นิวเคลียสธาลามิกส่วนหน้า: พื้นผิวที่สำคัญสำหรับหน่วยความจำแบบไม่เชื่อมโยงเชิงพื้นที่ในหนู ตอนที่ 2

2|วัสดุและวิธีการ

2.1|สัตว์และสภาพที่อยู่อาศัย

หนูลองอีแวนส์ตัวผู้ (อายุ 12 เดือน; เฉลี่ย 630 กรัม) เลี้ยงเป็นกลุ่มสามหรือสี่ตัวในกรง Makrolon (48 28 22 ซม.) ในวงจรแสงย้อน 12- ชั่วโมง (เปิดไฟเวลา 20.00 น.) ).

Behavioural testing occurred in thedark phase of the light cycle, five sessions per week;observations confirmed that rats were relatively moreactive during the dark phase. Rats were maintained at85% of free-feeding body weight with water ad libitum;food was ad libitum before and after surgery for postoperative recovery. 

การผ่าตัดเป็นกระบวนการรักษาโรคและปรับปรุงสุขภาพร่างกาย กระบวนการกู้คืนหลังการผ่าตัดต้องการความสนใจเป็นพิเศษ นอกเหนือจากการฟื้นตัวทางกายภาพความรู้สึกที่ดียังต้องมุ่งเน้นไปที่การกู้คืนหน่วยความจำ มีการเชื่อมต่อที่แข็งแกร่งระหว่างการกู้คืนหลังการผ่าตัดและหน่วยความจำ

ในระหว่างการผ่าตัด ปัจจัยต่างๆ เช่น การตอบสนองต่อความยากลำบากของร่างกายและผลของยาชามักส่งผลต่อการทำงานของความจำของสมอง หลังจากที่ร่างกายฟื้นตัวแล้ว ให้ใส่ใจกับการรับประทานอาหารที่ดี การออกกำลังกายในระดับปานกลาง และการนอนหลับที่เพียงพอ ในช่วงพักฟื้นนอกโรงพยาบาล คุณต้องหลีกเลี่ยงกิจกรรมที่มากเกินไปและรักษาสภาพร่างกายให้สบายอยู่เสมอ

นอกจากนิสัยการใช้ชีวิตแล้ว การปรับเปลี่ยนทางจิตอย่างสมเหตุสมผลยังช่วยฟื้นฟูสุขภาพและความจำอีกด้วย ผ่อนคลายตัวเอง รักษาจิตใจให้สงบ และช่วยปรับตัวในการฟื้นฟูความจำ ในเวลาเดียวกัน คุณควรมีส่วนร่วมในกิจกรรมสันทนาการและสื่อสารกับญาติและเพื่อนฝูงเพื่อให้สมองของคุณตื่นตัวและพัฒนาความสามารถในการรับรู้และความจำ กิจกรรมนี้สามารถค่อยๆ เพิ่มขึ้นและสามารถทำได้โดยทั่วไปสัปดาห์ละครั้ง

กล่าวโดยสรุป กระบวนการพักฟื้นหลังการผ่าตัดจำเป็นต้องได้รับการดูแลเอาใจใส่อย่างรอบด้าน การรักษานิสัยการใช้ชีวิตที่ดีและการปรับตัวทางจิตวิทยามีบทบาทสำคัญในการส่งเสริมการฟื้นฟูร่างกายและการฟื้นฟูความจำ ขอให้เราเผชิญมันในแง่บวกด้วยความมั่นใจและความหวังอย่างเต็มที่ เราจำเป็นต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche Deserticola สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมาก เนื่องจาก Cistanche Deserticola ยังสามารถควบคุมความสมดุลของสารสื่อประสาท เช่น การเพิ่มระดับของอะเซทิลโคลีนและปัจจัยการเจริญเติบโต สารเหล่านี้มีความสำคัญมากต่อความจำและการเรียนรู้ นอกจากนี้ เนื้อสัตว์ยังช่วยเพิ่มการไหลเวียนของเลือดและส่งเสริมการส่งออกซิเจน ซึ่งช่วยให้สมองได้รับสารอาหารและพลังงานที่เพียงพอ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความมีชีวิตชีวาและความอดทนของสมอง

คลิกรู้วิธีปรับปรุงการทำงานของสมอง

ขั้นตอนทั้งหมดเป็นไปตามแนวทางที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยแคนเทอร์เบอรี หนูสี่กลุ่มได้รับการสร้างขึ้นโดยการสุ่มมอบหมายภายหลังการทำความคุ้นเคยก่อนการผ่าตัดในเขาวงกตแขนเรเดียล (RAM) และรันเวย์ ทั้งสี่กลุ่มเป็นรอยโรค ATN ในระดับทวิภาคีโดยไม่มีร่องรอยระหว่างกลิ่นและสิ่งเร้าวัตถุ เมื่อได้รับการฝึกในงานแบบจับคู่และกลุ่มรอยโรคเสแสร้งสองกลุ่มที่สอดคล้องกัน

ขนาดตัวอย่างสุดท้ายคือ (1) Sham-No Trace=7 (กล่าวคือ กลุ่ม Sham-lesion ที่ไม่มีช่วงเวลาระหว่างกลิ่นและสิ่งเร้าวัตถุที่ใช้ในงานที่เชื่อมโยงกัน) (2) Sham-Trace=7 (กลุ่ม Shamlesion ให้ร่องรอย 10- ระหว่างการนำเสนอกลิ่นและสิ่งเร้าของวัตถุ) (3) ATN-ไม่มีการติดตาม=8; และ (4) ATN-ติดตาม=9 หนูที่มีรอยโรค ATN เพิ่มเติมถูกแยกออกเนื่องจากไม่ตรงตามเกณฑ์ของรอยโรค (ดูด้านล่าง)

2.2|การผ่าตัด

หนูถูกดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรน (การเหนี่ยวนำ 4%; การบำรุงรักษา 2.5%) และวางไว้ในอุปกรณ์ Stereotaxic ที่มีแถบหูที่ทำให้เกิดบาดแผล (Kopf, Tujunga, CA) แถบฟันตัดถูกตั้งค่าไว้ที่ 7.5 มม. ใต้เส้นระหว่างหู เพื่อลดความเสียหายของ fornix

ในแต่ละซีกโลก มีการให้สาร 2 หยดโดยตรงที่นิวเคลียสระหว่างโพรงมดลูก (AV; ด้านบนและด้านล่าง) และการให้สาร 1 หยดโดยตรงที่นิวเคลียสของหลอดเลือดแดง (AM) การผ่าตัดแต่ละครั้งใช้พิกัดด้านหน้า-หลัง (AP) หนึ่งตำแหน่งที่สัมพันธ์กับระยะห่าง Bregma-Lambda ของหนูแต่ละตัว (ค่าทั้งหมดเป็นหน่วยมิลลิเมตร) สำหรับรอยโรค AV พิกัด AP คือ: 2.20 สำหรับ B – L 6.9–7.2; 2.25 สำหรับ B–L 7.3 ถึง 7.6; 2.30 สำหรับ B–L มากกว่าหรือเท่ากับ 7.7 การเติม AV ทำได้ที่ 5.68 และ 5.73 ต่ำกว่า dura และ 1.52 ด้านข้างถึงเส้นกึ่งกลาง

การแช่ AM เกิดขึ้น {{0}}.1 มม. ซึ่งอยู่ข้างหน้ากว่าพิกัด AV โดยที่ต่ำกว่า dura 5.76 และด้านข้าง 1.16 รอยโรค AM แรกเกิดขึ้นหลังจากเสร็จสิ้น AVinfusion ทั้งหมด และเริ่มตรงกันข้ามกับบริเวณรอยโรค AV สุดท้าย 0.15 M N-เมทิล-d-แอสพาร์เทต (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.20) ถูกฉีดเข้าไปในแต่ละไซต์ที่ 0.04 ul ต่อนาทีผ่านทาง 2.5-กระบอกฉีดยา ulHamilton (รีโน เนวาดา สหรัฐอเมริกา) โดยใช้ปั๊มแช่ขนาดเล็ก (Stoelting, Wood Dale, IL)

ไซต์ AV ในซีกโลกได้รับ {{0}}.12 และ 0.10 ul สำหรับไซต์หน้าท้องดอร์ซาแลนด์ตามลำดับ 0.06 ul ถูกใช้สำหรับแต่ละไซต์ AM เข็มหลอดฉีดยายังคงอยู่ในแหล่งกำเนิดเป็นเวลา 3 ด้านของ minper หลังการปล่อยให้ไหลเข้าหลอดเลือด
การผ่าตัดเสแสร้งรอยโรคใช้ขั้นตอนเดียวกัน แต่เข็มถูกลดลงเหลือ 1 มม. เหนือบริเวณรอยโรค AV บนและ AM โดยให้ noinfusion

2.3|งานด้านพฤติกรรม

RAM แปดแขนยืนยันความบกพร่องของหน่วยความจำเชิงพื้นที่ในหนูที่มีรอยโรค ATN หลังการผ่าตัด เครื่องมือทางวิ่งถูกใช้เพื่อฝึกหนูในงานที่ไม่ใช่อวกาศทั้งหมด กล่าวคือ กลิ่นธรรมดาและการเลือกปฏิบัติวัตถุธรรมดา และกลิ่น-วัตถุและกลิ่น-ร่องรอย-วัตถุที่เชื่อมโยงกัน

ก่อนการผ่าตัด หนูที่ถูกจำกัดอาหารจะถูกเคยชินกับ RAM แปดแขน ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง เพื่อดึงช็อกโกแลต 0.1 กรัม (Foodfirst LTD Auckland, NZ) และปรับให้เข้ากับการเปิดและปิดประตูแขน ในรันเวย์ Perspex สีแดง (รูปที่ 1) หนูก็ถูกปั้นให้จมูกโผล่หมวกพลาสติกสีขาวทรงกลม 2- ซม. ซึ่งอยู่สูงจากพื้น 10 ซม. และอยู่ตรงกลางของฟองน้ำบาง ๆ บนแผ่น Perspex ใสที่ติดอยู่กับ ผนังด้านท้าย

พวกเขายังถูกปั้นให้ดัน (โดยใช้จมูกหรืออุ้งเท้า) วัตถุที่บานพับที่ด้านหลังของฐานไปจนถึงด้านบนของบ่ออาหารที่ฝังอยู่ตรงกลางของบล็อกไม้ขนาด 5 8.5 3 ซม. อาหารประกอบด้วยชิ้นช็อกโกแลต (และเก็บอาหารที่ไม่สามารถเข้าถึงได้ไว้ใต้ช่อง) วัตถุที่ใช้ในการฝึกล่วงหน้าไม่ได้ถูกนำมาใช้อีก หลังการผ่าตัด หนูพักฟื้นได้รับความคุ้นเคยกับทั้ง RAM และรันเวย์อีกครั้ง

2.4|หน่วยความจำการทำงานเชิงพื้นที่ใน RAM

หลังการผ่าตัด มีการทดสอบหน่วยความจำการทำงานเชิงพื้นที่โดยใช้ RAM ที่อยู่ตรงกลางห้องที่ไม่มีหน้าต่าง (3 3 ม.) เขาวงกตมีดุมกลางไม้ทาสีเทากว้าง 35 ซม. พร้อมแขนอลูมิเนียม 8 อัน (กว้าง 65 ซม. กว้าง 8.6 ซม. และมีเส้นขอบสูง 4.5 ซม.) ยกขึ้นเหนือพื้นห้อง 67.5 ซม. ผนัง Perspex แบบใส (ยาว 19 ซม. และสูง 25 ซม.) ขยายไปตามแขนข้างใดข้างหนึ่งจากฮับเพื่อป้องกันไม่ให้หนูกระโดดระหว่างแขน

หลุมอาหารไม้สีดำ (5 8.5 3 ซม.) โดยมีอาหารที่ไม่สามารถเข้าถึงได้อยู่ข้างใต้ วางอยู่ที่ปลายแขนแต่ละข้าง ในระหว่างการทดสอบ มีช็อกโกแลต 2 0.1 กรัมปรากฏอยู่ในอาหารแต่ละหลุมที่จุดเริ่มต้นของแต่ละหลุม การทดลอง. ประตู Perspexguillotine แบบใส ซึ่งสามารถยกขึ้นจากใต้ดุมล้อได้โดยใช้ระบบลูกรอก ควบคุมการเข้าถึงแขนดุมล้อ

การฝึกอบรมอย่างเป็นทางการใน RAM เป็นเวลาสิบวันติดต่อกันใช้เพื่อทดสอบหน่วยความจำการทำงานเชิงพื้นที่ หนูถูกวางไว้ที่ศูนย์กลาง และ 10 วินาทีต่อมา แขนทั้งแปดก็ถูกเปิดออก และหนูก็ได้รับอนุญาตให้เลือกได้ โดยกำหนดให้เป็นเท้าหลังทั้งสองข้างเหนือธรณีประตูของแขน เมื่อหนูเข้าไปในแขน ประตูทุกบานก็ปิดลง และมันถูกกักขังไว้ที่แขนเป็นเวลา 15 วินาที ไม่ว่ามันจะเลือกถูกหรือไม่ก็ตาม

จากนั้นหนูก็ได้รับอนุญาตให้กลับเข้าไปในศูนย์กลางและจับไว้ที่นั่นเป็นเวลา 10 วินาทีก่อนที่ประตูทั้งหมดจะเปิดออกอีกครั้งเพื่อให้สามารถเลือกแขนอื่นได้ การพิจารณาคดีสิ้นสุดลงเมื่อราธาดไปเยี่ยมทั้งแปดแขน มีการเลือกแขน 20 แขน หรือผ่านไป 10 นาที

2.5|งานที่ไม่ใช่เชิงพื้นที่: การเลือกปฏิบัติอย่างง่ายและการเรียนรู้แบบเชื่อมโยง

ทั้งการเลือกปฏิบัติและงานเชื่อมโยงกันใช้รันเวย์ Perspex สีแดงเส้นเดียวกัน (93 26 26 ซม.) วางอยู่บนโต๊ะที่มีความสูง 75- ซม. (รูปที่ 1) รันเวย์สามารถแบ่งออกได้ด้วยประตูที่ถอดออกได้ในแนวตั้ง 3 บาน (redPerspex, 26 26 ซม.) ที่เลือกโดยพิจารณาจากพฤติกรรมเฉพาะ เพื่อความคุ้นเคย ฟองน้ำบาง 6.5 6 8 มม. ที่มีฝาปิดอยู่ตรงกลางถือเป็นรางวัลอาหารช็อกโกแลต (รูปที่ 1)

ฟองน้ำติดอยู่กับประตูที่ถอดออกได้ในรันเวย์ (สำหรับงานที่ต้องจับคู่กัน) หรือผนังส่วนท้ายของรันเวย์ (สำหรับงานการเลือกปฏิบัติแบบธรรมดา) แต่ละกลิ่นใช้ฟองน้ำประตูพลัสที่แตกต่างกัน ซึ่งฉีดติดกับภาชนะที่มีน้ำมันดอกทานตะวัน 5 มล. ผสมกับน้ำมันหอมระเหยของนิวซีแลนด์ 20 ul

กลิ่นได้แก่ กลิ่นเลมอนและกานพลูสำหรับงานคู่กัน และกลิ่นอบเชยกับมะนาวสำหรับงานแบ่งแยกง่ายๆ หรือกลิ่นตรงกันข้ามในกลุ่มที่ถ่วงดุลกัน วัตถุที่มีน้ำหนักเบาและมองเห็นได้ชัดเจน (รูปที่ 1) ถูกติดไว้ด้วยบานพับที่ด้านหลังของฐานจนถึงด้านบนของบ่ออาหาร เพื่อให้หนูสามารถดันวัตถุไปด้านหลังได้อย่างง่ายดาย (จมูกหรืออุ้งเท้า) เพื่อค้นหารางวัลอาหารในหลุม

โครงไม้ (สูง 1.8 ม. จากพื้น กว้าง 1.3 ม.) ติดม่านสีดำ ปิดทุกด้านของพื้นที่ทดสอบเพื่อลดสัญญาณเชิงพื้นที่ในระหว่างการทดสอบ

การเลือกปฏิบัติง่ายๆ (เฉพาะกลิ่นเท่านั้น วัตถุเท่านั้น) และงานที่เชื่อมโยงกันโดยใช้ขั้นตอน 'ไป/ไม่ไป'

การทดลองครั้งแรกสำหรับแต่ละเซสชั่นเริ่มต้นด้วยการกักหนูไว้ในบริเวณเริ่มต้นเป็นเวลา 120 วินาทีเพื่อปรับตัวให้เข้ากับสภาพเขาวงกตอีกครั้ง การทดลองครั้งต่อไปใช้เวลา 20 วินาทีในพื้นที่เริ่มต้นนี้ Allrats ได้รับการทดลองใช้จำนวนมาก 12 ครั้งต่อเซสชั่นรายวัน โดยมีการทดลองแบบ Sixgo (ให้รางวัล) และการทดลองแบบไม่ให้รางวัล 6 ครั้ง (ไม่มีการให้รางวัล) ตามลำดับแบบสุ่ม มีการดำเนินการทดลองแบบไม่ต้องไปมากกว่าสามครั้งหรือสามครั้งติดต่อกันในเซสชัน

ไม่มีคู่กระตุ้นกลิ่นและวัตถุที่แตกต่างกันสี่คู่เกิดขึ้นซ้ำในการทดลองติดต่อกัน รายการที่ถูกต้องในงานแบ่งแยกอย่างง่ายและคู่กระตุ้นเศรษฐกิจที่ถูกต้องในงานที่เชื่อมโยงเป็นคู่นั้นมีความสมดุลกัน

สำหรับการแบ่งแยกกลิ่นแบบง่ายๆ การตอบสนองถูกกำหนดโดยการใช้จมูกจิ้มเข้าไปในหมวกที่อยู่ตรงกลางของฟองน้ำที่มีกลิ่น การดมฟองน้ำเพียงอย่างเดียวถือเป็นการตอบสนองที่ไม่ต้องดำเนินการ มีอาหารอยู่ในหมวกที่อยู่ตรงกลางฟองน้ำเสมอสำหรับงานที่เกี่ยวข้องกับกลิ่นและวัตถุ แง่มุม go/no-go ในที่นี้หมายถึงว่าวัตถุนั้นถูกผลักเพื่อเผยให้เห็นว่ามีรางวัลอาหารอยู่ข้างใต้หรือไม่ ที่ส่วนท้ายของรันเวย์

สำหรับวัตถุ การตอบสนองหมายถึงการกดด้วยอุ้งเท้าจมูกที่เอียงวัตถุไปข้างหลัง เวลาแฝงจากเวลาที่ประตูสุดท้ายถูกยกขึ้น และเมื่อหนูมีปฏิสัมพันธ์กับกลิ่น (จมูกจิ้มที่หมวก สำหรับการเลือกปฏิบัติแบบธรรมดา) หรือกับวัตถุ (ดันกลับบนบานพับ สำหรับการแยกแยะวัตถุแบบธรรมดาและงานที่เชื่อมโยงกัน) คือ วัดโดยใช้นาฬิกาจับเวลาแบบเงียบๆ(Dick Smith, นิวซีแลนด์)

ผู้สังเกตการณ์นั่งอยู่ในม่านและติดกับรันเวย์เพื่อควบคุมประตูและบันทึกพฤติกรรม การทดลองถูกกำหนดว่า 'ถูกต้อง' หากหนูตอบสนองในเวลาน้อยกว่า 8 วินาทีในการทดลองขณะเดินทาง หรือไม่ตอบสนองก่อน 8 วินาทีในการทดลองแบบไม่ไป

2.6|การเลือกปฏิบัติง่ายๆ

หนูครึ่งหนึ่งได้รับการฝึกอบรมในงานแยกแยะกลิ่นอย่างง่าย ตามด้วยการเลือกปฏิบัติวัตถุอย่างง่าย และในทางกลับกันสำหรับอีกครึ่งหนึ่ง เวลาแฝงระหว่างประตู X (รูปที่ 1a) และการโต้ตอบกับกลิ่นหรือวัตถุที่ส่วนท้ายของรันเวย์ถูกบันทึกไว้ หนูถูกฝึกในเรื่องกลิ่นธรรมดาและงานแยกแยะวัตถุธรรมดาจนกระทั่งถึงเกณฑ์ (ถูกต้อง 80% ใน 2 วันติดต่อกัน)

สำหรับงานแยกแยะกลิ่นแบบธรรมดา จะมีการนำเสนอกลิ่นเดียวในแต่ละการทดลอง Rathad เพื่อแยกแยะว่ากลิ่นใดในสองกลิ่นที่จับคู่กับรางวัลอาหารที่แสดงอยู่ในฟองน้ำที่ส่วนท้ายของช่อง B (รูปที่ 1a)

ในงานแยกแยะวัตถุอย่างง่าย มีการนำเสนอวัตถุชิ้นเดียวในแต่ละการทดลองที่ส่วนท้ายของช่อง B (ไม่แสดงในรูปที่ 1) Therat ต้องเรียนรู้ว่าวัตถุใดในสองชิ้นที่จับคู่กับรางวัลอาหารที่แสดงอยู่ใต้วัตถุนั้น

2.7|งานที่เชื่อมโยงแบบคู่ (ติดตามและไม่มีการติดตาม) งานเหล่านี้ใช้เค้าโครงใหม่ของประตูที่ถอดออกได้ในแนวตั้ง (รูปที่ 1) หนูเรียนรู้ว่าการจับคู่กลิ่นใดกับวัตถุใดที่จะได้รับรางวัล (เช่น กลิ่น 1 + ObjectA และกลิ่น 2 + วัตถุ B) และการจับคู่ใดที่ไม่ได้รับรางวัล (เช่น กลิ่น 1 + วัตถุ B และกลิ่น 2 + ออบเจ็กต์ A)

ไม่ว่าการจับคู่จะเป็นอย่างไร หนูจะได้รับรางวัลสำหรับการนำเสนอกลิ่นเสมอเมื่ออนุญาตให้เข้าไปในช่องที่สองของรันเวย์ นี่คือช่อง C สำหรับสภาวะ 'ไร้ร่องรอย' โดยที่ช่อง A ไม่ได้ใช้ และช่อง B เป็นช่องเริ่มต้น กลิ่นอยู่ที่ส่วนท้ายของช่อง B สำหรับสภาพ 'ร่องรอย' ซึ่งช่อง A ถูกใช้เป็นกล่องสตาร์ท

หนูที่อยู่ในสภาวะการติดตามจะถูกหน่วงเวลา 10- วินาทีระหว่างการนำเสนอกลิ่นและสิ่งเร้าของวัตถุ โดยการจับไว้ในช่อง C ในขณะที่หนูที่อยู่ในสภาวะที่ไม่มีการติดตามจะถูกสัมผัสกับวัตถุทันทีหลังจากการโต้ตอบกับกลิ่น (หลังจาก การกินรางวัล) ทั้งในสภาวะการติดตามและไร้ร่องรอย เราได้บันทึกเวลาแฝงในการสำรวจช่อง D นับตั้งแต่เวลาที่ DoorZ ถูกยกขึ้นจนกระทั่งหนูมีปฏิสัมพันธ์กับวัตถุ หรือละเว้นจากการโต้ตอบกับวัตถุเป็นเวลา 8 วินาที

หนูสองกลุ่ม (รอยโรคเสแสร้ง และรอยโรค ATN) ได้รับการฝึกเกี่ยวกับงานที่เกี่ยวข้องกับการจับคู่ด้วยกลิ่น-วัตถุ (กลุ่มไม่มีร่องรอย) และกลุ่มที่เกี่ยวข้องสองกลุ่มได้รับการฝึกอบรมเกี่ยวกับงานที่เกี่ยวข้องกับกลิ่น-ร่องรอย-วัตถุ (กลุ่มติดตาม) จนกระทั่งพวกเขา ถึงเกณฑ์ (การทดลองที่ถูกต้อง 80% ตลอด 3 วัน) หรือสูงสุด 50 วัน

2.8|การทดสอบการรักษาผู้ใช้หลังการซื้อกิจการ

การเก็บรักษางานคู่ร่วมสำหรับหนูใดๆ ดำเนินการ 5 วันหลังจากถึงเกณฑ์หรือหลังจาก 50 วันของการฝึกอบรม เซสชั่นนี้ใช้การทดลองแบบมีรางวัลจำนวนมาก/ไม่ได้รับรางวัล 12 ครั้งในวันเดียวในลักษณะเดียวกับที่ใช้ก่อนหน้านี้กับหนูตัวนั้น

2.9|มิญชวิทยา

2.9.1|การสะสมของกำซาบและเนื้อเยื่อ

ในช่วง 3 วันก่อนการทดสอบการคงอยู่ หนูตัวเดียวคุ้นเคยกับกรงที่ว่างเปล่าสะอาดเป็นเวลา 90 นาทีในห้องมืดที่เงียบสงบ ทันทีหลังจากการทดลองครั้งสุดท้ายในการทดสอบความคงอยู่ หนูถูกวางไว้ในกรงของมันในห้องมืดที่เงียบสงบที่คุ้นเคย 90 นาทีก่อนที่จะมีการแพร่กระจาย

หนูได้รับการดมยาสลบอย่างล้ำลึกด้วยโซเดียม เพนโทบาร์บาร์บิทอล (125 มก./กก.) และฉีดผ่านทางหัวใจด้วยน้ำเกลือ ตามด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ [4% PFA ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์(PB)] เพื่อซ่อมแซมสมอง สมองได้รับการแก้ไขภายหลังใน 4% PFA ตามด้วยอย่างน้อย 48 ชั่วโมงในสารละลายระยะยาว (20% กลีเซอรอลใน 0.1 M PB) ส่วนโคโรนา 40- ไมโครเมตรถูกรวบรวมโดยใช้ไมโครโตมเยือกแข็ง (เทอร์โม ฟิชเชอร์ สหราชอาณาจักร) และเก็บไว้ในสารละลายป้องกันด้วยความเย็น (กลีเซอรอล 30%, เอทิลีนไกลคอล 30% ใน 0.1 โมลาร์ PB) ที่ 20 C จนกระทั่งได้รับการประมวลผลสำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนชเวียนถูกรวบรวมเป็นสองชุดแยกกัน ชุดแรกจับส่วนที่ต่อเนื่องกันในหลอดสำหรับการแช่แข็งห้าหลอดสำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี (นั่นคือ หนึ่งในห้า) ซีรีส์นี้ประกอบด้วยบล็อกด้านหน้าของส่วนหน้าจากเปลือกนอกส่วนหน้าถึงบริเวณผนังกั้นช่องจมูก (ประมาณ {{0}}.7 ถึง 0.6 มม. จากเบร็กมา) และบล็อกด้านหลังจากทาลามัสกลาง (ประมาณ 3.5 มม. จากเบร็กมา) ไปจนถึงหาง เยื่อหุ้มสมอง retrosplenial

ชุดที่สองบันทึกส่วนที่ต่อเนื่องกันเพื่อการตรวจสอบรอยโรค ส่วนเหล่านี้ถูกรวบรวมไว้ในขวดสำหรับการแช่แข็งสี่หลอดตั้งแต่ด้านหน้าไปยัง ATN ทันทีไปจนถึงทาลามัสกลางกลิ่นกลางหลัง (ประมาณ 0.6 ถึง 3.5 มม. จาก Bregma)

2.9.2|การย้อมสี Neu-N และการตรวจสอบรอยโรค ATN

ส่วนที่ลอยอย่างอิสระทั่วทั้งภูมิภาค ATN ถูกล้าง (3 10 นาที) ในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ด้วย Triton-X (0.2%; PBSTx) ก่อนบ่มในบัฟเฟอร์การปิดกั้นเปอร์ออกซิเดสภายนอกเป็นเวลา 30 ขั้นต่ำ [ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 1% (H2O2), เมทานอล 50% (CH3OH) ใน 2% PBSTx]

ส่วนถูกบ่มในชั่วข้ามคืนที่แอนติบอดีปฐมภูมิ 4 C inanti-NeuN (1: 5000; monoclonal-MouseCat# MAB377; มิลลิพอร์, แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) ใน PBSTx พร้อมด้วยซีรั่มแพะปกติ 1% (NGS; Life Technologies, NZ)

แอนติบอดีบัฟเฟอร์ส่วนเกินถูกกำจัดออกด้วย PBSTx และตามด้วยการบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิที่ต้านหนูเมาส์ของแพะที่มีไบโอตินเลต (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, California USA) ข้ามคืนที่ 4 C ใน PBSTx และ 1% NGS ส่วนต่างๆ ถูกวางไว้ใน ExtrAvidin (peroxidase conjugated; 1:1000; Sigma, NSW Australia), PBSTx และ 1% NGS เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง

ในการกำจัด ExtrAvidin และ Triton X{{0}} ส่วนเกินออก ส่วนต่างๆ จะถูกล้างใน PBS, PB และบัฟเฟอร์ Tris (pH 7.4 ใน H2 กลั่น0) เพื่อเตรียมส่วนสำหรับการแสดงภาพด้วยไดอะมิโนเบนซิดีนที่เตรียมสดใหม่ ( DAB 0.05%; Sigma ใน 0.01% H2O2 ในบัฟเฟอร์ทริส)

ปฏิกิริยา DAB (ประมาณ 5 นาที) หยุดโดยใช้บัฟเฟอร์ Tris (ล้าง 1 10 นาที) และวางส่วนต่างๆ ใน ​​PB ที่ 4 C ข้ามคืนก่อนติดตั้งบนสไลด์เจลาติไนซ์และปล่อยให้แห้ง สไลด์ถูกทำให้แอลกอฮอล์ที่ผ่านการทำให้แห้ง (70% –100%) ก่อนที่จะถูกเคลียร์อินไซลีนและติดตั้งด้วย DPX (06522; Sigma-Aldrich) และแผ่นปิด

จำนวนเซลล์ Neu-N-positive ใน ATN ถูกใช้เพื่อกำหนดขอบเขตของรอยโรค ข้อมูลนี้ใช้ส่วนต่างๆ จากทั้งซีกซ้ายและขวาสำหรับทุกๆ หนึ่งในสี่40-μm ส่วนทั่วทั้ง ATN และพื้นที่ที่วัดปริมาณโดยใช้ ImageJ (NIH, USA) การย้อมสีเซลล์เชิงบวกของ NeuN ถูกถ่ายภาพที่ 5 วัตถุประสงค์บนกล้องจุลทรรศน์ตั้งตรง LeicaDM6 B และกล้อง DFC7000T (Leica Microsystems ประเทศเยอรมนี)

ได้รับการนับเซลล์อัตโนมัติผ่าน ImageJ (ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ, สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, NIH, สหรัฐอเมริกา) พื้นที่โดยรอบเซลล์ประสาทในภูมิภาค ATN ถูกเลือกด้วยตนเอง และรูปภาพถูกแปลงเป็นระดับ {{0}} bitgreyscale พื้นหลังถูกลบออก (กลิ้ง=40) แปลงเป็นรูปแบบมาส์กและใช้ฟังก์ชันลุ่มน้ำ และเซลล์ประสาททั้งหมดที่อยู่เหนือเกณฑ์ (เกณฑ์ 'MaxEntropy', ความหมุนเวียน 0.5–1.0) ถูกนับ

เกณฑ์การตรวจจับจะเหมือนกันในทุกส่วน นิวเคลียสของเซลล์ที่ย้อมด้วย NeuN แบบอัตโนมัติจะถูกนับในหนูแสมเก้าตัว (ห้าตัวในกลุ่ม Sham-Trace และสี่ตัวในกลุ่ม Sham-No Trace) เพื่อแสดงจำนวนเซลล์ใน ATN

การนับนิวเคลียสของ NeuN-stainednuclei แบบอัตโนมัติในหนูที่มีรอยโรค ATN ทั้งหมดถูกเปรียบเทียบโดยสัมพันธ์กับจำนวนเฉลี่ยของเซลล์ NeuN ที่พบในหนูเสแสร้ง รอยโรคที่ยอมรับได้ถูกกำหนดให้เป็นถึงเกณฑ์ของการสูญเสียเซลล์ใน ATN 50% โดยมีอย่างน้อย 25% ต่อซีกโลก สิ่งนี้สอดคล้องกับเกณฑ์รอยโรค ATN ในการศึกษาก่อนหน้า (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018)

2.9.3|Zif268 อิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนที่ลอยอิสระได้รับการประมวลผลในลักษณะที่คล้ายกันกับ NeuN แต่บ่มในแอนติบอดีปฐมภูมิ polyclonal Zif268 ของกระต่าย (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) เป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่ 4 C ใน PBSTx ที่มี 1%NGS ตามด้วยการฟักตัวในแอนติบอดีทุติยภูมิของแพะที่มีไบโอตินเลต (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) ข้ามคืนใน PBSTx และ 1% NGS

หลังจากการแสดงภาพด้วย DAB (18 นาที) การย้อมสีเซลล์ Zif268- เชิงบวกในแต่ละภูมิภาคที่สนใจถูกถ่ายภาพด้วยวัตถุประสงค์ 10 ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Leica ประเทศเยอรมนี) การนับเซลล์อัตโนมัติได้รับผ่าน ImageJ ( NIH, USA) ในลักษณะเดียวกับเซลล์ NeuNpositive ยกเว้นความเป็นวงกลมถูกตั้งค่าที่ 0.65–1.0

จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกของ Zif268- สำหรับทุกภูมิภาคใช้อัลกอริธึมเกณฑ์เดียวกัน โดยมีระหว่างสองถึงหกส่วนต่อภูมิภาคที่สนใจในหนูแต่ละตัว มีการใช้ค่าเฉลี่ย Zif268- จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกต่อ mm2 ของส่วนต่างๆ (จากทั้งสองซีกโลก) ภายในขอบเขตที่สนใจ

2.10|การวิเคราะห์ข้อมูล

การวิเคราะห์ความแปรปรวนโดยใช้ Statistica (v13; Dell Inc.) ดำเนินการเพื่อทดสอบความแตกต่างเฉลี่ยของหนูทั้งสี่กลุ่ม (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace และ ATNTrace) มีการเพิ่มปัจจัยการวัดผลซ้ำๆ เป็นเวลาหลายวัน (RAM และการเลือกปฏิบัติอย่างง่าย) บล็อกการทดลอง (งานที่เชื่อมโยงกัน) และการนับ Zif268 ในภูมิภาคที่เกี่ยวข้องหรือภูมิภาคย่อยที่น่าสนใจ

การวิเคราะห์ความแปรปรวนสำหรับทั้ง RAM และงานการเลือกปฏิบัติแบบง่ายเปรียบเทียบกลุ่มสี่กลุ่มเพื่อยืนยันว่ากลุ่มรอยโรค Sham สองกลุ่มและกลุ่มรอยโรค ATN สองกลุ่มมีความสอดคล้องกัน แต่โปรดทราบว่าไม่มีองค์ประกอบการติดตามใน RAM หรืองานการเลือกปฏิบัติแบบธรรมดา สำหรับทั้งการเลือกปฏิบัติแบบธรรมดาและงานที่เชื่อมโยงแบบคู่กันในรันเวย์ มีการใช้การเปลี่ยนแปลงข้อมูลเวลาแฝงในการทดลองแต่ละรายการเพื่อให้แน่ใจว่ามีความแปรปรวนเป็นเนื้อเดียวกัน

ในวันทดสอบใดๆ เวลาแฝงที่เปลี่ยนแปลงทำให้เกิดเวลาแฝงเฉลี่ยสำหรับการทดลองที่ไม่ได้รับรางวัลทั้งหกครั้งและการทดลองที่ได้รับรางวัลทั้งหกครั้ง สำหรับงานการเลือกปฏิบัติแบบง่ายๆ เราได้วิเคราะห์คะแนนความแตกต่างของเวลาแฝงเฉลี่ย (ค่าเฉลี่ยของการทดลองที่ให้รางวัลลบด้วยค่าเฉลี่ยของการทดลองที่ไม่ได้ให้รางวัล) แต่ไม่ใช่การทดลองที่ให้รางวัลและไม่ได้รางวัลแยกกันเนื่องจากความล้มเหลวในการจัดเก็บข้อมูล

การวัดเวลาแฝงทั้งสามมีให้ใช้งานสำหรับงานหน่วยความจำที่จับคู่กัน (การทดลองที่ไม่ได้รับรางวัล การทดลองที่ได้รับรางวัล และความแตกต่างของเวลาแฝง) เพื่อพิจารณาถึงการเปรียบเทียบหลายรายการและเพื่อปรับสมดุลข้อผิดพลาด Type I และ Type II เราใช้ระดับนัยสำคัญของ p < 0.02 สำหรับการวิเคราะห์พฤติกรรม เนื่องจากมีมาตรการที่เกี่ยวข้องสามประการในงานที่เกี่ยวข้องกับการจับคู่ (การทดลองที่ไม่ได้รับรางวัล การทดลองที่มีการให้รางวัล และค่าความต่างของเวลาแฝงเฉลี่ย)

มีการวิเคราะห์เบื้องต้นหกรายการสำหรับภูมิภาคที่สนใจสำหรับการแสดงออกของ Zif268 ความสำคัญในการวิเคราะห์เหล่านี้ถูกกำหนดไว้ที่ p < 0.01 การทดสอบ Posthoc Newman–Keuls (NK) ประเมินความแตกต่างกลุ่มแบบคู่ การวิเคราะห์ผลกระทบหลักอย่างง่ายถูกนำมาใช้เมื่อมีการโต้ตอบที่มีนัยสำคัญที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยการวัดซ้ำ

3|ผลลัพธ์

3.1|การตรวจสอบรอยโรค

หนูทั้งหมดยกเว้นหนึ่งใน 18 ตัวที่มีรอยโรค ATN ตรงตามเกณฑ์ apriori ของความเสียหายทวิภาคี 50% ต่อ ATN และความเสียหายขั้นต่ำ 25% ต่อซีกโลก ค่ามัธยฐานของความเสียหายทวิภาคีอยู่ที่ 76% ทั้งสองกลุ่มของรอยโรค ATN (ช่วง: ATN-ไม่มีร่องรอย, 61%–93%; ATN-Trace, 63%–93%; รูปที่ 2) หนูที่ถูกแยกออกมีรอยโรคที่น่าพอใจในซีกโลกเดียวเท่านั้น (ทั้งหมด 48%, ด้านซ้าย 75% และด้านขวา 20%)

รูปที่ 2d แสดงให้เห็นว่า NeuN นับสำหรับเซลล์ประสาท ATN ในหนูที่มีรอยโรค ATN (M=3388, SD=2024) ต่ำกว่าค่าที่พบในหนูที่มีรอยโรคปลอม (M=15 ทั้งหมด 339, SD=1065; จำนวนนี้คล้ายกับที่รายงานโดย Frost et al., 2020) หนูที่เป็นรอยโรคแปดใน 17 ตัว (สี่ตัวในกลุ่ม Trace และสี่ตัวในกลุ่ม No-Trace) ไม่มีความเสียหายต่อทาลามัสกลาง (MD) หรือนิวเคลียสการรวมตัวใหม่/รูปสี่เหลี่ยมขนมเปียกปูน (Re/Rh) นิวเคลียส และมีความเสียหายค่อนข้างน้อย โครงสร้างเหล่านี้ในหนูที่เหลืออีกเก้าตัวที่มีรอยโรค

เมื่อความเสียหายของ MD เกิดขึ้น มันจะอยู่ด้านหน้าซึ่งอยู่ติดกับ ATN ดังนั้น ความเสียหาย MD ได้รับการประเมินตั้งแต่ประมาณ {{0}}.72 ถึง +2.10 มม. จาก Bregma โดยมีการสูญเสียเซลล์โดยรวมตั้งแต่ 0% ถึง 41% กลุ่ม (มัธยฐาน=21%) เมื่อความเสียหายของ Re/Rh เกิดขึ้น มันก็อยู่ติดกับภูมิภาค ATN ด้วย ดังนั้นจึงประเมินได้ประมาณ 1.08 ถึง 2.04 มม. จาก Bregma โดยมีช่วงตั้งแต่ 0% ถึง 33% (ค่ามัธยฐาน=6%) โปรดทราบว่าค่าต่อการบาดเจ็บร้อยละ 100 เหล่านี้ไม่ได้แสดงถึง MD และ Re/Rhregions ทั้งหมด เนื่องจากบริเวณด้านหลังของนิวเคลียสทั้งสองไม่เสียหายในหนูที่มีรอยโรค ATN ทั้งหมด

For more information:1950477648nn@gmail.com