สารสกัดจากวัฒนธรรมเซลล์ Oenothera Biennis ที่มีกิจกรรมต่อต้านวัยของผิวหนังช่วยปรับปรุงคุณสมบัติทางกลของเซลล์

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:ริ้วรอยแห่งวัยของผิวเป็นกระบวนการที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าการเสื่อมสภาพของคุณสมบัติทางกลไกของผิวหนังอย่างค่อยเป็นค่อยไป อันเนื่องมาจากการลดลงของการผลิตเครื่องจักรเมทริกซ์นอกเซลล์และการเปลี่ยนแปลงในกระบวนการหดตัวพร้อมกัน เพื่อชะลอการลุกลามนี้ จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีนหลายชนิดที่สามารถส่งเสริมการสร้างเส้นใยยืดหยุ่นและการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ ในที่นี้ สารสกัดในน้ำสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ Oenothera ได้รับการตรวจสอบจากมุมมองทางเคมี จากนั้นจึงทำการทดสอบในหลอดทดลอง ในเซลล์ และในการทดลองภายนอกร่างกายเพื่อเป็นการเสริมในการต่อต้านริ้วรอยของผิว แสดงให้เห็นว่าสารสกัด Oenothera biennis สามารถเพิ่มการแสดงออกของยีน MYLK เพื่อส่งเสริมการหดตัวของคอลลาเจนของเมทริกซ์ แอกตินโพลิเมอไรเซชัน และการผลิตโปรตีน ECM ที่จำเป็น

คำสำคัญ:เมแทบอลิซึม; เครือข่ายโมเลกุล สารสกัดที่ชอบน้ำของการเพาะเลี้ยงเซลล์ Oenothera biennis; การหดตัวของคอลลาเจนเมทริกซ์ ผิวแก่ก่อนวัย

1. บทนำ

ริ้วรอยแห่งวัยของผิวเป็นกระบวนการที่รู้จักกันดีซึ่งเกิดจากปัจจัยภายนอกและปัจจัยภายนอก ในช่วงวัยชรา หน้าที่ทางสรีรวิทยาของผิวหนังทั้งหมดจะเสื่อมสภาพลงอย่างไม่ลดละ และการเสื่อมสภาพแบบก้าวหน้านี้จะทำลายผิว [1] อันที่จริง ผิวหนังค่อยๆ ค่อยๆ ลดคุณสมบัติทางกลลง เนื่องมาจากการผลิตโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ลดลงและการเปลี่ยนแปลงในกระบวนการหดตัวพร้อมกัน [2] ส่วนประกอบเมทริกซ์นอกเซลล์ที่สำคัญที่สุดของหนังแท้ ได้แก่ โปรตีน เช่น คอลลาเจน I และ IIl, ลามินิน, เพอริโอติน, tenascin, อีลาสติน, ไฟโบรเนกติน และโปรตีโอไกลแคน เนื่องจากปริมาณสัมพัทธ์และสถานะการพับของพวกมันมีบทบาทสำคัญในการทำงานร่วมกันระหว่างเซลล์และ เมทริกซ์รับประกันเนื้อสัมผัสที่เหมาะสมของผิวหนังชั้นหนังแท้ [3] ตัวอย่างเช่น ในพื้นที่นอกเซลล์ ไฟโบรเนกตินมีบทบาทสำคัญในการประกอบเมทริกซ์เนื่องจากเป็นสะพานเชื่อมระหว่างตัวรับที่ผิวเซลล์ (เช่น อินทิกริน) กับคอลลาเจน โปรตีโอไกลแคน และโมเลกุลการยึดเกาะโฟกัสอื่นๆ แผ่นลามินินมีส่วนช่วยในโครงสร้างของเมทริกซ์นอกเซลล์และปรับการยึดเกาะ การแยกตัว การโยกย้าย ความเสถียรของฟีโนไทป์ และความต้านทานต่อการตายของเซลล์ อีลาสตินยังมีความสำคัญต่อการยึดเกาะของเซลล์และการย้ายเซลล์ และมีความสามารถในการมีส่วนร่วมในการส่งสัญญาณของเซลล์ ไฟบริลลินมีปฏิสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโทรโพอีลาสตินและอินทิกรินอย่างใกล้ชิด และมีความสำคัญต่อการประกอบอีลาสตินให้เป็นเส้นใยยืดหยุ่น ยอดเยี่ยมมีการเชื่อมต่ออย่างแน่นหนากับเยื่อหุ้มชั้นใต้ดิน เส้นใยยืดหยุ่น และส่วนประกอบอื่น ๆ ของเมทริกซ์นอกเซลล์ และมีส่วนร่วมในการก่อตัวของเส้นใยยืดหยุ่น Tenascins เป็น extracellular matrix (ECM) polymorphic glycoproteins ซึ่งเป็นสื่อกลางในกระบวนการ fibrotic เพื่อให้สามารถซ่อมแซมเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ [4]นอกจากนี้ กระบวนการหดตัวของผิวหนังยังขึ้นอยู่กับการกระทำของไฟโบรบลาสต์ ซึ่งเป็นเซลล์ที่มีจำนวนมากที่สุดในเมทริกซ์ผิวหนัง พวกเขาสร้างความตึงเครียดของผิวอย่างเหมาะสม ส่งเสริมการติดต่อระหว่างส่วนประกอบเมทริกซ์ ซึ่งส่งผลต่อความกระชับ ความหนาแน่น และความต้านทานของหนังแท้ บนพื้นฐานของโครงสร้างโครงร่างเซลล์ของเซลล์ มีเครื่องจักรแอคติน-ไมโอซิน ซึ่งกำหนดการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นในรูปร่างและโครงสร้าง อันที่จริงการยึดเกาะของแอคตินและไมโอซินทำให้เกิดโครงสร้างเซลล์ที่มีขนาดกะทัดรัดมากขึ้น นำเส้นใยมาใกล้กันมากขึ้น รับประกันการพัฒนาของเนื้อเยื่อที่แข็งแรงและกะทัดรัด และป้องกันการสลายตัวของเส้นใยที่ส่งผลให้เกิดริ้วรอย อย่างไรก็ตาม ความสามารถของไฟโบรบลาสต์ในการหดตัวและยืดตัวได้หายไปบางส่วนในช่วงหลายปีที่ผ่านมา เนื่องจากเซลล์ที่มีอายุมากไม่สามารถทำหน้าที่ได้อย่างถูกต้องและสมบูรณ์อีกต่อไป เนื่องจากแรงทางกลที่ต่ำกว่า ไฟโบรบลาสต์จึงมีสัณฐานที่โค้งมนและบิดเบี้ยวมากกว่าแบบที่ยืดออก [5] หลักฐานบางชิ้นระบุว่าในช่วงอายุมากขึ้น การสังเคราะห์โปรตีนที่เรียกว่า MYLK (Myosin Light Chain Kinase) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ MYLK มีกิจกรรมไคเนสที่เกิดจากฟอสโฟรีเลชั่นของโดเมน myosin จำเพาะ ซึ่งตั้งชื่อว่า myosin regulatory light chain สามารถกระตุ้นการจับตัวของแอคติน ดังนั้นจึงส่งเสริมการหดตัวของเซลล์ [6]ไบโอฟลาโวนอยด์เมื่อตรวจพบกิจกรรมที่ต่ำของโปรตีนนี้ ตัวอย่างเช่น เนื่องจากการแสดงออกของโปรตีนที่น้อยกว่า การลดลงที่สอดคล้องกันของการหดตัวของเมทริกซ์คอลลาเจน [7] และแอกตินโพลิเมอไรเซชัน [8] ถูกวัด แอสเซมบลีของโครงร่างโครงร่างของแอคตินไม่เพียงเชื่อมโยงกับการเคลื่อนที่ของเซลล์และความสามารถในการหดตัวเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการผลิตโปรตีนเมทริกซ์ ECM ผ่านการกระตุ้นของรีเซพเตอร์ TGF -II (TGFBRII)[9] TGFBRII อยู่ในคอมเพล็กซ์ตัวรับผิวเซลล์ TGF ซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนจำนวนมากที่เข้ารหัสส่วนประกอบ ECM ผ่านการกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัส Smad รวมถึงคอลลาเจน ลามินิน ไฟโบรเนกตินและโปรตีโอไกลแคน [10] การถอดแยกชิ้นส่วนโครงกระดูกของแอคตินปรับลดรีเซพเตอร์ TGF -Il ในทางกลับกัน การควบคุมที่ลดลงนี้จะลดการผลิตคอลลาเจนและโปรตีน ECM อื่นๆ ส่งผลให้สูญเสียมวลผิวหนังและความเปราะบางของผิวหนัง

