ศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต่อต้านวัยของสารสกัด Kalmia Angustifolia และการระบุสารประกอบสำคัญบางชนิด ตอนที่ 1

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:ริ้วรอยแห่งวัยของผิวเป็นองค์ประกอบที่มองเห็นได้ชัดเจนที่สุดของกระบวนการชราภาพ ทำให้เกิดความกังวลอย่างมากสำหรับคนจำนวนมาก พืชจากตระกูล Ericaceae โดยทั่วไปมีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ ทำให้เป็นสารออกฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอยที่มีศักยภาพ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินความปลอดภัยและประสิทธิภาพในการต่อต้านริ้วรอยของสารสกัด Kalmia angustifolia โดยใช้สารทดแทนผิวหนังที่สร้างขึ้นใหม่ การประเมินความปลอดภัยดำเนินการโดยใช้การทดสอบ 3-(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ในขณะที่ประสิทธิภาพเป็น กำหนดโดยการประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการอักเสบ และวิเคราะห์สารทดแทนผิวหนังที่สร้างขึ้นใหม่ตามวิธีการประกอบตัวเองโดยการตรวจเนื้อเยื่อวิทยาและการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (อีลาสติน คอลลาเจน-1 คอลลาเจน-3 อควาพอริน-3) . การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์สร้างความปลอดภัยของสารสกัดที่ความเข้มข้นสูงถึง 200 ug/mL การทดสอบ Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) และการทดสอบตามเซลล์โดยใช้ 2',7'-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) เปิดเผยฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งด้วยค่า ORAC เท่ากับ 16 ไมโครโมล Trolox Equivalent/mg และ half- ความเข้มข้นสูงสุดในการยับยั้ง (IC50) ที่ 0.37±0.02 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ในขณะที่พบฤทธิ์ต้านการอักเสบที่น่าสนใจในการยับยั้งการผลิต NO โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการผลิต NO ที่ 49±2 เปอร์เซ็นต์ที่ 80 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร การแยกตัวและการกำหนดคุณลักษณะของสารสกัดทำให้สามารถระบุสารประกอบที่อาจรับผิดชอบต่อกิจกรรมทางชีวภาพเหล่านี้ โดยสองตัวในนั้นถูกระบุเป็นครั้งแรกใน K.cistanche ก้านAngustifolia: avicularia และ epicatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatechin. การวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาของสารทดแทนผิวหนังที่รักษาด้วยสารสกัดพบว่าความหนาของผิวหนังเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม สารสกัด K. Angustifolia ช่วยเพิ่มการแสดงออกของอีลาสตินและคอลลาเจน-1 ซึ่งมักจะลดลงตามอายุของผิว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า K. Angustifolia มีประสิทธิภาพในการต้านอนุมูลอิสระและศักยภาพในการต่อต้านริ้วรอย

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

คีย์เวิร์ด: สารทดแทนผิว; ริ้วรอยของผิว; ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ สารออกฤทธิ์; แกะลอเรล; ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ กิจกรรมต้านการอักเสบ วิศวกรรมเนื้อเยื่อ

