ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ Phenylethanoids จาก Cistanche Deserticola

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong/ Shigetoshi Kadota, "ทาดาโตะ ทานิ,6 และสึเนโอะ นัมบะ"

สารสกัดอะซิโตน-H2O (9:1) จากลำต้นของ Cistanche deserticola แสดงให้เห็นถึงกิจกรรมการไล่อนุมูลอิสระที่รุนแรง สารสกัดนี้แยกสารประกอบฟีนิลทานอยด์หลักเก้าชนิด โดย NMR ระบุว่าเป็น acteoside, isoacteoside, l^acetylacteoside, tubuloside B, echinacoside, tubuloside A, syringalide A 3z-a-rhamno- pyranoside, cistanoside A และ cistanoside F. สารประกอบทั้งหมดนี้มีกิจกรรมการไล่อนุมูลอิสระที่แรงกว่า a -โทโคฟีรอลบน 1,1 -diphenyI-2-picrylhydrazy 1 (DPPH) เรดิคัลและแซนไทน์/แซนไทน์ออกซิเดส (XOD) ทำให้เกิดซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนเรดิคัล (Oj) ในบรรดาสารประกอบทั้งเก้าชนิด ไอโซแอคทีโอไซด์และทูบูโลไซด์บีซึ่งมีคาเฟอีนมอยอิตีอยู่ที่ตำแหน่ง d' ของกลูโคส แสดงผลการยับยั้ง XOD เรายังศึกษาผลกระทบของฟีนิลทานอยด์เหล่านี้ต่อลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในไมโครโซมของตับของหนูที่ถูกเหนี่ยวนำโดยเมท ods ที่มีเอนไซม์และไม่ใช่เอนไซม์ ตามที่คาดไว้ สารแต่ละชนิดแสดงการยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญต่อทั้ง ascorbic acid/Fe2 plus และ ADP/NADPH/Fe3 plus ที่เหนี่ยวนำให้เกิด lipid peroxidation ในไมโครโซมตับของหนูแรท ซึ่งมีศักยภาพมากกว่า a-tocopherol หรือกรด caffeic พบว่าสารต้านอนุมูลอิสระ eflFect มีศักยภาพโดยการเพิ่มจำนวนของกลุ่มฟีนอลไฮดรอกซิลในโมเลกุล

คำสำคัญ: ซิสแทนเชเดซิโกลา; ฟีนิลทานอยด์;สารต้านอนุมูลอิสระ DPPH (1 ,1 -ไดฟีนิล-2-พิคริลไฮดราซิล) เรดิคัล; ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนเรดิคัล; ลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน

ต้นกำเนิดของ Cistanche deserticola

ลำต้นของ Cistanche spp. (Cistanche Herbaวงศ์ Orobanchaceae) เป็นยาชูกำลังในยาจีนโบราณ ใช้สำหรับภาวะไตบกพร่อง โดยมีลักษณะอาการอ่อนแรง รู้สึกเย็นที่เอวและหัวเข่า ภาวะเป็นหมันของสตรี และท้องผูกเนื่องจากลำไส้แห้งในวัยชราองค์ประกอบจำนวนหนึ่งรวมถึงฟีนิลเอทมอยด์ (บางครั้งเรียกว่าฟีนิลโพรพานอยด์) 2) ir idoids3* และโพลีแซ็กคาไรด์4) ถูกแยกออกจากพืชเหล่านี้ Sato et al5} รายงานว่า phenylethanoids บางตัวจากยาดิบนี้มีผลในการป้องกันพฤติกรรมทางเพศและการเรียนรู้ที่ลดลงในหนูที่แขวนคอด้วยความเครียด ฟีนิลทานอยด์เป็นองค์ประกอบหลักของพืชเหล่านี้และถือว่ามีส่วนช่วยในการดำเนินการต่างๆ ของยานี้6)

Phenylethanoids มีการกระจายอย่างกว้างขวางในอาณาจักรพืชและพบว่าบางชนิดมีฤทธิ์ในการต้าน anoxia,7) ต่อต้านเนื้องอก, 8) การยับยั้งเอนไซม์, 9* ต้านการอักเสบ, 10) ไตอักเสบ, 1 n ต่อต้านจุลินทรีย์และ immunomodulation.12) การศึกษาเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านออกซิเดชันของฟีนิลเลธานอยด์บางชนิดจาก Pedicularis ก็ถูกรายงานเช่นกัน13 -15) แต่ไม่พบรายงานที่เกี่ยวข้องกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของฟีนิลเลทานอยด์จากสายพันธุ์ Cistanche

เป็นที่ทราบกันดีว่าอนุมูลอิสระมีส่วนอย่างมากในการเกิดโรคต่างๆ เช่น มะเร็ง โรคหลอดเลือดหัวใจ โรคข้ออักเสบ การอักเสบ ตลอดจนในกระบวนการเสื่อมที่เกี่ยวข้องกับการสูงวัย16™18) ในการคัดกรองสารต่อต้านริ้วรอยจากทรัพยากรธรรมชาติของเรา เราพบว่าแต่ละ CHC13 (C), EtOAc (E), อะซิโตน (A), acetone-H2O (9:1) (AH) และน้ำ (H) สารสกัดของลำต้นของ Cistanche deserticola แสดง DPPH ที่มีศักยภาพ กิจกรรมการกวาดล้างอย่างรุนแรง (รูปที่ 1) ซึ่งในจำนวนนี้ สารสกัดที่แรงที่สุดถูกแสดงโดยอะซิโตน—H?.(9:1) สารสกัด (AH) สารสกัดอะซิโตน-H2O (9:1) มีอัตราส่วนของฟีนิลเลทานอยด์สูง ซึ่งน่าจะเป็นองค์ประกอบที่ออกฤทธิ์ของผลการขับอนุมูลอิสระ เราแยกฟีนิลทานอยด์ที่สำคัญออกจากสารสกัดนี้และศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยการกำจัดสารอนุมูลอิสระของ DPPH และแซนทีน/XOD ที่สร้างอนุมูลจากซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน และการยับยั้งของแอสคอร์บิกแอซิด/ Fe2 plus และ ADP/NADPH/Fe3 บวกกับการเกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในตับของหนู ไมโครโซม

Cistanche deserticola

วัสดุและวิธีการ

รีเอเจนต์ Polyamide C-200 (75一150/zm) และซิลิกาเจล (Wakogel C-200, 75—150^m) ผงสำหรับคอลัมน์โครมาโตกราฟี, DPPH (1,1 -diphenyl{{ 8}}picrylhydrazyl), xanthine, XOD (xanthine oxidase), NBT (nitroblue tetrazolium), ADP, g-NADPH, caffeic acid และ a-tocopherol ซื้อมาจาก Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan Malonaldehyde bis (dimethylacetal) มาจาก Tokyo Kasei กรุงโตเกียว ประเทศญี่ปุ่น BSA (bovine serum albumin) และ allopurinol มาจาก sigma,St. Louis, USA สารเคมีอื่นๆ อยู่ในระดับวิเคราะห์

เครื่องมือวัดค่าการดูดกลืนแสง UV บน aเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์สำหรับการบันทึก Shimadzu UV-2200, สเปกตรัม NMR ถูกบรรทุกบนระบบ JEOL GX-400 หรือ JEOL JNM-LA 400WB FT NMR

วัสดุจากพืช ยาดิบเชิงพาณิชย์ (ผลิตใน Nei Monggol ซื้อในตลาดยาดิบ Bozhou มณฑลอานฮุย ประเทศจีน ปี 1995; ยาเฉพาะกลุ่ม TMPW หมายเลข 15479 ที่ฝากไว้ในพิพิธภัณฑ์ Materia Medica, ศูนย์วิจัยเชิงวิเคราะห์สำหรับ Ethnomedicine, Research สถาบัน Wakan-Yaku, Toyama Medical and Pharmaceutical University) ถูกระบุว่าเป็นต้นกำเนิดของ Cistanche deserticola YC Ma โดยการเปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยาและกายวิภาคกับตัวอย่างจริงที่จัดทำโดยศาสตราจารย์ Dawen Shi ภาควิชาเภสัชศาสตร์ Shanghai Medical Uni เวอร์ชันเก่า ประเทศจีน

การสกัดและการแยก ยาดิบแบบผง (5.87 กก.) ถูกสกัดอย่างต่อเนื่องด้วย CHC13 (12, 9 1x2) และ EtOAc (9 1 x 3) ที่อุณหภูมิห้องและถูกรีฟลักซ์ด้วยอะซีโตน (9 1 x 3), acetone-玦0 (9:1,91x3) และ H2O (7.5 1x4) เพื่อให้สารสกัดจาก CHC13 (C) (28.7g), EtOAc (E) ( 13.4g), อะซิโตน (A) (95g), อะซิโตน- H2O (9:1) (AH) (175 ก.) และ H2O (H) (2.51 กก.) โดยคำนึงถึงลักษณะเฉพาะ ส่วนหนึ่งของ lOOg ของสารสกัดอะซิโตน-H2O (9:1) ถูกนำไปยังโพลีเอไมด์ C-200 (4{{50}}0 ก.) และชะด้วย H2O ({{41 }}) จากนั้น MeOH (5 1) สารชะ MeOH (20 กรัม) ถูกเติมลงในคอลัมน์ซิลิกาเจล (600 กรัม) และถูกชะด้วย CHCl3-MeOH-H2O (8: 3:0.3) (5 1) เพื่อให้ 10 เศษส่วน แต่ละเศษส่วนอยู่ภายใต้คอลัมน์ Sephadex LH-20 และชะด้วยอัตราส่วนต่างๆ ของ MeOH-H2O (0一50 เปอร์เซ็นต์ ); ฟีนิลทานอยด์หลักเก้าชนิด 1 (607 มก.), 2 (286 มก.), 3 (43 มก.), 4 (187 มก.), 5 (1.1 กรัม), 6 (100 มก.), 7 (208 มก.), 8 (168 มก.) , ได้รับ 9 (75 มก.)

สัตว์ เพศผู้ Std: ใช้หนู Wistar (อายุ 8 สัปดาห์, 230一 250 กรัม) สัตว์เหล่านี้ซื้อมาจากศูนย์สัตว์ทดลองชิซูโอกะและให้อาหารเม็ดเชาในห้องปฏิบัติการ (Clea Japan) และให้น้ำเปล่า

การเตรียมสารแขวนลอยไมโครโซมอลตับหนูหนูหนูเตรียมโดยวิธี Kiso et al.l9) แต่ไม่มีการปรับสภาพฟีโนบาร์บิทัลก่อน หลังจากที่สัตว์อดอาหารเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตับจะได้รับสารละลาย NaCl ที่เย็นจัด 0.9 เปอร์เซ็นต์ ในแหล่งกำเนิด จากนั้นหั่นเป็นชิ้นบางๆ และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในสารละลาย KC1 ที่เย็นจัด 1.15 เปอร์เซ็นต์ (1.{{9} } มล./กรัม ของน้ำหนักตับเปียก) โฮโมจีเนตถูกเจือจางสี่ครั้งด้วยสารละลาย KC1 ร้อยละ 1.15 และหมุนเหวี่ยงที่ 8000 กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 องศา จากนั้นจึงเก็บเศษส่วนเหนือตะกอนและปั่นแยกเหวี่ยงพิเศษที่ 105000 กรัม เป็นเวลา 60 นาที เม็ดที่ได้รับถูกแขวนลอยใหม่ในปริมาตรเดียวกันของสารละลาย KC1 1.15 เปอร์เซ็นต์ ปริมาณโปรตีนถูกกำหนดโดยวิธีการของ Lowry et โดยใช้อัลบูมินเป็นมาตรฐาน

การเตรียมตัวอย่าง ตัวอย่างที่ทดสอบถูกละลายในน้ำหรือเอทานอลและเจือจางด้วยน้ำจนถึงความเข้มข้นต่างๆ ความเข้มข้นสุดท้ายของเอทานอลต่ำกว่า 1 เปอร์เซ็นต์ ในทุกระบบการทดสอบ ยกเว้น DPPH radical scavenging assay เอทานอลที่ความเข้มข้นสุดท้ายต่ำกว่า 1 เปอร์เซ็นต์ไม่มีผลต่อระบบการทดสอบเหล่านี้

DPPH Radical Scavenging Effect เอฟเฟกต์การไล่ตามความรุนแรงของการดับ DPPH รุนแรง ตามที่ Hatano et al.21 อธิบายไว้) ห้าร้อย /A ของ 60 卩m DPPH ใน EtOH ถูกเพิ่มเป็น 500 /zl ของสารละลายตัวอย่างและอนุญาตให้ทำปฏิกิริยาสำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นวัดความหนาแน่นของแสงที่ 520 นาโนเมตร สำหรับช่องว่าง ใช้ EtOH แทนสารละลาย DPPH และสำหรับการควบคุม ใช้ H2O แทนสารละลายตัวอย่าง ค่า IC50 คำนวณจากเส้นการถดถอย โดยที่ abscissa แสดงความเข้มข้นของสารประกอบที่ทดสอบและกำหนดเปอร์เซ็นต์การลดลงเฉลี่ยของ DPPH แรดิคัลจากการทดสอบสี่แบบแยกกัน

ผลกระทบต่อการสร้างประจุลบซูเปอร์ออกไซด์ การผลิตซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนในระบบแซนทีน/XOD ถูกกำหนดโดยใช้ขนาดครึ่งหนึ่งของวิธีการของ Imanari et al.22) ส่วนผสมประกอบด้วย 900/zl ของ 0.05m Na2CO3 (pH 10.2), 50 /il แต่ละตัวของ 3mM xanthine, 3mM EDTA, 1.5mg/ml BSA, 0.75 mM NBT และตัวอย่างที่ทดสอบถูกเติมด้วย 50 ของ 0.1 มก./มล. XOD เพื่อเริ่มต้น ปฏิกิริยา. หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 30 นาที ปฏิกิริยาหยุดด้วย 50 /il ที่ 6 mM CuCl2 และการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 560 นาโนเมตร สารละลายควบคุมถูกเตรียมในลักษณะเดียวกัน แต่ใช้ H2O 50 /il แทนสารละลายตัวอย่าง ในสารละลายเปล่า ใช้ H2O 50 /il แทนสารละลาย XOD ค่า IC50 คำนวณจากเส้นการถดถอยโดยที่ abscissa แสดงความเข้มข้นของล็อกของสารประกอบที่ทดสอบและปรับการยับยั้งเปอร์เซ็นต์เฉลี่ยของการลด NBT ของสี่ในการทดสอบที่ไม่ขึ้นต่อกัน

ผลการยับยั้งต่อกิจกรรมของ XOD ผลการยับยั้งต่อกิจกรรมของ XOD ประเมินโดยวิธีการของ Hatano et al.* โดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ของผสมที่ประกอบด้วย 600/11 ของบัฟเฟอร์ (0.1 ม. สารละลายฟอสเฟต, pH 7.5), 50 以 ของสารละลาย XOD (0.068 U/ml ในบัฟเฟอร์) และ สารละลายตัวอย่าง 50 卩 1 ถูกบ่มล่วงหน้าเป็นเวลา 10 นาที ที่ 25 องศา จากนั้น 300 pl ของสารละลายแซนทีน (0.1 มิลลิโมลาร์ในบัฟเฟอร์) ถูกเติมไปยังของผสม และสารละลายที่เป็นผลลัพธ์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 25 องศา ปฏิกิริยาของเอนไซม์สิ้นสุดลงโดยการเติม 1 n HC1 (100 /zl) และการดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาถูกวัดที่ 295 นาโนเมตร ความเข้มข้นของกรดยูริกที่เกิดขึ้นในของผสมคำนวณจากค่าการดูดกลืนแสง หลังจากลบค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายเปล่าที่เตรียมตามที่อธิบายข้างต้น ยกเว้นว่าสารละลาย XOD ถูกแทนที่ด้วย 50 /zl ของบัฟเฟอร์ ผลการยับยั้ง XOD แสดงโดยเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง (เปอร์เซ็นต์) ของการก่อตัวของกรดยูริกเทียบกับการควบคุม ซึ่งใช้น้ำแทนสารละลายตัวอย่าง สารยับยั้ง XOD ที่รู้จักกันดีคือ allopurinol ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

ผลการยับยั้งต่อลิปิดเปอร์ออกซิเดชันในไมโครโซมตับของหนู ลิปิดเปอร์ออกซิเดชันในไมโครโซมของตับของหนูที่เหนี่ยวนำโดยไม่ใช้เอนไซม์โดยแอสคอร์บิก/Fe2 บวก และเอนไซม์ที่เหนี่ยวนำโดย ADP/NADPH/Fe3 plus โดยวิธี Kiso et al.l9) ที่มีการดัดแปลงบางอย่าง .

ก) Ascorbic Acid/Fe2 บวกกับ Induced Lipid Peroxidation ในไมโครโซมตับหนู: ของผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วย 390/11 ของ 100mM KC1/45 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50pl ของเศษส่วนไมโครโซมอลใน 1.15 เปอร์เซ็นต์ KC1 (โปรตีน 20 มก./มล.) และ 50 以 ของสารละลายตัวอย่าง หลังจากการเติม 10/11 ของกรดแอสคอร์บิก 10 มิลลิโมลาร์/0.5 มิลลิโมลาร์ FeSO4 จากนั้นจึงบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 20 นาที ของผสมของปฏิกิริยาถูกทำให้เย็นในน้ำแข็งเพื่อหยุดปฏิกิริยา ลิปิดเปอร์ออกซิเดชันถูกวัดโดยวิธีกรดไธโอบาร์บิทูริก 24) และแสดงเป็นการผลิต MDA (มาลอนไดอัลดีไฮด์) ที่

b) ADP/NADPH/Fe3 บวกกับ Induced Lipid Peroxidation ในไมโครโซมตับหนู: ส่วนผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วย 290贝 ของ 100mM KC1/45him Tris-HCl (pH 8.0), 50/il ของสารแขวนลอย microsomal ใน 1.15 เปอร์เซ็นต์ KC1 (โปรตีน 20 มก./มล.) และตัวอย่าง 50 以 ในน้ำ 50//I ของ NADPH 1 มิลลิโมลาร์ และ 10 ของ 2 มิลลิโมลาร์ FeCl3 ที่เตรียมใหม่ ถูกเติมและจากนั้นบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที ลิปิดเปอร์ออกซิเดชันถูกวัดและ IC50 ถูกคำนวณโดยวิธีการข้างต้น

ประโยชน์ของ cistanche: ปกป้องตับ

ผลลัพธ์

การกำหนดโครงสร้าง โดยการเปรียบเทียบโดยตรงของข้อมูล ^H-NMR และ 13C-NMR ของพวกมันกับวรรณกรรม 2* ฟีนิลธานอยด์เก้าชนิดถูกระบุเป็น 2,-อะซิติแลคติโอไซด์ (1), ซิสตาโนไซด์ A (2), ทูบูโลไซด์ A (3), อิชินาโคไซด์ ( 4), acteoside (5), syringalide A 3'-a-rhamnopyranoside (6), tubuloside B (7), isoacteoside (8) และ cistanoside F (9) ตามลำดับ (รูปที่ 2) อย่างไรก็ตาม สำหรับแอกทีโอไซด์ สารประกอบตัวแทนของฟีนิลทานอยด์ การกำหนดสัญญาณ 13C-NMR ของ C-3 และ C-4 ในอะไกลโคนมอยอิตี, C-3, C-4 , C-5 และ C-6 ใน caffeic moiety ในรายงานก่อนหน้านี้25) ทำให้เกิดความสับสน โดยวิธีการของ 2D-NMR เช่น HMBC และ HMQC เราได้กำหนดข้อมูล 13C-NMR ของแอคทีโอไซด์อย่างไม่น่าสงสัยเป็น aglycone moiety Cl: 131.49, C-2: 117.14, C-3: 146.07, C{ {41}}: 144.62, C-5: 116.34, C-6: 121.29, Ca: 72.33, C# 36.54; คาเฟอีนมอยอิตี Cl: 127.63, C-2: 115.26, C-3: 146.79, C-4: 149.78, C-5: 116.55, C-6: 123.24 , Ca: 168.33, Cg: 114.68, Cy: 148.04; กลูโคสมอยอิตี C-l': 104.16, C-2': 75.97, C-3': 81.66, C4: 70.39, C-5': 76.16, C-6' : 62.35; และมอยอิตีของแรมโนส: Cl: 102.99, C-2: 72.22, C-3: 72.05, C-4: 73.79, C-5: 70.58, C-6 : 18.46.

ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรมได้รับการศึกษาสำหรับฟีนิลทานอยด์ทั้งเก้านี้โดยอนุมูล DPPH และแซนทีน/XOD ของพวกมันสร้างกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน กรดแอสคอร์บิก/Fe2 บวก และ ADP/NADPH/ Fe3 บวกกับลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่เหนี่ยวนำในไมโครโซมของตับหนู กรดคาเฟอีนและเอ-โทโคฟีรอลซึ่งเป็นสารกำจัดอนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระที่รู้จักกันดีถูกใช้เป็นสารควบคุมเชิงบวก

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>ไซริงกาไลด์ A S'-a-rhamnopyranoside (6) (IC5O=5.52 /zm) > ซิสตาโนไซด์ F (9) (IC50=6.29 /im) > a-tocopherol (IC{{10) }}.2//ม.). Tubuloside B ⑺,echinacoside (4), 2/-acetylacetoside (1), tubuloside A (3), acteoside (5) และ isoacteoside (8) (IC5O=2.99一3.49 /im) แต่ละรายการ มีหมู่ฟีนอลิกไฮดรอกซิลสี่กลุ่มในโมเลกุลที่แสดงให้เห็นกิจกรรมที่แข็งแรงกว่าซิสตาโนไซด์ A (2) ในทำนองเดียวกันซึ่ง 3-OH ของ aglycone moiety ถูกเมทิลเลต Syringalide A 3z-a-rhamnopyranoside (6) ซึ่งมีหมู่ OH เพียงกลุ่มเดียวใน aglycone moiety แสดงกิจกรรมที่ค่อนข้างอ่อนแอ Cistanoside F (9) ซึ่งมีกลุ่มไฮดรอกซิลเพียงสองกลุ่มตั้งอยู่ที่ caffeoyl moiety แต่ไม่มี phenylethanol aglycone แสดงกิจกรรมที่อ่อนแอที่สุด

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>ซิสตาโนไซด์ A (2) (IC5O=3.69 jUm) > a-tocopherol (IC50 > 10 〃m)

ผลการยับยั้งต่อกิจกรรม XOD เฉพาะไอโซแอคทีโอไซด์ (8) และทูบูโลไซด์บี (7) ซึ่งมีคาเฟอีนมอยอิตีอยู่ที่ตำแหน่ง 6z ของกลูโคส มีผลยับยั้งการทำงานของ XOD และฟีนิลเลทานอยด์อื่นๆ ซึ่งมีคาเฟอีนมอยอิตีที่ ^- ตำแหน่งของกลูโคส ไม่แสดงผลที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ (25一200 ม.) (ตารางที่ 1) แยกสารประกอบฟีนิลทานอยด์หลักเก้าชนิดจากสารสกัดนี้ และกำหนดโครงสร้างของพวกมันโดย NMR ระบบที่เป็น tubuloside B (7)M2'-acetylacteoside (1) iso-acteoside (8) echinacoside (4) tubuloside A (3) M ด้าน acteo (5) > syringalide A 3'-a-rhamnopyranoside (6) > cistanoside A (2) > ซิสตาโนไซด์ F (9); ในระบบ ADP/NADPH/Fe3 plus เช่น tubuloside B (7)2,-acetylacteoside (^^iso acteoside (8) acteoside (5) > tubuloside A (3) > echinaco side (4) > syringalide A 3z-a-rhamnopyranoside (6) > ซิสตาโนไซด์ A (2) > ซิสตาโนไซด์ F (9) คำสั่งทั้งสองนี้คล้ายกับในการทดสอบการกำจัดอนุมูลอิสระข้างต้นโดยเฉพาะในการทดสอบการขับอนุมูลอิสระ DPPH อย่างไรก็ตามจำนวนกลุ่มฟีนอลิกไฮดรอกซิลในโมเลกุล มีบทบาทสำคัญในการยับยั้งการเกิด lipid peroxidation ในไมโครโซมตับของหนู

ผลกระทบของ cistanche

อภิปรายผล

เราทดสอบกิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระของสารสกัดตัวทำละลายต่างๆ ของต้นกำเนิดของ Cistanche Deserticola ต่อสารอนุมูลอิสระ DPPH และพบว่าสารสกัด acetone-H2O (9:1) มีฤทธิ์รุนแรงที่สุด เพื่อค้นหาองค์ประกอบที่ออกฤทธิ์ของกิจกรรมการขับอนุมูลอิสระ เราได้แยกสารประกอบฟีนิลทานอยด์หลัก 9 ชนิดออกจากสารสกัดนี้ และกำหนดโครงสร้างของพวกมันโดย NMR

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ phenylethanoids เหล่านี้ได้รับการประเมินโดยกิจกรรมการขับอนุมูลอิสระและการต่อต้านไขมันเปอร์ออกซิเดชัน เอ-โทโคฟีรอลที่เป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายถูกใช้เป็นสารควบคุมเชิงบวก ในฐานะที่เป็นlipophilicity ของ a-tocopherol อาจส่งผลต่อการทำงานของมันในระบบการทดสอบปัจจุบัน ยกเว้นในการทดสอบการขจัดอนุมูลอิสระ DPPH เราใช้กรด caffeic เป็นสารควบคุมเชิงบวกอีกตัวหนึ่ง

ขั้นแรก เราดำเนินการทดสอบกิจกรรมการขับอนุมูลอิสระ phenylethanoids ที่ทดสอบทั้ง 9 อย่างไม่ต้องสงสัยแสดงกิจกรรมการขับอนุมูล DPPH และ superoxide anion radical ที่แรงกว่า a-tocopherol อย่างไม่ต้องสงสัย แต่บางชนิดก็แข็งแรงกว่าและบางชนิดก็อ่อนแอกว่ากรดคาเฟอีน กิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นด้วยการเพิ่มจำนวนกลุ่มฟีนอลิกไฮดรอกซิล การขนานที่ไม่สมบูรณ์ของกิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH และซูเปอร์ออกไซด์ของอนุมูล DPPH เชื่อกันว่าเป็นเพราะลักษณะที่แตกต่างกันระหว่างสปีชีส์หัวรุนแรงกับปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับระบบปฏิกิริยาทั้งสองนี้ 21,26) สำหรับอนุมูล DPPH นั้นเป็นอนุมูลที่เหนี่ยวนำทางเคมีซึ่งทำปฏิกิริยา ด้วยสารกำจัดอนุมูลอิสระในสารเคมีอย่างง่าย ในขณะที่ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนเรดิคัลถูกสร้างขึ้นโดยแซนธิน/XOD ซึ่งเป็นปฏิกิริยาของเอนไซม์

ถ้า phenylethanoids ยับยั้ง xanthine/XOD gen erated superoxide anion radical การยับยั้งอาจถือได้ว่าเป็นผลจากกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ superoxide anion หรือ (และ) การยับยั้งเอนไซม์ XOD,23) ดังนั้นเราจึงทำการทดสอบ ผลการยับยั้งแซนทีนออกซิเดส เป็นที่น่าสนใจว่า เมื่อคัดเลือกเฉพาะไอโซแอคทีโอไซด์ (8) และทูบูโลไซด์บี (7) ซึ่งมีคาเฟอีนมอยอิตีอยู่ที่ตำแหน่ง 6/- ของกลูโคส แสดงให้เห็นถึงการยับยั้ง พวกเขาแสดงผลที่ความเข้มข้น 25–200jtiM ต่อ 3.4xlO^3U/ml (10jug/ml) ของ XOD แม้ว่ากิจกรรมจะอ่อนแอกว่า allopurinol; สารประกอบอื่นๆ ซึ่งคาเฟอีนมอยอิตีอยู่ที่ตำแหน่ง《 ของกลูโคส ไม่แสดงผลการยับยั้ง ผลลัพธ์นี้เป็นรายงานฉบับแรกเกี่ยวกับผลการยับยั้งฟีนิลทานอยด์ต่อเอ็นไซม์ XOD Chan et al21) รายงานว่ากรด caffeic และสารคล้ายคลึงบางตัวมีผลยับยั้งต่อกิจกรรม XOD อย่างไรก็ตาม เราไม่พบผลกระทบของกรด caffeic ภายใต้สภาวะปฏิกิริยาปัจจุบัน ในการทดสอบนี้ ความเข้มข้นของ XOD นั้นใกล้เคียงกับในการทดสอบผลกระทบของการสร้างซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน เรดิคัล (4.3 /zg/ml) แต่ความเข้มข้นของสารประกอบนั้นสูงกว่าในครั้งหลังมาก ดังนั้นการยับยั้งการสร้าง Oj โดย phenylethanoids เหล่านี้จึงเกิดจากกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระ แต่ไม่ใช่การยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ XOD

ในที่สุดปฏิกิริยาลูกโซ่ของอนุมูลอิสระก็นำไปสู่ไขมันเปอร์ออกซิเดชันเป็นที่รู้จักกันดี28,29) ดังนั้นเราจึงศึกษาสารประกอบฟีนิลทานอยด์สำหรับผลกระทบต่อลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในไมโครโซมของตับหนูที่เกิดจากระบบเอนไซม์ ADP/NADPH/Fe3 plus และที่เหนี่ยวนำโดย ระบบที่ไม่ใช่เอนไซม์ ascorbic acid/Fe2 plus สารประกอบทั้งหมดเหล่านี้มีฤทธิ์ต้านไขมันเปอร์ออกซิเดชันที่แรงกว่ากรด caffeic และ a-tocopherol ในทั้งสองระบบ เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าทั้งสองระบบถูกเร่งปฏิกิริยาด้วยไอออนของเหล็ก ทั้ง Fe2 plus หรือ Fe3 plus ที่เกี่ยวข้องกับอนุมูล lipid peroxyl 30,31) และ OH อนุมูลไฮดรอกซิลมีบทบาทสำคัญในการเกิด lipid peroxidation32 _34) แม้ว่าการเริ่มต้นของ OH จะถูกตั้งคำถามในรายงานบางฉบับ 35祁6) ในทางกลับกัน OJ ของ superoxide anion radical OJ ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์หลักของการโจมตี e_ ต่อ O2 ในสายสัญญาณรุนแรงนั้นค่อนข้างแย่ ปฏิกิริยารุนแรงและไม่ส่งผลให้เกิดลิพิดเปอร์ออกซิเดชันนั่นเอง แม้ว่า phenylethanoids เหล่านี้จะมีฤทธิ์ในการขจัดอนุมูล superoxide anion ที่อ่อนแอกว่ากรด caffeic แต่ก็มีฤทธิ์ในการต่อต้านไขมัน peroxidation ได้ดีกว่าอย่างหลัง ดังนั้นเราจึงเชื่อว่าพอลิฟีนอลทำลายลูกโซ่ที่มีกลิ่นหอมอื่นๆ บางชนิด อาจยับยั้งลิพิดเปอร์ออกซิเดชันข้างต้นในไมโครโซมของตับของหนูได้โดยการคีเลตไอออน Fe2 plus หรือ Fe3 บวก และโดยการขับอนุมูลซูเปอร์ออกไซด์ Oj เพื่อทำลายปฏิกิริยาลูกโซ่อย่างรุนแรง .37,38) ยิ่งไปกว่านั้น พวกมันยังอาจไล่สายพันธุ์อนุมูลที่เป็นพิษ เช่น ไฮดรอกซิล เรดิคัล และลิพิด เปอร์ออกซิล แรดิคัล เพื่อขัดขวางลิพิด เปอร์ออกซิเดชันโดยตรงที่ศักยภาพที่สูงกว่ากรดคาเฟอีนิก 38,39)

หลี่และคณะ ศึกษาฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์บางชนิดรวมถึงแอกทิโอไซด์ (verbascoside) (5) ไอโซแอคทีโอไซด์ (ไอโซเวอร์บาสโคไซด์) (1) และเอไคนาโคไซด์ (4) จาก Pedicularis สำหรับการยับยั้ง autoxidation ของกรดลิโนเลอิกในไมเซลล์ ซึ่งเป็นระบบที่ไม่ใช่ชีวภาพ13) สำหรับการป้องกันการแตกของเม็ดเลือดแดงออกซิเดชันในหลอดทดลอง 14''1 และสำหรับผลการขจัดของพวกมันต่อ NBT/PMS/NADH ทำให้เกิดซูเปอร์ออกไซด์และการยับยั้งของลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่เกิดจากกรดแอสคอร์บิก/Fe2 บวกในไมโครโซมของตับของหนูเมาส์15) กิจกรรมที่คล้ายคลึงกัน - โครงสร้างความสัมพันธ์ถูกสังเกตในรายงานของ Li et al และผลลัพธ์ของเรา นั่นคือกิจกรรมของฟีนิลทานอยด์ในการยับยั้งลิพิดเปอร์ออกซิเดชันขึ้นอยู่กับจำนวนและตำแหน่งสเตอริกของกลุ่มฟีนอลไฮดรอกซิลเป็นหลัก15) บนพื้นฐานของเคมีสเตอริโอ กลุ่มฟีนอลไฮดรอกซิลของคาเฟอีนมอยอิตีบนแอกทิโอไซด์ (5), ทูบูโลไซด์ A ( 3) และเอไคนาโคไซด์ (4) ซึ่งมีคาเฟอีนอยู่ที่ตำแหน่ง 4z ของกลูโคส จะสร้างพันธะไฮโดรเจนกับกลุ่มไฮดรอกซิลของแรมโนซิลได้ง่ายกว่าในกลุ่มไอโซแอคทีโอไซด์ (8) และทูบูโลไซด์บี (7) ซึ่ง มีคาเฟอีนอยู่ที่ตำแหน่ง 6'- ของกลูโคส ดังนั้นกลุ่มหลังสงวนกลุ่มฟีนอลิกไฮดรอกซิลอิสระมากกว่ากลุ่มเดิมและก่อนหน้านั้นมีฤทธิ์ต้านลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่แข็งแกร่งกว่า นอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นว่า 2z-acetylation ของ phenylethanoids เหล่านี้แม้ว่าจะเพิ่มผลต้านอนุมูลอิสระเล็กน้อยก็ตาม ตัวอย่างเช่น แอกทิโอไซด์ (5) และไอโซแอคทีโอไซด์ (8) เมื่อ 2'- อะซิติเลตเป็น 2/-อะซิติแลคติโอไซด์ (1) และทูบูโลไซด์บี (7) ตามลำดับ แสดงกิจกรรมที่แรงกว่าในระบบการทดสอบทั้งสี่ระบบ เนื่องจากความเหนือกว่าของสเตอริโอเคมีและ 2'-acetylation ทูบูโลไซด์ B (7) จึงแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แรงที่สุดในบรรดาตัวอย่างที่ทดสอบ อาจเป็นเพราะแทนที่น้ำตาลมอยอิตีที่สามที่ตำแหน่ง 6'~ ความสัมพันธ์นี้ไม่พอดีในกรณีของทูบูโลไซด์ A (3) หรือเอไคนาโคไซด์ (4); อย่างไรก็ตาม ในระบบ ADP/NADPH/Fe3 plus ทูบูโลไซด์ A ⑶ ยังคงแสดงฤทธิ์ต้านลิพิดเปอร์ออกซิเดชันได้ดีกว่าอิชินาโคไซด์ (4)

นอกจากนี้ ลำดับของกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ DPPH แสดงให้เห็นความเท่าเทียมกับลำดับการต่อต้านลิพิดเปอร์ออกซิเดชันมากกว่าลำดับของกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน สิ่งนี้พิสูจน์ให้เห็นอีกครั้งว่าการทดสอบการขจัดอนุมูล DPPH เป็นวิธีที่สะดวกและเชื่อถือได้สำหรับการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระ26) แม้ว่า DPPH เรดิคัลจะเป็นเรดิคัลที่เหนี่ยวนำทางเคมี ในขณะที่ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนเรดิคัลอาจเป็นอนุมูลอิสระภายในร่างกาย

สรุปได้ว่า phenylethanoids ทั้งเก้าแสดงฤทธิ์การขับอนุมูลอิสระอย่างมีนัยสำคัญและฤทธิ์ต้านไขมันเปอร์ออกซิเดชันในการศึกษานี้ ฤทธิ์ต้านการเกิดออกซิเดชันเกิดขึ้นได้จากการเพิ่มจำนวนกลุ่มฟีนอลิกไฮดรอกซิลในโมเลกุล อย่างที่คิดได้ ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ phenyletha noids ที่พิสูจน์แล้วในที่นี้อาจมีบทบาทสำคัญในการกระทำของยา Cistanchis Herba และอาจอธิบายกลไกการทำงานของฟีนิลเอธานอยด์บางชนิดต่อเนื้องอก 8* การอักเสบ10) และโรคไตอักเสบ 1 n ซึ่งอนุมูลอิสระมีส่วนร่วมอย่างจริงจัง.

Cistanche Echinacoside: ต่อต้านอนุมูลอิสระ

ข้อมูลอ้างอิง

1) Namba T., "The Encyclopedia of Wakan-Yaku (Traditional Sino-Japanese Medicines) with Color Pictures,5, Vol. II, Hoikusha, Tokyo, 1994, pp. 16-17.

2) ก) Kobayashi H,, Karasawa H. , Miyase T. , Fukushima S. , Chem. แพม. BullL, 32, 3009—3014 (1984); ข) Idem, อ้างแล้ว, 32, 3880—3885 (1984); ค) Idem, ibid., 33, 1452—1457 (1985); d) Karasawa H. , Kobayashi H. , Takizawa N. , Miyase T. , Fukushima S. , Yakugaku Zasshi, 106, 562–566 (1986); จ) Idem, อ้างแล้ว, 106, 721-724 (1986); /) Kobayashi H. , Oguchi H. , Takizawa N. , Miyase T. , Ueno A. , Usmanghani K. , Ahmad M. , Chem. เภสัช. กระทิง., 35, 3309一3314 (1987); g) Yoshizawa F. , Deyama T. , Takizawa N. , Usmanghani K. , Ahmad M. , ibid., 38, 1927–1930 (1990)

3) ก) Kobayashi H, Komatsu J., Yakugaku Zasshi, 103, 508一511 (1983); b): Kobayashi H. , Karasawa H. , Miyase T. , Fukushima S. , Chem. เภสัช. กระทิง., 32, 1729-1734 (1984); ค) Idem, อ้างแล้ว, 33, 3645–3650 (1985)

4) Naran R. , Ebringerova A. , Hromadkova Z. , Patoprsty V. , Phytochemistry, 40, 709—715 (1995)

5) Sato T. , Kozima S. , Kobayashi K. , Kobayashi H. , Yakugaku Zasshi 105, 1131-1144 (1985)

6) Jin XL, Zhang QR, China J. Chinese Materia Medica, 19, 695-697 (1994).

7) Yamahara J. , Kitani T. , Kobayashi H. , Kawahara Y. , Yakugaku Zasshi, 110, 932—935 (1990).

8) ก) Pettit G. R・,Numata A. , Takemura T. , Ode RH, Narula A, S. , Schmidt JM, Cragg GM, Pase CP, J. Nat. ผลผลิต, 53, 456— 58 (1990)); b) Saracoglu I. , Inoue M. , Calis I. , Ogihara Y. , Biol Pharm, Bull., 18, 1396-1400 (1995).

9) Andary C., '4Caffeic Acid Glycoside Esters และเภสัชวิทยา/ ed. โดย Scalbert A., Polyphenolic Phenomena, INRA Editions, Paris, 1993, หน้า 237—245

10) Murai M. , Tamayama Y. , Nishibe S. , Planta Med.. 61, 479― 80 (1995)

11) Hayashi K. , Nagamatsu T. , Ito M. , Hattori T. , Suzuki Y. , Jpn. เจ. ฟาร์มาคอล., 66, 47一52 (1994).

12) a) Molnar J. , Gunics G. , Mucsi I. , Koltai M. , Petri L, Shoyama Y. , Matsumoto M. , Nishioka L, Acta Microbiol ฮัง.. 36, 425– 32 (1989); b) Sasaki H. , Nishimura T. , Morota T. , Chin M. , Mitsuhashi H" Komatsu Y. , Maruyama H. ​​, Tu GR, He W. , Xiong YL, Planta Med., 55, 4582462 (1989)

13) Li J. , Wang PF, Zheng RL, Liu ZM, Jia 乙 J. , Planta Med., 59, 315—317 (1993)

14) Zheng RL, Wang PF, Li J. , Liu Z. M ,, Jia ZJ, เคมี สรีรวิทยา ไขมัน. 65, 151—154 (1993).

15) Li J. , Zheng RL, Liu 乙 M. , Jia 乙 J. , Acta Pharmacol ซินิกา, 13, 427T30 (1992).

16) Barber DA, Harris SR, ร้านขายยาอเมริกัน 34, 26一35 (1993).

17) Elstner EF, Klin Wochenschr, 69, 949-956 (1991).

18) Martin GR, Danner DB, Holbrook NJ, แอน รายได้ Med., 44, 419—29 (1993).

19) Kiso Y. , Tohkino H. , Hattori M. , Sakamoto T. , Namba T. , Planta Med.. 50, 298—302 (1984)

20) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol เคมี.. 193, 265—275 (1951)

21) Hatano T., Edamatsu R., Hiramatsu M., Mori A., Fujita Y., Yasuhara T" Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 37, 2016一2021 (1989).

22) Imanari T. , Hirota M. , Miyazaki M. , Igaku No Ayumi, 101, 496-497 (1977)

23) Hatano T., Yasuhara T, Yoshihara R., Agata L, Noro T., Okuda T., เคมี เภสัช. บูล., 38, 1224–1229 (1990).

24) Ohkawa H. , Ohishi N. , Yagi K. , Anal. ไบโอเคมี., 95, 351一358 (1979).

25) ก) Lahloub M, F. , Zaghloul AM, El-Khayat SA, Afifi MS, Sticher O. , Planta Med.. 57, 481— 85 (1991); b) Nishimura H. , Sasaki H. , Inagaki N. , Chin M. (Zhen 乙 X. ), Mitsuhashi H. , ไฟโตเคมี 30, 965-969 (1991); c) Budzianowski J., Skrzypczak L., อ้างแล้ว,, 38, 997—1001 (1995),

26) Marsden SB, Nature (ลอนดอน), 181, 1199—1200 (1958)

27) Chan WS, Wen PC, Chiang HC, Anticancer Res., 15, 703一 708, (1995).

28) Janero DR, Burghardt B., Biochem, Pharmacol.. 37, 3335一3342 (1988).

29) Buettner GR, อาร์ค ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์., 300, 535一543 (1993).

30) Herbert V. , Shaw S. , Jayatilleke E. , Stopler-Kasdan T. , Stem Cells, 12, 289—303 (1994)

31) Aust SD, Miller DM, Samokyszyn VM,วิธีการ Enzymol., 186, 457-463 (1990).

32) Kubota S. , Ikegami Y. , Kurokawa T. , Sasaki R. , Sugioka K. , Nakano M. , Biochem. ชีวฟิสิกส์ Res, คอมมูนิตี้, 108, 1025一1031 (1982).

33) Yagi K. , Ishida N. , Komura S. , Ohishi N. , Kusai M. , Kohno M. , Biochem ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด คอมมูนิตี้, 183, 945一951 (1992).

34) Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ, เซลล์ 75, 241-251 (1993).

35) Bucher JR, Tien M. , Aust AD, Biochem ชีวฟิสิกส์ Res, Commun., Ill, 777—784 (1983).

36) Yoshida T. , Otake H. , Aramaki Y. , Hara T. , Tsuchiya S. , Hamada A. , Utsumi H. , Biol. เภสัช. กระทิง.. 19, 779-782 (1996).

37) Afanas5 EVIB, Dorozhko A. L, Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch L A., Biochem Pharmacol., 38, 1763–1769 (1989).

38) Robak J., Gryglewski RJ, Biochem. เภสัช.. 37, 837–841 (1988).

39) Chimi H., Morel I., Lescoat G., Pasdeloup N・,Cillard P., Cillard J., Toxicology in Vitro, 9, 695一702 (1995)