ฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอยและไทโรซิเนสของสารสกัดบิวทาโนลิกจากดอก Cassia Fistula ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง: ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ผลิตจากพืชได้ถูกนำมาใช้ในเครื่องสำอางที่หลากหลาย เป็นแหล่งของสารอาหารและเป็นสารฟอกสีฟัน ดอกของ Cassia fistula L วงศ์ Fabaceae ถูกนำมาใช้เป็นยาแผนโบราณสำหรับโรคผิวหนังและการรักษาบาดแผล และมีรายงานว่ามีคุณสมบัติในการต่อต้านอนุมูลอิสระ การศึกษาฤทธิ์ต้านความชราของสารสกัดจากดอก C. fistula ต่อไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และสามารถกำจัดสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา ป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่ประโยชน์ของทะเลทราย Cistanche

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

วิธีการ: การสกัดบิวทานอลของดอก C. fistula เสร็จสิ้นและจำแนกสารออกฤทธิ์ ความเป็นพิษต่อเซลล์ของไฟโบรบลาสต์ได้รับการประเมินโดยการทดสอบ SRB เพื่อเลือกปริมาณที่ไม่เป็นพิษสำหรับการทดลองเพิ่มเติม จากนั้นวัดการสังเคราะห์คอลลาเจนและกรดไฮยาลูโรนิก (HA) โดยใช้ชุดคอลลาเจนและ ELISA ตามลำดับ นอกจากนี้ยังประเมินการทำงานของเอนไซม์ ซึ่งรวมถึงคอลลาจีเนส เมทริกซ์เมลโลโปรตีนเนส-2 (MMP-2) และไทโรซิเนส

ผลลัพธ์: พบว่าสารสกัดจากดอกไม่มีผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนัง (IC50 > 200 ug/mL) ผลการวิจัยพบว่าสารสกัดจากดอกไม้ช่วยเพิ่มการสังเคราะห์คอลลาเจนและ HA อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา สารสกัดจากดอกไม้ (50–200 มก./มล.) ยังยับยั้งการทำงานของคอลลาเจนเนสและ MMP-2 อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ สารสกัดจากดอกไม้ชนิดนี้ยังสามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสที่เป็นสาเหตุของการสร้างเม็ดสีผิวมากเกินไป ซึ่งกระตุ้นให้เกิดริ้วรอยแห่งวัย

ข้อสรุป: สารสกัดจากดอก C. fistula แสดงผลการป้องกันเมื่อใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการต่อต้านริ้วรอยในเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ และอาจเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมสำหรับผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางที่มีเป้าหมายเพื่อให้ผลไวท์เทนนิ่ง และถูกกำหนดให้เป็นผลิตภัณฑ์ดูแลผิวหน้าต่อต้านริ้วรอย .

คำหลัก: Collagenase, การสังเคราะห์คอลลาเจน, Glycosaminoglycan, Hyaluronic acid, Matrix metalloproteinase

พื้นหลัง

ความชราของผิวหนังเป็นความก้าวหน้าทางชีวเคมีที่ซับซ้อนซึ่งเป็นผลมาจากปัจจัยทั้งภายในและภายนอก เช่น อายุ ฮอร์โมน และการสัมผัสแสงยูวี [1] การลุกลามเกิดขึ้นในชั้นหนังกำพร้าและผิวหนัง และส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการสลายตัวของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) [2] เอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลาย ECM คือเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีนเนส (MMPs) เช่น เจลาติเนส (MMP-2) และคอลลาจิเนส [3] ผิวหนังสูญเสียความต้านทานแรงดึงเนื่องจากผลกระทบของการสลายตัวของ ECM โดย MMP ในกระบวนการนี้ รอยย่นของผิวหนังจะเกิดขึ้น และความหยาบและความแห้งก็เกิดขึ้นอย่างชัดเจนพร้อมกับความผิดปกติของเม็ดสีบางอย่าง เช่น เม็ดสีน้อยเกินไปหรือมากเกินไป [2, 4] สำหรับการรักษารอยดำนั้นได้ทำการตรวจสอบสารยับยั้งไทโรซิเนส ไทโรซิเนสเป็นเอนไซม์จำกัดอัตราที่เปลี่ยนไทโรซีนเป็นเมลานิน [5] สารยับยั้งไทโรซีนจึงมีบทบาทสำคัญในฐานะสารทำให้ผิวกระจ่างใส [6] ในขณะที่การสังเคราะห์กรดไฮยาลูโรนิก (HA) จะควบคุมความชุ่มชื้นของผิวและการเกิดริ้วรอย HA ซึ่งเป็นไกลโคซามิโนไกลแคนที่ไม่ซัลเฟต (GAG) ประกอบด้วยหน่วยซ้ำของไดแซ็กคาไรด์ รวมทั้งกรด D-กลูโคโรนิก และ N-อะซีติล-ดีกลูโคซามีน [7] HA ยังควบคุมการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ รวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยการกระตุ้นเซลล์อักเสบและการตอบสนองต่อการบาดเจ็บของไฟโบรบลาสต์ [8–10]

ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ทำจากพืชเช่น Glycyrrhiza glabra [11] หรือชาเขียว [12] ถูกนำมาใช้ในเครื่องสำอางเป็นแหล่งของสารอาหารและเป็นตัวแทนไวท์เทนนิ่ง หลักฐานจำนวนมากชี้ให้เห็นถึงผลประโยชน์ของไฟโตเคมิคอลจากสารสกัดจากพืชที่รับประทานหรือทาเฉพาะที่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการปรับปรุงสภาพผิว ตัวอย่างบางส่วนของผลประโยชน์คือสามารถลดความชราของผิวหนังและการอักเสบของผิวหนังได้ C. fistula (golden shower) วงศ์ Fabaceae พบในหลายประเทศในเอเชีย เช่น ไทย จีน พม่า และอินเดีย ในการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าสารสกัดจากดอก C. fistula มีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง ต้านแบคทีเรีย ต้านเชื้อรา และต้านเบาหวาน [13, 14] ผลของ C. fistula ในการแพทย์อายุรเวทเป็นที่รู้กันว่าเกี่ยวข้องกับการรักษาความผิดปกติต่างๆ รวมถึงโรคผิวหนัง โรคเรื้อน โรคโลหิตจาง อาการคัน และโรคเบาหวาน [15, 16] ส่วนต่างๆ ของ C. fistula มีคุณสมบัติทางเภสัชวิทยา [17] ดอก เมล็ด ผล และเยื่อใช้รักษาโรคผิวหนังรวมทั้งโรคเรื้อน [18] เยื่อกระดาษได้รับการยอมรับว่ามีสรรพคุณในการต้านเบาหวาน [15] และถูกนำมาใช้ในยาชูกำลังซึ่งใช้ในการรักษาโรคเกาต์และโรคไขข้อ [19] ใบและฝักสุกใช้เป็นยาระบาย [20, 21] มีรายงานว่าฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์ไฟโตเคมิคอลของ C. fistula มีประโยชน์ในการรักษาโรคผิวหนัง [14] ดังนั้นในการศึกษานี้เราจึงสนใจบทบาทของสารสกัดจากดอกกระบองเพชรในเวชสำอาง มีการตรวจสอบผลการป้องกันของการเสื่อมสลายของ ECM พร้อมกับเอ็นไซม์อายุของผิวหนังที่รวมถึงกิจกรรมของคอลลาเจนเนสและ MMP-2 รวมทั้งไทโรซิเนส นอกจากนี้ยังมีการพิจารณาการสังเคราะห์คอลลาเจนและ HA

วิธีการ

สารเคมีและน้ำยา

Modified Eagle Medium (DMEM), DQ gelatin และ penicillin-streptomycin ของ Dulbecco ได้รับการจัดหาจาก Gibco (Grand Island, NY, USA) Fetal bovine serum (FBS) จัดหามาจาก Thermo Scientific (USA) ชุดย้อมสีคอลลาเจน Sirius Red/Fast Green ซื้อมาจาก Chondrex, Inc. (Redmond, WA, USA) Sulforhodamine B reagent, hyaluronic acid, และ mushroom tyrosinase ได้มาจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)

วัสดุปลูก

ดอกค.ทวารได้มาจากศูนย์อนุรักษ์สมุนไพรลำปาง จังหวัดลำปาง ประเทศไทย หมายเลขตัวอย่างใบสำคัญ (023197) รับรองโดย วรรณรี เจริญทรัพย์ นักพฤกษศาสตร์ พรรณไม้ พรรณไม้แห่งประเทศไทย คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ ประเทศไทย

การเตรียมสารสกัดจากดอกขี้เหล็กทวาร

นำดอกค.ทวารมาทำให้แห้งในห้องที่มีอากาศถ่ายเท แล้วนำดอกแห้ง 500 กรัมมาบดละเอียดเป็นผง หลังจากนั้นนำผงไปแช่ในเอทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ แล้วเขย่าที่ 70 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ตัวอย่างจะถูกกรองผ่านกระดาษกรองเพื่อแยกกากออก นำส่วนที่เหลือไปแช่ในเอทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ และเขย่าที่ 70 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และทำซ้ำขั้นตอนนี้ 2 ครั้ง ตัวอย่างที่กรองแล้วถูกรวมเข้าด้วยกันและระเหยด้วยเครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน (BUCHI สวิตเซอร์แลนด์) เพื่อให้ได้เศษส่วนของน้ำ เติมเฮกเซนลงในส่วนที่เป็นน้ำในอัตราส่วนเฮกเซน 2:1 ตัวอย่างถูกเขย่าและปล่อยให้แยกออกจากกันนานกว่า 30 นาที แยกตัวอย่างออกเป็นสองส่วนคือส่วนเฮกเซนและส่วนน้ำ จากนั้นเก็บเศษส่วนของน้ำและเติมถ่าน 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาทีโดยกวนเบาๆ ที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกกรองผ่านกระดาษกรองและซีไลท์เพื่อแยกถ่าน ตัวอย่างถูกผสมกับบิวทานอลอิ่มตัวในอัตราส่วนของบิวทานอลอิ่มตัว 2:1 และปล่อยให้ตัวอย่างแยกออกจากกันเป็นระยะเวลา 12 ชั่วโมง และทำซ้ำขั้นตอนนี้ 3 ครั้ง ตัวอย่างถูกแยกออกเป็นสองส่วน ซึ่งรวมถึงเศษส่วนของน้ำและบิวทานอล น้ำถูกเติมเพิ่มเติมในเศษส่วนบิวทานอลให้มีปริมาตรเท่ากัน และปล่อยให้เศษส่วนเหล่านี้ระเหยออกโดยใช้เครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน ตัวอย่างที่ระเหยได้ถูกนำไปทำให้แห้งแบบเยือกแข็งเพื่อให้ได้ผงสกัดจากดอก C. fistula

การหาปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดในสารสกัดจากดอก C. fistula โดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่มองเห็นด้วยรังสียูวี

ปริมาณฟีนอลทั้งหมดในสารสกัดจากดอก C. fistula ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ Folin-Ciocalteu โดยสังเขป สารสกัดจากดอก C. fistula 0.4 มล. ผสมกับสารรีเอเจนต์ Folin-Ciocalteau 0.3 มล. 10 เปอร์เซ็นต์ และบ่มในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 นาที . จากนั้น เติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต 0.3 มล. และบ่มสารละลายต่อไปในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ค่าการดูดกลืนแสงได้รับการประเมินที่ 765 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่มองเห็นได้ด้วยรังสียูวี ความเข้มข้นของปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานสำหรับกรดแกลลิก (GA) ที่ 0–20 ไมโครกรัม/มล. รายงานปริมาณฟีนอลทั้งหมดเป็นมิลลิกรัมของ GA เทียบเท่าต่อกรัมของ C. fistula สารสกัดจากดอกไม้ (สารสกัด mg GAE/g)

การหาปริมาณสารประกอบฟีนอลในสารสกัดดอกกระเจียวโดยใช้การวิเคราะห์ HPLC

วิเคราะห์สารประกอบฟีนอลชนิดต่างๆ ในสารสกัดจากดอก C. fistula โดยใช้การวิเคราะห์ HPLC แล้วเปรียบเทียบกับกรดแกลลิกมาตรฐาน คาเทชิน กรดโปรโตคาเทชูอิก กรดวานิลลิก กรดคลอโรจีนิก กรดเฟรูลิก และกรดคูมาริก สารสกัดจากดอกไม้ละลายในเอทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ และได้รับการประเมินเพิ่มเติมโดย HPLC (Agilent Technologies, CA, USA) โดยใช้คอลัมน์ C18 แบบกลับเฟส (WATER, MA, USA) เฟสการเคลื่อนที่ประกอบด้วยเมทานอล (A) และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ของกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) ในน้ำ (B) ที่มีสภาวะเกรเดียนต์ อัตราการไหลถูกกำหนดไว้ที่ 1.0 มล./นาที และบันทึกความยาวคลื่นการตรวจจับที่ 280 ด้วยเครื่องตรวจจับรังสียูวี ระดับความเข้มข้นของสารประกอบฟีนอลถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานโดยพิจารณาจากความเข้มข้นมาตรฐานและพื้นที่สูงสุด (สารสกัด mg/g)

การหาปริมาณปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดในสารสกัดจากดอก C. fistula โดยใช้ colorimetric assay

ปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดถูกกำหนดโดยอะลูมินัมคลอไรด์ดัดแปลง (AlCl3) colorimetric assay ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [22] โดยสังเขป สารสกัดจากดอกไม้ 0.25 มล. ผสมกับโซเดียมไนไตรต์ 5 เปอร์เซ็นต์ (NaNO2) 0.125 มล. และสารละลายถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น ผสม 0.125 มล. ของ AlCl3 10 เปอร์เซ็นต์ลงในของผสมและเก็บไว้ในที่มืดเป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้น เติมโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) 1 มล. และสารละลายถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 510 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่มองเห็นได้ด้วยรังสียูวี ปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมดถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับค่าคาเทชินมาตรฐาน และแสดงเป็นมิลลิกรัมของคาเทชินเทียบเท่าต่อกรัมของสารสกัด (มก. CE/สารสกัดกรัม)

การเพาะเลี้ยงเซลล์

ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์เบื้องต้นถูกแยกออกจากแผลเป็นในช่องท้องอย่างปลอดเชื้อหลังจากขั้นตอนการผ่าตัดที่เกี่ยวข้องกับการผ่าตัดคลอดที่หอผู้ป่วยศัลยกรรมของ CM โรงพยาบาลมหาราช มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ (เชียงใหม่ ประเทศไทย) (รหัสการศึกษา: BIO-2558-03549 ได้รับการอนุมัติโดยทางการแพทย์ คณะกรรมการจริยธรรมการวิจัย, มหาวิทยาลัยเชียงใหม่). ไขมันถูกกำจัดออกจากวัสดุเริ่มต้นและถูกแช่ใน DMEM ที่มีสารต่อต้านเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน หลังจากนั้น ผิวหนังถูกแช่ใน DMEM ที่มีโปรติเอส 1 เปอร์เซ็นต์ (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, USA) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 4 องศา ชั้นหนังกำพร้าถูกกำจัดออกและไฟโบรบลาสต์ปกติถูกแยกออกจากผิวหนังชั้นหนังแท้ ไฟโบรบลาสต์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์, แอล-กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์, เพนิซิลลิน 50 U/มล. และสเตรปโตมัยซิน 50 ไมโครกรัม/มล. เซลล์ได้รับการบำรุงรักษาในตู้อบที่มีความชื้น CO2 ร้อยละ 5 ที่ 37 องศา

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ของสารสกัดจากดอก C. fistula กับเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังถูกวัดโดยใช้การทดสอบ sulforhodamine B (SRB) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] โดยสังเขป เซลล์ (8x103 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจานหลุม 96-และบ่มที่ 37 องศา 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น เซลล์จะได้รับการบำบัดโดยมีหรือไม่มีสารสกัดดอก C. fistula ที่มีความเข้มข้นต่างๆ (0–200 ug/mL) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจาก 48 ชั่วโมง กรดไตรคลอโรอะซีติก (TCA) 10 เปอร์เซ็นต์ (w/v) ถูกเติมลงในเซลล์ และจากนั้นเซลล์ถูกบ่มที่ 4 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สื่อถูกนำออกและล้างเซลล์ด้วยน้ำประปาที่ไหลช้า เติมสารละลาย SRB 0.057 เปอร์เซ็นต์ (w/v) (100 ไมโครลิตร) ลงในแต่ละหลุมและเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง สารละลาย SRB ถูกกำจัดออกและจากนั้นเซลล์ถูกล้าง 4 ครั้งด้วยกรดอะซิติก 1 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) และปล่อยให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง สีย้อมถูกละลายด้วยสารละลายเบสทริส 10 มิลลิโมลาร์ (pH 10.5) และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 510 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท

การทดสอบการสังเคราะห์คอลลาเจน

คอลลาเจนภายในเซลล์ทั้งหมดในเซลล์ไฟโบรบลาสต์ถูกกำหนดโดยใช้ Sirius Red/Fast Green Collagen Staining Kit (Chondrex, Inc, Redmond, WA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสังเขป เซลล์ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังถูกเพาะในเพลต 24 หลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 องศา 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 หลังจากนั้น เซลล์จะได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วยสื่อ DMEM ที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเอาออกและเซลล์ถูกบ่มโดยมีหรือไม่มีสารสกัดจากดอก C. fistula (0-150 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกนำออก จากนั้นล้างเซลล์ด้วย PBS และแก้ไขด้วย Kahle fixative เป็นเวลา 10 นาที สารตรึงถูกกำจัดออกและเซลล์ถูกล้างด้วย PBS เติมสารละลายสีย้อม Sirius Red/Fast Green ลงในแต่ละหลุมและบ่มตัวอย่างเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง สีย้อมถูกกำจัดออกและเซลล์ถูกล้างสี่ครั้งด้วยน้ำ DI หรือจนกว่าของเหลวจะไม่มีสี สุดท้าย เพิ่มบัฟเฟอร์การสกัดและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตรและ 605 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่มองเห็นด้วยรังสียูวี

การทดสอบกิจกรรมของคอลลาเจนเนส

กิจกรรมของคอลลาเจนเนสถูกวัดโดยใช้การทดสอบฟลูออโรเจนิก DQ™-เจลาตินที่ได้รับการดัดแปลงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [24] โดยสังเขป ความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัดจากดอก C. fistula (0–200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเติมลงในจาน 96 หลุม คอลลาเจนเนสหนึ่ง U/มล. ถูกเติมในแต่ละหลุม (100 ไมโครลิตร/หลุม) หลังจากนั้นเจลาติน (เจลาติน DQ) 15 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรถูกเติมและของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาที อัตราการสลายโปรตีนถูกกำหนดโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ช่วงเวลา 2 นาทีเป็นเวลา 20 นาทีโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 485 นาโนเมตร และความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมา 528 นาโนเมตร กิจกรรมของเอนไซม์ประเมินโดยการตรวจสอบความชันของการถดถอยเชิงเส้นระหว่างเวลาและการดูดกลืนแสงในช่วงเวลา 2-6 นาที

การทดสอบกิจกรรม MMP-2

กิจกรรม MMP{{0}} ถูกกำหนดโดยเจลาตินไซโมกราฟีตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] เพาะเลี้ยงเซลล์ไฟโบรบลาสต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรั่ม DMEM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นจึงทำการเก็บส่วนเกินของวัฒนธรรม สิ่งเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงอยู่ภายใต้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ที่มีเจลาติน 0.1 เปอร์เซ็นต์น้ำหนัก/ปริมาตรภายใต้สภาวะที่ไม่รีดักชัน เจลถูกล้างสองครั้งด้วย 2.5 เปอร์เซ็นต์ v/v ของ Triton X-100 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อกำจัด SDS แผ่นเจลถูกตัดเป็นชิ้นที่ตรงกับเลน จากนั้นจึงใส่ชิ้นส่วนลงในถังต่างๆ และบ่มด้วยบัฟเฟอร์กระตุ้น (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ที่มีความเข้มข้นต่างๆ ของ C . สารสกัดจากดอกทวาร (0–200 มก./มล.) ที่ 37 องศา เป็นเวลา 18 ชม. หลังจากนั้น แถบของเจลถูกล้างและย้อมด้วย Coomassie Brillant Blue R (0.1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก/ปริมาตร) จากนั้นถูกกักด้วยเมทานอล 30 เปอร์เซ็นต์และกรดอะซิติก 10 เปอร์เซ็นต์ กิจกรรม MMP-2 ปรากฏเป็นแถบสีใสตัดกับพื้นหลังสีน้ำเงิน แถบการย่อยถูกหาปริมาณโดยโปรแกรม Image J

การทดสอบการสังเคราะห์กรดไฮยาลูโรนิก (HA) โดย ELISA

ผลของสารสกัดจากดอก C. fistula ต่อการสังเคราะห์ HA ถูกกำหนดโดยใช้ชุด ELISA ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [26] เซลล์ไฟโบรบลาสต์ (5.0 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะใน 24-จานหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37 องศา 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 เซลล์ได้รับการบำบัดล่วงหน้าในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นจึงได้รับการรักษาด้วยหรือไม่ใช้สารสกัดจากดอก C. fistula ที่มีความเข้มข้นต่างๆ (0–200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง รวบรวมอาหารเลี้ยงเชื้อและวัดการสังเคราะห์ HA โดย ELISA วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 และ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท ความเข้มข้นของ HA ในส่วนเหนือตะกอนที่เพาะเลี้ยงที่ได้มาจากเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ผ่านการบำบัดถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐานของ HA

การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนส

การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนสถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] ความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัดจากดอก C. fistula ถูกเติมลงใน 96-จานหลุม ปฏิกิริยาถูกดำเนินการในโซเดียมบัฟเฟอร์ (pH 6.4) ที่มีไทโรซิเนสเห็ด 100 U/mL ซับสเตรต L-DOPA (1 มิลลิโมลาร์) ถูกเติมลงในของผสมของปฏิกิริยาและจากนั้นมันถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การเปลี่ยนแปลงของการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรถูกวัดทุกๆ 1.5 นาที เป็นเวลา 15 นาที โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนสคำนวณโดยสูตรต่อไปนี้:

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากดอก C. fistula ถูกกำหนดโดยใช้ 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)- กิจกรรมอนุมูลอิสระ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [28] ความเข้มข้นต่างๆ ของสารสกัดจากดอกไม้ (0–100 ug/mL) ถูกเตรียมในเมทานอล 1 มล. ของ 0.002 เปอร์เซ็นต์ของ DPPH ถูกเติมลงในสารละลายสกัดจากดอกไม้ 1 มล. และของผสมถูกเก็บไว้ในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ เปอร์เซ็นต์การยับยั้งถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับวิตามินอีมาตรฐาน (1–100 มก./มล.) โดยใช้สูตรต่อไปนี้:

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากดอก C. fistula ได้รับการยืนยันโดยใช้การทดสอบ ABTS ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [29] ABTS [2, 2′- azino-bis (ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] อนุมูลไอออนบวกถูกเตรียมโดยการผสมสารละลายสต็อก ABTS 7 mM กับโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต 2.45 mM (K2S2O8) (1/1, v/v) ของผสมถูกบ่มในที่มืดเป็นเวลา 12–16 ชั่วโมงจนกระทั่งปฏิกิริยาเสร็จสิ้น การทดสอบดำเนินการโดยใช้สารละลาย ABTS 990 ไมโครลิตร และสารสกัดจากดอกไม้ 10 ไมโครลิตร (0–4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หลังจากผ่านไป 6 นาที ค่าการดูดกลืนแสงจะถูกบันทึกทันทีที่ 734 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ เปอร์เซ็นต์การยับยั้งการทำงานของ ABTS ของสารสกัดจากดอกไม้คำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การวิเคราะห์ทางสถิติวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ Prism เวอร์ชัน 60 โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวกับการทดสอบของ Dunnett กำหนดนัยสำคัญทางสถิติที่ * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 หรือ **** p < 0.0001

ผลลัพธ์

ลักษณะทางพฤกษเคมีของสารสกัดจากดอกกระบองเพชร

หลังจากขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการทำแห้งเยือกแข็งตัวอย่าง สารสกัดจากดอก C. fistula จะถูกชั่งน้ำหนักและนำไปศึกษาทางพฤกษเคมีและชีวภาพต่อไป 18.08 กรัมของสารสกัดจากดอก C. fistula ได้จากวัตถุดิบ 500 กรัม และเปอร์เซ็นต์ผลผลิตของสารสกัดจากดอกคือ 3.62 ลายนิ้วมือ HPLC ของสารสกัดจากดอก C. fistula ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ HPLC (รูปที่ 1) โปรไฟล์ HPLC ที่แสดงจุดสูงสุดของสารประกอบฟีนอลิกได้รับการติดฉลากในแง่ของส่วนประกอบแต่ละตัวในแต่ละช่วงเวลาการเก็บรักษา คุณสมบัติของสารประกอบฟีนอลิกของสารสกัดจากดอก C. fistula แสดงไว้ในตารางที่ 1 ปริมาณฟีนอลทั้งหมดในสารสกัดจากดอกคือ 275.32 ± 14.21 mg GAE/g สารสกัด อนุพันธ์ของกรดไฮดรอกซีเบนโซอิก ได้แก่ กรดวานิลลิกและกรดโปรโตคาเทชูอิก พบว่ามีค่า {{20}}.95 ± 0.09 และ 2.56 ± 0 สารสกัด 42 มก./ก. ตามลำดับ ในขณะที่กรดแกลลิกบันทึกที่สารสกัด {{30}}.60 ± 0.02 มก./ก. ตรวจพบอนุพันธ์ของกรดไฮดรอกซีซินนามิก ได้แก่ กรดคูมาริก กรดเฟรูลิก และกรดคลอโรเจนิกที่สารสกัด 0.39 ± 0.08, 0.80 ± 0.09 และ 0.83 ± 0.03 มก./กรัม ตามลำดับ ปริมาณฟลาโวนอยด์เท่ากับ 27.62 ± 3.56 mg CE/g extract Catechin ซึ่งเป็นอนุพันธ์ของฟลาโวนอล วัดได้ที่สารสกัด 1.10 ± 0.00 mg/ g

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】