1. บทนำ

ความชราของผิวเป็นกระบวนการทางสรีรวิทยาตามธรรมชาติที่หลายคนกังวล นับเป็นสัญญาณบ่งชี้แรกของอายุที่เพิ่มขึ้นและความเสื่อมของผิวหนัง ดังนั้น การกำหนดสูตรการต่อต้านริ้วรอย: ผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางได้รับความสำคัญในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาเนื่องจากความปรารถนาที่จะจำกัดลักษณะที่ปรากฏของริ้วรอยนี้ ความชราของผิวมีลักษณะดังนี้ การเปลี่ยนแปลงหลายอย่างในระดับชีวภาพ ซึ่งรวมถึงการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ลดลง ส่งผลให้ผิวหนังลีบ และส่วนประกอบทางผิวหนังลดลง เช่น ไฟโบรบลาสต์ อีลาสติน และเส้นใยคอลลาเจน ส่งผลให้ความหนาของผิวหนังในผู้สูงอายุลดลง [1,2] . ป่าทางเหนือเต็มไปด้วยทรัพยากรที่ยังไม่ได้สำรวจและมีศักยภาพในการพัฒนาสารออกฤทธิ์ในเครื่องสำอาง Kalmia angustifolia หรือที่รู้จักในชื่อ Sheep Laurel เป็นพืชชั้นสูงในตระกูล Ericaceaeประโยชน์ของ cistanche tubulosa และผลข้างเคียงพืชชนิดนี้มีถิ่นกำเนิดในอเมริกาเหนือตะวันออก แต่พบมากในป่าทางเหนือของแคนาดา [3] ในการแพทย์แผนโบราณของอเมริกา K. Angustifolia ถูกใช้เพื่อรักษาปัญหาสุขภาพต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบ เช่น ปวดท้อง เคล็ดขัดยอก และบวม บ่งบอกว่าพืชชนิดนี้มีคุณสมบัติต้านการอักเสบ [4] พืชหลายชนิดในตระกูล Ericaceae ยังมีคุณสมบัติต้านการอักเสบและต้านอนุมูลอิสระซึ่งทำให้เป็นส่วนผสมที่น่าสนใจของเครื่องสำอาง องค์ประกอบทางเคมีของ K.angustifolia ยังไม่มีการจัดทำเอกสารไว้เป็นอย่างดี งานวิจัยบางชิ้นระบุสารประกอบที่เป็นพิษ เช่น เกรย์อาโนทอกซิน ซึ่งเป็นสารพิษต่อระบบประสาทของมนุษย์เมื่อกลืนกิน แต่ไม่ค่อยเป็นอันตรายถึงชีวิต และอาร์บูติน (4-ไฮดรอกซีฟีนิล -D-กลูโคพาราโนไซด์) ซึ่งเป็นสารยับยั้งไทโรซิเนสที่พบในใบของ K. Angustifolia และใช้เป็นสารลดรอยคล้ำ [5-8] แม้จะพบสารประกอบที่อาจเป็นพิษเหล่านี้ใน K. Angustifolia แต่งานวิจัยอื่นๆ ยังระบุด้วยว่าพบสารฟลาโวนอยด์ กรดฟีนอลิก แทนนิน และเทอร์พีนอย่างมากมายในพืช [9-15] สารประกอบเหล่านี้บางชนิดมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่น่าสนใจ ดังนั้นจึงสามารถให้ฤทธิ์ต้านริ้วรอยแก่ K. Angustifolia เช่นเดียวกับพืชชนิดอื่นๆ

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

แม้ว่าจะมีความจำเป็นในการพัฒนาผลิตภัณฑ์เดอร์โม-คอสเมติกชนิดใหม่ที่ช่วยป้องกันการเสื่อมสภาพของผิว กฎหมายฉบับใหม่ห้ามหรือจำกัดการทดสอบกับสัตว์ในอุตสาหกรรมเครื่องสำอางทำให้ยากต่อการดำเนินการดังกล่าว ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีทางเลือกอื่นในการทดสอบประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์ การใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์ในหลอดทดลองหรือสารทดแทนผิวหนังเป็นทางเลือกที่ดีสำหรับการตรวจคัดกรองส่วนผสมเครื่องสำอาง หลายรุ่นได้รับการอนุมัติจากศูนย์ตรวจสอบความถูกต้องของวิธีทางเลือกแห่งยุโรป (ECVAM, Ispra, Italy) และขายในเชิงพาณิชย์ให้กับบริษัทเครื่องสำอาง เพื่อให้ทำการทดสอบความปลอดภัยและหลีกเลี่ยงความทุกข์ทรมานที่ไม่จำเป็นจากการใช้สัตว์ [16,17] . อย่างไรก็ตาม โมเดลที่มีจำหน่ายในท้องตลาดส่วนใหญ่จะมีเพียงชั้นหนังกำพร้าที่แตกต่างกัน และไม่มีปฏิสัมพันธ์ระหว่าง keratinocytes และไฟโบรบลาสต์ [16] แบบจำลองความหนาเต็มใหม่ได้เกิดขึ้นในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาและอนุญาตให้มีการตรวจสอบเส้นทางการชราภาพและสารประกอบต่อต้านวัย ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับทดแทนการใช้สัตว์ในด้านเครื่องสำอาง [18,19]สารสกัดจากซิสแทนเช่ทูบูโลซ่าจุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้เป็นอันดับแรกเพื่อประเมินกิจกรรมทางชีววิทยาของสารสกัด K. Angustifolia บน monolayers ของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง จากนั้นจึงประเมินศักยภาพในการต่อต้านริ้วรอยของสารสกัดนี้โดยใช้สารทดแทนผิวหนังที่สร้างขึ้นใหม่ตามวิธีการประกอบตัวเอง [20,21] . จุดแข็งของแบบจำลองทดแทนผิวหนังนี้คือปราศจากวัสดุภายนอกและอาศัยความสามารถของกรดแอสคอร์บิกในการส่งเสริมการผลิตเมทริกซ์นอกเซลล์โดยไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนัง ทำให้แบบจำลองนี้เป็นมนุษย์ทั้งหมดcistanche tubulosa บทวิจารณ์การศึกษานี้นำเสนอส่วนผสมออกฤทธิ์ใหม่ที่สามารถนำมาใช้ในผลิตภัณฑ์เดอร์โม-คอสเมติก และแนะนำการใช้แบบจำลองในหลอดทดลองเพื่อเป็นทางเลือกในการวิจัย coSmetic

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การเตรียมวัสดุและสารสกัดจากพืช

K.angustifolia เก็บเกี่ยวเมื่อวันที่ 2 พฤษภาคม015 ในเขต Lac-St-Jean ของ Quebec ประเทศแคนาดา พืชถูกระบุโดย M. Patrick Nadeau และตัวอย่างใบสำคัญ (หมายเลข QFA0617265) ถูกนำไปฝากไว้ที่หอสมุนไพร Louis Marie ของมหาวิทยาลัย Laval เมือง Ouébec ประเทศแคนาดา ส่วนทางอากาศของ K.angustifolia (2.1 กก.) ถูกบดโดยใช้เครื่องตัด Fritsch Pulverisette 25 (Fritsch, Laval, QC, Canada) และสกัดภายใต้การไหลย้อนด้วยเอธานอลปราศจากน้ำ (1.5L, สามครั้ง) และ EtOH-H2O3:1( 1.5 ลิตรสองครั้ง) สารสกัดที่ได้รับหลังจากการสกัดครั้งแรก (ใน EtOH และ EtOH-H, O) ถูกกรองและรวมเข้าด้วยกัน หลังจากการระเหยของ EtOH ในสุญญากาศ วัฏภาคที่เป็นน้ำถูกแบ่งส่วนด้วยไดคลอโรมีเทน (DCM, CHCl; 300 มล. ห้าครั้ง) และเอทิล อะซีเตต(EtOAc; 300 มล. ห้าครั้ง) เฟส EtOAc ถูกระเหยภายใต้แรงดันที่ลดลงจนแห้งเพื่อให้ได้สารสกัด K.angustifolia (222.6 ก., 10.6 เปอร์เซ็นต์) วันก่อนการรักษา สารสกัดในรูปแบบผงถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Canada) เพื่อให้ได้สารละลายสต็อคและเก็บไว้ที่ -20 องศาจนกว่าจะจำเป็น ความเข้มข้นที่ต้องการของ K.angustifolia ได้มาจากการเจือจางสารละลายสต็อก (12.5 หรือ 25 มก./มล.) โดยตรงในอาหารเลี้ยงเชื้อในวันที่ทำการทดลอง ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO คือ 0.2 เปอร์เซ็นต์ (ofo) เพื่อหลีกเลี่ยงความเป็นพิษของตัวทำละลาย

2.2.การแยกสารประกอบหลักของสารสกัด K. Angustifolia

ของสารสกัด EtOAc ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 30 กรัมถูกแยกออกโดยโครมาโตกราฟีเหนือไดไอออนคอลัมน์ (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA) โดยใช้ MeOH/H2O เป็นสารชะในสภาวะเกรเดียนต์ (40 เปอร์เซ็นต์ , 50 เปอร์เซ็นต์ , 60 เปอร์เซ็นต์ , 70 เปอร์เซ็นต์ , และ 100 เปอร์เซ็นต์ ) เพื่อให้เศษส่วนเสริมสมรรถนะสี่ส่วน (AD) เศษส่วน B (2 กรัม) ถูกนำไปยังคอลัมน์ซิลิกาเจล (200 กรัม)และชะด้วยสภาวะเกรเดียนท์ของ MeOH-DCM จาก 5 เปอร์เซ็นต์ เป็น 15 เปอร์เซ็นต์ เพื่อให้เศษส่วนสี่ส่วน (B1-B4) เศษส่วน C(6 กรัม) ยังอยู่ภายใต้คอลัมน์ซิลิกาเจล (300 กรัม) และชะด้วยสภาวะเกรเดียนต์ของ MeOH-DCM จาก 5 เปอร์เซ็นต์ เป็น 25 เปอร์เซ็นต์ เพื่อให้เศษส่วนเจ็ดส่วน(C1-C7) เศษส่วน C3(500 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโตกราฟีแบบรีเวอร์สเฟสบนคอลัมน์ C18 (120 ก., FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, ซิลิไซเคิล, ควิเบก, QC, แคนาดา) โดยใช้กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ใน H, O-MeOH จาก ร้อยละ 40 ถึง 60 เปอร์เซ็นต์ ได้เศษย่อยสี่ส่วน: C3A-C3D กับ C3B และ C3C ที่มีความบริสุทธิ์สูง ซึ่งประกอบด้วยสารประกอบหลัก เศษส่วน C4(2g) ยังถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโตกราฟีแบบรีเวอร์สเฟสบนคอลัมน์ C18 โดยใช้กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ใน H2O-MeOH จาก 30 เปอร์เซ็นต์ ถึง 45 เปอร์เซ็นต์ ได้เศษย่อยสามส่วนมาจากการแยก: C4A-C4C โดยมี C4A และ C4C ที่มีความบริสุทธิ์สูง ซึ่งแต่ละสารประกอบเป็นสารประกอบเดี่ยว เศษส่วน D(8.7 ก.) ตกอยู่ภายใต้คอลัมน์ซิลิกาเจล (2×200 ก.) และชะด้วยสภาวะเกรเดียนต์ของ CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) เพื่อให้ได้เศษส่วนแปดส่วน (D 1-D8). เศษส่วน D1 ถึง D4 แต่ละส่วนแสดงสารประกอบหลัก

2.3. การวิเคราะห์ NMR และ GC-MS

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) ถูกบันทึกด้วย Bruker Avance 400 spectrometer (Bruker, Milton, ON, Canada) ที่ 400 MHz สำหรับนิวเคลียส H และ 100 MHz สำหรับนิวเคลียส 13C โดยใช้ดิวเทอเรตคลอโรฟอร์ม (CDCl3) หรือเมทานอลดิวเทอเรต (CH3OD) เป็นตัวทำละลาย การเปลี่ยนแปลงทางเคมีถูกรายงานเป็น ppm ที่สัมพันธ์กับยอดตกค้างของตัวทำละลาย High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) ได้รับการบันทึกบนแมสสเปกโตรมิเตอร์ Agilent 6224 MS-TOF (Agilent, Saint-Laurent, QC, Canada) ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดสเปรย์ไฟฟ้า

2.4.การตรวจชิ้นเนื้อและการสกัดเซลล์

keratinocytes ปฐมภูมิและไฟโบรบลาสต์ได้มาจากการตัดชิ้นเนื้อของการผ่าตัดลดขนาดเต้านม ผู้บริจาคเป็นผู้หญิงคอเคเซียนอายุระหว่าง 18 ถึง 52 ปี Keratinocytes และไฟโบรบลาสต์ถูกสกัดจากชิ้นเนื้อโดยใช้วิธีการแยกที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [22,23] การตรวจชิ้นเนื้อถูกฟักในเทอร์โมไลซินที่ 4 องศาเป็นเวลา 16 ชั่วโมงเพื่อแยกหนังกำพร้าออกจากผิวหนังชั้นหนังแท้ ต่อจากนั้น keratinocytes ถูกแยกออกจากหนังกำพร้าโดยใช้ทริปซินเป็นเวลา 30 นาที ในขณะที่ไฟโบรบลาสต์ถูกแยกออกจากผิวหนังชั้นหนังแท้โดยใช้คอลลาเจนเนสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ถูกเพาะเลี้ยงตามเส้นทางที่ต้องการ Keratinocytes ถูกใช้ที่ข้อ 1 และไฟโบรบลาสต์ที่ข้อ 4

2.5. การเพาะเลี้ยงเซลล์

ไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิ (ระยะ 4) ถูกเพาะที่ 4× 103 เซลล์/ซม²และเพาะเลี้ยงในสื่อ Modified Eagle (DMEM) ของ Dulbecco เสริมด้วย FB Essence 10 เปอร์เซ็นต์ (FBI; Seradigm, Salt Lake City , UT, USA), 100 UI/ml penicillin G(Sigma, Oakville, ON, Canada) และ gentamicin 25ug/ml （Gemini, West Sacramento, CA, USA） เคอร์ติโนไซต์ปฐมภูมิ (ส่วนที่ 1) เพาะที่ 4×103 เซลล์/ซม² บนชั้นป้อนของไฟโบรบลาสต์ของหนู 3T3 ที่ฉายรังสีและเพาะเลี้ยงในการผสมผสานของ DMEM กับ F12 ของแฮมในสัดส่วน 3: 1 (DMEMH) เสริมด้วยโคลนของทารกในครรภ์ 5 เปอร์เซ็นต์ Ⅱ เซรั่ม (Hyclone, Scarborough, ON, แคนาดา), อินซูลิน 5 ug/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA), ไฮโดรคอร์ติโซน 0.4 ug/mL (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, แคนาดา), 0.212 ug /mL isoproterenol hydrochloride(Sandoz Canada, Boucherville, QC, Canada), 10 ng/mL human epidermal growth factor (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA),100UI/mL penicillin G(Sigma, Oakville, ON, Canada) ) และ 25 ug/mL gentamicin(Gemini, West Sacramento, CA, USA) การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกบ่มที่ 37ซ ในบรรยากาศคาร์บอนไดออกไซด์ 8 เปอร์เซ็นต์(CO2) สื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกเปลี่ยนทุกสองวัน รวมเป็นสามครั้งต่อสัปดาห์

2.6. การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

ความเป็นพิษของสารสกัด K.angustifolia ถูกประเมินบน keratinocytes ปฐมภูมิโดยใช้ {{0}}(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,{{5} }การทดสอบไดฟีนิลเตตราโซเลียมโบรไมด์ (MTT) การทดสอบ MTT เป็นการทดสอบสีโดยใช้เอนไซม์ลดลงจากเกลือเตตตราโซเลียมสีเหลือง (MTT) เป็นผลึกฟอร์มาซานสีม่วง ปฏิกิริยาของเอนไซม์นี้ถูกเร่งโดย mitochondrial succinate dehydrogenase ในเซลล์ที่มีฤทธิ์ทางเมตาบอลิซึม ดังนั้นจึงใช้ในการประเมินความมีชีวิตของเซลล์โดยพิจารณาจากกิจกรรมการเผาผลาญของเซลล์ โดยสังเขป ในวันที่ 0 keratinocytes ที่ P3 จากผู้ให้ที่มีสุขภาพดีถูกชุบที่ 5×103 เซลล์/หลุมในจาน 96- หลุมบนชั้นตัวป้อนของ 3T3 ของมิวรีนไฟโบรบลาสต์ที่ถูกฉายรังสี ในวันที่ 2 การรักษาถูกเพิ่มเข้ามา ในวันที่ 4 สีย้อม MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) ถูกเติมลงในจานที่ความเข้มข้น 0.5 มก./มล. ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตปลอดเชื้อ (PBS)1X จากนั้น เพลตถูกบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง (37 องศา ,8 เปอร์เซ็นต์ CO,)และฟอร์มาซานถูกสกัดด้วยสารละลายสดของไอโซโพรพานอลและกรดไฮโดรคลอริก (HCl) อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA) 2.7. การทดสอบความสามารถในการดูดซับออกซิเจน (ORAC)

เพื่อประเมินคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด K.angustifolia การทดสอบ Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) ได้ดำเนินการตามที่ Ou et al. อธิบาย ดัดแปลงบางส่วน [24]. โดยสังเขป การทดสอบดำเนินการในเพลต384-หลุมบนเครื่องอ่านเพลต Fluoroskan Ascent FLTM(Labsystems, Milford, MA, USA) ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid; a vitamin E analog) ถูกเตรียมเพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐานตามลำดับ เพื่อเปรียบเทียบตัวอย่างทดสอบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวกนี้ ทำการทดลองที่อุณหภูมิ 37.5 องศาครึ่ง 7.4 โดยมีตัวอย่างเปล่าขนานกันcistanche สหราชอาณาจักรการเรืองแสงของฟลูออเรสเซนถูกบันทึกทุก 60 วินาทีด้วยฟลูออโรมิเตอร์หลังจากการเติม 2,2'-อะโซบิส(2-อะมิดิโน-โพรเพน) ไดไฮโดรคลอไรด์ การเรืองแสงถูกวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 485 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อย 538 นาโนเมตร ผลลัพธ์คำนวณโดยใช้ความแตกต่างระหว่างพื้นที่ภายใต้การสลายตัวของฟลูออเรสซีนจากส่วนว่างและเส้นโค้งของตัวอย่าง ผลลัพธ์สำหรับค่า ORAC แสดงเป็นไมโครโมลของเทียบเท่า Trolox （TE） ต่อมิลลิกรัม （μmol TE/mg) หรือไมโครโมลของ TE ต่อไมโครโมล (umol TE/mol)

2.8. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่ประเมินโดยใช้การทดสอบจากเซลล์

กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระได้รับการประเมินด้วยการทดสอบตามเซลล์โดยใช้ 2',7/-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) ตามที่อธิบายโดย Girard-Lalancette และคณะด้วยการดัดแปลงบางอย่าง [25] โดยสังเขป WS1 ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, USA) ถูกฟักเป็นเวลา 60 นาทีด้วย 100 ไมโครลิตร 5μM DCFH-DA ในสารละลายเกลือที่สมดุลของ Hanks (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . จากนั้น เพื่อประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 60 นาทีด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของสารสกัด K.angustifolia และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (เควอซิทินและโทรลอกซ์) สำหรับความเค้นออกซิเดชัน 100 ไมโครลิตรของ 400 ไมโครโมลาร์ tertbutyl hydroperoxide （t-BuOOH） ถูกเติมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 200 μM t-BuOOH ในบ่อ จากนั้นวัดการเรืองแสงทันทีและหลังจาก 90 นาทีโดยใช้เครื่องอ่านเพลต Fluoroskan Ascent FLTM อัตโนมัติ (Labsystems, Milford, MA, USA) การเรืองแสงได้รับการประเมินที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 485 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อย 538 นาโนเมตร ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของ DCFH

2.9. ฤทธิ์ต้านการอักเสบที่ประเมินโดยการวัดปริมาณไนไตรต์

กิจกรรมต้านการอักเสบได้รับการประเมินโดยการประเมินการยับยั้งการผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) โดยสารสกัด K.angustifolia ตามที่อธิบายโดย Legault et al [26]. โดยย่อ มาโครฟาจของหนู RAW 264.7(ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของสารสกัด K. Angustifolia และจากนั้นกระตุ้นด้วยไลโปโพลีแซคคาไรด์ 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร (LPS) กลุ่มควบคุมที่เป็นบวก Nw-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) ยังถูกใช้ที่ความเข้มข้นที่ต่างกันสองระดับ∶250 ไมโครโมลาร์ (67 ไมโครโมลาร์) และ 1 มิลลิโมลาร์ (270 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ส่วนลอยเหนือตะกอนที่ปราศจากเซลล์ถูกรวบรวม 24 ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้น LPS และความเข้มข้นของ NO ถูกประเมินผลทันทีโดยใช้ปฏิกิริยา Griess อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านเพลต Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) การมีอยู่ของไนไตรต์ถูกหาปริมาณโดยใช้ NaNO ซึ่งเป็นเส้นโค้งมาตรฐาน เซลล์ที่ถูกกระตุ้น (ที่เผยต่อสื่อเพียงอย่างเดียว) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบและเซลล์ที่ถูกกระตุ้นในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงบวก

2.10.การผลิตสารทดแทนผิวหนัง

สารทดแทนผิวที่แข็งแรงถูกผลิตขึ้นตามวิธีการประกอบตัวเอง ดัดแปลงบางส่วนโดยใช้6-แผ่นหลุม [20,21] โดยย่อ ไฟโบรบลาสต์ที่ P5 จากผู้ให้ที่มีสุขภาพดีถูกเพาะที่ 1.5×105 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 26 วันใน DMEM ที่เสริมด้วยโซเดียม L-ascorbate 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (บวก ) (Sigma, St. Louis, MO, USA) จนเกิดเป็นแผ่นพับ จากนั้น แผ่นไฟโบรบลาสต์สองแผ่นถูกแยกออกและซ้อนทับเพื่อสร้างสารที่เทียบเท่าทางผิวหนัง สารที่เทียบเท่ากันทางผิวหนังถูกบ่มที่ 37 องศาใน 8 เปอร์เซ็นต์ CO บรรยากาศเป็นเวลาสองวันเพื่อให้เกิดการหลอมรวมของแผ่นงานและทำให้เกิดชั้นผิวหนังใหม่ของสารทดแทนผิวหนัง หลังจากช่วงเวลานี้ keratinocytes ที่ P2 จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีถูกเพาะบนผิวหนังที่เทียบเท่ากันที่ 1 × 10 องศาเซลล์/เทียบเท่าเพื่อสร้างชั้นผิวหนังชั้นนอกของสารทดแทนผิวหนังและเพาะเลี้ยงเป็นเวลาเจ็ดวันใน DMEMH ที่เสริมด้วย 50 ug/mL ของ (บวก) -sodium L-ascorbate (Sigma, St. Louis, MO, USA) เพื่อให้ Keratinocyte เพิ่มจำนวนขึ้น จากนั้น สารทดแทนผิวหนังถูกยกขึ้นไปยังส่วนต่อประสานระหว่างอากาศและของเหลวเพื่อส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของเซลล์ ที่ส่วนต่อประสานระหว่างอากาศและของเหลว สารทดแทนผิวหนังถูกเพาะเลี้ยงด้วยสื่อที่ขาด EGF เพื่อให้ได้เยื่อบุผิวที่แบ่งชั้นของผิวหนังในร่างกาย สิบสี่วันหลังจากถูกยกขึ้นไปยังส่วนต่อประสานระหว่างอากาศและของเหลว สารทดแทนผิวหนังได้รับการรักษาสามครั้งต่อสัปดาห์เป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ด้วยสารละลายสต็อกของสารสกัดที่เจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อ (ด้วยความเข้มข้นสุดท้ายของสารสกัด K. Angustifolia 25 ไมโครกรัม/มล.) หลังจากการเพาะเลี้ยงทั้งหมด 56 วัน การตรวจชิ้นเนื้อทดแทนผิวหนังถูกนำและวิเคราะห์โดยจุลชีววิทยาและการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

2.11. การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อ

การตรวจชิ้นเนื้อทดแทนผิวหนังจากแต่ละสภาวะได้รับการแก้ไขในสารละลาย HistoChoice (Amresco, Solon, OH, USA) และฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน จากนั้นตัดส่วนที่หนา 5 ไมโครเมตรและย้อมด้วย Trichrome ของ Masson โดยใช้สีย้อม Hematoxylin ของ Weigert, fuchsin-ponceau และสีย้อมสีน้ำเงินของ aniline วัดความหนาของผิวหนังชั้นหนังแท้และผิวหนังชั้นนอกที่มีชีวิตด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH), Bethesda, MD, USA) สำหรับการวัดความหนา มีการวิเคราะห์ประชากรเซลล์ที่แตกต่างกันสามกลุ่ม และสำหรับแต่ละภาพนั้น ถ่ายภาพตัวแทนสองภาพต่อหนึ่งเงื่อนไข และดำเนินการวัด 10 ครั้งต่อภาพสำหรับการวัดทั้งหมด 60 รายการต่อเงื่อนไข

2.12. การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

การตรวจชิ้นเนื้อทดแทนผิวหนังจากแต่ละสภาวะถูกฝังในสารประกอบ OCT ของเนื้อเยื่อ-เต็ก (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และจากนั้นเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกว่าจะจำเป็น ส่วนที่แช่แข็งของผิวหนังมนุษย์ปกติถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนทางอ้อมถูกดำเนินการบนไครโอเซกชันที่มีความหนา 6 ไมโครเมตรที่ถูกตรึงในอะซิโตน แอนติบอดีหลักที่ใช้คือ:rabbit polyclonal anti-elastin (gG)(dilution 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA),rabbit polyclonal anti-collagen-1 (IgG)(dilution 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, แคนาดา),rabbit polyclonal anti-collagen-3 (IgG)(dilution 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Canada) และ rabbit polyclonal anti-aquaporin-3(IgG)(dilution) 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA) แอนติบอดีทุติยภูมิที่ใช้คือ IgG ต่อต้านกระต่ายลา (H บวก L)Alexa 488 (เจือจาง 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA) นิวเคลียสของเซลล์ถูกติดฉลากหลังแอนติบอดีทุติยภูมิด้วยสื่อสำหรับติดตั้ง DAPI Fluoromount-G(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) ในการหาค่าความเข้มของการเรืองแสงของโปรตีนแต่ละชนิดกึ่งเชิงปริมาณ ความเข้มพิกเซลของการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ถูกวัดโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ (NIH), Bethesda, MD, USA) โดยสังเขป วิเคราะห์ชั้นผิวหนังทั้งหมด (หนังแท้หรือหนังกำพร้าที่มีชีวิต) ของโปรตีนที่ศึกษาโดยการวัดค่าสีเทาเฉลี่ยของแต่ละพื้นที่ ความเข้มการเรืองแสงของสารทดแทนผิวหนังที่รับการรักษาถูกเปรียบเทียบกับความเข้มของการเรืองแสงของสารทดแทนผิวหนังกลุ่มควบคุม เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของโปรตีนที่สังเกตได้จากการรักษา

2.13. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การวิเคราะห์ทางสถิติของการทดสอบ MTI การทดสอบตามเซลล์ต้านอนุมูลอิสระ และกิจกรรมต้านการอักเสบได้ดำเนินการด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบเฉพาะกิจของ Dunnett (ค่า p<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

บทความนี้คัดมาจาก Antioxidants 2021, 10, 1373 https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants