การอภิปราย

เราได้พัฒนาเทคนิคเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์สำหรับการศึกษาการส่งผ่านระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ของ SNCA ในค. สง่างาม. แบบจำลองนี้แสดงคุณลักษณะที่สำคัญหลายประการของ synucleinopathy รวมถึงการสะสมที่เพิ่มขึ้นของมวลรวม SNCAความเสื่อมของเส้นประสาท,การขาดดุลทางพฤติกรรม, และอายุขัยที่ลดลง. ทั้งทางกรรมพันธุ์และการจัดการทางเภสัชวิทยาของสัตว์ได้แสดงความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นระหว่างอัตราอายุ, การส่งผ่าน SNCA ข้ามเซลล์ และฟีโนไทป์ของระบบประสาท และในทำนองเดียวกัน การจัดการต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับผลการต่อต้านริ้วรอยสามารถชะลอการดำเนินไปของเหตุการณ์เหล่านี้ได้ความก้าวหน้าของซินนิวเคลียสขึ้นอยู่กับอายุมาพร้อมกับการย่อยสลายโปรตีนที่ลดลงการรักษาต่อต้านริ้วรอยสามารถฟื้นฟูระบบที่เป็นสื่อกลางในการย่อยสลายโปรตีน นอกจากนี้ การฟื้นฟูการทำงานของ lysosomal ยังช่วยลดการแพร่กระจายของมวลรวมและการเสื่อมสภาพของระบบประสาทที่เกิดขึ้นในแบบจำลองอายุเหล่านี้ BiFC เป็นที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลายชั้นเทคนิค uorescence ที่ประสบความสำเร็จในการประเมินปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนและการลดขนาดโปรตีนและ/หรือโอลิโกเมอไรเซชันในเซลล์ที่มีชีวิต7 แสดงคู่ V1S-SV2 BiFC แล้วชั้นuoresce เมื่อมีการลดขนาด / โอลิโกเมอไรเซชันของ SNCA เมื่อโปรตีนเหล่านี้แสดงออกร่วมกันในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม7 ในการศึกษาก่อนหน้านี้17 โดยการสร้างเซลล์นิวโรบลาสโตมาที่แสดงหนึ่งใน V1S และ SV2 เราได้แสดงให้เห็นว่าการถ่ายโอนระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ของโปรตีน SNCA และการรวมตัวของโปรตีนที่ถ่ายโอนด้วยSNCA ภายนอกสามารถมองเห็นได้ด้วย BiFCชั้นยูเรสเซนซ์ในระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์เหล่านี้

ยินดีต้อนรับสู่ร้านค้าของฉันเพื่อรับ Cistanche สมุนไพรสำหรับการรักษาต่อต้านริ้วรอย

จัดส่งฟรีและจัดส่งทั่วโลก

ประเด็นทางเทคนิคที่สำคัญประการหนึ่งของระบบ BiFC คือการตรวจสอบการแสดงออกเฉพาะประเภทเซลล์ของโปรตีนแต่ละชนิดแม้ว่าการวิเคราะห์เชิงปริมาณของการแสดงออกของยีนดัดแปลงพันธุกรรมของ SNCA ในเซลล์แต่ละประเภทนั้นไม่สามารถทำได้ในทางเทคนิค เรามีชุดข้อมูลที่สนับสนุนข้อโต้แย้งว่า SNCA นั้นเป็นเพียงแสดงในประเภทเซลล์ที่ต้องการเท่านั้น อย่างแรก ดีเอสเรดความล้มเหลวตรวจพบมะเร็งได้เฉพาะในพลิกเท่านั้น-21 เซลล์ประสาทไม่ได้อยู่ในเซลล์กล้ามเนื้อคอหอยเลย ประการที่สอง การย้อมด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ SNCA ด้วยแอนติบอดีที่มีความจำเพาะสูงและมีความละเอียดอ่อน แสดงการแสดงออกของโปรตีนนี้โดยเฉพาะในเซลล์ที่ต้องการประเภท ประการที่สาม การแสดงออกของ BiFC คู่เดียวกันในเวิร์มกับดิน-1สัญญาณการกลายพันธุ์ฟีฟายไม่สามารถลด BiFC ได้ชั้นสัญญาณ uorescence แสดงว่าเกิด BiFCชั้นอูเรสจึงต้องการเอนโดไซโทซิส สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าสัญญาณ BiFC ไม่ได้มาจากการแสดงออกร่วมกันของคู่ BiFC ในเซลล์ประเภทเดียวกัน แต่ได้มาจากการส่งผ่านระหว่างเซลล์ของโปรตีน

ระบบการระบุตัวดัดแปลงพันธุกรรมใหม่ นอกจากนี้ โครงสร้างที่โดดเด่นของคอหอยใน C. elegans จะช่วยให้สามารถระบุการเปลี่ยนแปลงในการส่งผ่านของ syn synucleinopathy ได้สะดวกในการตรวจคัดกรองขนาดใหญ่สำหรับตัวดัดแปลงพันธุกรรมและโมเลกุลขนาดเล็ก

ผลกระทบของริ้วรอยกระบวนการเกี่ยวกับ "การส่งผ่าน" แทนที่จะเป็นการรวมเป็นหัวข้อสำคัญของเอกสารนี้ ตอนนี้ เราต้องการให้ชัดเจนว่าเราไม่ได้พยายามโต้แย้งว่าความชราและความผิดปกติของ lysosomal ส่งผลต่อการส่งผ่านของมวลรวมเท่านั้น โดยไม่กระทบต่อการรวมตัวของเซลล์ที่เป็นอิสระ ระบบ BiFC ของเราเป็นระบบที่ยอดเยี่ยมในการวัดปริมาณเหตุการณ์การส่งสัญญาณ แต่ไม่ได้ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบการรวมการโทรอัตโนมัติ การศึกษาก่อนหน้านี้25-27 รวมถึงของเราเอง28 กล่าวถึงผลกระทบของความผิดปกติของ lysosomal ในการกวาดล้างการรวมตัวของ SNCA ที่เป็นอิสระจากเซลล์ อย่างไรก็ตาม เรายังต้องการชี้ให้เห็นว่าไม่มีข้อพิสูจน์ที่แน่ชัดว่าการศึกษาเหล่านี้สังเกตเฉพาะการรวมตัวของเซลล์ที่เป็นอิสระ ไม่รวมผลกระทบของการส่งผ่านและการขยายมวลรวมข้ามเซลล์ เราขอเน้นย้ำด้วยว่าการเริ่มต้นการรวมเป็นข้อกำหนดที่แน่นอนสำหรับการส่งข้อมูลรวม ในความเป็นจริง เราแสดงให้เห็นว่าการรวมตัวของเซลล์อิสระระดับฐานเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติแม้ในสัตว์ดัดแปรพันธุกรรมตัวเดียว (รูปที่ 8F)

เดอะฤทธิ์ต้านความชราของ GlcNAcได้รับการอธิบายว่าเป็น DAF-16-อิสระ 12 สิ่งนี้บ่งชี้ว่า GlcNAc ช่วยฟีโนไทป์ของ daf-16 โดยไม่ได้ส่งผลกระทบโดยตรงต่อวิถี DAF-16 แต่โดยการกระทำผ่านวิถีการแก่ตัวที่เป็นอิสระ ข้อมูลที่เรานำเสนอชี้ให้เห็นว่าการส่งผ่าน SNCA ไม่ได้อยู่ภายใต้การควบคุมของเส้นทางความชราที่เฉพาะเจาะจง แต่ถูกควบคุมโดยความชราทั่วไป

การศึกษาในปัจจุบันของเราเป็นพื้นฐานสำหรับการพิจารณาใช้วิธีการต่อต้านวัยทั่วไปเป็นกลยุทธ์การรักษาเพื่อหยุดหรือชะลอการลุกลามของ PD และ synucleinopathies ที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้ สารเสริมการทำงานของไลโซโซมยังได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวเลือกสำหรับการรักษาโดยมีเป้าหมายเพื่อหยุดหรือชะลอการลุกลามของโรคเหล่านี้ ในทางทฤษฎีวิธีการเดียวกันนี้สามารถนำไปใช้กับโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาทที่เกี่ยวข้องกับอายุอื่นๆ ซึ่งหลายโรคคิดว่ามีความก้าวหน้าผ่านการแพร่กระจายของมวลรวมโปรตีนเฉพาะ สมมติว่าการแพร่กระจายของมวลรวมโปรตีนที่แตกต่างกันใช้หลักการพื้นฐานเดียวกัน เราคาดการณ์อย่างระมัดระวังว่ากลยุทธ์การต่อต้านวัยและโปรไลโซโซมสามารถพัฒนาเป็นการบำบัดทั่วไปเพื่อหยุดการลุกลามของโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาทจำนวนมาก สมมติฐานนี้สามารถระบุได้โดยใช้แบบจำลองสัตว์ที่ใช้ BiFC กับแบบจำลองการส่งผ่านอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับ MAPT, โปรตีนโพลีกลูตามีน และ TARDBP1

วัสดุและวิธีการ

สายพันธุ์และการเพาะเลี้ยงไส้เดือนฝอย สายพันธุ์ทั้งหมดได้รับการจัดการโดยใช้ขั้นตอนมาตรฐานและเติบโตบนจานที่มีการเจริญเติบโตของไส้เดือนฝอย (NGM) ที่มีหญ้าของ Escherichia coli (E. coli) สายพันธุ์ OP50 ที่ 20 C.29 Bristol N2 ชนิดป่าและสายพันธุ์กลายพันธุ์ unc-119(ed3), dyn-1(ky51) และ asp-4(ok2693) ได้มาจาก Caenorhabditis Genetics Center (CGC; University of Minnesota, St. Paul, MN , สหรัฐอเมริกา). asp สายพันธุ์กลายพันธุ์-1(tm666) จัดทำโดย C. elegans National BioResource Project (NBRP; Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokyo, Japan) สายพันธุ์กลายพันธุ์ daf-2(e1370) และ daf-16(mu86) เป็นของขวัญมากมายจากศาสตราจารย์ Kyuhyung Kim (DGIST, Daegu, Korea)

โครงสร้างพลาสมิดสำหรับ C. elegans

พลาสมิดแม่แบบ V1S และ SV2 เป็นของขวัญมากมายจาก Dr. Pamela McLean (Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA) หนึ่ง) Pmyo-2::EGFP ตัวก่อการ myo-2 (Pmyo-2) ได้รับการขยาย PCR จาก DNA จีโนมที่ได้จากเวิร์ม N2 ชนิดป่า

มีการใช้เซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ HindIII 50 -GACAAGCTTGGGTTTTTGTGCTGTG GACGTT-30 และแอนติเซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ BamHI 50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30 Pmyo-2::EGFP สร้างขึ้นโดยการแทรกผลิตภัณฑ์ PCR ลงในไซต์ HindIII และ BamHI ของ pFX_EGFPT vector.30 สอง) Pmyo-2::SNCA(Myc) ความหมาย ไพรเมอร์ที่มีไซต์ SalI, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 และไพรเมอร์ antisense ที่มีลำดับแท็ก myc และไซต์ BglII, 50 - AGCA GATCCTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG GCTTCAGGTTCGTAGTCTTG-30 ถูกนำมาใช้เพื่อขยาย MYC- SNCA ของมนุษย์ที่ติดแท็กซึ่งได้รับจาก pcDNA3.1 MycHis SNCA vector.28 ชิ้นส่วน EGFP ของ Pmyo-2::EGFP ถูกแทนที่ด้วยชิ้นส่วน SNCA ของมนุษย์ที่ติดแท็กด้วย PCR เพื่อสร้าง Pmyo-2::SNCA (มค). สาม) Pmyo-2::V1S ไพรเมอร์ที่มีไซต์ SalI, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30 และไพรเมอร์ antisense ที่มีไซต์ BglII, 50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC{{ 25}} ถูกใช้เพื่อขยาย V1S นอกจากนี้ ชิ้นส่วน EGFP ของ Pmyo-2::EGFP ถูกแทนที่ด้วยชิ้นส่วน V1S ที่ขยายด้วย PCR เพื่อสร้าง Pmyo-2::V1S สี่) Pmyo-2::V1Q25 ไพรเมอร์เซนส์ที่มีไซต์ claI 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30 และไพรเมอร์แอนติเซนส์ที่มีไซต์ claI 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGGTGCA GAGGCTCCTC{{ 38}} ถูกใช้เพื่อขยาย Q25 จากนั้น ชิ้นส่วน SNCA ของมนุษย์ของ Pmyo-2::V1S ถูกแทนที่ด้วยชิ้นส่วน Q25 ที่ขยายด้วย PCR เพื่อสร้าง Pmyo-2::V1Q25 สี่) Pflflp-21::SV2 ชิ้นส่วน EGFP ของ pFX_EGFPT ถูกแทนที่ด้วยชิ้นส่วน SV2 ที่ขยายสัญญาณด้วย PCR เพื่อสร้างเวกเตอร์ SV2

มีการใช้เซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ SpeI 50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30 และแอนติเซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ BglII 50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC CG-30 โปรโมเตอร์ flip-21 (Pflflp-21) ถูกขยาย PCR จาก N2 จีโนม DNA และซับโคลนลงในไซต์ KpnI และ SalI ของเวกเตอร์ SV2 เพื่อสร้าง Pflflp-21::SV2 เซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ KpnI, 50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 และแอนติเซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ SalI, 50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 ถูกนำมาใช้เพื่อขยาย flflp{{15} } โปรโมเตอร์ ห้า) Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed ในการสร้างเวกเตอร์ SV2 ซึ่งแสดงค่า DsRed ร่วมกันเป็นเครื่องหมายของเซลล์ประสาทคอหอย Pflflp-21 ถูกโคลนย่อยลงในไซต์ KpnI และ SalI ของ pFX{ {21}}DsRedxT vector30 และตั้งชื่อว่า Pflflp-21::DsRed การแสดงออกร่วมกันของ SV2 และ DsRed ภายใต้โปรโมเตอร์ flflp-21 ทำได้โดยการวางบริเวณ inter cistronic (ICR) ระหว่าง SV2 และ DsRed ซึ่งได้รับการขยาย PCR จาก N2.31 ชิ้นส่วน SV2 ถูกหลอมรวมกับภูมิภาค ICR โดยการหลอมรวม PCR32 และโคลนย่อยลงใน Pflflp-21::DsRed เพื่อสร้าง Pflflp-21::SV2-ICR DsRed มีการใช้เซนส์ไพรเมอร์ที่มีไซต์ SalI, 50 -AGCGTC GACGCCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 และแอนติเซนส์ไพรเมอร์ที่มีบริเวณที่คาบเกี่ยวกันกับ ICR, 50 -CGATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC-30 ในปฏิกิริยา PCR สำหรับ SV2 ขอบเขต ICR ถูกขยายด้วยเซ้นส์ไพรเมอร์ที่มีขอบเขตทับซ้อนกับ SV2, 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATTCCCCAAAAT CATCG-30 และไพรเมอร์แอนติเซนส์ที่มีไซต์ SpeI 50 - AGCACTAGTTACCCTGTAATAATATATTAAAC-3

การสร้างหนอนดัดแปลงพันธุกรรม BiFC

Pmyo-2::V1S และ Pflflp-21::SV2-พลาสมิด ICR-DsRed ถูกฉีดเข้าไปในอวัยวะสืบพันธุ์ของเวิร์ม L4- ระยะ N2 ระยะสุดท้ายที่มีเครื่องหมายการเลือก pRF4 ซึ่งแสดงออกถึงยีนคอลลาเจนที่กลายพันธุ์ rol- 6(su1006), 33 เพื่อสร้างสายพันธุกรรมสองสายที่แสดงคู่ BiFC ในฐานะที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบสำหรับ BiFC, Pmyo-2::V1S เพียงอย่างเดียวถูกฉีดเข้าไปในเวิร์ม N2 ด้วย pRF4 และ Pflflp-21::SV2-ICR DsRed เพียงอย่างเดียวถูกฉีดเข้าไปใน unc{{18 }}(ed3) เวิร์มกลายพันธุ์ที่มีเครื่องหมายการเลือก pCFJ151 ซึ่งแสดง unc-119(C) ยีน 34 พลาสมิด Pmyo-2::V1 ถูกสร้างขึ้นเพื่อแสดงลำดับย่อย BiFC โดยการแนะนำเท่านั้น codon หยุดก่อนลำดับการเข้ารหัส SNCA ใน Pmyo-2::V1S โดยใช้ Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 200521) Pmyo-2::V1 และ Pflflp-21::SV2-จากนั้นพลาสมิด ICR-DsRed จะถูกฉีดเข้าไปใน N2 ด้วย pRF4 พลาสมิด Pmyo-2::V1Q25 ถูกสร้างขึ้นเพื่อแสดง Huntingtin exon 1 ด้วย 25 กลูตามีนที่ยืดออกโดยการแทนที่ SNCA ด้วยชิ้นส่วน Q25 ใน Pmyo-2:: V1S Pmyo-2::V1Q25 และ Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed พลาสมิดถูกฉีดเข้าไปใน N2 ด้วย pRF4 นอกจากนี้ Pflflp-21::DsRed ยังถูกฉีดเข้าไปใน N2 โดยมี pRF4 เป็นตัวควบคุมผลกระทบของโปรตีนทั่วไปที่แสดงออกมากเกินไปในเซลล์ประสาท สำหรับการรวมโครโมโซมของพลาสมิดที่แนะนำ เส้นที่ฉีดได้รับการฉายรังสียูวี หลังจากการฉายรังสี UV แต่ละเส้นที่รวมกันจะถูกตัดออก 4 ครั้งด้วย N2 สายพันธุกรรมคู่ที่มี Pmyo-2::V1S และ Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมพันธุ์สาย Pmyo{63}}::V1S ที่ผสานเข้ากับ Pflflp-21::SV2-ICR-Dsสายสีแดง เวิร์มแปลงพันธุ์เหล่านี้ทั้งหมดแสดงฟีโนไทป์แบบลูกกลิ้งและการแสดงออกของ DsRed

การเรืองแสงในเซลล์ประสาทคอหอย

การสร้างโมเดล SNCA ที่ไม่ติดแท็ก Pmyo-2::SNCA และ Pflflp-21::SNCA พลาสมิดได้รับการออกแบบมาเพื่อแสดง SNCA โดยการแนะนำ stop codon หลังจากลำดับการเข้ารหัส SNCA โดยใช้ QuikChange Site-Directed Mutagenesis ชุด. ในฐานะที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ Pmyo-2::SNCA เพียงอย่างเดียวถูกฉีดเข้าไปในเวิร์ม N2 ที่มี pRF4 Pmyo-2::SNCA และ Pflflp-21:: พลาสมิดของ SNCA ถูกฉีดเข้าไปในอวัยวะสืบพันธุ์ของเวิร์ม N2 ระยะ L4-ระยะสุดท้ายที่มี pRF4 เวิร์มทั้งหมดเหล่านี้แสดงฟีโนไทป์แบบลูกกลิ้งและใช้สายตัวแทน 3 สายของแต่ละจีโนไทป์สำหรับการทดลอง การสร้างโมเดล BiFC ที่เกี่ยวข้องกับอายุ Pmyo-2::V1S และ Pflflp-21::SV2-พลาสมิด ICR-DsRed ถูกฉีดเข้าไปในอวัยวะสืบพันธุ์ของ L4-stage daf -2(e1370) และ daf-16 (mu86) เวิร์มกลายพันธุ์ด้วย pRF4 ในฐานะที่เป็นตัวควบคุมสำหรับโมเดล BiFC ที่เกี่ยวข้องกับอายุ Pmyo-2::V1S หรือ Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed เพียงอย่างเดียวถูกฉีดเข้าไปในอวัยวะสืบพันธุ์ของ L{{30} }ระยะของ N2 และ daf-16(mu86) เวิร์มกลายพันธุ์ที่มี pRF4 หลังจากได้รับสายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมหลายสายที่มีพลาสมิดที่แนะนำ ตัวแทน 3 สายในแต่ละพื้นหลังกลายพันธุ์ถูกนำมาใช้สำหรับการทดลอง

การสร้างสายพันธุกรรม hlh-30p::hlh-30

พลาสมิดที่แสดง hlh-30p::hlh-30::gfp เป็นของขวัญจาก Dr. Malene Hansen (Sanford-Burnham Medical Research Institute, CA, USA) พลาสมิด hlh-30p::hlh-30 ได้รับการออกแบบมาเพื่อแนะนำ stop codon ก่อนลำดับการเข้ารหัส GFP โดยใช้ QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit เพื่อยับยั้งการแสดงออกของ GFP ในฐานะที่เป็นตัวควบคุม แต่ละ Pmyo-2::V1S หรือ Pflflp-21::SV2-ICRDsRed และ hlh-30p::hlh-30 ถูกรวมเข้ากับ อวัยวะสืบพันธุ์ของหนอน L4-ระยะ N2 ระยะสุดท้ายที่มี pRF4 พลาสมิดที่แสดง Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed และ hlh-30p::hlh-30 ถูกรวมเข้ากับ อวัยวะเพศของ L4-stage daf-16(mu86) กลายพันธุ์เวิร์มที่มี pRF4 ในการวิเคราะห์ความผิดปกติของ lysosomal จะใช้เวิร์มกลายพันธุ์ asp-4(ok2693) และ asp-1(tm666) ซึ่งยีน cathepsin ของเอนไซม์ lysosomal ถูกยับยั้ง Pmyo-2::V1S และ Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed พลาสมิดถูกฉีดเข้าไปในอวัยวะสืบพันธุ์ของเวิร์มกลายพันธุ์ระยะ L4-ระยะสุดท้ายที่มี pRF4 หลังจากได้รับสายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมที่มีพลาสมิดที่แนะนำแล้ว 3 สายตัวแทนของแต่ละจีโนไทป์ถูกนำมาใช้สำหรับการทดลอง

กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

สำหรับการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ของเวิร์มนั้น ได้รวบรวม N2 ชนิดป่าและเวิร์มดัดแปรพันธุกรรม ล้างด้วยบัฟเฟอร์ M9 (22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4) แล้วตรึงล่วงหน้าด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ใน MRWB ( 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 1{{60}} mM EGTA, 5 mM สเปิร์มมิดีน [Sigma-Aldrich, S0266], 50 เมทานอลร้อยละ) เพื่อลดความแข็งของชั้นหนังกำพร้าสำหรับการแทรกซึม เวิร์มถูกนำไปแช่แข็ง/ละลายหลายครั้งโดยใช้ไนโตรเจนเหลว และบ่มด้วยการกวนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เนื่องจากขั้นตอนการรีดักชันและออกซิเดชั่นเพิ่มความสามารถในการซึมผ่านของหนอน เวิร์มจึงถูกล้างด้วย Tris-Triton buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.4, Triton X 1 เปอร์เซ็นต์-100 [Bio-Rad Laboratories Inc., 161– 0407], 1 มิลลิโมลาร์ EDTA) และบ่มด้วย 1 เปอร์เซ็นต์ b-เมอร์แคปโตเอทานอล (Sigma-Aldrich, M7522) ในบัฟเฟอร์ทริส-ไทรทันที่อุณหภูมิห้อง (RT) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น เวิร์มถูกบ่มในสารละลายคอลลาจิเนส (collagenase type IV 100 หน่วย [Worthington Biochemical Co., LS004188] ใน 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM CaCl2, 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100) พร้อมการหมุน เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ RT จากนั้นหนอนจะถูกบ่มใน Tris-Triton buffer ที่เสริมด้วย 0.3 เปอร์เซ็นต์ H2O2 (Sigma-Aldrich, H1009) เป็นเวลา 15 นาทีที่ RT หลังจากการฟักตัวในบล็อคบัฟเฟอร์ (0.1 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมอัลบูมินของวัว [BSA; Sigma-Aldrich, A7906], 0.5 เปอร์เซ็นต์ของ Triton X-100, 1 mM EDTA ในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต [PBS; GenDEPOT, CAP08-050 ]) เวิร์มถูกบ่มด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดี 274 mAb10 ข้ามคืนที่ 4 C ในสารละลายปฐมภูมิของแอนติบอดี (BSA 1 เปอร์เซ็นต์, Triton X 0.5 เปอร์เซ็นต์-100, EDTA 1 มิลลิโมลาร์ใน PBS) ในวันต่อมา เวิร์มถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ปิดกั้นและบ่มด้วยโรดามีนเรด X-conjugated แพะต่อต้านหนู IgG (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, 115-295-166) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นหนอนจะถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ปิดกั้นและติดตั้งในรีเอเจนต์ Antifade (Invitrogen, P36930) ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์สแกนเลเซอร์คอนโฟคอล Olympus FV1000 (โอลิมปัส โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น)

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงของเวิร์มที่มีชีวิต

หนอนถูกตรึงด้วยโซเดียมเอไซด์ 10 มิลลิโมลาร์ในบัฟเฟอร์ M9 และปิดด้วยใบปิด ภาพของเวิร์มได้มาจากการใช้กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล Olympus FV1000

การซับแบบตะวันตก

หนอนตัวเต็มวัยถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ M9 และตามด้วย PBS ที่มี Triton X 1 เปอร์เซ็นต์-100 เม็ดหนอนถูกทำให้เป็นเม็ดใน PBS ที่มี Triton X 1 เปอร์เซ็นต์-100, 1 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) สารยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอส (Sigma-Aldrich, P8340) และหมุนเหวี่ยงเพื่อให้ได้ไตรตันที่ละลายน้ำได้ ) และ - เศษส่วนที่ไม่ละลายน้ำ (เม็ด) วัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้การทดสอบโปรตีน BCA (Pierce Biotechnology, 23223 และ 23224) ตัวอย่างโปรตีน (3 มก. สำหรับการทดสอบการแสดงออกของ SNCA, 50 มก. เพื่อตรวจหาโปรตีนโพลียูบิควิติน และ 20 มก. (V1S, V1SCSV2 บรรทัด) และ 40 มก. (บรรทัด SV2) สำหรับความแตกต่างของการละลายของ SNCA) ถูกบรรจุลงบนเจล SDS-PAGE 12 เปอร์เซ็นต์ แอนติบอดีหลักที่ใช้สำหรับ Western blotting ได้แก่ monoclonal anti-SNCA antibody, 274 mAb (1:1,500) และ Syn-1 (1:1,500; BD BioScience, 610787) และ anti-ubiquitin antibody (1:3,{ {35}}; แอ็บแคม, ab7254). การตรวจจับเคมีเรืองแสงดำเนินการโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ภาพเรืองแสง LAS-3000 (Fujifilm โตเกียว ญี่ปุ่น) และ Amersham imager 600 (Ge Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA) และซอฟต์แวร์ Multi Gauge (v3.0) (Fujifilm , โตเกียว, ญี่ปุ่น).

การแต้มจุด

หนอนตัวเต็มวัยของแต่ละสายพันธุ์ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ M9 และตามด้วย PBS ที่มี Triton X 1 เปอร์เซ็นต์-100 เม็ดหนอนถูกทำให้เป็นเม็ดใน PBS ที่มี 1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 และ 1 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) ค็อกเทลที่ยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอส ตัวอย่างโปรตีน (500 นาโนกรัม) ถูกบรรจุลงบนเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส ซึ่งจากนั้นจะถูกทำให้แห้งและบ่มในสารละลายปิดกั้น แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้สำหรับการทำดอตบล็อตติงคือโมโนโคลนอลแอนติบอดี 274 mAb และ Syn-O2,13 ซึ่งเป็นแอนติบอดีชนิดหลังซึ่งจำเพาะสำหรับมวลรวม SNCA การตรวจจับเคมิลูมิเนสเซนซ์ดำเนินการโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ภาพการเรืองแสง LAS-3000 และซอฟต์แวร์ Amersham imager 600 และ Multi Gauge (v3.0)

การรักษาด้วยสารต่อต้านริ้วรอย

N-acetylglucosamine (GlcNAc) (Sigma-Aldrich, A8625) ถูกละลายในน้ำกลั่นถึง 1 M เป็นสารละลายสต็อก สารละลายสต็อกถูกเจือจางด้วยตัวกลางที่เป็นของเหลว LB (Sigma-Aldrich, L3022) สเตจเวิร์ม L4- ของสายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมแต่ละสายพันธุ์ถูกถ่ายโอนไปยังเพลต NGM ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ GlcNAc 10 มิลลิโมลาร์ PCR หนอนเดี่ยว หนอนเดี่ยวที่จับตัวเป็นก้อนจากแต่ละบรรทัดถูกสลายในบัฟเฟอร์การสลาย (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 2.5 mM MgCl2, 0.45 เปอร์เซ็นต์ NP-40 [IGEPAL; Sigma-Aldrich, I3021], ทวีน 20 0.45 เปอร์เซ็นต์ [Sigma-Aldrich, P1379]) ที่มีโปรตีน K 0.1 มก./มล. (Sigma Aldrich, P4850) หนอนตัวเดียวในบัฟเฟอร์ถูกแช่แข็ง-ละลายหลายรอบโดยใช้ไนโตรเจนเหลว บ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อปลดปล่อยดีเอ็นเอจีโนม จากนั้นให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาทีเพื่อยับยั้งโปรตีเอสเค การวิเคราะห์ PCR แบบหนอนเดี่ยวคือ ดำเนินการโดยใช้ Ex TaqTM polymerase (Takara Biotechnology, RR001A) ในระบบ Bio-Rad MyCycler PCR Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)

PCR-จำกัด ความยาวของชิ้นส่วน จีโนไทป์ polymorphism

เวิร์ม Gravid 5 จากแต่ละบรรทัดถูกสลายในบัฟเฟอร์การสลายด้วยโปรตีน K 0.1 มก./มล. เวิร์มในบัฟเฟอร์ถูกแช่แข็ง-ละลายหลายรอบโดยใช้ไนโตรเจนเหลว บ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปล่อยจีโนมดีเอ็นเอ จากนั้นให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อยับยั้งโปรตีเอสเค หลังจากทำ PCR แล้ว ผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกย่อยด้วยเอนไซม์ NcoI (New England Biolabs Inc., R3193S) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสข้ามคืนและอิเล็กโตรโฟรีเพื่อตรวจจับการจำกัด ความหลากหลายของความยาวแฟรกเมนต์

พีซีอาร์เชิงปริมาณ (qPCR)

หนอนดัดแปลงพันธุกรรมที่โตเต็มวัยถูกรวบรวมและล้างในบัฟเฟอร์ M9 เวิร์มในบัฟเฟอร์ถูกทำให้เป็นฟองและตัวอย่างถูกทำให้เย็นและละลายหลายรอบโดยใช้ไนโตรเจนเหลว สกัด RNA ด้วย Trizol Reagent (Invitrogen, 15596-026) และทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ RNeasy mini kit (Qiagen, 74106) แต่ละ cDNA ถูกสังเคราะห์จาก 500 ng ของ RNA ทั้งหมดโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories Inc., 170–8891) สำหรับ PCR แบบเรียลไทม์ ยีนเป้าหมายและไพรเมอร์เฉพาะถูกผสมกับ SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, RR081A) ใน 96-จานหลุม ใช้ไพรเมอร์เฉพาะที่ออกแบบโดยกลุ่มอื่นก่อนหน้านี้14 ผลิตภัณฑ์ DNA ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ระบบ 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ระดับ mRNA สัมพัทธ์ของยีนเป้าหมายถูกทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อทำหน้าที่-1

การรักษาภาวะช็อกจากความร้อนของ dyn-1 กลายพันธุ์

เวิร์มดัดแปลงพันธุกรรมสองเท่า (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) ผสมพันธุ์กับเวิร์มกลายพันธุ์ dyn-1(ky51)20 ตัวเต็มวัย แม่เวิร์มของสายพันธุกรรมสองสายพันธุ์ โดยมีหรือไม่มีการกลายพันธุ์ของ dyn-1(ky51) ถูกเลี้ยงบนเพลต NGM ที่มี E. coli OP50 เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 20 C เพื่อวางไข่ จากนั้นจึงถูกกำจัดออก เวิร์มรุ่นลูกที่ซิงโครไนซ์ของแต่ละสายพันธุ์ที่ระยะ L4-ถูกเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเพื่อการสังเกต

การวิเคราะห์การปั๊มคอหอย

การปั๊มคอหอยถูกนับเป็นเวลา 1 นาทีที่ RT โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ วิเคราะห์ N2 ชนิดไวด์ การกลายพันธุ์ และเวิร์มดัดแปรพันธุกรรม ข้อมูลถูกแสดงเป็น PPM (ปั๊มต่อนาที)

การทดสอบอายุขัย

ไข่ที่วางโดยแม่เวิร์มตัวเต็มวัยเติบโตพร้อมกันจนถึงระยะตัวอ่อน L4 บนเพลต NGM ที่เพาะด้วย E. coli OP50 ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส เวิร์มระยะ L4- ถูกย้ายไปยังเพลต NGM ที่มี 100 มิลลิโมลาร์ 5- flfluoro-20 -deoxyuridine (Sigma-Aldrich, F0503) เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดลูกหลาน จำนวนเวิร์มที่มีชีวิตหรือตายถูกบันทึกทุกๆ 1 หรือ 2 วัน หนอนที่แตก ขุด หรือคลานออกจากจานจะถูกเซ็นเซอร์ แต่รวมอยู่ในการวิเคราะห์อายุขัยในฐานะสัตว์ที่ถูกเซ็นเซอร์ ข้อมูลการอยู่รอดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ OASIS (แอปพลิเคชันออนไลน์สำหรับการวิเคราะห์การอยู่รอดของการตรวจวิเคราะห์ช่วงชีวิต

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองทั้งหมดดำเนินการแบบปิดตาและทำซ้ำอย่างน้อย 3 ครั้ง ค่าในรูปจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ความแตกต่างได้รับการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญ หากค่า P เป็น § < SEM 0.05. กราฟถูกวาดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Prism 5 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) ค่าถูกเปรียบเทียบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวกับการทดสอบ Tukey posthoc โดยใช้ซอฟต์แวร์ InStat (เวอร์ชัน 3.05) (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA)

ตัวย่อ

ACTB แอกติน, ข

โรคอัลไซเมอร์

อับอมีลอยด์ ข

ALS เส้นโลหิตตีบด้านข้าง amyotrophic

การเสริมการเรืองแสงด้วย BiFC bimolecular

GlcNAc N-อะเซทิลกลูโคซามีน

โรคพีดีพาร์กินสัน

การเปิดเผยความขัดแย้งทางผลประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้น

ไม่มีการเปิดเผยความขัดแย้งทางผลประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้น

เงินทุน

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย National Research Foundation (NRF) ซึ่งได้รับทุนสนับสนุนจากรัฐบาลเกาหลี (MEST) (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661) และโครงการ R&D เทคโนโลยีด้านสุขภาพของเกาหลี กระทรวงสาธารณสุข & สวัสดิการ สาธารณรัฐเกาหลี (HI14C0093) และโครงการ 2014 KU Brain Pool ของมหาวิทยาลัยคอนกุก

อ้างอิง

[1] Brundin P, Melki R, Kopito R. Prion-like การส่งผ่านของการรวมตัวของโปรตีนในโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท แนท เรฟ โมล เซลล์ ไบโอล 2010; 11:301-7; PMID:20308987;http://dx.doi.org/10.1038/nrm2873

[2] Lee SJ, Desplats P, Sigurdson C, Tsigelny I, Masliah E. การส่งผ่านเซลล์ต่อเซลล์ของการรวมตัวของโปรตีนที่ไม่ใช่พรีออน แนท เรฟ นิวรอล 2010; 6:702-6; PMID:21045796; http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2010.145

[3] ยุคเกอร์ เอ็ม, วอล์กเกอร์ แอล.ซี. การแพร่กระจายด้วยตนเองของมวลรวมโปรตีนที่ทำให้เกิดโรคในโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท ธรรมชาติ 2556; 501:45-51; PMID:24005412;http://dx.doi.org/10.1038/nature12481

[4] Bae EJ, Lee HJ, Rockenstein E, Ho DH, Park EB, Yang NY, Des plats P, Masliah E, Lee SJ การกวาดล้าง a-synuclein นอกเซลล์โดยใช้แอนติบอดีช่วยป้องกันการส่งผ่านแบบรวมระหว่างเซลล์กับเซลล์ เจ Neurosci 2012; 32:13454-69; PMID:23015436; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.1292-12.2012

[5] Tran HT, Chung CH, Iba M, Zhang B, Trojanowski JQ, Luk KC, Lee VM การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันอัลฟ่า-ไซนิวคลีอินบล็อกการดูดซึมและการขยายพันธุ์ของอะ-ไซนิวคลีอินและการเสื่อมสภาพของระบบประสาทที่ไม่ถูกต้อง ตัวแทนเซลล์ 2014; 7:2054-65; PMID:24931606; http://dx.doi.org/10.1016/j. เซลล์ rep.2014.05.033

[6] Lee HJ, Bae EJ, Lee SJ. Extracellular a–synuclein- นวนิยายและปัจจัยสำคัญในโรคร่างกายของ Lewy แนท เรฟ นูรอล 2014; 10:92-8; PMID:24468877;http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2013.275

[7] Outeiro TF, Putcha P, Tetzlaff JE, Spoelgen R, Koker M, Carvalho F, Hyman BT, McLean PJ. การก่อตัวของสายพันธุ์ oligomeric a-synuclein ที่เป็นพิษในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต กรุณาหนึ่ง 2008; 3:e1867; PMID:18382657; http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0001867

[8] McKay JP, Raizen DM, Gottschalk A, Schafer WR, Avery L. eat-2 and eat-18 จำเป็นสำหรับการส่งสารสื่อประสาทนิโคตินในคอหอย Caenorhabditis elegans พันธุศาสตร์ 2547; 166:161-9; PMID:15020415; http://dx.doi. org/10.1534/genetics.166.1.161

[9] Rogers C, Reale V, Kim K, Chatwin H, Li C, Evans P, de Bono M. การยับยั้งการให้อาหารทางสังคมของ Caenorhabditis elegans โดยการกระตุ้นเปปไทด์ที่เกี่ยวข้องกับ FMRFamide ของ NPR-1 ณัฐ ประสาทวิทยา 2546; 6:1178-85; PMID:14555955;http://dx.doi.org/10.1038/nn1140

[10] Lee HJ, Bae EJ, Jang A, Ho DH, Cho ED, Suk JE, Yun YM, Lee SJ การตรวจหาอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์สำหรับ a-synuclein ที่มีสปีชีส์และความจำเพาะของสถานะมัลติเมอริก วิธี J Neurosci 2011; 199:249-57; PMID:21658411; http://dx.doi.org/10.1016/j. Nemeth.2011.05.020

[11] Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, Tabtiang R. A. C. elegans กลายพันธุ์ที่มีอายุยืนยาวเป็นสองเท่าของสัตว์ป่า ธรรมชาติ 2536; 366:461-4; PMID:8247153;http://dx.doi.org/10.1038/366461a0

[12] Denzel MS, Storm NJ, Gutschmidt A, Baddi R, Hinze Y, Jarosch E, Sommer T, Hoppe T, Antebi A. เมแทบอไลต์ของวิถีเฮกโซซามีนช่วยเพิ่มการควบคุมคุณภาพโปรตีนและยืดอายุ เซลล์ 2014; 156:1167-78; PMID:24630720; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.061

[13] Vaikath NN, Majbour NK, Paleologou KE, Ardah MT, van Dam E, van de Berg WD, Forrest SL, Parkkinen L, Gai WP, Hattori N และอื่นๆ การสร้างและลักษณะเฉพาะของโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อโครงสร้างใหม่สำหรับพยาธิสภาพของอะ-ไซนิวคลีอิน โรคระบบประสาท พ.ศ. 2558; 79:81-99; PMID:25937088; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.nbd.2015.04.009

[14] Lapierre LR, De Magalhaes Filho CD, McQuary PR, Chu CC, Visvikis O, Chang JT, Gelino S, Ong B, Davis AE, Irazoqui JE และคณะ TFEB orthologue HLH-30 ควบคุม autophagy และปรับอายุขัยใน Caenorhabditis elegans ณัฐ ชุมชน 2556; 4:2267; PMID:23925298

[15] Vilchez D, Morantte I, Liu Z, Douglas PM, Merkwirth C, Rodrigues AP, Manning G, Dillin A. RPN-6 ระบุอายุขัยของ C. elegans ภายใต้สภาวะความเครียดที่เกิดจากโปรตีน ธรรมชาติ 2555; 489:263-8; PMID:22922647;http://dx.doi.org/10.1038/nature11315

[16] Hansen C, Angot E, Bergstrom AL, Steiner JA, Pieri L, Paul G, Outeiro TF, Melki R, Kallunki P, Fog K และอื่นๆ a-Synuclein แพร่กระจายจากสมองของหนูไปยังเซลล์ประสาท dopaminergic กราฟต์และการรวมตัวของเมล็ดในเซลล์มนุษย์ที่เพาะเลี้ยง J Clin ลงทุน 2011; 121:715-25; PMID:21245577;http://dx.doi.org/10.1172/JCI43366

[17] Bae EJ, Yang NY, Song M, Lee CS, Lee JS, Jung BC, Lee HJ, Kim S, Masliah E, Sardi SP และอื่นๆ การพร่องของกลูโคเซอโบรซิเดสช่วยเพิ่มการส่งผ่านระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ของ a-synuclein ณัฐ ชุมชน 2557; 5:4755; PMID:25156829; http://dx.doi.org/10.1038/ncomms5755

[18] Lee HJ, Suk JE, Bae EJ, Lee JH, Paik SR, Lee SJ. endocytosis ขึ้นอยู่กับการประกอบและการกวาดล้างของ a-synuclein นอกเซลล์ Int J Biochem Cell Biol 2008; 40:1835-49; PMID:18291704; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biocel.2008.01.017

[19] Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spen cer B, Masliah E, Lee SJ การรวมตัวและการตายของเซลล์ประสาทผ่านการส่งผ่านเซลล์ประสาทถึงเซลล์ประสาทของ a-synuclein Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2552; 106:13010-5; PMID:19651612; http://dx.doi. org/10.1073/pnas.0903691106

[20] Clark SG, Shurland DL, Meyerowitz EM, Bargmann CI, van der Bliek AM การกลายพันธุ์ GTPase ของไดนามินทำให้เกิดความบกพร่องในการเคลื่อนที่ที่เหนี่ยวนำให้เกิดอุณหภูมิอย่างรวดเร็วและย้อนกลับได้ใน C. elegans Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2540; 94:10438-43; PMID:9294229; http://dx.doi.org/ 10.1073/pnas.94.19.10438

[21] Lee HJ, Cho ED, Lee KW, Kim JH, Cho SG, Lee SJ autophagic ล้มเหลว ure ส่งเสริม exocytosis และการถ่ายโอนระหว่างเซลล์ของ a-synuclein ประสบการณ์ Mol Med 2013; 45:e22; PMID:23661100; http://dx.doi.org/ 10.1038/emm.2013.45

[22] Syntichaki P, Xu K, Driscoll M, Tavernarakis N. จำเป็นต้องมี aspartyl และ calpain proteases เฉพาะสำหรับการเสื่อมสภาพของระบบประสาทใน C. elegans ธรรมชาติ 2545; 419:939-44; PMID:12410314; http://dx.doi.org/ 10.1038/nature01108

[23] Sardiello M, Palmieri M, di Ronza A, Medina DL, Valenza M, Gennarino VA, Di Malta C, Donaudy F, Embrione V, Polishchuk RS และอื่น ๆ เครือข่ายยีนที่ควบคุมการกำเนิดและการทำงานของ lysosomal biogenesis วิทยาศาสตร์ 2552; 325:473-7; PMID:19556463

[24] Grove CA, De Masi F, Barrasa MI, Newburger DE, Alkema MJ, Bulyk ML, Walhout AJ เครือข่ายหลายพารามิเตอร์เผยให้เห็นความแตกต่างอย่างกว้างขวางระหว่างปัจจัยการถอดรหัส C. elegans bHLH เซลล์ 2009; 138:314-27; PMID:19632181; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.058

[25] Klucken J, Poehler AM, Ebrahimi-Fakhari D, Schneider J, Nuber S, Rockenstein E, Schlotzer-Schrehardt U, Hyman BT, McLean PJ, Masliah E และอื่น ๆ การรวมตัวของอัลฟ่า-ไซนิวคลีอินเกี่ยวข้องกับบาฟิโลมัยซิน เอ 1-ทางเดินที่ไวต่อการดูดซึมอัตโนมัติ การดูดเลือดอัตโนมัติ 2012; 8:754-66; PMID:22647715; http://dx.doi.org/10.4161/auto.19371

[26] Yu WH, Dorado B, Figueroa HY, Wang L, Planel E, Cookson MR, Clark LN, Duff KE กิจกรรมเมแทบอลิกกำหนดประสิทธิภาพของการกวาดล้างโอลิโกเมอริก a-synuclein ทางพยาธิวิทยาแบบมาโคร-ออโตฟาจิก แอม เจ ปะถล 2552; 175:736-47; PMID:19628769; http://dx.doi.org/10.2353/ ajpath.2009.080928

[27] Kilpatrick K, Zeng Y, Hancock T, Segatori L. การเปิดใช้งานทางพันธุกรรมและทางเคมีของ TFEB เป็นสื่อกลางในการกวาดล้าง a-synuclein แบบรวม โปรดหนึ่ง 2015; 10:e0120819; PMID:25790376; http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.pone.0120819

[28] Lee HJ, Khoshaghideh F, Patel S, Lee SJ. การกวาดล้างสารมัธยันตร์ a-synuclein oligomeric ผ่านทางวิถีการย่อยสลายของ lysosomal เจ Neurosci 2547; 24:1888-96; PMID:14985429; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.3809-03.2004