ศักยภาพในการต้านเชื้อราของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อก่อโรคในตระกูลส้มและ Cistanche

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

ผลไม้ที่มีรสเปรี้ยวมีผลกระทบสำคัญต่อเศรษฐกิจของโลกเนื่องจากมีการผลิตมากที่สุดเมื่อเทียบกับผลไม้อื่นๆ ตัวอย่างเช่น การผลิตส้มทั่วโลกสำหรับปี 2018/19 คาดว่าจะสูงถึง 54.3 ล้านตัน ปัจจัยหลักที่ส่งผลต่อคุณภาพของส้มคือหลังการเก็บเกี่ยวโรคเชื้อราโดยเฉพาะอย่างยิ่งราสีเขียวที่เกิดจาก Penicillium digitatum ที่รับผิดชอบต่อการสูญเสียส้ม 90 เปอร์เซ็นต์ในช่วงหลังการเก็บเกี่ยว1,3 ในการควบคุมโรคหลังการเก็บเกี่ยว มีการใช้สารฆ่าเชื้อราสังเคราะห์อย่างแพร่หลาย ทำให้เกิดปัญหาด้านสุขภาพและสิ่งแวดล้อม นอกจากนี้ เชื้อราบางสายพันธุ์ได้พัฒนาความต้านทานต่อสารฆ่าเชื้อราที่ใช้กันทั่วไป เนื่องจากเชื้อราการดื้อยาเป็นปัญหาสำคัญ การค้นหาสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพใหม่มีบทบาทสำคัญในการเลี่ยงการใช้สารฆ่าเชื้อราอย่างกว้างขวาง7 จุลินทรีย์เป็นหนึ่งในแหล่งหลักของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีกิจกรรมทางชีวภาพที่เป็นประโยชน์ กล่าวคือ ศักยภาพยาต้านเชื้อรา, ยาปฏิชีวนะ, สารต้านมะเร็ง, สารลดแรงตึงผิว อย่างไรก็ตาม นอกเหนือจากศักยภาพทางพันธุกรรมและความหลากหลายของจุลินทรีย์แล้ว ยีนสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของจุลินทรีย์จำนวนมากไม่ได้ถูกกระตุ้นในสภาพการเพาะปลูกที่ผิดธรรมชาติที่ใช้ในห้องปฏิบัติการและมีสารเมแทบอไลต์เพียงไม่กี่ส่วนเท่านั้นที่สามารถเข้าถึงได้10 มีการใช้กลยุทธ์หลายอย่างเพื่อเอาชนะข้อจำกัดในการค้นพบผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากแหล่งจุลินทรีย์ เช่น แนวทาง OSMAC10,11 การใช้การดัดแปลงพันธุกรรม และการเพาะปลูกร่วม14 วัฒนธรรมร่วมที่เลียนแบบสภาพแวดล้อมทางธรรมชาติ ซึ่งแสดงถึงการแข่งขันของจุลินทรีย์สำหรับพื้นที่จำกัดและสารอาหาร ได้รับการเปิดเผยว่าเป็นพลังทางนิเวศวิทยาที่สำคัญที่สามารถกระตุ้นกลุ่มยีนเงียบและกลไกการป้องกันที่สามารถนำไปสู่การผลิตสารทุติยภูมิที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ การทดลองร่วมวัฒนธรรมเป็นอย่างสูง 1 Institute of Chemistry, University of Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazil 2 Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brazil. 3ภาควิชาเคมีชีวโมเลกุล สถาบันไลบนิซเพื่อการวิจัยผลิตภัณฑ์ธรรมชาติและชีววิทยาการติดเชื้อ – สถาบัน Hans Knöll เมืองเยนา ประเทศเยอรมนี 4Chair of Natural Product Chemistry, Friedrich Schiller University Jena, 07743, Jena ประเทศเยอรมนี เกี่ยวข้องกับการอนุญาตไม่เพียงแต่การระบุสารประกอบใหม่ แต่ยังรวมถึงการตรวจสอบเหตุการณ์ทางเคมีที่ควบคุมปฏิกิริยาระหว่างจุลินทรีย์ในธรรมชาติ จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีข้อมูลว่าเชื้อราก่อโรคในตระกูลส้มมีปฏิสัมพันธ์กับจุลินทรีย์ชนิดอื่นในสภาพแวดล้อมเดียวกันได้อย่างไร และกลไกการจู่โจมและป้องกันจุลินทรีย์จากพืชเอนโดไฟต์หรือสารก่อโรคจากพืชชนิดอื่นๆ มีอะไรบ้าง ข้อมูลนี้อาจนำไปสู่การค้นพบเมตาโบไลต์ทุติยภูมิใหม่ที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ของจุลินทรีย์ และให้ความรู้ที่ดีขึ้นเกี่ยวกับความสำคัญของนิเวศวิทยาของจุลินทรีย์ในระหว่างกระบวนการติดเชื้อ ที่นี่เราแสดงปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Penicillium digitatum และ Penicillium citrinum โดยมีเป้าหมายเพื่อค้นหาสิ่งใหม่เชื้อราสารที่สามารถใช้ควบคุมโรคหลังการเก็บเกี่ยวได้ เมื่อพิจารณาถึงจุดประสงค์นี้ กลยุทธ์การร่วมวัฒนธรรมและ MSI ถูกนำมาใช้เพื่อกระตุ้นการผลิตเมตาโบไลต์ทุติยภูมิและให้ข้อมูลเชิงลึกเบื้องต้นเกี่ยวกับบทบาททางชีวภาพของพวกมันตามการกระจายเชิงพื้นที่ในการโต้ตอบ เมแทบอไลต์ที่น่าสนใจถูกแยกออกมาและโครงสร้างทั้งหมดได้รับการอธิบายโดยอิงจากการทดลองแมสสเปกโตรเมทรีและ NMR ยัง,เชื้อราตรวจวิเคราะห์และวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพื่อตรวจสอบศักยภาพของสารเมแทบอไลต์ของเชื้อราในรูปแบบใหม่เชื้อราตัวแทน

สมุนไพร CISTANCHE

วัสดุและวิธีการ

วัฒนธรรมเชื้อราสายพันธุ์ Te P. digitatum (PD) ที่ใช้ในการศึกษาฝากไว้กับ Spanish Type Culture Collection (CECT) ภายใต้รหัสภาคยานุวัติ CECT20796 สายพันธุ์ P. citrinum (PC) จัดหาให้โดย Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brazil) P. digitatum และ P. citrinum ถูกปลูกบนวุ้นเดกซ์โทรสมันฝรั่งเชิงพาณิชย์ (PDA) (Acumedia) PDA ถูกนึ่งฆ่าเชื้อที่ 103 KPa (121 องศา ) เป็นเวลา 15 นาที เพลต PDA ถูกเก็บไว้ที่ 25 องศาเป็นเวลา 7 วันในความมืด สปอร์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการล้างพื้นผิววุ้นด้วยน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อและเจือจางจนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 106 หรือ 105 สปอร์ มล-1

สภาพการเจริญเติบโตร่วมกันของเชื้อรา สารละลายสปอร์ (106 สปอร์ mL-1) ถูกฉีดวัคซีนที่ด้านตรงข้ามกัน แผ่น Te ถูกบ่มในความมืดที่อุณหภูมิ 25 องศาเป็นเวลา 7 วัน

สำหรับการวิเคราะห์ของ MSI และกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลนั้น การเพาะเลี้ยงร่วมในหลอดทดลองนั้นถูกเตรียมโดยการวางสไลด์ไมโครสโคปที่ปลอดเชื้อในจานเพาะเชื้อ ตามด้วยการเท PDA22 ขนาด 11 มล. และทำการสร้างหัวเชื้อเหนือสไลด์ไมโครสโคป แผ่นเปลือกโลกถูกบ่มในความมืดที่อุณหภูมิ 25 องศาเป็นเวลา 72 ชั่วโมง สำหรับการเพาะเลี้ยงร่วมในร่างกาย ส้มสุก (Citrus sinensis) ถูกฆ่าเชื้อที่พื้นผิวและได้รับบาดเจ็บ23 ฉีด PDA ชิ้นเล็กๆ ที่มี P. citrinum ในบริเวณบาดแผล ส้มที่ติดเชื้อและกลุ่มควบคุมถูกเก็บไว้ในบีกเกอร์ขนาด 500 มล. ปลอดเชื้อ ในความมืดที่อุณหภูมิ 25 องศา หลังจากผ่านไป 10 วัน ผลไม้ได้รับบาดเจ็บบริเวณเส้นศูนย์สูตรตรงข้ามของ P. citrinum inoculum และติดเชื้อ P. digitatum 106 spore mL-1 solution ผลไม้ถูกเก็บไว้นานกว่า 5 วันในความมืดที่อุณหภูมิ 25 องศา

การวิเคราะห์ Mass Spectrometry Imaging (MSI) และการสร้างภาพ MS

หลังจากระยะฟักตัว สไลด์ไมโครสโคปจะถูกลบออกจากจานเพาะเชื้อและใส่ในเครื่องดูดความชื้นแบบสุญญากาศเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อการคายน้ำของวุ้นโดยสมบูรณ์ (Angolini et al., 2015) การวิเคราะห์ของ MSI ได้ดำเนินการโดยตรงบนกล้องจุลทรรศน์ที่มีการเพาะเลี้ยงร่วม ในโหมดบวก โดยใช้แหล่งกำเนิดไอออนไนซ์ไอออนแบบคายการดูดซับ (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) ควบคู่ไปกับ Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap แมสสเปกโตรมิเตอร์ ข้อมูล MSI ได้มาโดยมีกำลังการแยกมวลเท่ากับ 70.000 ที่ m/z 200 การกำหนดค่า DESI ที่ใช้เป็นชุดเดียวกันกับงานก่อนหน้า22 รูปภาพถูกสร้างขึ้นด้วยความกว้างถังขยะ Δm/z=± 0.07 โดยใช้ซอฟต์แวร์แปลงข้อมูล Firefly (เวอร์ชัน 2.1.05) และประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ BioMap (เวอร์ชัน 3.8.0.4) ที่พัฒนาโดย Novartis Institutes for BioMedical Research ใน BioMap การปรับสเกลสีถูกปรับเป็นค่าคงที่ระหว่างการประมวลผลแต่ละภาพ MS spectra ได้รับการประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์ Xcalibur (เวอร์ชัน 3.0.63) ที่พัฒนาโดย Thermo Fisher Scientific

การสกัดสารเมตาโบไลต์จากการทดลองวัฒนธรรมร่วม

เนื้อหาทั้งหมดของวัฒนธรรมร่วมในหลอดทดลองถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และโอนไปยังขวดรูปชมพู่ การสกัดถูกดำเนินการโดยใช้เมทานอล ขวดถูกโซนิเคตเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในอ่างอัลตราโซนิกและกรองสุญญากาศ ตัวทำละลายถูกกำจัดออกภายใต้แรงดันที่ลดลง และสารสกัดสุดท้ายถูกเก็บไว้ที่ -20 องศา

สำหรับการเพาะเลี้ยงร่วมในร่างกาย เปลือกส้มถูกตัด (2 ซม. × 2 ซม.) ในโซนเชื่อมต่อระหว่างจุลินทรีย์ และทำการสกัดด้วยเมทานอล 5 มล. เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในอ่างอัลตราโซนิก สารสกัดถูกกรอง ถูกทำให้แห้งภายใต้ N2 และเก็บไว้ที่ -20 องศา

การวิเคราะห์มวลสาร (MS)

สารสกัดถูกเจือจางในเมทานอลและวิเคราะห์ด้วย Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer วิเคราะห์ในโหมดบวกด้วยช่วง m/z 115–1500, แรงดันเส้นเลือดฝอย 3.4 kV, อุณหภูมิเส้นเลือดฝอยขาเข้า 280 องศา , เลนส์ S 100V. 5 ไมโครลิตรของตัวอย่างถูกฉีด เฟสอยู่กับที่: คอลัมน์วิทยาศาสตร์ Termo Accucore C18 2.6 µm (2.1 มม. × 100 มม.) เฟสเคลื่อนที่: กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ (A) และอะซิโตไนไทรล์ (B) โปรไฟล์ชะล้าง (A/B): 95/5 ถึง 2/98 ภายใน 15 นาที กดค้างไว้ 5 นาที สูงสุด 95/5 ภายใน 1.2 นาที และค้างไว้ 7.8 นาที เวลาทำงานทั้งหมดคือ 29 นาทีสำหรับการวิ่งแต่ละครั้งและอัตราการไหลคือ 0.2mLmin-1 ปริมาตรการฉีด: 5 µL.MS/MS ดำเนินการโดยการแยกตัวที่เกิดจากการชนกัน (CID) ที่มีช่วง m/z ที่ 100–800 และพลังงานการชนอยู่ระหว่าง 10 ถึง 50V ตัวอย่างถูกเติมโดยตรงโดยสเปรย์ฉีดไฟฟ้าที่มีอัตราการไหล 5.0 ไมโครลิตรต่ำสุด-1 ข้อมูล MS และ MS/MS ได้รับการประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์ Xcalibur (เวอร์ชัน 3.0.63) ที่พัฒนาโดย Thermo Fisher Scientific

ประโยชน์ของอาหารเสริม CISTANCHE: ปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

การแยกสารเมตาโบไลต์ (การวิเคราะห์ HPLC)

การแยกสารเมแทบอไลต์ทุติยภูมิทำได้โดยใช้คอลัมน์ Phenomenex Luna 5µm Phenyl-Hexyl (25{{10}}×4.6mm) และ SHIMADZU prominence HPLC LC-20AT พร้อมกับ CBM{{6} }โมดูลบัสสื่อสาร SPD-M20A เครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอด และ SIL-20เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ เฟสเคลื่อนที่: น้ำ (กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์) (A) และอะซิโตไนไทรล์ (B) โปรไฟล์ชะล้าง (A/B): 65/35 สูงสุด 50/50 ภายใน 50 นาที สูงสุด 40/60 ภายใน 20 นาที เวลาทำงานทั้งหมดคือ 70 นาทีและอัตราการไหล 1.0 มล. นาที-1 ปริมาตรของการฉีดคือ 5µL การทำให้บริสุทธิ์ด้วย HPLC แบบเตรียมการได้ดำเนินการบนคอลัมน์ Phenomenex Luna 5µm Phenyl-Hexyl (250×10 มม.) โดยใช้ Waters 1525 Binary HPLC Pump ที่ติดตั้ง Waters 2998 Photodiode Array Detector และ Waters Fraction Collector III โดยใช้เงื่อนไขการไล่ระดับที่เหมาะสมที่สุดเช่นเดียวกัน อัตราการไหลถูกกำหนดไว้ที่ 4.7mLmin-1 และปริมาตรการฉีดคือ 200 µL

สเปกโตรสโคปี NMR

การทดลอง 1H NMR, 13C NMR และ 2D ถูกดำเนินการบน Bruker Avance III 500 (1H 500.13MHz และ 13C 125.7MHz) และ Bruker Avance III 600 (1H 600.17MHz) คลอโรฟอร์มดิวเทอเรต (CDCl3; 7.23 ppm), ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; 2.50 ppm และ 39.51 ppm) และ tetramethylsilane (TMS; 0.0 ppm) ถูกใช้เป็นตัวทำละลายและการอ้างอิงภายใน การเปลี่ยนแปลงทางเคมี (δ) แสดงเป็น (ppm) และค่าคงที่การมีเพศสัมพันธ์ (J) ในหน่วยเฮิรตซ์ (Hz)

การวิเคราะห์เครือข่ายโมเลกุล

เครือข่ายระดับโมเลกุลสำหรับ P. citrinum metabolites ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เวิร์กโฟลว์ออนไลน์ที่ Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu) ข้อมูลถูกกรองโดยการลบพีค MS/MS ทั้งหมดภายในบวก /−17 Da ของสารตั้งต้น m/z สเปกตรัม MS/MS ถูกกรองหน้าต่างโดยเลือกเฉพาะจุดสูงสุด 6 อันดับแรกในหน้าต่าง plus /−50Da ตลอดสเปกตรัม ข้อมูลถูกจัดกลุ่มด้วย MS-Cluster ที่มีความทนทานต่อมวลหลักที่ 0.2 Da และความทนทานต่อเศษส่วนของ MS/MS ที่ 0.2Da เพื่อสร้างสเปกตรัมที่สอดคล้องกัน นอกจากนี้ สเปกตรัมฉันทามติที่มีสเปกตรัมน้อยกว่า 2 สเปกตรัมถูกละทิ้ง จากนั้นจึงสร้างเครือข่ายโดยกรองขอบเพื่อให้มีคะแนนโคไซน์สูงกว่า 0.65 และพีคที่ตรงกันมากกว่า 2 จุด ขอบเพิ่มเติมระหว่างสองโหนดจะถูกเก็บไว้ในเครือข่ายก็ต่อเมื่อแต่ละโหนดปรากฏในโหนดที่คล้ายกันมากที่สุด 10 อันดับแรกของกันและกัน จากนั้น สเปกตรัมในเครือข่ายจะถูกค้นหาโดยเทียบกับไลบรารีสเปกตรัมของ GNPS สเปกตรัมของห้องสมุดถูกกรองในลักษณะเดียวกับข้อมูลที่ป้อนเข้า การแข่งขันทั้งหมดที่เก็บไว้ระหว่างเน็ตเวิร์กสเปกตรัมและไลบรารีสเปกตรัมต้องมีคะแนนที่สูงกว่า 0.5 และอย่างน้อย 5 พีคที่ตรงกัน

การทดสอบเชื้อรา

สารละลายสต็อกของสารสกัดจากการเพาะเลี้ยงร่วมถูกเตรียมในเมทานอลและเจือจางเพิ่มเติมใน PDA จนถึงความเข้มข้น 0.5mgmL-1 สารละลายที่เป็นผลลัพธ์ 15 มล. ถูกเทลงในจานเพาะเชื้อที่ตามด้วยการฉีด 15ul ของสารละลาย P. digitatum 105 มล. 105 มล. ที่กึ่งกลางของเพลต การสอบวิเคราะห์กลุ่มควบคุมยังถูกดำเนินการอีกด้วย เพลตถูกบ่มในความมืดที่ 25 องศา เป็นเวลา 96 ชม. สำหรับเชื้อราการสอบวิเคราะห์ 2.5 มล. ของ PDA ถูกเสริมด้วย 6, 9 และ 10 (400µgmL-1 ) และแต่ละสารละลายถูกเทลงในไมโครเพลท 6-หลุม 5ul ของสารละลายสปอร์ 105 มล.-1 พี. ดิจิทาทัมถูกฉีดวัคซีนที่กึ่งกลางของเพลตวุ้นแต่ละจาน การควบคุมเชิงลบดำเนินการเป็นสามเท่า ไมโครเพลทถูกบ่มในความมืดที่ 25 องศาเป็นเวลา 96 ชั่วโมง สำหรับการกำหนดความเข้มข้นขั้นต่ำในการยับยั้ง (MIC) ของสารประกอบ 1 และ 4 การทดสอบการเจือจางด้วยน้ำซุปขนาดเล็กได้ดำเนินการตามที่แนะนำโดย Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 โดยมีการดัดแปลงเพียงเล็กน้อย สารละลายสต็อคของ 1 และ 4 ถูกเตรียมในน้ำ (เมทานอล 5 เปอร์เซ็นต์) และเจือจางเพิ่มเติมในตัวกลาง YES ในช่วงความเข้มข้นถึง 600 ไมโครกรัม มิลลิลิตร-1 ถึง 1 ไมโครกรัม มิลลิลิตร-1 195 ไมโครลิตรของสารละลายแต่ละชนิดถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลท 96-หลุมที่ตามด้วยการฉีดวัคซีน 5 ไมโครลิตรของสารละลายสปอร์ 105 มิลลิลิตร-1 พี. ดิจิทาทัม การทดสอบทำแบบซ้ำซ้อนและควบคุมเป็นสามเท่า อิทราโคนาโซล (100 ไมโครกรัมลิตร-1 ) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก การควบคุมเชิงลบดำเนินการด้วยเมทานอลใน YES ไมโครเพลทถูกบ่มในความมืดที่ 25 องศา เป็นเวลา 96 ชั่วโมง

กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล

หลังจากระยะฟักตัว สไลด์ไมโครสโคปจะถูกลบออกจากจานเพาะเชื้อ ตัวอย่างการเพาะเลี้ยงร่วม Te ในหลอดทดลอง ถูกย้อมด้วยคองโกเรด (0.25 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักในน้ำ) เป็นเวลา 20 นาทีและล้างในน้ำกลั่นชั่วครู่ ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ Leica TCS SP5 การกระตุ้นเกิดจากสายการแผ่รังสี 543 นาโนเมตรของเลเซอร์ He-Ne และรวบรวมแสงที่ปล่อยออกมาระหว่าง 570 ถึง 680 นาโนเมตร

ประโยชน์CISTANCHE: ปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

ผลลัพธ์และการอภิปราย

MSI เปิดเผยศักยภาพในการต้านเชื้อราในการทำงานร่วมกันระหว่าง P. digitatum และ P. citrinum

เพื่อคัดกรองใหม่เชื้อราสารประกอบที่มีศักยภาพในการปกป้องผลไม้รสเปรี้ยวและควบคุมโรคหลังการเก็บเกี่ยว เราใช้กลยุทธ์การเพาะเลี้ยงร่วมกันที่เกี่ยวข้องกับ P. digitatum และเชื้อก่อโรคเช่น P. citrinum วัฒนธรรมร่วมเป็นกลยุทธ์ที่ได้รับแรงบันดาลใจจากธรรมชาติ ซึ่งการแข่งขันระหว่างจุลินทรีย์สามารถกระตุ้นการผลิตเมตาบอลิซึมใหม่ได้ ในงานก่อนหน้านี้ การเพาะปลูกร่วมกันระหว่าง Trichophyton rubrum และ Bionectria ochroleuca ทำให้เกิดการผลิตสารอะนาล็อกซัลเฟตใหม่ของ PS-990 ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบนี้มีซัลเฟตเพิ่มเติมในระหว่างการปฏิสัมพันธ์ของเชื้อรา26 นอกจากนี้ อีกตัวอย่างหนึ่งของสารประกอบที่ได้มาจากการกระทำระหว่างกันของเชื้อราคือ tetrapeptide cyclo-(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolyl-D-leucyl-trans-4-hydroxy-L-proline) ที่ถูกแยกเดี่ยว จากน้ำซุปเนื้อร่วมของ Phomopsis sp. K38 และ Alternaria sp. E33; cyclic tetrapeptide มีฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อราไฟโตที่ทำให้เกิดโรคในระดับปานกลางถึงสูงเมื่อเปรียบเทียบกับยาฆ่าเชื้อรา triadimefon27 เชิงพาณิชย์ ดังนั้น การทดลองร่วมปลูกจึงเป็นแนวทางในการค้นหาสารประกอบที่สามารถยับยั้งไฟโตพาโตเจนในตระกูลส้ม โดยเฉพาะเชื้อราสีเขียวที่เกิดจาก P. digitatum

ในการปลูกร่วมกันดำเนินการทั้งในส้ม (ในร่างกาย) และสื่อสังเคราะห์ (ในหลอดทดลอง) เราสังเกตเห็นการยับยั้งการเจริญเติบโตทางไกลระหว่าง P. citrinum และ P. digitatum ด้วยสายตา ในการปฏิสัมพันธ์ของเชื้อรา ยีนเงียบสามารถถูกกระตุ้นและเมแทบอไลต์ที่เป็นอันตรายสามารถคลี่คลายจากคู่หนึ่งไปอีกคู่หนึ่งได้ 16,28 เมแทบอไลต์ที่เกิดจาก Tese มักจะถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นที่โซนของการเผชิญหน้าในตัวกลางที่เป็นของแข็งของวัฒนธรรมร่วม16 อย่างไรก็ตาม แนวทางปกติที่ใช้ในการตรวจหาและอธิบายเมตาโบไลต์ เช่น แมสสเปกโตรเมทรีควบคู่กับโครมาโตกราฟีแบบของเหลว (LC-MS) หรือแก๊ส (GC-MS) ไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับการกระจายเชิงพื้นที่ของโมเลกุล

ข้อมูลเกี่ยวกับการกระจายเชิงพื้นที่ของโมเลกุลสามารถรับได้โดยการถ่ายภาพแมสสเปกโตรเมตรี (MSI) ซึ่งเป็นเครื่องมืออันทรงพลังที่สร้างภาพสำหรับไอออนแต่ละตัวที่ตรวจพบในสเปกตรัมมวล การใช้ MSI เพื่อทำความเข้าใจระบบจุลินทรีย์และเมแทบอไลต์ทุติยภูมิไม่ใช่เรื่องใหม่ และการศึกษาซึ่งเทคนิคนี้ประสบความสำเร็จ สามารถพบได้ในเอกสารประกอบการ30 ตัวอย่างเช่น ใช้ MSI เพื่อตรวจสอบการทำงานร่วมกันระหว่าง Bacillus subtilis 3610 และ Streptomyces coelicolor A3 ภาพ DESI ของการเพาะเลี้ยงร่วมของแบคทีเรียเผยให้เห็นสัญญาณ 57 สัญญาณที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังอาณานิคมของแบคทีเรีย ซึ่งนำไปสู่การระบุสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิบางอย่าง เช่น สารลดแรงตึงผิวและ plipastatin31 นอกจากนี้ การวิเคราะห์ของ MSI ยังแสดงให้เห็นว่า S. coelicolor มีการผลิตสารทุติยภูมิบางอย่างที่ถูกยับยั้งเมื่อมี B. subtilis ซึ่งเผยให้เห็นปฏิสัมพันธ์ระหว่างแบคทีเรีย31

ดังนั้น เพื่อตรวจหาเมตาโบไลต์ทุติยภูมิที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อก่อโรคในตระกูลส้ม เราใช้ DESI-MSI โดยตรงบนพื้นผิวของวุ้นที่เพาะเลี้ยงร่วมกัน เพื่อให้เห็นภาพการแพร่กระจายของสารประกอบไปยังโซนของการเผชิญหน้า ได้รับสัญญาณ MSI สำหรับไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960, m/z 459.1645, m/z 625.3942, m/z 609.3988, m/ z 527.2862, m/z 511.2894 และ m/z 448.2938 (รูปที่ S1–S10) เราสังเกตว่าไอออนทั้งหมดที่กล่าวถึงถูกตรวจพบและรวมตัวอยู่ในโซนของการเผชิญหน้าระหว่างเชื้อรา (รูปที่ 1) สารประกอบเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับการทำงานร่วมกันของเชื้อราและเชื้อรา และอาจเป็นสารต้านจุลชีพชนิดใหม่ ไอออนที่ m/z 625, 609, 527, 511 และ 448 ผลิตโดย P. citrinum ในขณะที่ไอออนที่ m/z 519, 503, 475, 460 และ 459 ดูเหมือนจะเป็นการโต้กลับของ P. digitatum เผยให้เห็นการทำสงครามเคมีระหว่างเชื้อก่อโรคส้มทั้งสองชนิดนี้ ไอออน Te ที่ตรวจพบ ในหลอดทดลอง ผ่านการวิเคราะห์ของ MSI ยังตรวจพบในสารสกัดของการเพาะเลี้ยงร่วม ในร่างกาย (รูปที่ S11–S20) โดยใช้ส้มเป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 2)

ในการจำแนกลักษณะเฉพาะของเมตาโบไลต์ที่เกี่ยวข้องในการปฏิสัมพันธ์ ได้สารสกัดจากวัฒนธรรมร่วมจากการทดลองการเพาะเลี้ยงแบบขยายขนาด และสารประกอบที่น่าสนใจซึ่งตรวจพบในขั้นต้นผ่านการวิเคราะห์ของ MSI ถูกแยกออกโดยการเตรียม HPLC และกำหนดลักษณะผ่านการวิเคราะห์มวลสารควบคู่และการวิเคราะห์ NMR

ด้วยมวลที่แน่นอนที่ได้จากการวิเคราะห์ DESI-MSI (ตารางที่ 1) เป็นไปได้ที่จะยืนยันการมีอยู่ของอินโดลอัลคาลอยด์ที่ผลิตโดย P. digitatum ไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960 และ m/z 459.1645 ซึ่งสอดคล้องกับทริปโตเควิอะลานีน A (1) ทริปโตควิอาลานีน C (2) ทริปโตเควิอะลาโนนตามลำดับ ( 3), 15-dimethyl-2-epi-fumiquinazoline A (4) และ deoxytryptoquialanone (5) (โครงสร้างทางเคมีที่แสดงในรูปที่ 3) สารประกอบเหล่านี้เป็นส่วนหนึ่งของวิถีสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของทริปโทเควิอะลานีน32 และก่อนหน้านี้ตรวจพบในระหว่างการวิเคราะห์ DESI-MSI ของส้มที่ติดเชื้อราเขียว23 สารประกอบ 1 ถูกรายงานว่าเป็นเมตาโบไลต์ทุติยภูมิหลักที่ผลิตโดย P. digitatum33 กระนั้น การลบยีนนั้น ซึ่งมีหน้าที่ควบคุมการสังเคราะห์ 1 อย่าง แสดงให้เห็นว่า 1 ไม่ได้เกี่ยวข้องกับการก่อโรคของ P. digitatum ต่อส้มเนื่องจากความสามารถในการติดเชื้อของการกลายพันธุ์ไม่ได้เปลี่ยนแปลง34 บทบาททางชีววิทยาที่แน่นอนของทริปโตเควิอะลานีนยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด34 และการศึกษานี้ให้กิจกรรมทางชีววิทยาใหม่ของทริปโตเควลาลานีนที่มีส่วนร่วมของอัลคาลอยด์เหล่านี้ในการปฏิสัมพันธ์ของเชื้อรา MS/MS ของไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 625.3951 ให้ผลเป็นชิ้นส่วนที่ m/z 594.3533, 576.3427, 449.2430 และ 431.2325 (รูปที่ S21) ซึ่งเป็นรูปแบบการกระจายตัวแบบเดียวกันที่ได้รับสำหรับ citrinin A (6) ในการศึกษาเกี่ยวกับวัฒนธรรมร่วมระหว่าง P. citrinum และ Pseudoalteromonas sp. โอที5919. นอกจากนี้ ฐานข้อมูล GNPS ยังแนะนำว่าไอออนที่ m/z 625 อาจเป็น citrinin A. Te tandem mass spectrum ที่ได้รับสำหรับสารประกอบนี้แบ่งส่วนย่อยห้าส่วนร่วมกันกับสเปกตรัมมวลควบคู่ของ 6 ที่ฝากไว้ในฐานข้อมูล (รูปที่ S22) นอกจากนี้ยังมีรูปแบบการกระจายตัวของ MS/MS ที่คล้ายคลึงกันกับซิทรินิน A ที่รายงานโดย Moree et al (2014). มีรายงานว่าซิทรินาดินมีการผลิตสูงขึ้นในสถานการณ์การเพาะเลี้ยงร่วมและเข้มข้นในส่วนต่อประสานการเพาะเลี้ยงร่วม ซึ่งบ่งชี้ถึงการตอบสนองเชิงป้องกันของ P. citrinum ต่อจุลินทรีย์อื่นๆ การวิเคราะห์เครือข่ายระดับโมเลกุลของสารประกอบที่แยกได้พบว่ามีซิทรินินอีกตัวหนึ่งเกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยงร่วม ปฏิสัมพันธ์. เราสังเกตว่าไอออนที่ m/z 609 ซึ่งตรวจพบในขั้นต้นโดยการวิเคราะห์ของ MSI ถูกจัดกลุ่มในกลุ่มสารประกอบ 6 เดียวกัน (m/z 625) (รูปที่ S23) ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบนี้เป็นเมตาโบไลต์ที่มีลักษณะคล้ายซิทรินิน ในการวิเคราะห์เครือข่ายระดับโมเลกุล เมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องจะถูกจัดกลุ่มในกลุ่มเดียวกัน เนื่องจากมีสเปกตรัม MS/MS ที่คล้ายคลึงกัน

มวลที่แน่นอนที่ได้รับสำหรับไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 609.4010 สอดคล้องกับสารประกอบที่มีสูตรโมเลกุล C35H53N4O5 รูปแบบการแยกส่วนทำให้เกิดเศษที่ m/z 578.3583, 464.2905, 451.2586 และ 433.2482 (รูปที่ S24 เพิ่มเติม) 1 H NMR และ 1 H-1 H COZY สเปกตรัมที่ได้รับสำหรับสารที่ทำให้บริสุทธิ์ (รูปที่ S25–S26 และตาราง S1) แสดงสัญญาณที่คล้ายกันของ deoxycitrinadin A สังเคราะห์ที่รายงานโดย Bian et al (2013)37. สัญญาณลักษณะเฉพาะของ Te epoxide ที่ δH 4.0 ไม่มีอยู่ในอนุพันธ์นี้ และสัญญาณสำหรับ vynilic ไฮโดรเจนสามารถสังเกตได้ที่ δH 6.9 ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีกลุ่มอีพอกไซด์และมีพันธะคู่เมื่อเปรียบเทียบกับซิทรินิน A37 นี่เป็นครั้งแรกที่รายงานเกี่ยวกับ deoxycitrinadin A (7) ในวรรณคดีว่าเป็นเมตาโบไลต์ทุติยภูมิที่ผลิตโดยจุลินทรีย์

มวลที่แน่นอนที่ได้มาโดย DESI-MSI สำหรับไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 527.2862 และ 511.2894 ระบุสารประกอบที่มีองค์ประกอบธาตุของ C28H38N4O6 และ C28H38N4O5 ตามลำดับ MS/MS เปิดเผยว่าไอออนที่ m/z 511 มีโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันเมื่อเปรียบเทียบกับ m/z 527 ยกเว้นในกรณีที่ไม่มีอะตอมออกซิเจน การกระจายตัวของไอออนที่ m/z 527 ให้ผลเป็น m/z 281, 247, 219, 182 และ 120 (รูปที่ S27) ในขณะที่ไอออนที่ m/z 511 ให้ผลเป็น m/z 265, 247, 219, 166 และ 120 (รูปที่ S30) มีการรายงานรูปแบบการกระจายตัวแบบเดียวกันสำหรับลำดับของเตตระเปปไทด์ Phe-Val-Val-Tyr (8) ของ Penicillium canescens อย่างไรก็ตาม เมื่อเร็ว ๆ นี้ tetrapeptides 8 และ Phe-Val-Val-Phe (9) ได้รับการรายงานว่าเป็นสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิที่ผลิตโดย Penicillium roqueforti การวิเคราะห์ 1 H และ 13C NMR ของสารประกอบที่แยกได้ (รูปที่ S28–S32 และตาราง S2-S3) ยืนยันผลลัพธ์ที่ได้รับผ่าน MS/MS โดยสรุปว่าไอออนที่ m/z 527 และ m/z 511 สอดคล้องกับ 8 และ 9 ตามลำดับ การผลิตเตตระเปปไทด์เหล่านี้ในสงครามเคมีของเชื้อรานั้นไม่น่าแปลกใจเพราะเปปไทด์ขนาดเล็กเป็นที่รู้จักสำหรับฤทธิ์ต้านจุลชีพของพวกมัน40 นี่เป็นรายงานฉบับแรกของจำนวน 8 และ 9 เรื่องเมแทบอไลต์ทุติยภูมิของ P. citrinum สำหรับไอออน [M บวก H] บวกที่ m/z 448.2938 มวลที่แน่นอนแนะนำสารประกอบที่มีสูตรโมเลกุล C28H38N3O2 ซึ่งเป็นองค์ประกอบเดียวกันของเมแทบอไลต์รองไครโซจีนาไมด์ A (10) (ข้อผิดพลาด=−4.6 ppm) สารประกอบ 10 ถูกแยกออกมาและการวิเคราะห์ 1 H และ 13C NMR (รูปที่ S33–S34 และตาราง S4) ยืนยันโครงสร้างของมัน; เป็นรายงานฉบับแรกที่ chrysogenamide A เกี่ยวข้องกับการมีปฏิสัมพันธ์ของเชื้อรา สารประกอบ 10 ถูกรายงานครั้งแรกในฐานะเมตาโบไลต์ทุติยภูมิของ Penicillium chrysogenum No. 005, เชื้อราเอนโดไฟต์ที่เกี่ยวข้องกับพืชCistanche deserticola. นอกจากนี้ มีรายงานว่า 10 รายการเป็นสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิของสายพันธุ์ P. citrinum 42 โครงสร้างของสารที่ผลิตโดย P. citrinum แสดงในรูปที่ 4

การทดสอบเชื้อรา

เราตรวจสอบเชื้อรากิจกรรมของเมตาบอลิซึมที่ผลิตในวัฒนธรรมร่วมและ P. digitatum ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารสกัดร่วมวัฒนธรรม เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม เราสังเกตเห็นการลดลงร้อยละ 67 ในการเติบโตของ P. digitatum ในแนวรัศมี (รูปที่ S35) ซึ่งบ่งชี้ว่าสารเมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องกับสงครามเชื้อรามีศักยภาพในการเป็นสารต้านเชื้อรา เพื่อยืนยันสมมติฐานนี้ เราทดสอบสารประกอบที่แยกได้และสังเกตว่าสารประกอบ 6, 9 และ 10 (400 µg mL-1 ) ลดลง 48 เปอร์เซ็นต์ , 41 เปอร์เซ็นต์ และ 61 เปอร์เซ็นต์ของการเติบโตของ P. digitatum ในแนวรัศมี ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5) ยืนยันฤทธิ์ต้านเชื้อรา พบว่า Citrinadins มีส่วนเกี่ยวข้องในการตอบสนองของ P. citrinum ต่อจุลินทรีย์อื่นๆ ในวัฒนธรรมร่วม แต่บทบาททางชีวภาพของพวกมันในสภาพแวดล้อมทางชีวภาพยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด19 สารประกอบ 6 ถูกทดสอบสำหรับการมีฤทธิ์ของแผลที่ต้าน Buruli บน Mycobacterium Ulcerans MN209 แต่ไม่พบ MIC ที่น่าสนใจ43; นอกจากนี้ ยังมีรายงานกิจกรรมความเป็นพิษต่อเซลล์ของ 6 ต่อมะเร็งเม็ดเลือดขาวและเซลล์มะเร็งอีกด้วย44 ผลลัพธ์ของเราคือรายงานฉบับแรกเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านจุลชีพของซิทรินาดินในวรรณคดี และสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกครั้งแรกเกี่ยวกับบทบาททางชีววิทยาของสารประกอบเหล่านี้ในปฏิกิริยาระหว่างเชื้อราและเชื้อรา นอกจากนี้ ไครโซจีนาไมด์ A ยังไม่เคยถูกรายงานว่าเป็นสารต้านจุลชีพมาก่อนจนถึงขณะนี้ สารประกอบ 10 แสดงผลการป้องกันต่อเซลล์ประสาทที่ต้านการตายของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชัน41, อย่างไรก็ตาม, ไม่มีการรายงานการออกฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นสำหรับ 10 ในเอกสารวรรณกรรม การทดสอบเชื้อราโดยใช้ D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr เปิดเผยว่า tetrapeptide นี้มีฤทธิ์ในการยับยั้งคำบรรยาย B. และไฟโตพาโตเจนจากถั่วเหลือง Fusarium virguliforme38 ในทางตรงกันข้าม ไม่มีการยับยั้ง E. coli, B. subtilis และ S. cerevisiae เมื่อมี D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr หรือ D-Phe-L-Val-D-Val-L - เพได้รับการสังเกต39. ฤทธิ์ต้านเชื้อราของทริปโตเควิอะลานีนยังได้รับการประเมินเนื่องจากสารประกอบเหล่านี้ดูเหมือนจะเป็นการตอบสนองทางเคมีของ P. digitatum ต่อ P. citrinum ในสงครามเคมี Tryptoquialanines 1 และ 4 ได้รับการทดสอบและพบว่ามีฤทธิ์ต้านเชื้อราที่ต่อต้าน P. citrinum สารประกอบ 1 และ 4 มี MIC ที่ 300µgmL-1, ซึ่งยับยั้งการผลิตสปอร์ของ P. citrinum (รูปที่ S36) เท่าที่เราทราบ นี่เป็นรายงานฉบับแรกเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านจุลชีพของทริปโตเควลาลานีน เมื่อเร็ว ๆ นี้ แสดงให้เห็นว่า 1 เป็นสารประกอบฆ่าแมลงต่อเอ ตัวอ่อนของอียิปต์23; ฤทธิ์ต้านเชื้อราสามารถให้ความเข้าใจมากขึ้นเกี่ยวกับบทบาทของทริปโตเควิอะลานีนในสภาพแวดล้อมของเชื้อก่อโรคในตระกูลส้ม เมื่อสารเหล่านี้ไม่จำเป็นสำหรับเชื้อ P. digitatum

ประโยชน์CISTANCHE: ป้องกันแบคทีเรีย

สงครามเคมีเปลี่ยนแปลงผนังเซลล์ P. digitatum ในการเพาะเลี้ยงร่วม

เพื่อตรวจสอบการทำงานของเมตาบอไลต์ทุติยภูมิในระหว่างเชื้อราปฏิสัมพันธ์ ตัวอย่างวัฒนธรรมร่วมถูกย้อมด้วยคองโกเรดและสังเกตผ่านกล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล คองโกเรดมักใช้เพื่อย้อมโพลีแซคคาไรด์ที่มีการเชื่อมโยง 1,4 เช่นเชื้อราไคตินส่วนประกอบผนังเซลล์45,46. P. digitatum hyphae ถูกสังเกตพบในเขตเผชิญหน้า (ตัวอย่าง) และเปรียบเทียบกับ hyphae ที่อยู่ห่างไกลจากบริเวณส่วนต่อประสาน (ตัวควบคุม) (รูปที่ S37) เส้นใยควบคุมถูกย้อมเป็นเนื้อเดียวกันด้วยคองโกเรด ในขณะที่เส้นใยในบริเวณส่วนต่อประสานแสดงรูปแบบการย้อมสีที่เปลี่ยนแปลงไป (รูปที่ 6) โดยมีจุดปะปนไม่ปกติ ได้รูปแบบการย้อมสีที่คล้ายกันสำหรับเชื้อรากลายพันธุ์ที่น่าพิศวงซึ่งยีนที่ถูกลบมีบทบาทในการจัดระเบียบผนังเซลล์ เป็นผลให้การกลายพันธุ์แสดงผนังเซลล์ชำรุดและการย้อมสีผิดปกติ25,46,47 อย่างไรก็ตาม พบการย้อมสีผิดปกติด้วย Calcofluor White สำหรับ P. ostreatus P89 ที่ได้รับการรักษาด้วย 36 องศา ; การเปลี่ยนแปลงการกระจายไคตินที่อุณหภูมิสูงและความสมบูรณ์ของผนังเซลล์48. ข้อมูลนี้แสดงให้เห็นว่า P. digitatum hyphae เมื่อสัมผัสกับสารที่แพร่กระจายระหว่างการเพาะเลี้ยงร่วม มีผนังเซลล์ที่บกพร่องตั้งแต่ Congo Red ล้อมรอบโครงสร้างผนังเซลล์ของเชื้อรา ผนังเซลล์ของเชื้อราเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจของยาต้านจุลชีพเพราะไม่มีอยู่ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยสรุป การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์และการทดสอบเชื้อราช่วยเสริมว่าสารเมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาของเชื้อรามีศักยภาพดังนี้เชื้อราและอาจเป็นกลไกในธรรมชาติที่ไฟโตพาโทเจนเหล่านี้พัฒนาขึ้นเพื่อแข่งขันกับจุลินทรีย์อื่นๆ สำหรับเจ้าบ้าน (รูปที่ 7)

บทสรุป

การค้นหายาต้านจุลชีพตามธรรมชาติชนิดใหม่เป็นสาขาวิชาที่มีแนวโน้มดีในการวิจัยผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเกี่ยวกับผลกระทบทางเศรษฐกิจของโรคหลังการเก็บเกี่ยวต่อการเกษตรทั่วโลก นอกจากนี้ การปรากฏตัวของเชื้อราสายพันธุ์ที่ทนต่อสารฆ่าเชื้อราทำให้เกิดการค้นพบใหม่เชื้อราสารทดแทนสารสังเคราะห์ที่สำคัญอย่างยิ่ง การใช้การเพาะปลูกร่วมกันระหว่างไฟโตพาโทเจนที่แข่งขันกันเพื่อโฮสต์เดียวกัน P. digitatum และ P. citrinum เราสังเกตการทำงานร่วมกันของเชื้อรา ด้วยเทคนิคของ MSI เราตรวจพบเมแทบอไลต์ทุติยภูมิที่ถูกปลดปล่อยไปยังโซนส่วนต่อประสานระหว่างจุลินทรีย์ Tryptoquialanines, citrinadins, chyrsogenamide A และ tetrapeptides มีฤทธิ์ต้านเชื้อราได้ดีเยี่ยม เป็นการยืนยันว่าวัฒนธรรมร่วมและเทคนิคของ MSI เป็นส่วนผสมที่ดีในการค้นหาสารต้านจุลชีพตามธรรมชาติชนิดใหม่

จนถึงวันนี้ ยังไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับการทำงานร่วมกันระหว่างเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคจากส้ม ข้อมูลของเราเปิดเผยสารประกอบที่มีบทบาทในระบบนิเวศของจุลินทรีย์ในตระกูลส้ม นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นว่าสารที่ศึกษามีศักยภาพสูงเช่นเชื้อราสารเนื่องจากผนังเซลล์ของเชื้อราเป็นเป้าหมายหลักของเชื้อราสารประกอบ ควรมีการตรวจสอบการใช้สารประกอบที่ระบุว่าเป็นยาต้านเชื้อราตามธรรมชาติแทนสารฆ่าเชื้อราสังเคราะห์ เอกสารนี้เปิดโอกาสการวิจัยใหม่ๆ และสนับสนุนสิ่งแวดล้อมและสุขภาพของมนุษย์ ช่วยในการค้นหากลยุทธ์ที่ปลอดภัยกว่าสำหรับการเกษตรผ่านการใช้สารประกอบที่ได้จากแหล่งธรรมชาติ

ประโยชน์อาหารเสริม CISTANCHE: ปรับปรุงภูมิคุ้มกัน