ผลการต่อต้านวัยของ Urolithin A ต่อไข่ไก่ในหลอดทดลอง

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและความผิดปกติของไมโตคอนเดรียเกี่ยวข้องกับอายุที่ลดลงของคุณภาพไข่และกลยุทธ์ในการป้องกัน Urolithin A (UA) เป็นสารเมตาโบไลต์ตามธรรมชาติที่มีผลโปรอะพอพโทติกและสารต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งสามารถป้องกันการสะสมของไมโตคอนเดรียที่ผิดปกติในเซลล์ที่มีอายุต่างกันได้ UA ไม่เคยได้รับการทดสอบในไข่ของวัว เป้าหมายของเราคือศึกษาผลของ UA ต่อศักยภาพการพัฒนาของคิวมูลัส-ไข่-คอมเพล็กซ์ (COC) และการแสดงออกของเซลล์แกรนูโลซา (GCs) ของยีนที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับความสามารถในการสืบพันธุ์ ความก้าวหน้าในการเจริญเต็มที่ของนิวเคลียส ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (MMP) และความสามารถในการพัฒนาของไข่ที่โตเต็มที่ทางสรีรวิทยา (22 ชั่วโมง) และโอโอไซต์ในหลอดทดลอง (30 ชั่วโมงของ IVM) ที่ได้รับจากสตรีก่อนวัยเจริญพันธุ์และผู้ใหญ่ที่เสริมด้วย UA หรือไม่ได้รับการประเมิน นอกจากนี้ ปริมาณของ mRNA ของยีนหลายตัว (NFE2L2, NQO1 และ mt-DN5) และจำนวนสำเนาดีเอ็นเอ mt-ND5 ถูกหาปริมาณใน GCs ที่เพาะเลี้ยงจากเพศหญิงก่อนวัยเจริญพันธุ์และผู้ใหญ่ ไม่ว่าจะเสริมด้วย UA หรือไม่ก็ตาม การศึกษาของเรายืนยันผลที่เป็นอันตรายของการแก่ของเซลล์ไข่ต่อความก้าวหน้าในการสุกของนิวเคลียร์ MMP ความสามารถในการพัฒนา และระดับการแสดงออกของยีน การรักษาด้วย UA ในระหว่างการสุกในหลอดทดลองได้รับการปรับปรุง (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

คำสำคัญ:ไข่; อายุ; ยูริลิน เอ; เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์

1. บทนำ

การลดลงของความสามารถในการสืบพันธุ์ของเพศหญิงเป็นหนึ่งในการทำงานทางสรีรวิทยาแรกๆ ที่ได้รับผลกระทบในทางลบจากอายุที่เพิ่มขึ้น และถือเป็นปัญหาสุขภาพที่เกิดขึ้นทั่วโลก [1,2] นอกจากปัญหาทางพยาธิวิทยาหลายประการแล้ว การลดลงที่เกี่ยวข้องกับอายุในการเจริญพันธุ์ของเพศหญิงส่วนใหญ่มาจากการลดลงของปริมาณสำรองของรังไข่ [1,3-5]ซึ่งสัมพันธ์กับการเสื่อมคุณภาพของไข่ตามเวลา [2] กระบวนการเสื่อมสภาพนี้สามารถเกิดขึ้นได้เนื่องจากการเปิดรับโอโอไซต์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของรังไข่ที่มีอายุก่อนการตกไข่ นอกจากนี้ เซลล์สืบพันธุ์เพศหญิงมักจะถูกทำให้แก่ก่อนวัยหลังการตกไข่เมื่อกระบวนการปฏิสนธิไม่เกิดขึ้นภายในช่วงระยะเวลาที่เหมาะสมที่สุด และเซลล์ไข่ที่ไม่ได้รับการปฏิสนธิจะยังคงอยู่ในท่อนำไข่หรือในหลอดทดลองเพื่อผสมเทียมเป็นระยะเวลานาน [6]การด้อยค่าของ คุณภาพของไข่เป็นปัจจัยสำคัญที่เกี่ยวข้องกับความล้มเหลวของเทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ (ART) เนื่องจากคุณภาพของไข่เป็นตัวกำหนดหลักสำหรับศักยภาพในการพัฒนาของตัวอ่อนหลังการปฏิสนธิ [7,8] บ่อยครั้งที่รายงานการตกไข่แบบอะซิงโครไนซ์และโอโอไซต์ที่เสื่อมลงทำให้ความสำเร็จของโปรแกรมการผสมเทียมและการผลิตตัวอ่อนในแม่ม้า วัวควาย และแกะลดลง ซึ่งแสดงถึงความสูญเสียทางเศรษฐกิจที่สำคัญ[1,9,10] ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญอย่างยิ่งที่จะต้องศึกษากลไกที่อยู่เบื้องหลังการชราของไข่ เพื่อออกแบบวิธีการรักษาที่ดีขึ้นเพื่อช่วยชีวิตการเจริญพันธุ์ในหลายสายพันธุ์ รวมทั้งมนุษย์ และยังเป็นเครื่องมือในการปรับปรุงพันธุกรรมในปศุสัตว์อีกด้วยcistanche wikungต้องให้ความสนใจเป็นพิเศษกับการปรับปรุงความสามารถในการพัฒนาของโอโอไซต์จากโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ ซึ่งมักใช้เพื่อเร่งการได้รับทางพันธุกรรมและย่นช่วงการสร้างให้สั้นลง

สาเหตุหลักประการหนึ่งของความสามารถในการพัฒนาที่บกพร่องในไข่ที่มีอายุมากขึ้นคือการเพิ่มขึ้นของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งทำให้เกิดความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย ความเสียหายของดีเอ็นเอ และข้อผิดพลาดในการสร้างแกนหมุน ซึ่งส่งผลต่อคุณภาพของไข่ [1] เป็นที่ทราบกันดีว่าการผลิตอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้นเป็นสาเหตุของการเสื่อมสภาพของเซลล์ในโรคเรื้อรังต่างๆ และในชีววิทยาการเจริญพันธุ์ด้วย ซึ่งส่งผลให้ภาวะเจริญพันธุ์ไม่ดี [12] สภาพแวดล้อมจุลภาคของรังไข่ ซึ่งรวมถึงเซลล์ไข่และเซลล์แกรนูลโลซา (GCs) ให้กลไกการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่สามารถควบคุมสภาวะออกซิเดชันและรักษาสมดุลของสารออกซิแดนท์/สารต้านอนุมูลอิสระ [13] อย่างไรก็ตาม ในระหว่างกระบวนการชราภาพ ประสิทธิภาพของการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระในการต่อต้านสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) จะลดลง จึงเป็นการเพิ่มระดับความเครียดออกซิเดชัน Nuclear factor-E2-related factor2(Nrf2 or NFE2L2) หรือที่รู้จักในชื่อ Nrf2/Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) เป็นลำดับการตอบสนองที่โดดเด่นซึ่งกระตุ้นโดยความเครียดออกซิเดชัน[14] วิถีทางนี้เป็นกลไกการป้องกันระดับเซลล์ที่เซลล์ได้พัฒนาขึ้นเพื่อรับมือกับผลกระทบที่เป็นอันตรายของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ภายใต้สภาวะปกติ Nrf2 ถูกควบคุมโดย Keap1 ในเชิงลบ ซึ่งอยู่ในไซโตพลาสซึมและคงระดับที่ต่ำ เมื่อสัมผัสกับสารออกซิแดนท์ Nrf2 จะถูกแยกออกจาก Keapl ทำให้มีการเคลื่อนย้ายในนิวเคลียสซึ่งจับกับลำดับ DNA ที่เฉพาะเจาะจง ลำดับเหล่านี้ ตั้งชื่อองค์ประกอบการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) นำไปสู่การกระตุ้นการถอดรหัสของยีนที่ปกป้องเซลล์ เช่น NAD(P)H:quinone-oxidoreductase-1 (NQO1), heme oxygenase-1 (HMOX1) และหน่วยย่อยตัวเร่งปฏิกิริยากลูตาเมต-ซิสเทอีน ลิเกส (GCLC)[15,16] การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น Nrf2-เส้นทางการส่งสัญญาณ Keapl ช่วยลดความเสียหายจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดยการยกระดับสารต้านอนุมูลอิสระใน GCs ของมนุษย์และรังไข่ของเมาส์[17,18] อย่างไรก็ตาม บทบาทของมันในกระบวนการชราของ gamete ของผู้หญิงยังคงเข้าใจยาก แม้ว่าจะมีการระบุชัดเจนว่าไมโตคอนเดรียเป็นแหล่งผลิตหลักสำหรับ ROS ในระหว่างกระบวนการนี้ [9,10]

KSL02

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

ในทางกลับกัน ไมโตคอนเดรียมีส่วนเกี่ยวข้องกับหน้าที่ของเซลล์ที่สำคัญหลายอย่าง และเป็นพื้นฐานสำหรับการตอบสนองความต้องการในการผลิตพลังงานที่จำเป็นในระหว่างการเจริญเติบโตของไข่และการพัฒนาของตัวอ่อนในภายหลัง [19] กิจกรรมของไมโตคอนเดรียที่มีความสามารถมีความเกี่ยวข้องอย่างมากกับเนื้อหาของไมโตคอนเดรีย DNA (mt-DNA) และการสร้าง ATP ที่สูงขึ้น [20] ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่สูงขึ้น [21] และการรักษาคุณภาพและปริมาณของไมโตคอนเดรียผ่านไมโทฟาจี [22] นอกจากนี้ กิจกรรมยลยังได้รับการแนะนำว่ามีความสัมพันธ์โดยตรงกับความมีชีวิตของตัวอ่อนและผลการเจริญพันธุ์ที่ดีขึ้น [23] หลักฐานที่เพิ่มขึ้นสนับสนุนว่าการเปลี่ยนแปลงของไมโตคอนเดรียที่เกี่ยวข้องกับอายุทำให้เกิดการแก่ของรังไข่ และทำให้ความสามารถในการดำรงชีวิตของตัวอ่อนลดลงและศักยภาพในการฝังตัวในเวลาต่อมา การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้รวมถึงจำนวนสำเนา mt-DNA ที่ลดลง การสร้าง ATP ที่ลดลง [20] การเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนยล [24, ความเสียหายของ mt-DNA [25] และศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่ลดลง [26]

KSL03

วิธีการรักษาที่มุ่งเป้าไปที่ไมโตคอนเดรียทำให้เกิดความสนใจอย่างมากในหลายโรคที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ เนื่องจากมีศักยภาพที่ดีในการเสริมสร้างการทำงานของไมโตคอนเดรีย [27] ภายในกรอบนี้ Urolithin A (UA) ซึ่งเป็นสารเมแทบอไลต์ตามธรรมชาติที่ได้รับหลังจากการกลืนกินเข้าไป เช่น ทับทิม ตามด้วยการเปลี่ยนแปลงโดยจุลินทรีย์ในลำไส้ ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถป้องกันการสะสมของไมโตคอนเดรียที่ไม่สมบูรณ์ตามอายุ กระตุ้นการเกิดไมโทฟาจี และยังช่วยรักษาไมโตคอนเดรียอีกด้วย biogenesis และความสามารถในการหายใจ [28,29]. UA ถูกใช้เป็นยารักษาที่มีแนวโน้มว่าจะป้องกันมะเร็งบางชนิด เช่น มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก[30,31] นอกจากนี้ UA ยังมีสารต้านการอักเสบ [32] ป้องกันโรคอ้วน [33] สารต้านอนุมูลอิสระ [34] และคุณสมบัติต่อต้านริ้วรอย [35]ไบโอฟลาโวนอยด์ส้มการศึกษาล่าสุดได้เน้นถึงผลกระทบของการเสริม UA ต่อไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ที่ชราต่อการกระตุ้นของ Nrf2-วิถี Keapl ที่ช่วยเพิ่มความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของพวกมัน การกระตุ้นเส้นทาง Nrf2-Keapl นี้ช่วยลดระดับ ROS ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยผ่านการควบคุมการแสดงออกของยีนที่ตอบสนองต่อยีน Nrf2 ดาวน์สตรีม (SOD, NQO1, GCLC และ HMOX1) ซึ่งบ่งชี้ถึงผลการต่อต้านริ้วรอยที่มีแนวโน้มดี [ 35].

KSL04

มีการศึกษาหลายชิ้นโดยมีเป้าหมายเพื่อชะลอการแก่ของรังไข่ ส่งผลให้คุณภาพไข่และผลการเจริญพันธุ์ดีขึ้น เนื่องจากการมีส่วนสนับสนุนของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันต่อกระบวนการชราของรังไข่ เช่นเดียวกับความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย การเสริมด้วยสารต้านอนุมูลอิสระจึงกลายเป็นวิธีการรักษาที่มีแนวโน้มดี [36,37] อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่าการเสริม Urolithin A อาจฟื้นฟูความเสียหายที่เกิดขึ้นระหว่างอายุของรังไข่ซึ่งช่วยป้องกันปัญหาภาวะมีบุตรยากได้หรือไม่ ดังนั้น จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือ (1) เพื่อแสดงให้เห็นว่าการสูงวัยสามารถเปลี่ยนแปลงศักยภาพการพัฒนาของคิวมูลัส-ไข่ คอมเพล็กซ์ (COC) และการแสดงออกของยีนที่สำคัญของ GCs ที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2 (2) เพื่อพิจารณาว่า UA สามารถช่วยชีวิตได้หรือไม่ ภาวะเจริญพันธุ์ของเพศหญิงแสดงให้เห็นถึงผลการต่อต้านริ้วรอยใน COCs และ GCs สูงอายุ และ (3) เพื่อประเมินผลกระทบของ UA ต่อระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2 เช่นเดียวกับคุณภาพของไข่

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การออกแบบทดลอง

การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลสัตว์ของ National Veterinary Authority (ระดับ N 08965DGAV) ตามแนวทางของสหภาพยุโรป (หมายเลข86/609/EEC) เพื่อตรวจสอบผลกระทบของการแก่ชราต่อการเปลี่ยนแปลงคุณภาพของไข่และผลการต่อต้านริ้วรอยที่อาจเกิดขึ้นของ UA แบบจำลองที่ใช้ COC ที่รวบรวมจากโคก่อนวัยเจริญพันธุ์และที่โตเต็มวัยที่ส่งไปยังการแก่ก่อนวัย (30 ชั่วโมงของการเจริญเติบโต) หรือการเจริญเติบโตทางสรีรวิทยา (22 h) กระบวนการถูกนำไปใช้

2.1.1.การทดสอบก่อนหน้า—การศึกษาการตอบสนองต่อปริมาณยา

การทดสอบก่อนหน้านี้เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของ UA ที่ควรใช้ในระหว่างกระบวนการสุกเต็มที่ COCs ของวัวได้ดำเนินการตามการศึกษาการตอบสนองต่อขนานยาในสี่ช่วง เนื่องจากไม่เคยมีการทดสอบ UA ในไข่ของวัว ปริมาณก่อนหน้านี้จึงประสบความสำเร็จในการป้องกันและบรรเทามะเร็งบางชนิด และเพื่อแสดงให้เห็นถึงผลการต่อต้านริ้วรอยของ UA ในเซลล์ต่างๆ จึงถูกนำมาใช้ [28,39] COC ที่ได้จากโคที่โตเต็มวัยและโคที่โตเต็มวัย (n=978) ถูกเลือกและจากนั้นแบ่งสุ่มออกเป็นห้ากลุ่มเพื่อทดสอบขนาดยาที่แตกต่างกันของ UA: กลุ่มควบคุม 1,10,25 และ 50 ไมโครโมลาร์ ระหว่างการสุกในหลอดทดลองทางสรีรวิทยา หลังจากระยะการเจริญเติบโตเต็มที่ ไข่บางส่วน (n=154) ถูกย้อมสีเพื่อกำหนดโครงร่างของโครโมโซมและระยะการเจริญเติบโต โอโอไซต์ที่โตเต็มที่ที่เหลือถูกส่งไปยังการผสมเทียมภายนอกร่างกายด้วยน้ำอสุจิแช่แข็ง/ละลาย ไซโกตที่สันนิษฐานไว้ก่อนถูกเพาะเลี้ยง และกำหนดอัตราความแตกแยกและบลาสโตซิสต์ในวันที่ 2 และวันที่ 7 ของการเพาะเลี้ยง ตามลำดับ จากผลลัพธ์ที่ได้ กล่าวคือ ไม่มีผลร้ายและส่งเสริมการเจริญเติบโตและการพัฒนาบลาสโตซิสต์ ความเข้มข้น 1 uM ของ UA ถูกเลือก

2.1.2.การทดลอง1

ในการทดลองนี้ ดำเนินการในหกเซสชัน ทั้ง COC จากวัยเจริญพันธุ์ (อายุเฉลี่ย=9 เดือน, n=660) และผู้ใหญ่ (อายุเฉลี่ย =39เดือน, น=674) รวบรวมวัวเพื่อประเมินคุณภาพของไข่และศักยภาพในการพัฒนาของไข่ที่มีอายุและที่เจริญเต็มที่ทางสรีรวิทยา รวมทั้งผลของ UA ในการช่วยชีวิตการเจริญพันธุ์ของเพศหญิง COC ถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 8 กลุ่ม: (1) กลุ่มก่อนวัยแรกรุ่นควบคุม, COC จากลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์เป็นเวลา 22 ชม. (n=148); (2)กลุ่มก่อนวัยแรกรุ่น UA, COC จากลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วย 1 ไมโครโมลาร์ของ UA เป็นเวลา 22 ชั่วโมง (n=155); (3) ควบคุมกลุ่มก่อนวัยแรกรุ่นที่มีอายุ 30 ชั่วโมง, COC จากลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์จนถึง 30 ชั่วโมงของการสุกของไข่ขาว (n=149); (4) UA อายุ 30 ชั่วโมง กลุ่มก่อนวัยเจริญพันธุ์, COC จากลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ซึ่งมีอายุในหลอดทดลองเป็นเวลา 30 ชม. ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วย 1 uM ของ UA(n=144);(5) กลุ่มผู้ใหญ่ที่ควบคุม, COC จากโคที่โตเต็มวัยเป็นเวลา 22 ชม. (n=155 );(6) กลุ่มผู้ใหญ่ UA, COC จากวัวที่โตเต็มวัยในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วย UA 1 uM เป็นเวลา 22 ชั่วโมง (n=129);(7) กลุ่มควบคุมอายุ 30 ชั่วโมง, COC จากโคที่โตเต็มวัยจนถึง 30 ชั่วโมงในการเจริญเติบโตของ oitro (n=148); และ (8) กลุ่มผู้ใหญ่ UA อายุ 30 ชั่วโมง COC จากโคที่โตเต็มวัยใน oitro เป็นเวลา 30 ชั่วโมงในอาหารที่ทำให้สุกเต็มที่เสริมด้วย UA(n=138) 1 ไมโครโมลาร์ประโยชน์ของไซโนโมเรียมหลังจากช่วงการสุกในหลอดทดลองตามลำดับ เซลล์ไข่ถูกผสมเทียมด้วยน้ำอสุจิจากวัวตัวผู้ที่ละลายแล้ว จากนั้นจึงประเมินพัฒนาการของตัวอ่อน โดยประเมินทั้งอัตราการแยกตัวและกำเนิดตัวอ่อน ตลอดจนคุณภาพของตัวอ่อน

นอกจากนี้ ในการทดลองนี้ COC จากแต่ละกลุ่มถูกดึงมาเพื่อประเมินระยะการสุกของนิวเคลียร์ของพวกมัน (กลุ่มควบคุมก่อนวัยเจริญพันธุ์ n=7;UA ก่อนวัยเจริญพันธุ์ n =7; กลุ่มควบคุมอายุ 30 ชั่วโมงก่อนวัยอันควร, n{ {3}}; UA อายุ 30 ชั่วโมงก่อนวัยแรกรุ่น, n=6; กลุ่มผู้ใหญ่ควบคุม, n=16; กลุ่มผู้ใหญ่ UA, n=21; กลุ่มผู้ใหญ่อายุ 30 ชั่วโมงควบคุม, n{ {9}}; กลุ่มผู้ใหญ่ UA อายุ 30 ชั่วโมง n=18) ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (MP) ของ COC ยังได้รับการประเมินอีกด้วย (กลุ่มก่อนวัยเจริญพันธุ์กลุ่มควบคุม n=10; กลุ่มก่อนวัยเจริญพันธุ์ UA, n{ {13}};กลุ่มควบคุมก่อนวัยอันควร 30 ชั่วโมง, n=9;UA อายุ 30 ชั่วโมงกลุ่มก่อนวัยเจริญพันธุ์,n=9;กลุ่มผู้ใหญ่ควบคุม n=15; กลุ่มผู้ใหญ่ UA, n{ {19}}; กลุ่มผู้ใหญ่อายุ 30 ชั่วโมงควบคุม, n=10; กลุ่มผู้ใหญ่ UA อายุ 30 ชั่วโมง, n=14)

2.1.3.การทดลอง2

เนื่องจาก GCs มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตของฟอลลิคูลาร์และการพัฒนาโอโอไซต์ การทดลองครั้งที่สองจึงดำเนินการในห้าช่วงเพื่อศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลกระทบของอายุและ UA ต่อการแสดงออกของ NFE2L2, NQO1 และ mt-ND5 นอกจากนี้ยังประเมินจำนวนสำเนาของยีน mt-ND5 ได้รับ GCs หลังจากการปั่นเหวี่ยงของไหลฟอลลิคูลาร์ที่ดูดจากรังไข่ในวัยเจริญพันธุ์ (อายุเฉลี่ย=10 เดือน) และโคที่โตเต็มวัย (อายุเฉลี่ย =62เดือน) เซลล์เหล่านี้ได้รับการเพาะเลี้ยงในสภาวะต่อไปนี้:(1)กลุ่มควบคุมก่อนวัยอันควร การเพาะเลี้ยง GCs ของลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์; (2) ก่อนวัยอันควร UA การเพาะเลี้ยง GC ของโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ที่เสริมด้วย 1 uM UA (3) การควบคุมของผู้ใหญ่ การเพาะเลี้ยง GC ของโคที่โตเต็มวัย และ (4) UA สำหรับผู้ใหญ่ วัฒนธรรมของ GCs ของโคผู้ใหญ่ที่เสริมด้วย 1 uM UA หลังจากการบรรจบกันของ GCs ในวันที่ 5 ของการเพาะเลี้ยง พวกมันจะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว และต่อมามีการสกัด DNA และ RNA ซึ่งทำให้สามารถหาปริมาณที่ตามมาของการถอดรหัส NFE2L2, NQO1 และ mt-ND5 mRNA และหมายเลขสำเนา mt-ND5 ด้วย

2.2. การเก็บไข่และการเจริญเติบโตในหลอดทดลอง

รังไข่จากโคที่โตเต็มวัยและโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ (การทดสอบก่อนหน้า n {0}} และประสบการณ์ 1, n=1334) ถูกรวบรวมที่โรงฆ่าสัตว์ในท้องถิ่น และเก็บไว้ที่ 35-37 องศา ใน น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ที่เสริมด้วย 0.15 เปอร์เซ็นต์ของอัลบูมินในซีรัมของวัว (w/v, BSA) ที่เสริมด้วยกานามัยซิน 0.05 มก./ลิตร ที่ห้องปฏิบัติการ รูขุมขนของรังไข่ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 2-8 มม. ถูกดูดด้วยเข็มวัดขนาด 19- เฉพาะ COC ที่มีเซลล์คิวมูลัสขนาดกะทัดรัดอย่างน้อยสามชั้นและอูพลาสมาที่เป็นเนื้อเดียวกันเท่านั้นที่ถูกล้างและเลือกเพื่อการเจริญเต็มที่ตามการออกแบบการทดลองผักตบชวาทะเลทรายการทำให้สุกเต็มที่ในตู้ฟักที่ 38.8 องศา , 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ในอากาศชื้นเป็นเวลา 22 หรือ 3{8}} ชั่วโมงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ 199 (TCM) ที่มีซีรั่มวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, โซเดียม 0.2 มิลลิโมลาร์ pyruvate, 10 ng mL-l ของปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังชั้นนอกและ 10 μL mL-l ของ gentamicin 【40】

2.3.การรวบรวมและการเพาะเลี้ยงเซลล์ Granulosa

เซลล์แกรนูโลซาได้มาจากของไหลฟอลลิคูลาร์ที่กู้คืนหลังการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 200x ก.[41] เม็ดถูกแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเชื้อ 1 มิลลิลิตร (TCM199 บวกซีรัม 10 เปอร์เซ็นต์) เพื่อทำการปั่นแยกอื่นเป็นเวลา 5 นาที เม็ดใหม่ถูกแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ 1 มล. ทั้งที่เสริมด้วย UA 1 ไมโครโมลาร์หรือไม่ตามการออกแบบการทดลองและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยหลอดฉีดยาที่ติดอยู่กับเข็ม 19G อย่างน้อย 30 ครั้งเพื่อแยกเซลล์ออก หลังจากการประเมินความมีชีวิตของ GC (สีย้อมทรีแพนสีน้ำเงิน 0.4 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร) เซลล์ถูกเพาะที่ความเข้มข้น 2×105 เซลล์ที่มีชีวิต มล.-1 และเพาะเลี้ยงเป็นเวลาห้าวันที่ 38.8 องศา, 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ในความชื้น บรรยากาศจนถึงจุดบรรจบ ทุกๆ 48 ชั่วโมง สื่อเพาะเลี้ยงจะถูกระบายออกและรีเฟรชด้วยอาหารใหม่ สำหรับการสกัด DNA และ RNA GCs ถูกรวบรวมและล้างโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 200x g เป็นเวลา 10 นาที เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน 1 มล. ของ PBS, แช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ -80 องศา

2.4. การสุกของนิวเคลียสของไข่

ระยะการเจริญเต็มที่ของนิวเคลียร์ได้รับการประเมินหลังจากช่วง 22 ชั่วโมงหรือ 30 ชั่วโมงของการสุกในหลอดทดลองวิธีการสกัดฟลาโวนอยด์ pdfโอโอไซต์ที่ถูกกำจัดถูกตรึงในสารละลายกรดอะซิติก/เอทานอล (1:3, v/v) และคงสภาพที่ 4 องศาเป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นโอโอไซต์ถูกย้อมด้วยสารละลายอะซีโต-แลคมอยด์ 1 เปอร์เซ็นต์ ติดตั้งในห้องนอยบาวเออร์ และสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ (Olympus BX41) เซลล์ไข่แบ่งได้ดังนี้ Germinal Vesicle(GV), Condensing Chromo-somes I (CCI), Condensing Chromosomes II(CCII), Diakinesis, Anaphase-I/Telophase-I (AI/TI) และ MII (Metaphase-II) . โดยพิจารณาเฉพาะเซลล์ไข่ที่มีการย้อมสีโครมาตินที่มองเห็นได้ [42]

2.5. การประเมินศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย

เพื่อวัดศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (MP) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้การออกฤทธิ์ของไมโตคอนเดรีย ไมโทคอนเดรียถูกย้อมด้วย 5, 6, 6'-เตตระคลอโร-1, 1', 3, 3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ไอโอไดด์ (JC-1 , อินวิโทรเจน, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา). โอโอไซต์ที่ถูกกำจัดถูกบ่มด้วย 5 ไมโครกรัม มิลลิลิตร-ลิตรของ JC-1 [37] ในตัวกลางในการทำให้สุกเป็นเวลา 30 นาทีที่ 38.8 องศาและ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในอากาศที่ทำให้ชื้นในที่มืด ไข่ถูกล้างสองครั้งใน PBS และถ่ายโอนทันทีไปยังกระจกสไลด์ที่อุ่นล่วงหน้าและสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Olympus BX51) โดยใช้ตัวกรองเรืองแสงสีน้ำเงิน (BP 470-490 วัตถุประสงค์ UPlanFI 20×/0.50) จากนั้นคำนวณศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียเป็นอัตราส่วนของการเรืองแสงสีแดง/เขียวที่วัดได้โดยใช้ซอฟต์แวร์ Image] (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) 2.6.การปฏิสนธินอกร่างกายและการเพาะเลี้ยงตัวอ่อน

ทำการปฏิสนธินอกร่างกายด้วยอสุจิที่ละลายน้ำแข็งของโคโฮลสไตน์-ฟรีเซียน ซึ่งก่อนหน้านี้ส่งไปยังการเก็บประจุโดยใช้วิธี Percoll gradient (45 และ 90) ที่ความเข้มข้น 2 x 10 องศาของตัวอสุจิ mL-4.COCs และ สเปิร์มถูกฟักร่วมกันเป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 38.8 องศาและ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ในอากาศที่มีความชื้น จากนั้นจึงย้ายไซโกตที่สันนิษฐานไว้ก่อนไปยังหยดของสื่อของเหลวเกี่ยวกับไข่สังเคราะห์ (SOF) ที่เสริมด้วยกรดอะมิโน BME และ MEM กลูตามีน กลูตาไธโอน และบีเอสเอ [40] หลังจาก 48 ชั่วโมงของการผสมเทียม อัตราการแตกแยก (ตัวอ่อนที่แยกต่อเซลล์ไข่ที่ผสมครึ่งแล้วทั้งหมด) ถูกส่งผ่าน และตัวอ่อนที่แยกออกถูกคงไว้ใน SOF ที่เสริมด้วย BSA และ 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมวัวในครรภ์ (FBS) เพาะเลี้ยงตัวอ่อนเป็นเวลา 12 วัน [41,43] เพื่อประเมินอัตราการพัฒนาของตัวอ่อนบลาสโตซิสต์ (ที่ 7,9 และ 12 วัน; ตัวอ่อน D7 ต่อตัวอ่อนที่แยกออก) และอัตราการฟักตัวของตัวอ่อน (ตัวอ่อนที่ฟักตัวต่อตัวอ่อน D7) และคุณภาพของพวกมัน [43] วันที่ 7 เอ็มบริโอจัดเป็นเกรด 1 (คุณภาพดี), 2 (คุณภาพพอใช้) และเกรด 3 (คุณภาพไม่ดี)[4]

2.7.DNA และ RNA การสกัดและการหาปริมาณ

DNA และ RNA ทั้งหมดแยกได้จาก GCs โดยใช้ High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Switzerland) และ PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) ตามลำดับ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โปรโตคอลเหล่านั้นรวมถึงการใช้คอลัมน์สปินที่ใช้ในการแยก DNA และ RNA และ DNase ทั้งหมดคุณภาพสูงออกเป็นการบำบัดเพื่อกำจัดจีโนม DNA ออกจาก RNA [40] หลังจากการสกัด ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ที่ -80 องศา ความเข้มข้นและคุณภาพของ DNA และ RNA ถูกกำหนดโดยใช้ NanoDropTM One/OneC Spectrophotometer (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA)

2.7.1. การสังเคราะห์ DNA เสริม

การสังเคราะห์ DNA เสริม (cDNA) จากอาร์เอ็นเอไอโซเลตดำเนินการโดยใช้ Xpert cDNA Synthesis Mastermix kit (GRiSP, ปอร์โต, โปรตุเกส ตามคำแนะนำของผู้ผลิต RNA ถูกคัดลอกย้อนกลับโดยใช้ RNA ที่สกัดได้ 500 ng จากแต่ละตัวอย่างเพื่อทำการสังเคราะห์ cDNA ซึ่งดำเนินการโดยใช้เทอร์โมไซเลอร์ (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) cDNA ที่เป็นผลลัพธ์ถูกเก็บไว้ที่ -20 องศาจนกว่าจะใช้สำหรับการทดสอบต่อไป 2.7.2.Primer Design

สำหรับการศึกษานี้ ไพรเมอร์สำหรับกลุ่มเป้าหมาย (NFE2L2 และ NQO1) และยีนควบคุมภายใน (6-แอกติน) ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer-BLAST ของศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,เข้าถึงเมื่อ 6 มีนาคม 2020) ลำดับของไพรเมอร์สำหรับยีนอ้างอิงและยีนเป้าหมายถูกแสดงไว้ในตารางที่ 1 นอกจากนี้ ยีน mt-ND5 ยังถูกใช้ในงานนี้ และรายละเอียดเกี่ยวกับไพรเมอร์ mt-ND5 ถูกดึงมาจากการศึกษาครั้งก่อน [45]

2.7.3.ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ

การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X กับ ROX ในเทอร์โมไซเคิล QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA) โดยใช้ cDNA ที่ความเข้มข้น 25 ng uL-l การประเมิน mitochondrial DNA (mt-DNA) คัดลอกหมายเลขของยีน ND5 ดำเนินการโดย qPCR ผ่าน DNA ที่สกัดก่อนหน้านี้ โดยใช้อุปกรณ์เดียวกันกับการหาปริมาณของยีน แต่ละปฏิกิริยาที่ปรับให้เหมาะสมถูกดำเนินการ ซึ่งประกอบด้วย Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X พร้อม ROX, ไพรเมอร์ (ไปข้างหน้าและย้อนกลับ) ของยีนเป้าหมายแต่ละยีน ตัวอย่าง (cDNA/DNA) และน้ำที่ปราศจาก RNase รวมกันเป็น 10 ไมโครลิตร ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ซ้ำกันและปฏิกิริยาที่มีน้ำแทนแม่แบบถูกรวมไว้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ ตัวอย่างได้รับโปรโตคอลการขยายสัญญาณที่ประกอบด้วยรอบเริ่มต้นที่ 95 องศาเป็นเวลา 2 นาทีของเฟสการทำให้เสียสภาพ ตามด้วย 40 รอบการเสื่อมสภาพที่ 95 องศาสำหรับ 55 วินาที, รอบการหลอม 40 รอบเป็นเวลา 30 วินาที ที่ 60 องศา (ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิหลอมเหลวของ ลำดับไพรเมอร์) และระยะการขยายที่ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาที และสุดท้าย ระยะการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเป็นเวลา 10 นาที

สำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของยีน ใช้วิธีการหาปริมาณสัมพัทธ์ วิธีการหาปริมาณสัมพัทธ์ของการแสดงออกของยีนนี้ดำเนินการด้วยระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายภายใต้การศึกษา ซึ่งถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยยีนการดูแลทำความสะอาด โดยวิธีเปรียบเทียบ CT เนื่องจากการขยายสัญญาณโดย RT-qPCR ถูกดำเนินการซ้ำกัน ค่า CT เฉลี่ยสำหรับแต่ละยีนถูกกำหนดหาและระดับการแสดงออกถูกคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

โดยที่ △Ct=Ct ยีนเป้าหมาย -Ct ยีนควบคุมภายใน

สำหรับการหาปริมาณของจำนวนสำเนา mt-DNA การหาปริมาณสัมพัทธ์ทำให้เป็นมาตรฐานเทียบกับวิธีมวลต่อหน่วย วิธีนี้ดำเนินการด้วยค่า CT ของ GCs ที่บำบัดด้วย UA (เรียกว่าการทดสอบ) ซึ่งถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยตัวอย่างควบคุม (ปัจจุบันถูกกำหนดให้เป็นเครื่องสอบเทียบ) เนื่องจากหมายเลขสำเนา mt-ND5 ได้รับการประเมินโดย qPCR และดำเนินการซ้ำกัน ค่า CT เฉลี่ยสำหรับตัวอย่างการทดสอบและเครื่องมือสอบเทียบถูกกำหนดหาและคำนวณอัตราส่วนโดยใช้สูตรต่อไปนี้: