การวิเคราะห์การแสดงออกของ MicroRNA หลังจากการแทรกแซงกลูตามีนในการบาดเจ็บที่ไตขาดเลือดเฉียบพลัน - การกลับคืนสู่สภาพเดิม

พื้นหลัง.ขาดเลือดกลับคืนอาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน(I/R AKI) คือ กโรคไตอย่างรุนแรงมีอัตราการเสียชีวิตและการเจ็บป่วยสูง การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาเรื่องกลไกการป้องกันกลูตามีน(GLN) สู้กับ I/R AKIวิธีการ ไทยe I/R AKI หนูได้รับการจัดตั้งขึ้นและฯพณฯการย้อมสีเนื้อเยื่อไตและครีเอตินีนในซีรั่ม(SCr) และการตรวจวัดยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) miRNA ถูกจัดลำดับโดยปริมาณงานสูงในตัวอย่างเนื้อเยื่อไตของหนู. miRNA ที่แสดงออกอย่างแตกต่าง (DEmiR) ระหว่างกลุ่ม I/R และกลุ่ม I/R + GLN ได้รับการคัดกรอง และทำการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าสำหรับยีนเป้าหมายของ DEmiR ในขณะเดียวกัน เซลล์ HK-2 ของมนุษย์ได้รับการเพาะเลี้ยง และแบบจำลอง I/R ถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ DEmiRผลลัพธ์.เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม I/R ระดับ SCr และ BUN ในแต่ละช่วงเวลาจะต่ำกว่าในกลุ่ม I/R + GLN ความเสื่อมของแวคิวโอลาร์ของท่อไตในกลุ่ม I/R + GLN ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ใน 104 DEmiR เราเลือก miR-132-5p, miR- 205 และ miR-615 เป็น miRNA ที่สำคัญ การวิเคราะห์ KEGG แสดงให้เห็นว่าวิถีการส่งสัญญาณแบบ Notch, วิถีการส่งสัญญาณ PI3K-Akt และวิถีการส่งสัญญาณ cGMP ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับ GLN เทียบกับ I/R qRT-PCR ตรวจสอบการลดลงของ miR-205 ในกลุ่ม I/R เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม Sham และ I/R ของกลุ่ม GLN โมเดล I/R ถูกสร้างขึ้นด้วยเซลล์ HK-2 และการแสดงออกของ miR- 132-5p และ miR-205 ลดลง

บทสรุป.GLN ลด AKI ที่เกิดจาก I/R มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการแสดงออกของ miRNA ใน I/R หลังการรักษาด้วย GLN กระบวนการของ GLN กับ AKI ที่เกิดจาก I/R อาจเกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ Notch และ PI3K-Akt

สารสกัดจากถังที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับไต

1. บทนำ

อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน(AKI) มีลักษณะเฉพาะคือการทำงานของไตเฉียบพลันสูญเสียและกระทบต่อประชาชนปีละ 13.3 ล้านคน [1] ในบรรดาปัจจัยต่าง ๆ ไตการบาดเจ็บขาดเลือดกลับคืน(I/R) เป็นหนึ่งในสาเหตุพื้นฐานของ AKI และปัญหาที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ในการปลูกถ่ายไต[2, 3]. AKI ที่เกี่ยวข้องกับ I/R สัมพันธ์กับการเจ็บป่วยและการเสียชีวิตสูง และปัจจุบันยังไม่มีการรักษาที่มีประสิทธิผล [4]

ในการปฏิบัติทางคลินิก AKI แสดงออกโดยการสะสมของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายจากการเผาผลาญไนโตรเจน (ยูเรียและครีเอตินีน) และปัสสาวะออกลดลง [5] นอกจากนี้ยังมีความเสียหายร่วมกันต่อเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตและหลอดเลือดและการตอบสนองต่อการอักเสบที่รุนแรง [6, 7] การศึกษาล่าสุดพบว่ากลูตามีนซึ่งเป็นยาที่ใช้เป็นโภชนาการบำบัดทั่วไปสำหรับ AKI สามารถปกป้องไตโดยการลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [8, 9] ภายใต้สถานการณ์ทางสรีรวิทยาบางอย่าง กลูตามีนถูกใช้อย่างกว้างขวางเป็นเชื้อเพลิงหลักในการเผาผลาญไตและระบบภูมิคุ้มกัน [10, 11] อย่างไรก็ตาม กลไกการป้องกันเฉพาะยังอยู่ระหว่างการศึกษา

microRNAs (miRNAs) ซึ่งเป็นโมเลกุลขนาดเล็กที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดีประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 21–25 ตัว มีรายงานว่าเกี่ยวข้องกับ I/R ของไตและ AKI [12, 13] miRNA สามารถมีบทบาทในการป้องกันใน I/R ของไตโดยการลดทอนตอบสนองต่อการอักเสบ[14]. แม้ว่าผลการป้องกันของ miRNA บางชนิดต่อ IRI ของไตจะถูกค้นพบแล้ว แต่กลไกการป้องกันยังไม่ชัดเจน

จนถึงขณะนี้ มีงานวิจัยเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับกลไกของการป้องกันไตที่ใช้กลูตามีนเป็นสื่อกลางในระดับ miRNA ในการศึกษานี้ เราใช้เทคนิคการจัดลำดับความเร็วสูงเพื่อวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันของ miRNA ใน I/R ของไต หลังจากการแทรกแซงกลูตามีน เรายังสำรวจกลไกการป้องกันของกลูตามีนต่อ I/R ของไตในระดับ miRNA เพิ่มเติม

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สัตว์ทดลอง.

หนู Sprague Dawley (SD) เพศผู้ SPF จำนวน 72 ตัว น้ำหนัก 180–260 กรัม และอายุ 90–120 วัน ได้รับการจัดเตรียมโดยศูนย์สัตว์ทดลองของโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยแพทย์ซินเจียง หนูถูกเก็บไว้ในสภาพแวดล้อมที่มีอุณหภูมิคงที่ด้วยการปันส่วนรายวันที่เป็นมาตรฐานในการทดลองโดยไม่ต้องควบคุมปริมาณน้ำ +ey ได้รับการสุ่มออกเป็นสามกลุ่มเท่าๆ กัน ได้แก่ กลุ่มหลอกลวง กลุ่ม I/R และกลุ่ม I/R + GLN โปรโตคอลการทดลอง +e ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ในโรงพยาบาลในเครือ +e แห่งแรกของมหาวิทยาลัยแพทย์ซินเจียง

2.2. การจัดตั้งแบบจำลองสัตว์

หนู SD ได้รับการดมยาสลบโดยการฉีดในช่องท้องของ 2% โซเดียม เพนโทบาร์บิทอล (40 มก./กก.) กลุ่ม I/R: มีการทำกรีดช่องท้องตรงกลางและไตทั้งสองข้างถูกเปิดออก ไตด้านขวาได้รับการผ่าตัดออก และหลอดเลือดแดงไตด้านซ้ายถูกหนีบ หลังจากผ่านไป 45 นาที อุปกรณ์ยึดหลอดเลือดก็ถูกถอดออก +e สีของไตเปลี่ยนจากสีแดงเข้มเป็นสีแดงสด แสดงว่าหนูได้รับกระบวนการทางพยาธิสรีรวิทยา I/R โดยสังเกตหนูเป็นเวลา 2 ชั่วโมงหลังจากปิดช่องท้อง NS และกลูตามีน (0.75 กรัม/กก.) ถูกฉีดตามลำดับโดยใช้ปั๊มขนาดเล็กจากหลอดเลือดดำหางในอัตรา 0.5 มิลลิลิตร/นาที หลังจากการสร้างแบบจำลองเสร็จสิ้น กลุ่มเสแสร้ง: ไตด้านขวาได้รับการแก้ไขในลักษณะเดียวกันและไม่ได้หนีบหัวขั้วไตด้านซ้าย ฉีดน้ำเกลือปกติ (NS) โดยใช้ไมโครปั๊มจากหลอดเลือดดำหางในอัตรา 0.5 มล./นาที หลังจากการสร้างแบบจำลองเสร็จสิ้น

2.3. การเก็บตัวอย่างและการทดสอบ

สุ่มเลือกหนูหกตัวจากแต่ละกลุ่มในแต่ละช่วงเวลา (1 ชั่วโมง, 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมงและ 24 ชั่วโมงหลังจากการสร้างแบบจำลอง) จากนั้นหนูจะถูกฆ่าภายใต้การดมยาสลบ +e เอออร์ตาช่องท้องถูกเปิดออก และเก็บเลือดจากหลอดเลือดดำด้วยเข็มฉีดยา ซีรั่มถูกแยกออกเป็นประจำและเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ -80 องศา ไต +e ได้รับการแก้ไขอย่างรวดเร็ว จากนั้นนำเนื้อเยื่อหนึ่งชิ้นจากไตทวิภาคีไปใส่ในฟอร์มาลดีไฮด์ที่เป็นกลาง 10% และตรึงค้างคืนที่ 4 องศา ทดสอบครีเอตินีนในเลือด (SCr) และยูเรียไนโตรเจนในเลือด (BUN) ด้วยเครื่องวิเคราะห์ชีวเคมีอัตโนมัติของ Beckman บล็อกพาราฟินถูกเตรียมจากเนื้อเยื่อไตคงที่โดยกระบวนการทำให้ขาดน้ำ ความโปร่งใส การทำให้มีขี้ผึ้ง และฝังการคายน้ำ จากนั้นบล็อกพาราฟินก็ถูกตัดออกเป็นส่วนๆ และทำการย้อมสี

2.4. การวิเคราะห์ลำดับปริมาณงานสูง

RNA ทั้งหมดของตัวอย่างเนื้อเยื่อไตของหนูจากกลุ่ม I/R และกลุ่ม I/R + GLN ได้รับการสกัดและประเมินคุณภาพ ตามกระบวนการสร้างห้องสมุดลำดับ RNA ขนาดเล็ก RNA ของเนื้อเยื่อไตทั้งหมดที่บริสุทธิ์แล้วจะถูกแปลงสำเนากลับเข้าไปใน cDNA +en, การขยาย PCR, การทำให้บริสุทธิ์ และการตรวจจับคุณภาพคลัง cDNA ดำเนินการเพื่อสร้างคลังตัวอย่างลำดับให้เสร็จสมบูรณ์ จากนั้น เราได้รับข้อมูลไฟล์ FASTQ ต้นฉบับ

2.5. การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศศาสตร์

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 และ P < 0.05. การทำนายยีนเป้าหมาย +e ดำเนินการโดยใช้ฐานข้อมูล RAID และ miRanda ตามลำดับ การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของ Gene Ontology (GO) และวิถีทาง KEGG ยังดำเนินการสำหรับยีนเป้าหมายโดยใช้แพ็คเกจ ClusterProfiler R P <0.05 ถือเป็นการเสริมสมรรถนะที่มีนัยสำคัญ

2.6. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR)

ตัวอย่างถูกเก็บมาจากเนื้อเยื่อไตของหนู24 ชั่วโมงหลังการสร้างแบบจำลอง สกัด RNA ทั้งหมด และได้รับผลิตภัณฑ์ cDNA ของ miRNA ทั้งหมดโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ cDNA สายแรกของ miRNA (Shenggong, เซี่ยงไฮ้, จีน) การตรวจจับเชิงปริมาณเรืองแสงดำเนินการโดยใช้ชุด PCR เชิงปริมาณเรืองแสง miRNA (Shenggong, เซี่ยงไฮ้, จีน) พร้อมไพรเมอร์เฉพาะ 3 miRNA (ตารางที่ 1) +e วิธีการวิเคราะห์เชิงปริมาณสัมพัทธ์ (2−ΔΔCt) ถูกนำมาใช้ในการคำนวณการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miRNA เป้าหมายในแต่ละกลุ่มตัวอย่าง +e นิพจน์สัมพัทธ์ของ miRNA ในแต่ละกลุ่มคำนวณโดยใช้นิพจน์ของ U6 ในแต่ละตัวอย่างในแต่ละกลุ่มเป็นข้อมูลอ้างอิง

2.7. การวิเคราะห์ทางสถิติ.

วิเคราะห์ข้อมูลโดย SPSS190 ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ค่าเฉลี่ย ± SD) +e t-test ใช้สำหรับการเปรียบเทียบแบบคู่ระหว่างกลุ่ม P < 0.05 บ่งชี้ว่าความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติ

3. ผลลัพธ์

3.1. ผลของกลูตามีนต่อการทำงานของไตของหนูหลังการขาดเลือดกลับคืนสู่ปกติ

มีการตรวจสอบระดับ SCr และ BUN ครั้งแรกในหนูสามกลุ่ม (รูปที่ 1 (a) และ 1 (b)) +e SCr และ BUN เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องจาก 1 เป็น 24 ชั่วโมง โดยถึงจุดสูงสุดที่ 24 ชั่วโมงในกลุ่ม I/R ซึ่งสูงกว่ากลุ่มหลอกลวงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.{{11} }5) ในกลุ่ม I/R + GLN ระดับ SCr และ BUN เพิ่มขึ้นจาก 1 ชั่วโมงเป็น 12 ชั่วโมง แต่แนวโน้มที่เพิ่มขึ้นช้ากว่าแนวโน้มในกลุ่ม I/R ระดับ SCr และ BUN ในแต่ละช่วงเวลาต่ำกว่าระดับในกลุ่ม I/R (P <0.05)

3.2. การเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยาในไตของหนู

ในกลุ่มหลอกลวง หลังจากการผ่าตัด 24 ชั่วโมง การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์พบว่าท่อไตบางส่วนในบริเวณเยื่อหุ้มสมองขยายตัว และเยื่อบุท่อไตบางส่วนมีอาการบวมน้ำและการเสื่อมของแวคิวโอลาร์ และไม่มีความผิดปกติที่ชัดเจนในโกลเมอรูลี (รูปที่ 2 (ก )). ในกลุ่ม I/R ขอบพู่กันของท่อไตในบริเวณเยื่อหุ้มสมองและบริเวณเปลี่ยนผ่านของเยื่อหุ้มสมอง-ไขกระดูกหายไป เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตจำนวนมากแสดงอาการบวมน้ำและความเสื่อมของแวคิวโอลาร์ ในขณะที่บางส่วนแสดงคาริโอปีโนซิส คราบสีแดงของไซโตพลาสซึม การแข็งตัวของเนื้อร้าย การหลุดออก และการหล่อแบบหล่อ

รูปที่ 1: การเปลี่ยนแปลงระดับ Scr (a) และ BUN (b) ของหนู ณ จุดเวลาที่แตกต่างกันในแต่ละกลุ่ม ∗P < 0.05 เทียบกับกลุ่มเสแสร้ง; #P < 0.05 เทียบกับกลุ่ม I/R

รูปที่ 2: การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาของไตหนูที่ตรวจพบโดยการย้อมสี HE (a) กลุ่มเสแสร้ง (b) กลุ่ม I/R และ (c) กลุ่ม I/R + GLN บาร์: 200×.

(รูปที่ 2(ข)) ไม่มีสัญญาณของการอักเสบใน interstitium และไม่พบความผิดปกติที่ชัดเจนในโกลเมอรูลี ในกลุ่ม I/R + GLN โครงสร้างโกลเมอรูลัสภายใต้กล้องจุลทรรศน์เป็นปกติ เซลล์เยื่อบุผิว tubular บางส่วนบวมและมีการเสื่อมแบบบอลลูน เซลล์เยื่อบุผิว tubular บางส่วนหลุดออก บาง tubule ขยาย และพบการหล่อโปรตีนจำนวนเล็กน้อย (รูปที่ 2(ค))

3.3. การระบุ miRNA ที่แสดงออกอย่างแตกต่าง

การวิเคราะห์ทางสถิติถูกดำเนินการบน miRNA ที่แสดงออกมาอย่างแตกต่างซึ่งคัดออกจากกลุ่ม I/R และกลุ่ม I/R + GLN เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม I/R + GLN แล้ว miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทั้งหมด 104 รายการถูกคัดกรองในกลุ่ม I/R (รูปที่ 3 (a)) ในหมู่พวกเขา 76 รายการแสดง miRNA ที่ควบคุม และ 28 รายการแสดง miRNA ที่ลดระดับ (รูปที่ 3 (b)) นอกจากนี้ RAID และ Miranda ยังถูกใช้เพื่อทำการทำนายยีนเป้าหมายสำหรับ miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ เราพบยีนเป้าหมายทางแยก 436 ยีน (รูปที่ 3 (c)) +en เราสร้างเครือข่ายการกำกับดูแลของยีนเป้าหมาย miRNA (รูปที่ S1) ที่สำคัญ เราเลือก miR-132-5p, miR-205 และ miR-615 ที่ลดลงในกลุ่ม I/ R เป็น miRNA ที่สำคัญสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม นอกจากนี้ยังมียีนเป้าหมาย 65 ยีนสำหรับ miRNA ทั้งสามนี้ (รูปที่ 3 (d)) ตามผลลัพธ์ของการตรวจจับ qRT-PCR ในเนื้อเยื่อไต ระดับการแสดงออกของ miR-132-5p, miR-205 และ miR-615 ลดลงในกลุ่ม I/R (รูปที่ 4 ).

3.4. หน้าที่ทางชีวภาพของยีนเป้าหมาย

เพื่อระบุกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นรากฐานของผลการรักษาของ GLN เราทำการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าสำหรับยีนเป้าหมาย ในผลลัพธ์ของ GO (รูปที่ 5 (a)) การถ่ายโอนสัญญาณภายในเซลล์ การควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ต้นกำเนิด และการตอบสนองของเซลล์ต่อการขาดออกซิเจนของกระบวนการทางชีวภาพ (BP) ได้รับการเสริมสมรรถนะด้วยยีนเป้าหมาย นอกจากนี้ เส้นทางการส่งสัญญาณ Notch, เส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K-Akt และเส้นทางการส่งสัญญาณ cGMP PKG ของเส้นทาง KEGG ยังได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5 (b)) สิ่งที่น่าสนใจคือ rno-miR-132-5p มีส่วนร่วมในวิถีทาง cGMP-PKG โดยมุ่งเป้าไปที่ Mylk

บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950

เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-ร้านค้า

รับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับการติดเชื้อในไต