดไซโทซิสปลายท่อส่วนปลายถูกมอดูเลตโดยความเค้นเฉือนของของไหลผ่านทางเดินที่ขึ้นกับ mTOR โมลไบโอลเซลล์ 28:2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากแรงเฉือนที่เกิดจากการจัดโครงสร้างเยื่อบุผิวในเซลล์ท่อไตของมนุษย์ กรุณา หนึ่ง 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L และ Giacomini KM (2013) ผู้ขนส่งไตในการพัฒนายา Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K และ Fromm MF (2013) บทบาทของตัวขนส่งไอออนบวกอินทรีย์ OCT2 และโปรตีนอัดขึ้นรูปหลายตัวและสารพิษ MATE1 และ MATE2-K สำหรับการขนส่งและปฏิกิริยาระหว่างยาของลามิวูดีนต้านไวรัส ไบโอเคมี ฟาร์มาคอล 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, และคณะ (2004) ศักยภาพในการเติบโต การทำให้เป็นอมตะ และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ทูบูลใกล้เคียงในวัยผู้ใหญ่ปกติ ในหลอดทดลอง เซลล์ Dev Biol Anim 40:22–34

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A และ Yeaman C (2009) Deciliation เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงอย่างมากของรอยต่อเซลล์เยื่อบุผิวและโดเมนพื้นผิว โมลไบโอลเซลล์ 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, ช่วย CR และ Day MJ (2007) การพัฒนาและการประยุกต์ใช้ชุดตรวจยีนอ้างอิงภายใน (แม่บ้าน) หลายชุดสำหรับการปรับมาตรฐานการศึกษาการแสดงออกของยีนสุนัขอย่างถูกต้อง สัตวแพทย์ Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W และ Gstraunthaler G (1998) การทดสอบความเป็นพิษต่อไตในหลอดทดลอง--สิ่งที่เรารู้และสิ่งที่เราจำเป็นต้องรู้ มุมมองด้านสุขภาพสิ่งแวดล้อม 106 (Suppl 2): ​​559–569

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD และ Weisz OA (2014) การควบคุมแรงเฉือนที่ขึ้นกับแรงเฉือนของการเอนโดไซโทซิสที่ปลายสุดในเซลล์ท่อไตใกล้เคียงโดยอาศัย cilia ปฐมภูมิ Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 111:8506–8511

Raghavan V และ Weisz OA (2016) สังเกตบทบาทของกลไกรับความรู้สึกในการควบคุมการทำงานของท่อใกล้เคียง Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD และ Livak KJ (2008) วิเคราะห์ข้อมูล PCR แบบเรียลไทม์โดยวิธี C(T) เปรียบเทียบ แนท โพรโทค 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B และ Ulfendahl H (1983) FITC-inulin เป็นเครื่องหมายของท่อไตในหนูแรท Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR และ Begg DA (1994) ผลกระทบที่ขึ้นกับความเข้มข้นของ cytochalasin D ต่อรอยต่อแน่นและเส้นใยแอคตินในเซลล์เยื่อบุผิว MDCK เจเซลล์วิทย์ 107: 367–375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S และอื่น ๆ (2018) วิศวกรรมท่อขนาดเล็กที่มีการเปลี่ยนแปลงขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางสำหรับการศึกษาการจัดระเบียบของเซลล์ไต ไบโอไมโครฟลูอิดิกส์ 12: 024114

Watkins PB (2011) วิทยาศาสตร์ความปลอดภัยของยาและคอขวดในการพัฒนายา คลินิก Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J และ Grillari-Voglauer R (2008) hTERT เพียงอย่างเดียวทำให้เซลล์เยื่อบุผิวของท่อไตใกล้เคียงเป็นอมตะโดยไม่เปลี่ยนลักษณะการทำงาน Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y และ Giacomini KM (2013) การค้นพบสารยับยั้งการอัดรีดสารพิษและสารพิษ 1 (MATE1, SLC47A1) ที่มีศักยภาพ ผ่านการทำโปรไฟล์ยาที่ต้องสั่งโดยแพทย์และแบบจำลองทางคอมพิวเตอร์ เจ เมด เคม 56:781–795.