ที่จริงแล้ว ส่วนผสมเครื่องสำอางจำนวนมากมุ่งเป้าไปที่การกระตุ้นการสังเคราะห์ปัจจัยสำคัญหลายประการที่รับผิดชอบในการรักษาความกระชับที่ถูกต้องของเมทริกซ์ทางผิวหนังและการหดตัวของผิวที่ดี ในสถานการณ์สมมตินี้ สารสกัดที่ได้จากสายพันธุ์ Oenothera biennis (Evening Primrose) ซึ่งเป็นของตระกูล Onagraceae ได้รับความสนใจอย่างกว้างขวางเนื่องจากมีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ เช่น กรดไขมัน ฟีนอล ไตรเทอร์พีน และฟลาโวนอยด์ ซึ่งได้รับแล้ว ผ่านการทดสอบในการรักษาโรคผิวหนังต่างๆ [11] ในทางกลับกัน สารเมตาโบไลต์เหล่านี้บางชนิดก็ถูกรายงานเพื่อยับยั้งตัวกลางการอักเสบ เช่น อินเตอร์ลิวคิน 1 (IL-1), อินเตอร์ลิวคิน 6 (IL-6), ไซโตไคน์ และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก (TNF-)[12 ]. นอกจากนี้ สารสกัดจากชิ้นส่วนทางอากาศ Oenothera biennis ยังปกป้องเซลล์ HaCaT จากความเสียหายของ DNA ที่เกิดจาก H, O และการตายของเซลล์โดยการปิดกั้นความเสียหายของเซลล์เนื่องจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านกลไกที่เกี่ยวข้องกับการกำจัด ROS และเส้นทางส่งสัญญาณ Nrf2/HO-1 13]. นอกจากนี้ น้ำมัน Oenothera biennis ซึ่งอุดมไปด้วยไขมัน ยังได้รับการเสนอให้เป็นมอยส์เจอร์ไรเซอร์ที่ดีสำหรับผู้ป่วยโรคเรื้อนกวาง เนื่องจากมีความสามารถในการซึมซาบเข้าสู่ผิวหนังได้ง่าย [14] น่าเสียดายที่การเตรียมสารสกัดจากพืชที่ปลูกโดยใช้เครื่องสำอางอาจมีข้อเสียอยู่บ้าง: ประการแรกพวกเขาสามารถปนเปื้อนด้วยสารพิษหรือสารก่อภูมิแพ้เช่นยาฆ่าแมลงปุ๋ยหรือสารมลพิษ จากนั้น พืชจะต้องเผชิญกับความเครียดที่คาดเดาไม่ได้และสภาวะตามฤดูกาล หรือความผันแปรของสารอาหารที่มีอยู่ ซึ่งสามารถกระตุ้นให้เกิดการสังเคราะห์สารที่ไม่คาดคิดได้ นอกจากนี้ สารสกัดอาจมีจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรค ซึ่งลดคุณภาพของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย ในทางกลับกัน ข้อเสียทั้งหมดเหล่านี้ก็รวมเข้ากับความเสี่ยงที่จะมีเนื้อหาที่แปรผันของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิและความสามารถในการทำซ้ำต่ำ เพื่อเอาชนะจุดอ่อนเหล่านี้ การใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์พืชในเครื่องสำอางจึงได้รับความนิยมและเป็นที่ชื่นชมอย่างมาก เพราะมันเอาชนะข้อเสียหลายประการที่กล่าวไว้ข้างต้น [15]

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

ในการศึกษานี้ สารสกัดที่ชอบน้ำของการเพาะเลี้ยงเซลล์ Oenothera biennis (ObHEx) มีลักษณะเฉพาะอย่างครบถ้วนโดยวิธีการขั้นสูงที่ใช้แมสสเปกโตรเมตรีโดยได้รับความช่วยเหลือจากชีวสารสนเทศ และทดสอบในการทดสอบทางชีวเคมีและทางชีววิทยาหลายแบบ ส่วนผสมประกอบด้วยสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพของลิกแนนและไตรเทอร์พีนเป็นหลัก เช่น กรดอาร์จูโนลิกและเอเซียติก ซึ่งเคยเกี่ยวข้องกับการผลิตโปรคอลลาเจน 1 ในไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ [16,17] สารสกัดได้รับการตรวจสอบถึงความสามารถในการเพิ่มการแสดงออกของ MYLK ส่งเสริมการหดตัวของคอลลาเจนของเมทริกซ์ แอกตินโพลิเมอไรเซชัน และการผลิตโปรตีน ECM ที่ควบคุมโดย TGF ซึ่งสนับสนุนการหดตัวของผิวหนังชั้นหนังแท้ จึงชะลอความชราของผิว

2. ผลลัพธ์

2.1.การวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณของสารสกัดที่ละลายน้ำได้ของการเพาะเลี้ยงเซลล์ Oenothera Biennis

วิเคราะห์ UPLC-MS/MS ของ ObHEx และใช้ข้อมูลสเปกโตรเมตรีความละเอียดสูงสำหรับการแสดงลักษณะทางเคมีโดยใช้ Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) ซึ่งเป็นระบบแมสสเปกโตรเมตรีบนเว็บที่ช่วยในการระบุและบันทึกย่อของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ (กรมอุทยานฯ)[18]. โดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อเป็นฐานความรู้ที่เข้าถึงได้แบบเปิดสำหรับองค์กรทั้งชุมชนและสำหรับการแบ่งปันข้อมูลแมสสเปกโตรเมตรี (MS/MS) ที่แตกแฟรกเมนต์แบบดิบ ประมวลผล หรือใส่คำอธิบายประกอบ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การค้นหาไลบรารีสเปกตรัม GNPS และงาน Feature-Based Molecular Networking (FBMN) ได้ดำเนินการ: การวิเคราะห์ครั้งแรกช่วยให้เราสามารถระบุสารประกอบธรรมชาติ เปรียบเทียบสเปกตรัม MS/MS ของพวกมันกับเมตาบอไลต์ที่มีลักษณะเฉพาะเชิงโครงสร้าง อันที่สองกับกลุ่มที่เกี่ยวข้อง NPs ภายในเครือข่ายเนื่องจากรูปแบบการกระจายตัวของ MS/MS ที่คล้ายคลึงกันถูกแสดงโดยโมเลกุลที่มีโครงสร้างคล้ายคลึงกัน [19] ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 1 และตารางที่ 1 NPS จำนวนมากถูกระบุอย่างไม่ต้องสงสัยว่าเป็นของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิหลายกลุ่ม ส่วนใหญ่เป็นลิกแนน (ข้างซัลวาดอร์และลิริโอเดนดรอน) และไตรเทอร์พีน (กรดมูริอาติก กรดแอริอูโนลิก กรดเอเซียติก และเฮเดอราเจนิน) สปีชีส์เคมีที่ไม่ได้ระบุโดย GNPS ถูกกำหนดตามวรรณกรรม

เป็นตัวอย่างของการใช้ GNPS เครือข่ายที่ได้มาจากการวิเคราะห์ FBMN ได้รับการรายงานในรูปที่ 2a ซึ่งแสดงให้เห็นว่า ObHEx มีไตรเทอร์พีนที่ไม่มีลักษณะเฉพาะอื่นๆ อีกมากมายที่เกี่ยวข้องกับกรด muriatic (18, m/z 503.3389, RT 21.89 นาที: การระบุกรด muriatic มี ได้รับการยืนยันผ่านการเปรียบเทียบกับมาตรฐานการวิเคราะห์) ตัวอย่างเช่น สปีชีส์ที่ไม่มีลักษณะเฉพาะก่อนหน้านี้หลายชนิดที่ m/z 701 และ 665 ถูกระบุว่าเป็นรูปแบบไกลโคซิเลตที่เกี่ยวข้องกับกรด muriatic หรือไอโซเมอร์ตามลำดับ ให้ความชุ่มชื้นหรือไม่มีโมเลกุล H2O สองโมเลกุลตามลำดับ

นอกจากนี้ รายงานไอออนที่ m/z 729, 703, 699,687,685, 683 ที่มาจากไกลโคซิเลชันตามลำดับบวกกับ H, O ของสปีชีส์ 2 ตัวที่ m/z531, 505,501, 489,487 และ 485: การระบุแบบเอกพจน์ยังไม่บรรลุผล แต่ พวกเขาทั้งหมดควรจะเป็น triterpenes ซึ่งเกี่ยวข้องกับกรด muriatic หรือ congeners เนื่องจากเส้นทางการกระจายตัวของ MSMS เมื่อเร็ว ๆ นี้ triterpenes จำนวนมากที่มี m/ 501 และ 485 ถูกแยกออกจาก Oenothera, Oenothera Maritima และโครงสร้างของพวกเขาได้ ได้รับการอธิบายโดยอาศัยข้อมูลทางสเปกโทรสโกปี ซึ่งสัมพันธ์กับผลลัพธ์ของเรา [20]

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

การวิเคราะห์ FBMN ยังให้ข้อมูลเกี่ยวกับเมแทบอไลต์ที่ m/z 617.3862 (ไอออน MS2 ที่ m/z 453,145 และ 119) ที่มีอยู่ในเครือข่ายโมเลกุลที่แสดงในรูปที่ 2b และไม่ได้รายงานในเอกสารประกอบสำหรับสปีชีส์ Oenothera ค่า m/z นี้และการแตกแฟรกเมนต์ตรงกันกับ 2-OEp-coumaroyl apostolic acid หรือไอโซเมอร์ของกรด อย่างน้อยก็พิสูจน์การมีอยู่ของ triterpene coumaroyl และ caffeoyl esters ในสารสกัด อันที่จริง MS สเปกตรัมของสปีชีส์ที่ m/z 649 (RT 25.72 และ 27.19) แสดงการมีอยู่ของไอออนที่ m/z 179, 161 และ 135 เนื่องจากความแตกแยกของมอยอิตีของกรด caffeic ในขณะที่สเปกตรัม MS2 ของสปีชีส์อื่น รายงานในรูปที่ 2b ที่ m/z 633(RT 26.88,27.20,28.12 และ 28.43),649 (RT24.18,24.65,24.83) และ 661 (RT 30.28) แสดงไอออนที่ m/z 145 และ 119 ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะ สำหรับคูมาโรอิล มอยอิตี

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)ภายในช่วงที่ทดสอบ นอกจากนี้ ขีดจำกัดของการตรวจจับ (LOD) และขีดจำกัดของการหาปริมาณ (LOO) ระบุว่าวิธีการที่ใช้มีความไวสูงแตกต่างกัน ผลที่ได้จากการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (ตารางที่ 3) แสดงให้เห็นว่า liriodendron และ hederagenin เป็นตัวแทนหลักของลิกแนนและไตรเทอร์พีนตามลำดับ

2.3.การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน MYLK ใน HDF

กิจกรรมของ ObHEx ได้รับการทดสอบใน HDF เกี่ยวกับการแสดงออกของยีน MYLK ซึ่งเข้ารหัสสำหรับไคเนสที่รับผิดชอบสำหรับฟอสโฟรีเลชั่นสายเบาของไมโอซิน (รูปที่ 3a) ผลการศึกษาพบว่าการรักษาด้วยสารสกัดที่ความเข้มข้นทั้งสองเพิ่มการแสดงออกของยีน MYLK ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์ คล้ายกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก TGF-

2.4. การวิเคราะห์ความสามารถในการหดตัวของคอลลาเจนเมทริกซ์

เพื่อประเมินการทำงานของ ObHEx ต่อความสามารถในการหดตัวของเส้นใยคอลลาเจน เราใช้ HDF ที่กระจายอยู่ในแผ่นเจลคอลลาเจน [21] ดังแสดงในรูปที่ 3b สารสกัด ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า กระตุ้นให้เกิดการหดตัวของแผ่นคอลลาเจนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ถึงผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อความกระชับของคอลลาเจน การบำบัดด้วย ML7(1-(5-iodonaphthalene-1-sulfonyl)-1H-hexahydro-1,4-diazepine), สารยับยั้ง MYLK ยกเลิกการเพิ่มนี้ ซึ่งบ่งชี้ว่าทั้งสารสกัดและ TGF- ทำหน้าที่ผ่าน MYLK เพื่อการหดตัวของแผ่นคอลลาเจน

2.5.การวัดระดับแอคตินพอลิเมอไรเซชัน

ความสามารถของ ObHEx ในการกระตุ้นแอกตินโพลิเมอไรเซชันถูกตรวจสอบโดยการวัดระดับของแอคตินโพลีเมอร์ในเซลล์ บำบัดด้วยสารสกัดและ TGF- กลุ่มควบคุมเชิงบวก เพียงอย่างเดียวและต่อหน้า ML7 ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3c การบำบัดด้วยความเข้มข้นทั้งสองของสารสกัดทำให้ปริมาณของพอลิเมอร์แอคตินเพิ่มขึ้นประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ 33 เปอร์เซ็นต์ของ TGF-ซื้อ cistancheอีกครั้ง การฟักไข่ล่วงหน้าด้วย ML7com ได้ยกเลิกผลกระทบนี้โดยสิ้นเชิง ซึ่งบ่งชี้ถึงการมีส่วนร่วมของ MYLK ในการเกิดพอลิเมอไรเซชันของเส้นใยแอคติน

2.6. การวิเคราะห์เส้นทาง TGF RII/SMAD ใน HDF

เพื่อตรวจสอบว่าการเพิ่มขึ้นของแอคตินพอลิเมอไรเซชันและการหดตัวของคอลลาเจนของเซลล์ที่รับการรักษาด้วย ObHEx นั้นสัมพันธ์กับการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางโดย TGF RII หรือไม่ เราสังเกตการแสดงออกของยีน TGF RII ก่อนแล้วจึงถ่าย HDF ด้วย SMAD{{ 0}}luciferase reporter plasmid และประเมินการเพิ่มขึ้นของกิจกรรม luciferase ในการตอบสนองต่อการรักษาด้วย ObHEx ผลลัพธ์ที่รายงานในรูปที่ 3d,e ระบุว่าการรักษาด้วย ObHEx ที่ 0.002 เปอร์เซ็นต์ และ 0.006 เปอร์เซ็นต์ เพิ่มการแสดงออกของ TGF RII ในลักษณะที่คล้ายกับ TGF- ซึ่งใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก และในทำนองเดียวกัน กิจกรรม luciferase ที่เชื่อมโยงกับ SMAD เพิ่มขึ้น 80 และ 40 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ การลดสัญญาณที่มีนัยสำคัญได้มาเมื่อเซลล์ถูกบำบัดด้วย ML7 ซึ่งแสดงให้เห็นด้วยว่ากิจกรรมนี้เชื่อมโยงกับ MYLK

2.7.การวิเคราะห์ Pro-Collagen I, Tropoelastin และ Periostin

ผลที่ตามมาของการเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ TGF RII เราวิเคราะห์การสังเคราะห์โปรตีนเมทริกซ์ภายนอกเซลล์หลัก เช่น โปรคอลลาเจนชนิดที่ 1, โทรโพอีลาสติน และเพอริออสตินใน HDF ที่บำบัดด้วย ObHEx ที่ 0.002 เปอร์เซ็นต์ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3f, ObHEx เพิ่มการผลิตโปรตีนที่ระบุประมาณ 98 เปอร์เซ็นต์ ,75 เปอร์เซ็นต์ และ 51 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ คล้ายกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก TGF- การวัดถูกดำเนินการโดย ELISA assay โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะต่อโปรคอลลาเจน I, โทรโปอีลาสติน และเพอริออสติน

2.8.การวิเคราะห์ MYLK, Phospho-Myosin, Collagen I และ Tropoelastin บน Ex-Vivo Skin Explants

ดังแสดงในรูปที่ 4a-c ObHEx ได้ผลิต MYLK และ myosin ที่มีฟอสโฟรีเลตเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสารสกัดจากผิวหนังมนุษย์

นอกจากนี้ยังวิเคราะห์การเหนี่ยวนำคอลลาเจน I และการเหนี่ยวนำโทรโพอีลาสตินในผลิตภัณฑ์เสริมความงามของผิวหนังที่ปรับสภาพด้วย ObHEx แล้วบำบัดด้วยไฮโดรคอร์ติโซนเป็นเวลา 8 วันเพื่อจำลองการเสื่อมสภาพตามลำดับเวลา [22] การรักษาด้วยไฮโดรคอร์ติโซนช่วยลดปริมาณคอลลาเจน I และโทรโพอีลาสตินได้มากกว่า 100 เปอร์เซ็นต์ และการมีอยู่ของ ObHEx 0.002 เปอร์เซ็นต์ช่วยฟื้นฟูปริมาณของ tropoelastin ได้เกือบ 91 เปอร์เซ็นต์ และของคอลลาเจน 120 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ แอสคอร์เบตใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก (รูปที่ 4d-f) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นถึงผลการต่อต้านริ้วรอยที่อาจเกิดขึ้นของ ObHEx โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีประสิทธิภาพในการเพิ่มความกระชับของผิวโดยทำหน้าที่เกี่ยวกับส่วนประกอบของเมทริกซ์ผิวหนัง

2.9.Atomic Force Microscopy (AFM) ใน Explants ผิวหนัง

เพื่อรวบรวมข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับคุณสมบัติทางชีวกลศาสตร์ของผิวหนังที่ได้รับการส่งเสริมโดยการรักษาด้วย ObHEx เราได้ประเมินความยืดหยุ่น ซึ่งเป็นคุณสมบัติทางกลที่แท้จริงของตัวอย่างผิวหนังในแง่ของโมดูลัส Young [23] ตามที่อธิบายไว้ในหัวข้อที่ 4 ในการคำนวณโมดูลัสยืดหยุ่น ทั้งในตัวอย่างผิวที่บำบัดแล้วและที่ไม่ผ่านการบำบัด เราได้รวบรวมเส้นโค้งแรงด้วยกล้องจุลทรรศน์อะตอมฟอร์ซ (AFM) และนำมาปรับใช้กับโมเดลเฮิรตซ์ [24,25] ดังแสดงในรูปที่ 5 การรักษาตัวอย่างผิวด้วยสารสกัดมีค่าโมดูลของ Young ต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ผ่านการบำบัด ซึ่งบ่งบอกถึงการปรับปรุงคุณสมบัติความยืดหยุ่นของผิว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ตัวอย่างผิวหนังที่ไม่ผ่านการบำบัดเปิดเผยค่าโมดูลัสเฉลี่ยของ Young เท่ากับ 0.37±0.15 GPa ในขณะที่ตัวอย่างผิวหนังที่บำบัดด้วย ObHEx แสดงค่าเฉลี่ยที่ต่ำกว่า 0.{{11 }}7±0.02 เกรดเฉลี่ย ค่าโมดูลัสของ Young ของตัวอย่างผิวหนังเป็นไปตามวรรณกรรม [26-28]

3. อภิปราย

การเพาะเลี้ยงเซลล์พืชเป็นแนวทางที่มีแนวโน้มมากที่สุดสำหรับการผลิตอย่างยั่งยืนของเมตาโบไลต์ทุติยภูมิของพืชที่น่าสนใจในเชิงพาณิชย์ โดยนำเสนอวัสดุอย่างต่อเนื่องโดยใช้วิธีการเพาะเลี้ยงในวงกว้างและสร้างระบบที่ยั่งยืนและเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม [29,30] สารสกัดจากการเพาะเลี้ยงเซลล์พืชพบการใช้งานที่ได้ผลในภาคการดูแลสุขภาพและเครื่องสำอาง เนื่องจากมีข้อดีบางประการที่เกี่ยวข้อง (i) สารสกัดจากเซลล์พืชมีสารสังเคราะห์ทางชีวเคมีในสภาวะของห้องปฏิบัติการที่มีการควบคุมการเจริญเติบโต (i) สารสกัดจากผลที่ได้มาจากกระบวนการผลิตที่ได้มาตรฐาน รับประกัน ลักษณะเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณที่เหมือนกันของชนิดพันธุ์ที่ได้รับ (ii) สารสกัดปราศจากสารปนเปื้อน เช่น จุลินทรีย์ สารกำจัดวัชพืช ยาฆ่าแมลง และสารฆ่าเชื้อรา (iv) สารสกัดเหล่านี้ไม่ขึ้นกับความผันผวนทางภูมิศาสตร์หรือสิ่งแวดล้อม และพันธุ์พืชสามารถอนุรักษ์ไว้ได้ในอนาคต รุ่น ในการประกวดครั้งนี้ ได้มีการตรวจสอบสารสกัดจากน้ำเพาะเลี้ยงเซลล์ Oenothera biennis (ObHEx) ว่าเป็นแหล่งของโมเลกุลออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่มีแนวโน้มว่าจะมีคุณสมบัติในการต่อต้านริ้วรอยของผิวหนัง อันที่จริง ObHEx ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ UPLC-MSMS ที่มีความละเอียดสูงควบคู่ไปกับแนวทางชีวสารสนเทศเพื่อให้ได้คุณลักษณะเชิงโครงสร้างที่กว้าง การระบุลักษณะเฉพาะแบบผสมเกิดขึ้นได้โดยใช้ GNPS เพื่อเร่งกระบวนการระบุ เปรียบเทียบสเปกตรัม MS/MS กับเมตาบอไลต์ที่มีลักษณะเฉพาะเชิงโครงสร้าง และยิ่งกว่านั้น เปิดเผยสปีชีส์ใหม่ที่ไม่คาดคิด โดยจัดกลุ่ม NP ที่คล้ายคลึงกันภายในเครือข่าย นอกจากนี้ เวลาเก็บรักษา การวัดมวลที่แม่นยำ และการวิเคราะห์ MS2 ยังถูกเปรียบเทียบกับมาตรฐาน และข้อมูลทั้งหมดถูกจับคู่กับเอกสารประกอบ ลิกแนนและไตรเทอร์พีนออกฤทธิ์ทางชีวภาพ เช่น ซัลวาดอร์ ลิริโอเดนดรอน กรด my-anthemic กรดอาร์จูโนลิก กรดเอเซียติก และเฮเดอราเจนิน Liriodendron [31] และกรด muriatic [32] มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ในขณะที่ hederagenin มีคุณสมบัติในการต่อต้านริ้วรอยของผิวอันเนื่องมาจากการลดลงของการเกิดออกซิเดชันของเซลล์และการกระตุ้นการทำงานของโปรตีเอสโซม [33] อย่างไรก็ตาม กรดอาร์จูโนลิกและเอเซียติกถูกพิจารณาว่ามีส่วนสำคัญต่อกิจกรรมการทดสอบบางอย่างต่อไปนี้ เนื่องจากกรดเหล่านี้กระตุ้นการสังเคราะห์คอลลาเจน 1 อันที่จริง มีการแสดงให้เห็นแล้วว่า ObHEx ปรับปรุงคุณสมบัติทางชีวกลศาสตร์ของผิวหนัง ซึ่งส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับปริมาณสัมพัทธ์ของส่วนประกอบต่างๆ ของ ECM และวิธีการที่ไฟโบรบลาสต์สามารถหดตัวและให้ความตึงเครียดที่เหมาะสมกับเส้นใยผิวหนังcistanchในความเป็นจริง ObHEx ส่งเสริมการหดตัวของคอลลาเจนเมทริกซ์และแอกตินพอลิเมอไรเซชันโดยการเพิ่มการแสดงออกของยีน MYLK ช่วยเพิ่มแรงหดตัวของไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนัง การประกอบโครงกระดูกของแอคตินจะควบคุมตัวรับ TGF-type II และสอดคล้องกับการกระตุ้นการส่งสัญญาณ TGF- /Smad จะเพิ่มระดับของโปรตีน ECM ที่ควบคุมโดย TGF อันที่จริง ObHEx กระตุ้นการผลิตคอลลาเจนชนิดที่ 1, periostin และ tropoelastin ดังนั้น คุณสมบัติทั้งหมดเหล่านี้จึงเป็นส่วนผสมที่ดีในการเลือกใช้ในสูตรเครื่องสำอางเพื่อต่อสู้กับการสูญเสียความกระชับและความยืดหยุ่นของผิวตามวัย สมมติฐานนี้ได้รับการสนับสนุนจากผลลัพธ์ที่ได้จากการวิเคราะห์ AFM ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการรักษาชิ้นผิวด้วย ObHEx ทำให้เกิดการปรับปรุงคุณสมบัติทางกลของผิวหนัง ซึ่งตรวจพบว่าเป็นโมดูลัสของ Young ที่ลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่าความตึงและความแข็งแกร่งของผิวหนังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

4. วัสดุและวิธีการ

4.1.การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชและการเตรียมสารสกัด

พืช Oenothera biennis จัดทำโดย GEEL Floricultura ss และมีต้นกำเนิดจากอิตาลี การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้มาจากใบของพืช Oenothera biennis โดยการกระตุ้นการเพิ่มจำนวนของเซลล์ Meristematic บนจานวุ้นที่เป็นของแข็งจนกระทั่งได้รับแคลลัส เซลล์ถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของเหลว (Gamborg B5, เสริมด้วย 24 dichlorophenoxyacetic acid(1 มก./ลิตร), อะดีนีน(1 มก./ลิตร) และไคเนติน (0.01 มก./ลิตร)) จากนั้น , เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงเป็นวัฒนธรรมแขวนลอยภายใต้การสั่นของออร์บิทัล เมื่อได้วัฒนธรรมที่ประมาณ 150 กรัม/ลิตร เซลล์ถูกรวบรวมและสลายในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ที่ pH 7.4 เพื่อเตรียมสารสกัดที่ละลายน้ำได้ ซึ่งถูกไลโอฟิไลซ์ ผงถูกละลายในน้ำหรืออาหารเลี้ยงเซลล์ที่ความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบ

4.2. การวิเคราะห์ UPLC-MSMS สำหรับการแสดงลักษณะทางเคมี

ObHEx(5{{10}} มก./มล.) ถูกเตรียมและส่งไปยังการสกัดแบบไบฟาซิกบิวทานอล/น้ำ เศษส่วนของบิวทานอลถูกทำให้แห้งและละลายในเมทานอล (10มก./มล.) ก่อนการวิเคราะห์ UPLC-MS/MS ได้ดำเนินการบนเครื่อง Q-Exactive Classic Mass Spectrometer จาก Thermo-Scientific(Waltham, MA, USA) ที่ติดตั้งระบบ UPLC ของ Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 โครมาโตกราฟีทั้งหมดดำเนินการโดยใช้คอลัมน์ Phenomenex Luna③C18 100 A (150×2.0 มม. ขนาดอนุภาค 3 ไมโครเมตร) ที่ 40 องศาเซลเซียส และอัตราการไหล 0.200 มล./นาที ปริมาตรของการฉีดคือ 5 ไมโครลิตร เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย A (น้ำจาก ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, สหราชอาณาจักรที่กรดอะซิติก 0.1 เปอร์เซ็นต์) และ B (อะซิโตไนไตรล์ 100 เปอร์เซ็นต์จาก ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) โดยใช้การชะแบบเกรเดียนต์ จาก5 เปอร์เซ็นต์ B ที่0-5นาที5-14 เปอร์เซ็นต์ B ที่5-8 นาที14-32 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 8-11 นาที 32-95 เปอร์เซ็นต์ ค้างคาว {{ 26}}นาที,95-98 เปอร์เซ็นต์ Bat32-33 นาที,98 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 33-38นาที,98-5 เปอร์เซ็นต์ Bat38-39 นาที และ 5 เปอร์เซ็นต์ B ที่ { {34}} นาที การวิเคราะห์ MS และ MSMS ทั้งหมดดำเนินการในโหมด ESI เชิงลบด้วยอัตราการไหลของก๊าซฝักที่ 30 (หน่วยตามอำเภอใจ) อัตราการไหลของก๊าซเสริมที่ 5 (หน่วยตามอำเภอใจ) แรงดันสเปรย์ที่ 3.2 kV และอุณหภูมิของเส้นเลือดฝอยและ อุณหภูมิเครื่องทำความร้อนแก๊สเสริมที่ 300 องศา ข้อมูลได้มาโดยใช้โหมด Full MS/dd-MS2 (Top5) การตั้งค่า MS แบบเต็มคือ: ความละเอียด 70.000, เป้าหมาย AGC 1×106, IT สูงสุด 200ms และช่วงการตั้งค่า 100 ถึง 800 m/z.dd-MS2 ได้แก่: ความละเอียด 17.500, เป้าหมาย AGC 2×105 สูงสุด IT 65 ms หน้าต่างการแยก 1.5 m/z และ NCE 35

ได้รับการตรวจสอบด้วยตนเอง ข้อมูล mzXML ถูกประมวลผลโดยใช้ Mzmine 2.53 ก่อนงาน Feature-Based Molecular Networking (FBMN) บน GNPS ขั้นตอนการตรวจจับมวลดำเนินการโดยใช้เครื่องตรวจจับมวลแบบเซนทรอยด์ โดยยังคงระดับเสียงไว้ที่ 5 × 1{{10}}3 การสร้างโครมาโตแกรมของไปป์ไลน์การวิเคราะห์ข้อมูลอัตโนมัติ (ADAP) เกิดขึ้นได้ด้วยการตั้งค่าต่อไปนี้: ขนาดกลุ่มขั้นต่ำในการสแกนจำนวน 5 ครั้ง เกณฑ์ความเข้มของกลุ่ม 5 × 1{{20}}³ ความเข้มสูงสุดต่ำสุด ของ 5× 10 บวก ,m/z พิกัดความเผื่อของ 0.01 m/z หรือ 10 ppm การแยกโครมาโตแกรมทำได้โดยใช้ Wavelets(ADAP) เป็นอัลกอริทึม, ขีดจำกัด S/N ที่ 3, ความสูงของฟีเจอร์ขั้นต่ำ 1 × 105, ค่าสัมประสิทธิ์/ขีดจำกัดพื้นที่ 5, ช่วงระยะเวลาสูงสุดที่ 0{{ 18}}.00 นาที และช่วงเวฟเล็ต RT ที่ 000-0.05 โครมาโตแกรมถูกแยกไอโซโทปโดยใช้อัลกอรึทึมของปลากะรังพีคไอโซโทปที่มีความคลาดเคลื่อน m/z ที่ 0.001 ม./ซ. หรือ 5.0 ppm และความคลาดเคลื่อนของ RT ที่ 0.10 นาที งาน FBMN ถูกดำเนินการโดยใช้ค่าความเผื่อมวลของพาเรนต์ที่ 0.02 Da และค่าความคลาดเคลื่อนของไอออนของชิ้นส่วน MS4 ที่ 0.02 Da ขอบถูกกรองเพื่อให้มีเกณฑ์คะแนน 0.7 และพีคที่ตรงกันอย่างน้อย 2 อัน นอกจากนี้ จำนวนสูงสุดของโหนดเพื่อนบ้านสำหรับแต่ละโหนดถูกกำหนดเป็น 10

4.4. การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ Lignans และ Triterpenes

สภาวะ UPLC เดียวกันที่รายงานสำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของลิกแนน ในขณะที่สำหรับเงื่อนไขของไตรเทอร์พีน พวกมันถูกทำให้เหมาะสมที่สุดเพื่อแยกไอโซเมอร์สองคู่, อาร์จูโนลิกและกรดเอเซียติก การวิเคราะห์ดำเนินการบน Q-Exactive Classic Mass Spectrometer ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การแยกสารดำเนินการโดย Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A (150×2.1 มม. ขนาดอนุภาค 5 µm) เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย A(5 mM สารละลายแอมโมเนียมอะซิเตตในน้ำ, pH 9.00 ที่ปรับโดยแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์) และ B(100 เปอร์เซ็นต์ของอะซิโตไนไทรล์) โดยใช้การชะแบบเกรเดียนท์ของ 17-28 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 0-18 นาที 28-65 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 18-22 นาที 65-75 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 22-26นาที75-95 เปอร์เซ็นต์ ที่ {{17 }}, 5 นาที, 95 เปอร์เซ็นต์ที่ 26,5-30 นาที, 95-17 เปอร์เซ็นต์ที่ 30-30,1 นาที,17 เปอร์เซ็นต์ที่ 30,1-42 นาที อัตราการไหลคือ 0.450 มล./นาที และปริมาตรของการฉีดคือ 5 uL สำหรับทั้งลิกแนนและไตรเทอร์พีน ข้อมูลได้มาโดยใช้โหมด Full MS-SIM และ PRM การตั้งค่า MS-SIM แบบเต็มมีดังนี้: ความละเอียด 70000, AGC เป้าหมาย 3×106, IT สูงสุด 200ms และช่วงตั้งแต่ 200 ถึง 800 m/z สำหรับ lignans และตั้งแต่ 400 ถึง 850 m/z สำหรับไตรเทอร์พีน การตั้งค่า PRM คือ: ความละเอียด 70000, AGC เป้าหมาย 2×10 องศา , IT สูงสุด 100 ms, หน้าต่างการแยก 1.0 m/z และ NCE เท่ากับ 35 ในกรณีของลิกแนน และ 50 ในนั้น ของไตรเทอร์พีนcistanche ออสเตรเลียเราซื้อซัลวาดอร์กัน (#{{0}}XS172930) จาก Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Switzerland), liriodendron (#SMB00181) และ arjunolic acid (#SMB00119) จาก Sigma -Aldrich(St. Louis, MO, USA), Asiatic acid (#0027) จาก Extrasynthese (Genay, Lyon, France) และ hederagenin(#89706)จาก PhytoLab GmbH & Co.KG(Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Germany) กรด Myrianthic เป็นของขวัญจาก Prof. Maria Valeria D'Auria มหาวิทยาลัยเนเปิลส์ กราฟการปรับเทียบได้มาจากการฉีดสารละลายมาตรฐานในช่วงความเข้มข้น 025-25 μM สำหรับลิกแนนและ 0.1-25 uM สำหรับไตรเทอร์พีน ทั้งซัลวาดอร์บริสุทธิ์กันและลิริโอเดนดรอนแสดงพีค LC-MSMS สองพีค อาจเป็นเพราะสมดุลทางเคมีที่สร้างขึ้นในสารละลาย ขีดจำกัดของการตรวจจับ (LOD) และขีดจำกัดของการหาปริมาณ (LOO) สำหรับมาตรฐานถูกกำหนดบนพื้นฐานของอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (S/N)

4.5.การเพาะเลี้ยงเซลล์ผิวหนังและคำอธิบาย

ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ (HDF) ได้รับการดูแลใน Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ของ Dulbecco ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) )ในอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์ CO 5 เปอร์เซ็นต์ และบรรยากาศที่มีความชื้นที่ 37 องศา สารสกัดจากผิวหนังที่ได้จากผิวหนังของผู้บริจาคเพศหญิงที่มีสุขภาพดี (อายุ 44-47) ที่ศูนย์ศัลยกรรม Villa Cinzia (เนเปิลส์ ประเทศอิตาลี) ได้รับการเพาะเลี้ยงใน 24-transwell plate ใน DMEM/FBS บวกกับยาปฏิชีวนะในอากาศ- สภาพของเหลวที่ 37 องศาใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ความชื้นในอากาศ ผู้บริจาคทั้งหมดได้ให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรสำหรับการใช้เนื้อเยื่อผิวหนังตามปฏิญญาเฮลซิงกิ

4.6. การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์เป็นไปตามการใช้ MTTcompound [{{0}}(45-dimethyl thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide [34] เซลล์ถูกปลูกในเพลต 96-หลุมในอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM (ตัวกลางดัดแปลงของ Dulbecco) เสริมด้วยซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลาประมาณ 8 ชั่วโมง หลังการบำบัดด้วย ObHEx ระหว่าง 0.05 เปอร์เซ็นต์ และ 0.0004 เปอร์เซ็นต์ (500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรและ 4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างใน PBS และบ่มด้วย 100 ไมโครลิตร/หลุมของ "บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา" ที่ประกอบด้วย∶ 10 mMof Hepes, 1.3 mM CaCl2, 1mM MgSO, 5 mM ของกลูโคส และ 0.5 มก./มล. ของสารตั้งต้นสี MTT ในบัฟเฟอร์ PBS ที่ pH7.4 หลังจากการบ่ม 3 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียสใน 5 เปอร์เซ็นต์ของ CO สารละลาย 100 ไมโครลิตรที่ละลายได้ซึ่งประกอบด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ Triton-X100,0.1 N ของ HCl ในไอโซโพรพานอลสัมบูรณ์ถูกเติมในแต่ละหลุม หลังจากการฟักไข่ 16 ชั่วโมง ปฏิกิริยาสีวัดที่ 595 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านเพลต Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

4.7. การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน MYLK และ TGF6RII ใน HDF

ต่อหลุม HDF 1×10 ดีกรีถูกปลูกในเพลต 6-หลุมใน DMEM ที่ 2 เปอร์เซ็นต์ FBS หลังจาก 24 ชั่วโมง FBS ถูกเจือจางเพิ่มเติมเป็น 0.5 เปอร์เซ็นต์ และ เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้น 0.002 เปอร์เซ็นต์ และ 0.006 เปอร์เซ็นต์ของความเข้มข้นของ ObHExand TGF- 2.5ng/mL ตามด้วยการฟักตัวของ 2 ชั่วโมงสำหรับ MYLK และ 48 สำหรับ TGFRII สำหรับการสกัด RNA จะใช้ชุดอุปกรณ์ "GenEluteM Total RNA Purification" ที่ซื้อโดยบริษัทเมอร์ค (ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) หลังจากการบำบัดตามที่ระบุ เซลล์ถูกล้างด้วย PBS รวบรวมในบัฟเฟอร์การสลาย และอยู่ภายใต้ขั้นตอนการสกัดตามที่รายงาน ตัวอย่างได้รับการรักษาด้วย DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) ที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อน DNA ของจีโนม จากตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง บรรจุ 2 ไมโครลิตรลงบนเจล 1 เปอร์เซ็นต์ของอะกาโรสในที่ที่มีสีย้อมสำหรับการโหลดที่เปลี่ยนสภาพเพื่อจุดประสงค์ในการวัดปริมาณของอาร์เอ็นเอในการอ้างอิงถึงมาร์กเกอร์เฉพาะสำหรับอาร์เอ็นเอ (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) ถูกใช้เป็นซอฟต์แวร์สำหรับการหาปริมาณ ถัดไป 300 ng ของ RNA ทั้งหมดถูกคัดลอกย้อนหลังโดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) RT-PCR กึ่งเชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้คู่ของไพรเมอร์สากล 18S ไพรเมอร์/คู่แข่ง (Ambion, Austin, TX, USA) เป็นมาตรฐานภายใน ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกออกจากเจล agarose 1.5 เปอร์เซ็นต์ ดูโดยใช้เครื่องมือ Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) และวิเคราะห์โดย densitometry โดยใช้ซอฟต์แวร์ Genetools ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยายเสียงมีดังต่อไปนี้: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT

4.8. การวิเคราะห์ความสามารถในการหดตัวของคอลลาเจนเมทริกซ์

เกี่ยวกับเซลล์ HDF 2.0× 10 องศาถูกแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM 5x (Gibco, Waltham, MA, USA) ในจานหลุม 24-หลุม และ 2 มก./ สารละลาย mL ของคอลลาเจนจากผิวหนังวัว (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ถูกเติมในแต่ละหลุม pH ของสารละลายถูกปรับเป็น 7.2 เพลตถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 นาทีเพื่อให้เจลคอลลาเจนแข็งตัว DMEM ที่เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ FBS และ/หรือ ML7 25 uM เป็นตัวยับยั้ง MYLKprotein ถูกเติมในภายหลัง หลังจาก 16 ชั่วโมง ML7 ถูกล้างและ ObHExat ความเข้มข้น 0.002 เปอร์เซ็นต์ใน DMEM ด้วย FBS 2 เปอร์เซ็นต์ถูกเติม TGF- 2.5 ng/mL ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก แผ่นคอลลาเจนที่ก่อตัวขึ้นถูกแยกออกจากบ่อน้ำทันทีโดยใช้ไม้พายขนาดเล็กที่ผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อส่งเสริมการหดตัว พื้นที่ของดิสก์ของการบำบัดแต่ละครั้งถูกวัดที่เวลา0 และ 5 ชั่วโมง และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์อิมเมจ

4.9. การวิเคราะห์ระดับของแอคตินพอลิเมอไรเซชัน

ถัดไป 1.5×10 ดีกรีของเซลล์ HDF ต่อหลุมเติบโตในจานหลุม 24-หลุม และในวันถัดไป สื่อถูกเติมด้วย FBS 2 เปอร์เซ็นต์และไซโตชาลาซิน บี ซึ่งเป็นตัวยับยั้งแอคติน โพลีเมอไรเซชัน ที่ 2 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 3{{1{{20}}}} นาที หลังจากผ่านไป 30 นาที บนเซลล์ ObHEx (0.002 เปอร์เซ็นต์และ 0.006 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกเติมร่วมกับ TGF- 2.5 ng/mL ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก และ ML7 25μM เป็น การควบคุมเชิงลบของ MYLKenzyme หลังจากการรักษา 30 นาที เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (PFA) ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเป็นเวลา 30 นาทีบนน้ำแข็ง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และซึมผ่านด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟตและไทรทัน-X100 ที่ 0.2 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 30 นาที ต่อจากนั้น เซลล์ถูกบ่มด้วยสารละลาย phalloidin 0.4 μM ที่คอนจูเกตด้วย rhodamine (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในความมืดประโยชน์ของซิสแทนเช่ที่เวลา 0 และหลังจาก 18 ชม. การเรืองแสงถูกวัดที่ 540/570 nm โดยใช้เครื่องอ่านเพลต Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) 4.10.การวิเคราะห์เส้นทาง SMAD2

เซลล์ HDF ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 3 × 103 ใน 96-หลุมเพลต และหลังจาก 16 ชั่วโมงถูกทรานส์เฟกโดยใช้ X-tremeGeneTM HP DNA transfection reagent (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) ด้วยเวกเตอร์รายงาน Smad2 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดด้วย ObHEx หรือ TGF- 2.5 ng/mL เพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับ ML7 25 μM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในตอนท้ายของการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และกิจกรรมของ luciferase ถูกกำหนดโดยใช้ระบบการทดสอบ SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) ในเครื่องอ่าน Multiwell Plate Victor Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , สหรัฐอเมริกา).

4.11.การวิเคราะห์ Pro-Collagen I, Tropoelastin และ Periostin Synthesis

ต่อหลุม 8× 103 HDF ถูกปลูกใน96-เพลตหลุมและบำบัดด้วย 0.002 เปอร์เซ็นต์ของ ObHEx หรือ TGF 2.5 ng/mL หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการประมวลผลสำหรับ ELISA โดยใช้โมโนโคลนัลแอนติบอดีปฐมภูมิต้านโปรคอลลาเจนชนิด I(sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ตามด้วยการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีต้านเมาส์ทุติยภูมิที่ติดฉลาก ด้วยเปอร์ออกซิเดส (170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA) supernatants ของเซลล์ถูกเคลือบบนจานอื่นเพื่อตรวจหา tropoelastin และ periostin โดยใช้แอนติบอดีต่อกระต่าย anti-tropoelastin (ab21600, Abcam, Cambridge, U หรือแอนติบอดีต่อเมาส์ anti-periostin (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology ดัลลัส รัฐเท็กซัส สหรัฐอเมริกา) ตามด้วยการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต้านกระต่ายที่ติดฉลากด้วยเปอร์ออกซิเดส (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA） ปฏิกิริยาสีได้รับการพัฒนาโดยการเติมสารละลายในน้ำ 100 ไมโครลิตรของ OPD(O-phenylenediamine),0.35 มก./มล. ในบัฟเฟอร์ซิเตรต 50 mM และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 0.012 เปอร์เซ็นต์ (H2O2) หลังจาก 30 นาที การดูดกลืนแสงจะถูกวัดที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านหลายเครื่อง Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, สหรัฐอเมริกา).

4.12. การทดสอบ Ex Vivo

ImmunoHistoFluorescence(IHF) ของ MYLK และ myosin ที่มีฟอสโฟรีเลตถูกประเมินใน explants ทางผิวหนังของผู้บริจาคอายุ {{0}} ปี การปลูกถ่ายผิวหนังมนุษย์ถูกตัดด้วยการตรวจชิ้นเนื้อเจาะ 8 มม. และเพาะเลี้ยงในเพลต 24-หลุมใน DMEM ด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์และยาปฏิชีวนะ หมัดที่ได้รับได้รับการรักษาด้วย 0.002 เปอร์เซ็นต์และ 0.006 เปอร์เซ็นต์ของ ObHEx เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พวกมันถูกบ่มในซูโครส 15 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นในซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์ และสุดท้ายถูกแช่แข็ง ถัดไป ได้ส่วน 10 μm โดยใช้ CM1520 cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) สไลด์ที่มี cryosections ถูกไฮเดรทเป็นเวลา 30 นาทีใน PBS และวางในสารละลาย "บล็อค" (BSA 6 เปอร์เซ็นต์, ซีรั่ม 5 เปอร์เซ็นต์, 20 mM MgCl, 0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง Cryosections ถูกบ่มด้วยแอนติบอดี anti-MYLK rabbit หลัก (1: 100, GeneTex, Irvine, CA, USA) และแอนติบอดี primary anti-phospho-myosin (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 4 องศา . สไลด์ถูกล้างด้วย PBS เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงฟักตัวด้วยแอนติบอดีต้านกระต่าย Alexa-Fluor 546 ตัวที่สอง (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง นิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI(4',6-5 ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลลินโดล)1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน PBS เป็นเวลา 10 นาที ได้ภาพมาด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ สำหรับ IHF ของโทรโพอีลาสตินและคอลลาเจน I มีการใช้สารสกัดจากผิวหนังของผู้บริจาคเพศหญิงอายุ 36-ปี ตรวจชิ้นเนื้อผิวหนังได้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและบำบัดล่วงหน้าด้วย 0.002 เปอร์เซ็นต์และ 0.006 เปอร์เซ็นต์ของ ObHEx เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ความเครียดด้วยไฮโดรคอร์ติโซนที่ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 8 วันถูกเติมต่อหน้า ObHEx หลังจากนั้น การตัดชิ้นเนื้อถูกแช่แข็งตามที่อธิบายข้างต้น และส่วนต่างๆ ถูกฟักด้วยแอนติบอดีหลักที่ต่อต้านโทรโพอีลาสตินกระต่าย (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) และสารต้านคอลลาเจน I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Germany) สำหรับ 16 ชม. ที่ 4 องศา สไลด์ได้รับการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และได้รับภาพและวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ

4.13. Atomic Force Microscopy (AFM) ใน Explants ผิวหนัง

ความยืดหยุ่นของตัวอย่างผิวที่ไม่ผ่านการบำบัดและรักษาด้วย ObHEx ได้รับการประเมินเพื่อให้มั่นใจว่า Young's moduli โดยวิธีการในระดับนาโนเมตรตาม Atomic Force Microscopy (AFM) ที่พัฒนาขึ้นไม่เพียงแต่สำหรับตัวอย่างทางชีววิทยาแต่สำหรับตัวอย่างอนินทรีย์ด้วย วิธีการเหล่านี้อิงตามสมมติฐานของแบบจำลองของเฮิรตซ์ และพิจารณาตัวอย่างและเสาเข็มเป็นสปริงสองชุดในการตั้งค่าการทดลอง AFM โดยสังเขป ผิว ex-plant ที่บำบัดด้วย 0.006 เปอร์เซ็นต์ของ ObHEx และตัวอย่างผิวหนังที่ไม่ผ่านการบำบัดถูกตัดด้วย cryostat เป็นชิ้นที่มีความหนา 10 um ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ 12 องศา จากนั้นล้างด้วย PBS และตรวจสอบที่อุณหภูมิคงที่และความชื้นสัมพัทธ์ที่ 22 องศาและ 55 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างได้รับการตรวจสอบโดย NanoScope IIA AFM ในโหมด Force Spectroscopy Single โดยใช้ปลายปิรามิด (RESP-20) ที่มีค่าสปริงคงที่ 0.9 N/m ในการคำนวณโมดูลัสของ Young ได้กราฟ Force Curve สิบจุดที่แตกต่างกันสิบจุดของผิวเผินตัวอย่างเดียวกัน เส้นโค้งแรงแต่ละเส้นเป็นเส้นโค้งของการโก่งตัว (โวลต์) กับการกระจัด (นาโนเมตร) และสามารถแปลงเป็นเส้นโค้งของแรง (N) กับการแยก (นาโนเมตร) อันที่จริง เส้นโค้งแรงแต่ละเส้นจะรายงานเส้นโค้งการโหลดและการขนถ่าย สิ่งเหล่านี้แสดงถึงแนวโน้มของทิปในส่วนที่เกี่ยวกับตัวอย่าง: เมื่อทิปอยู่ไกลจากตัวอย่าง เมื่อพวกเขาสัมผัสและทิปเริ่มเบี่ยงเบน และเมื่อมันเคลื่อนออกไปอีกครั้ง สามารถตรวจสอบได้เฉพาะส่วนแรกของเส้นโค้งเหล่านี้เท่านั้น ส่วนโค้งแต่ละส่วนเหล่านี้พอดีกับโมเดล Hertzian มาตรฐาน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Hertzequation ทั่วไปสำหรับปลายปิรามิด เพื่อแยกโมดูลัสยืดหยุ่นที่เรียกว่าโมดูลัสของ Young ใน GPa

4.14. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ค่าทั้งหมดที่รายงานเป็นค่าเฉลี่ยของการทดลองอิสระสามการทดลอง ซึ่งแต่ละค่าดำเนินการเป็นสามเท่า เครื่องหมายดอกจันบ่งชี้นัยสำคัญทางสถิติที่คำนวณตามข้อตกลงกับการทดสอบ t: *หมายถึงค่า น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05;** ค่า p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0 01;***p ค่าน้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.001

บทความนี้คัดมาจาก Metabolites 2021, 11, 527 https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites